Name: Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Naucz się wytwarzać ludzkie limfocyty T specyficzne dla alloantygenu z krwi obwodowej. Ta metoda pozwala na izolację i klonowanie komórek o określonej specyficzności alloantygenu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować NIH Tetramer Core Facility za produkcję tetrameru. Autor pragnie również podziękować E.D. O'Connorowi i K.E. Marquezowi z laboratorium cytometrii przepływowej UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility za pomoc w sortowaniu komórek. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

UWAGA: Ten protokół wymaga użycia próbek krwi obwodowej od ochotników. Wszystkie badania z udziałem ludzi powinny zostać zweryfikowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną ds. Badań nad Ludźmi w celu zapewnienia zgodności z Deklaracją Helsińską (2013) oraz Ustawą o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych z 1996 r.
1. Izolacja limfocytów T z krwi pełnej
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem podgrzej podłoże o gradiencie gęstości do temperatury pokojowej. Podaniec 4 ml pożywki o gradiencie gęstości do 2-4 sterylnych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml (1 probówka zostanie użyta na każde 10 ml całkowitej objętości rozcieńczonej krwi).</li>
	<li>Pobrać 10-20 ml krwi w 1-2 probówkach do pobierania krwi żylnej pokrytych heparyną sodową w sprayu (z zieloną górą). Zbieraj próbki ludzkie pod nadzorem przeszkolonych osób i zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną.</li>
	<li>Przetrzyj zewnętrzną część tub 70% etanolem. Ostrożnie zdjąć górną część napełnionych probówek zbiorczych i zdekantować krew do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej probówki do pobierania krwi. Zebrać PBS, dodać do zdekantowanej krwi pełnej i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 25 μl koktajlu wzbogacającego ludzkie limfocyty T / 2 ml całkowitej objętości. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie nałożyć do 10 ml krwi rozcieńczonej w stosunku 1:1 na podłoże o gradiencie gęstości. Uważaj, aby nie naruszyć powierzchni ośrodka o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Odwirować warstwową krew i pożywkę o gradiencie gęstości o sile 1 200 x g przez 20 minut w temperaturze 20 oC.</li>
	<li>Wyjąć probówki z wirówki, uważając, aby nie zakłócić granicy faz między pożywką o gradinie gęstości a warstwą leukocytów na granicy faz między pożywką o gradiencie gęstości a rozcieńczonym osoczem. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml ostrożnie zebrać warstwę leukocytów i przenieść do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać PBS, aby doprowadzić objętość zebranego PBL do 50 ml i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Zdekantować.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w 10 ml sterylnego buforu sortującego do cytometrii przepływowej (sterylnie przefiltrowany PBS zawierający 1% BSA). Pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórkowej, rozcieńczyć w stosunku 1:10 (dodać do 90 μl) błękitu trypanowego, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru (oczekiwana wydajność 1 – 4 x 106 komórek / probówka krwi pełnej).
	<ol>
		<li>Usunąć 1 ml podwielokrotności, przenieść do probówki o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do analizy limfocytów T nieznakowanych tetramerem. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Magnetyczne wzbogacanie limfocytów T specyficznych dla alloantygenu
<ol>
	<li>Rozcieńczyć tetramer alloantygenu pMHC w stosunku 1:100 w sterylnym buforze sortującym.</li>
	<li>Zawiesinę komórek wirówki (9 ml od kroku 1.11) w dawce 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Zdekantować.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego tetrameru alloantygenu pMHC do komórek granulowanych (do 10,7 komórek). Wymieszać delikatnie pipetując. Przenieść do sterylnej probówki o pojemności 5 ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu sortującego. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Zdekantować.</li>
	<li>Zawieś komórki w buforze sortującym o pojemności 100 μl. Dodaj 10 μl koktajlu Biotin Selection i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 5 μl nanocząstek magnetycznych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml buforu do sortowania i delikatnie wymieszać, pipetując. Usunąć 100 μl podwielokrotności, przenieść do probówki o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do analizy komórek wstępnie wzbogacających.</li>
