Minimalnie inwazyjna technika wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura
19 maja 2015
Bezpośrednia iniekcja do nerwu wzrokowego szczura jest przydatna do badań regeneracyjnych. Demonstrujemy minimalnie inwazyjną technikę bezpośredniego wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura, która nie wymaga otwierania czaszki. Dzięki tej metodzie powikłania chirurgiczne są zminimalizowane, a powrót do zdrowia jest szybszy.
Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie minimalnie inwazyjnego podejścia do wstrzykiwania leków lub komórek macierzystych do nerwu wzrokowego żywego szczura. Osiąga się to poprzez najpierw znieczulenie szczura, umieszczenie go na stanowisku sekcyjnym i wprowadzenie szwu do spojówki w celu manipulacji okiem. Później drugim krokiem jest wycięcie grzbietu oczodołu za okiem w celu odsłonięcia nerwu wzrokowego.
Następnie szklaną pipetę wprowadza się do nerwu wzrokowego, a lek lub komórki macierzyste są wstrzykiwane przed zamknięciem pola operacyjnego i ożywieniem szczura ze znieczulenia. Ostatecznie, po pewnym czasie, szczur jest składany w ofierze, nerw wzrokowy jest preparowany, a efekty chirurgicznego wstrzyknięcia lub przeszczepu można uwidocznić za pomocą mikroskopii. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że podejście to jest minimalnie inwazyjne, co pozwala szczurowi przetrwać tak długo, jak tego potrzebujesz.
Zbadaj efekty chirurgicznego wstrzyknięcia lub przeszczepu. Procedurę zademonstruje Kate Schwartz, studentka technika z mojego laboratorium. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać w znieczuleniu z użyciem od dwóch do 3% izofluoru.
Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i częstość oddechów. Sprawdź, czy szczur nie drga w odpowiedzi na palec u nogi. Szczypta. W razie potrzeby zabezpiecz zwierzę, aby uniknąć ruchów głowy podczas zabiegu.
Następnie umieść kroplę lidokainy na oku chirurgicznym. Używaj sztucznych łez co 10 minut, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przedoperacyjne wstrzyknięcie buprenorfiny należy wykonać w dawce 0,01 miligrama na kilogram podskórnie, a następnie w razie potrzeby co sześć do ośmiu godzin.
Utrzymuj zwierzę w cieple za pomocą poduszki grzewczej. Zwilż sierść skóry głowy alkoholem. Uważaj, aby nie dopuścić do ekspozycji na oczy.
Pamiętaj, aby używać sterylnych narzędzi i sterylnej techniki, aby zminimalizować ryzyko infekcji pooperacyjnych. Następnie umieść szew czterokrotny w bocznej spojówce i zawiąż go wystarczającym szwem, aby umożliwić delikatną trakcję. Wykonaj przybliżone nacięcie o długości jednego cala w skórze nad grzbietem oczodołu.
Za pomocą skalpela w rozmiarze 10. Cofnij skórę i leżącą pod nią powięź i ostrożnie wypreparuj powięź. Umieść jeden szew w cofniętej skórze, aby umożliwić odsłonięcie górnego worka oczodołowego, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu do pola operacyjnego.
Unikaj przecinania naczyń krwionośnych podczas preparowania powięzi. Przy delikatnym pociągnięciu spojówki, pociągnięciu oka w dół i wyjęciu z oczodołu, pojawi się mięsień oczodołu górny. Aby odsłonić nerw wzrokowy, tłuszcz zadoczodołowy musi zostać usunięty, a mięsień przecięty.
Tłuszcz można wyrzucić i nie należy go wymieniać po wstrzyknięciu. Od tego momentu powięź nerwu wzrokowego powinna być widoczna jako wiązka samego nerwu wzrokowego wraz z naczyniami krwionośnymi owiniętymi oponą twardą. Aby dokonać głębszej sekcji, wykonaj małe nacięcie w DRA za pomocą skalpela lub igły ze skosem 31 rozmiarów, aby przekłucie było mniej traumatyczne, przygotuj wyciągniętą szklaną mikropipetę o średnicy od 50 do 100 mikronów, aby zapewnić stabilność.