	<li>Umieścić probówkę o pojemności 5 ml zawierającą zawiesinę komórek w magnesie do separacji komórek. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, przelej zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki, aby usunąć ostatnie krople płynu.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z magnesu. Dodać 2 ml buforu do sortowania na zimno i delikatnie wymieszać pipetując. Pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórek, rozcieńczyć w stosunku 1:2 (dodać do 10 μl) błękitu trypanowego, aby zliczyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
3. Przygotowanie limfocytów T do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej jednokomórkowej
<ol>
	<li>Dodać bufor do sortowania na zimno do wszystkich probówek komórek (tetramer nieznakowany, znakowany tetramerem niewzbogacony i wzbogacony znakowany tetramerem), aby zwiększyć objętość do 3 ml.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC i zdekantować bufor w celu odzyskania komórek.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w 25 μl bufora do sortowania na zimno. Dodaj 5 μl ludzkiego bloku Fc. Inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Przygotuj przeciwciała do sortowania metodą cytometrii przepływowej. Wymieszaj 15 μl buforu sortującego, 15 μl anty-CD5, 15 μl anty-CD14 i 15 μl anty-CD19.</li>
	<li>Dodać 20 μl mieszaniny przeciwciał do każdej probówki z komórkami. Inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu do sortowania na zimno do każdej probówki.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC i zdekantować bufor w celu odzyskania komórek.</li>
	<li>Zawiesić komórki w stężeniu 1 -2 x 106 komórek/ml w buforze sortującym.</li>
	<li>Podać 100 μl pożywki do hodowli ludzkich komórek T (DMEM Iscove'a uzupełniony 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 μg/ml gentamycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB i 2,5 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-2) do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórek z okrągłym dnem. Trzymaj na lodzie.</li>
</ol>
4. Izolacja limfocytów T znakowanych tetramerem za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Ustal parametry bramkowania cytometrii przepływowej w celu identyfikacji limfocytów T znakowanych tetramerem alloantygenu-pMHC (ryc. 2.A). Użyj frakcji znakowanej tetramerem przed wzbogaceniem, aby ustalić strategie bramkowania w celu wyeliminowania dubletów, bramki na limfocytach, wykluczenia limfocytów z ekspresją CD19 i monocytów z ekspresją CD14 oraz identyfikacji limfocytów T na podstawie ekspresji CD5. Użyj próbki, która nie jest znakowana tetramerem, jako fluorescencji minus jedna kontrola, aby ustalić bramkowanie w celu identyfikacji limfocytów T wiążących tetramery (przy czym 0% komórek CD5 + CD14-CD19 z próbki nieznakowanej tetramerem powinno mieścić się w tej bramce). 
	UWAGA: Strategie bramkowania, które nie są odpowiednio rygorystyczne, spowodują izolację limfocytów innych niż T lub limfocytów T, które nie są specyficzne dla antygenu, podczas gdy zbyt restrykcyjne strategie bramkowania zmniejszą liczbę izolowanych limfocytów T.</li>
	<li>Zaprogramuj parametry płytki dla sortowania pojedynczych komórek. Skieruj sorter tak, aby umieścił 1 komórkę CD5 + CD14-CD19-tetramer + w każdym dołku. Skierować zestaw płytek tak, aby zawierały 1 studzienkę kontroli ujemnej (żadne komórki nie zostały posortowane w studzince) i 1 studzienkę kontroli dodatniej (100 komórek tetramerowych CD5 + CD14-CD19) w każdym rzędzie (rysunek 2.B).</li>
	<li>Korzystając z ustalonej strategii bramkowania cytometrii przepływowej i konfiguracji płytki, wyizoluj poszczególne limfocyty T wiążące tetramery bezpośrednio na 96-dołkowej płytce za pomocą sortera komórek cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Hodowla i ekspansja klonów limfocytów T specyficznych dla alloantygenu
<ol>
	<li>Po zakończeniu sortowania komórek, odwirować płytkę o masie 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Umieścić płytkę hodowlaną w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
	<li>Mikrogranulki anty-CD3/anty-CD28 stymulujące wirowo przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia kulek.</li>
	<li>Obliczyć objętość kulek aktywatora potrzebną do stymulacji pobranych limfocytów T (0,5 μl mikrokulek aktywatora / studzienkę). Przenieś obliczoną objętość kulek stymulatora do sterylnej probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml pożywki do hodowli ludzkich limfocytów T i odwirować.</li>
	<li>Umieść rurkę z zawieszeniem mikrokulek w magnesie. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, przelej zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z magnesu. Dodać pożywkę do hodowli ludzkich limfocytów T (początkowo dodano 100 μl pożywki / 0,5 μl mikrogranulek).</li>
	<li>Podwielokrotność 100 μl zawiesiny kulki aktywatora do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
	<li>Codziennie monitoruj wzrost komórek za pomocą badania mikroskopowego. Małe skupiska proliferujących komórek można obserwować pod mikroskopem po 5 – 7 dniach hodowli (ryc. 3.A). 
	UWAGA: Wizualizacja kultur komórek T w tym momencie może być trudna, a brak obserwowalnych klastrów komórkowych na tym etapie może nie wskazywać na brak rosnących limfocytów T.</li>
	<li>Po 14 dniach od izolacji komórek należy karmić hodowle, ostrożnie usuwając 100 μl pożywki z wierzchu hodowli i zastępując ją 100 μl świeżej pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Kontynuować inkubację płytki hodowlanej w temperaturze 37 oC w inkubatorze z 6% CO2 .</li>
	<li>Codziennie monitoruj wzrost komórek za pomocą badania mikroskopowego i oceny koloru pożywki hodowlanej. Duże skupiska komórek powinny być widoczne pod mikroskopem 2 – 3 dni po zmianie podłoża. Makroskopowo osady komórkowe powinny stać się widoczne w ciągu 14 dni po zmianie pożywki.</li>
	<li>Po 28 dniach od izolacji komórek zidentyfikuj rosnące klony za pomocą badania mikroskopowego. Przenieść objętość 200 μl 96-dołkowych kultur płytkowych z dodatnim wzrostem do indywidualnych dołków 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 200 μl pożywki do hodowli ludzkich limfocytów T.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawierających 12,5 μl stymulujących mikrogranulek anty-CD3/anty-CD28 (przygotowanych w sposób opisany w punktach 5.2 – 5.6). Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
	<li>Codziennie monitoruj wzrost kultury za pomocą badania mikroskopowego i oceny koloru pożywki hodowlanej. Gdy hodowla limfocytów T osiągnie >2x106/ml (zwykle 3-5 dni po ponownej stymulacji, można oszacować na dzień, w którym pożywka zaczyna zmieniać kolor na słomkowożółty), przenieś hodowlę do dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i dodaj 500 μl pożywki z ludzkich komórek T.</li>
	<li>Po 10-14 dniach od ponownej stymulacji należy pobrać 200 μl hodowli limfocytów T w celu oceny swoistości alloantygenu za pomocą analizy cytometrii przepływowej wiązania tetrameru pMHC (przy użyciu strategii znakowania i bramkowania opisanej w sekcjach 3 i 4.1).</li>
</ol>
6. Długotrwała restymulacja i hodowla klonów limfocytów T
<ol>
	<li>Ciągłe ponowne stymulowanie i rozszerzanie klonalnych hodowli komórek T o pożądanej swoistości może odbywać się co 14 dni. Zebrać hodowle limfocytów T do sterylnej probówki o pojemności 5 ml w 14 dniu po ostatniej stymulacji mikrokulkami anty-CD3/CD28. Połącz wiele dołków tego samego klonu limfocytów T w jednej probówce, do objętości 2,5 ml.</li>
	<li>Dodać pożywkę, aby doprowadzić końcową objętość do 2,5 ml i delikatnie wymieszać, pipetując.</li>
	<li>Umieść probówkę o pojemności 5 ml zawierającą hodowlę limfocytów T w magnesie do separacji komórek, aby usunąć stare mikrogranulki z hodowli. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, zdekantuj zawiesinę komórek do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki, aby usunąć ostatnie krople płynu.</li>
	<li>Dodać pożywkę, aby doprowadzić końcową objętość do 4 ml. Pobrać próbkę 10 μl, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odzyskać limfocyty T przez odwirowanie przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dekantacja supernatantu. Zawiesić limfocyty T w 106 komórkach / ml pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Przenieść 1 ml podwielokrotności do każdego dołka z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Ponownie stymulować limfocyty T, dodając 100 μl pożywki zawierającej 12,5 μl stymulujących mikrogranulek anty-CD3/anty-CD28 (jak opisano w punktach 5.2 – 5.6). Inkubować w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
</ol>

<ol><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li>
<li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li>
<li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+estimation+of+the+human+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li>
<li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+%CE%B2-chain+diversity+in+%CE%B1%CE%B2+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+T-cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li>
<li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li>
<li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+APCs%2C+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%2B+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li>
<li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li>
<li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection%2C+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li>
<li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li>
<li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Alloreaktywność limfocytów T jest zjawiskiem od dawna badanym i istotnym klinicznie. Silna odpowiedź proliferacyjna i efektorowa limfocytów T na stymulację allogeniczną umożliwiła szeroko zakrojone analizy odpowiedzi ludzkich limfocytów T in vitro poprzez stosunkowo proste reakcje limfocytów mieszanych limfocytów krwi obwodowej przeciwko inaktywowanym komórkom allogenicznym. Jednak te pierwotne alloreaktywne odpowiedzi limfocytów T są oligoklonalne, składające się z dużej liczby pojedynczych limfocytów T reagują...