Zamontuj mikropipetę na mikromanipulatorze i podłącz do plastikowej strzykawki o pojemności 20 cm3. Wyciągnij kulki lub komórki macierzyste rozpuszczone w 0,5 do jednego mikrolitra do wstecznej mikropipety, wraz z 0,5 mikrolitra roztworu błękitu metylowego przed i po załadowaniu szklanej pipety barwnikiem. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 cm3 i igły o rozmiarze 30 opuść końcówkę mikropipety na nerw wzrokowy tuż nad naciętą oponą twardą.
Niewielki, ale energiczny ruch szklanej końcówki w głąb nerwu wzrokowego powoduje najmniejsze uszkodzenie przy jednoczesnym powolnym i stałym nacisku na tłok. Niebieski barwnik Evansa powinien podkreślić obszar wstrzykniętego nerwu wzrokowego. Barwnik powinien pozostać zlokalizowany w nerwie wzrokowym bez wyciekania w przestrzeni podpajęczynówkowej.
Postępuj zgodnie z drugim pasmem Evan's Blue Dye, aby określić, kiedy wstrzyknięcie komórek macierzystych zostało zakończone. Po wstrzyknięciu niezbędnej objętości do nerwu wzrokowego puścić tłok. Trzymaj mikropipetę nieruchomo w nerwie wzrokowym przez pięć minut, aby zapobiec wyrzuceniu pod wysokim ciśnieniem po wyjęciu mikropipety po zakończeniu wstrzyknięcia.
Wyjmij mikropipetę wraz z bawełnianymi końcówkami używanymi do zapewnienia hemostazy. Zszyj skórę jedwabiem 3.0 i usuń szew spojówkowy. Utrzymuj szczury w cieple na poduszce grzewczej, aż wyjdą z narkozy.
Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać mostek w pozycji leżącej. Jeśli zwierzę wykazuje oznaki bólu, w tym nadmierny letarg, ataksję lub trudności w oddychaniu, należy podać odpowiednią analgezję z buprenorfiną podawaną domięśniowo do trzech razy dziennie. Po eksperymencie szczury zostały złożone w ofierze i poddane perfuzji paraldehydem.
Nerwy wzrokowe zostały starannie wypreparowane i zamontowane w celu przecięcia kriostatu, pokazany tutaj jest przykład nerwu wzrokowego w otworze szczura o niższej mocy, do którego wstrzyknięto niebieski barwnik Evana. Aby zobrazować miejsce, strzałka określa dokładną lokalizację wstrzyknięcia. To rozwarstwienie zostało wykonane w ciągu kilku dni od wstrzyknięcia, na co wskazuje ograniczona dyfuzja barwnika w dół nerwu po jego rozwoju.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurologią regeneracyjną do zbadania nowych sposobów regeneracji nerwu wzrokowego i potencjalnego przywrócenia utraconego wzroku w tym szczurzym modelu choroby demielinizacyjnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia małoinwazyjną technikę bezpośredniego wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura, mającą na celu usprawnienie badań nad regeneracją. Metoda ta minimalizuje powikłania chirurgiczne i sprzyja szybszej rekonwalescencji osobników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Medycyna regeneracyjna
- Chirurgia zwierząt
Wstęp
- Bezpośrednia iniekcja do nerwu wzrokowego jest kluczowa dla badania procesów regeneracyjnych.
- Tradycyjne metody często obejmują inwazyjne procedury, które mogą prowadzić do powikłań.
- Niniejsza technika ma na celu poprawę przeżywalności i rekonwalescencji badanych osobników.
- Zrozumienie wpływu iniekcji na nerw wzrokowy jest niezbędne dla przyszłych terapii.
Cel badania
- Opracowanie mniej inwazyjnej metody wstrzykiwania leków lub komórek macierzystych do nerwu wzrokowego.
- Zminimalizowanie ryzyka chirurgicznego i przyspieszenie czasu rekonwalescencji w modelach zwierzęcych.
- Ułatwienie badania efektów regeneracyjnych po iniekcji.
Zastosowane metody
- Znieczulenie szczura przed zabiegiem.