T limfocyty są kluczowymi składnikami adaptacyjnego układu odpornościowego. Limfocyty T są odpowiedzialne nie tylko za bezpośrednie pośredniczenie w ochronnych odpowiedziach immunologicznych na patogeny poprzez różne mechanizmy efektorowe, ale także za aktywne utrzymywanie samotolerancji immunologicznej i kierowanie odpowiedziami innych komórek w układzie odpornościowym. Funkcje te są kierowane przez szereg zintegrowanych sygnałów, w tym ligację receptora limfocytów T (TCR), cytokiny i chemokiny oraz metabolity1. Spośród tych sygnałów TCR ma szczególne znaczenie, ponieważ zapewnia charakterystyczną specyficzność, która określa rolę limfocytów T w odporności adaptacyjnej. TCR oddziałuje z liniowymi antygenami peptydowymi prezentowanymi przez cząsteczki MHC (ludzki ortolog HLA) (kompleksy pMHC) w wysoce specyficzny i czuły sposób, aby dostarczyć sygnały, które inicjują funkcję efektora limfocytów T. Parametry biochemiczne oddziaływań TCR z ligandami pMHC zapewniają nie tylko swoistość dla aktywacji limfocytów T, ale mają również jakościowy wpływ na późniejszą funkcję limfocytów T2. W związku z tym badanie funkcji limfocytów T często wymaga zbadania odpowiedzi klonalnych limfocytów T o określonej swoistości antygenowej.
Przedział ludzkich limfocytów T, zawierający około 1012limfocytów T αβ, zawiera około 107-10 8 różnych αβTCR3-4. Ten różnorodny repertuar daje możliwość rozpoznania szerokiej gamy peptydów potencjalnych patogenów, które wymagałyby odpowiedzi limfocytów T w celu uzyskania odporności ochronnej. Szacuje się, że częstość odpowiedzi limfocytów T na dany obcy antygen prezentowany przez samo-MHC jest rzędu 10-4-10-7 przy braku wcześniejszej odpowiedzi immunologicznej na ten antygen5. Repertuar naiwnych limfocytów T jest kształtowany przez selekcję grasicy, aby zapewnić zdolność do rozpoznawania antygenów peptydowych prezentujących własne MHC i ograniczać reaktywność przeciwko antygenom samopeptydowym, maksymalizując potencjalną użyteczność pośredniczenia w odporności ochronnej2. Jednakże, z naruszeniem tej zaprojektowanej reaktywności, stosunkowo duża częstotliwość, 10-3-10-4, limfocytów T od osób nieleczonych immunologicznie reaguje na stymulację komórkami allogenicznymi, rozpoznając zarówno obce cząsteczki MHC, jak i endogenne peptydy, które prezentują6. Rozpoznawanie allogenicznych ligandów pMHC jest strukturalnie podobne do rozpoznawania obcych antygenów prezentowanych przez samo-MHC; TCR zachodzi w krytycznych oddziaływaniach biochemicznych zarówno z allogeniczną cząsteczką MHC, jak i z prezentowanym peptydem7. Silny charakter odpowiedzi limfocytów T na stymulację allogeniczną wynika z różnorodności kompleksów pMHC obecnych na powierzchni komórek allogenicznych8. Szacuje się, że każdy MHC przedstawia około 2 x 104 różnych endogennych antygenów peptydowych9. Ten zakres odpowiedzi na stymulację allogeniczną jest istotnym aspektem klinicznie istotnej patologii, takiej jak odrzucenie przeszczepu allogenicznego lub choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), wynikająca z alloreaktywności limfocytów T.