- Ułożenie szczura na stole sekcyjnym w celu zapewnienia optymalnego dostępu.
- Disekcja brzegu oczodołu w celu odsłonięcia nerwu wzrokowego.
- Iniekcja leku lub komórek macierzystych przy użyciu szklanej pipety.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia skuteczną iniekcję bez konieczności otwierania czaszki.
- Szczury szybciej wracają do zdrowia w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Badanie pooperacyjne wykazuje, że efekty iniekcji można zwizualizować.
- Metoda ta sprzyja przeżywalności szczura w wydłużonych okresach obserwacji.
Wnioski
- Ta małoinwazyjna technika jest skuteczna w przypadku iniekcji do nerwu wzrokowego.
- Zmniejsza ona liczbę powikłań i usprawnia proces rekonwalescencji.
- Podejście to jest korzystne dla przyszłych badań regeneracyjnych w dziedzinie neuronauki.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta małoinwazyjna technika umożliwia bezpośrednie podawanie środków terapeutycznych do nerwu wzrokowego szczura bez konieczności otwierania czaszki, co wspiera badania podłużne w neurologii regeneracyjnej. Poprzez zapewnienie przeżywalności zwierząt i ograniczenie traumy chirurgicznej, metoda ta zwiększa wykonalność eksperymentów związanych z przewlekłym dawkowaniem oraz transplantacją komórek macierzystych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla strategii naprawy nerwu wzrokowego i redukuje ryzyko w ścieżkach translacyjnych w modelach chorób demielinizacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednie podanie komórek macierzystych lub leków do nerwu wzrokowego.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez lokalną interwencję bez zakłócających efektów systemowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie wizualizacji miejsc iniekcji oraz rozprzestrzeniania się znacznika za pomocą barwnika błękitu Evansa.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Tworzy zestandaryzowaną, powtarzalną platformę chirurgiczną do podawania związków lub komórek do nerwu wzrokowego.
- Wynik ilościowy: Umożliwia ocenę powodzenia iniekcji poprzez lokalizację barwnika i mikroskopię pooperacyjną.
- Skalowalność: Wspiera powtarzalne interwencje dzięki szybkiej rekonwalescencji i minimalnej inwazyjności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje uszkodzenie nerwu wzrokowego i demielinizację, co jest zgodne z opracowywaniem terapii w celu przywrócenia wzroku.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając przewlekłą obserwację efektów regeneracyjnych.
- Decyzje uwzględniające ryzyko: Wspiera kryteria go/no-go w oparciu o histologiczne potwierdzenie dokładności iniekcji i odpowiedzi tkankowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – umożliwiając iteracyjne projektowanie leków neuroterapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez bezpośrednie dostarczanie czynników do nerwu wzrokowego w celu oceny zaangażowania celu.
- Przesiewanie: Zwiększa niezawodność testów dzięki spójnemu, małoinwazyjnemu dostarczaniu substancji, eliminując zmienność chirurgiczną.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki za pomocą retencji barwnika i sekcjonowania histologicznego w celu porównania skuteczności iniekcji.
- Badania translacyjne: Umożliwia ciągłość przedkliniczną poprzez zapewnienie okresów przeżycia wystarczających do oceny regeneracji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną zdolność chirurgiczną do wykorzystania w wielu badaniach ukierunkowanych na naprawę nerwu wzrokowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie modulacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nerwu wzrokowego.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność podawania wewnątrzczaszkowego w modelach gryzoni.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko biologiczne na późnym etapie dzięki umożliwieniu wczesnej walidacji precyzji podania i tolerancji tkankowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów neuroregeneracyjnych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o wykonalność podania.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii i protokołów znieczulania gryzoni.
- Zależy od dostępności mikroszystrzek, szklanych mikropipet oraz sprzętu do manipulacji stereotaktycznych.
- Wymaga standaryzowanej opieki pooperacyjnej, w tym analgesji i termoregulacji.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji dla różnych szczepów gryzoni lub średnic nerwów.
- Ograniczone koniecznością wykonania sekcji końcowej w celu weryfikacji miejsca iniekcji, co wyklucza podłużne obrazowanie in vivo.