Badanie alloreaktywnych odpowiedzi ludzkich limfocytów T tradycyjnie polegało na badaniu odpowiedzi poliklonalnych naiwnych limfocytów T po stymulacji komórkami allogenicznymi. Wielokrotna stymulacja tą samą allogeniczną linią komórkową w połączeniu z analizami rozcieńczeń ograniczających jest w stanie wygenerować klonalne limfocyty T ze zdefiniowanym rozpoznaniem allogenicznego HLA10. Podejście to jest jednak problematyczne w przypadku badania odpowiedzi na poszczególne allogeniczne ligandy pMHC, ponieważ duży i zróżnicowany repertuar endogennych kompleksów pMHC obecnych dla danego allogenicznego HLA stymuluje szeroki repertuar limfocytów T. To podejście polegające na masowej stymulacji populacji i ograniczaniu rozcieńczania wymagałoby badań przesiewowych dużej liczby klonów w celu wyizolowania limfocytów T o pożądanej reaktywności przeciwko pojedynczemu ligandowi pMHC. Ponadto częstość reakcji limfocytów T na pojedynczy allogeniczny ligand pMHC jest stosunkowo niska wśród naiwnych populacji komórek T, co stanowi barierę dla wydajnego generowania klonów ludzkich limfocytów T reagujących na dany antygen.
Identyfikacja i izolacja specyficznych dla antygenu limfocytów T z populacji poliklonalnych została umożliwiona dzięki rozwojowi znakowanych fluoroforem multimerów pMHC11. Podejście to wykorzystuje specyficzne antygeny peptydowe załadowane do rekombinowanych, rozpuszczalnych, biotynylowanych cząsteczek MHC, które są znakowane przez wiązanie się z fluoroforem znakowanym streptawidyną. Multimeryzacja pMHC zwiększa awidność, kompensując wewnętrznie niskie (μM) powinowactwo TCR do rozpuszczalnych ligandów pMHC. Znakowane komórki można zidentyfikować i wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak podejście to jest nadal ograniczone przez niską częstość limfocytów T specyficznych dla antygenu wśród naiwnych populacji limfocytów T, które są zwykle o rzędy wielkości mniejsze niż granica dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji na większości cytometrów przepływowych. Aby rozwiązać ten problem, opracowano metodę znakowania tetramerów pMHC, a następnie wzbogacania kulek magnetycznych dla komórek znakowanych tetramerem12. Metoda ta wykazała wiarygodne wykrywanie, wyliczanie i izolację limfocytów T specyficznych dla antygenu o niskiej częstotliwości.
Ten protokół opisuje skuteczny protokół generowania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na indywidualne allogeniczne ligandy pMHC. W protokole zastosowano znakowanie i wzbogacanie multimerów pMHC (HLA) w celu izolacji ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z sortowaniem komórek metodą cytometrii przepływowej oraz solidną metodą hodowli in vitro ludzkich komórek T w celu umożliwienia produkcji klonów komórek T z pojedynczych posortowanych komórek (przegląd na rysunku 1).

<table><tbody><tr><td>Probówka do pobierania krwi żylnej heparyny sodowej 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rozeta Sep Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>PBS firmy Dulbecco, 1x bez Ca lub Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejSigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Znakowany fluoroforem tetramer pMHC</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wyboru biotyny EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>Magnes selekcyjny EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Ludzkie rozwiązanie</td> <td>blokujące FcBiolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (klon UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (klon HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td> Anti-CD19 FITC (klon HIB19)Biolegend 302205 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM, bez b-ME i L-glutaminy</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Corning</td><td></td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB, dawca męski</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ludzki T-Aktywator CD3/CD28</td><td>Life Technologie</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td>do sortowania komórek</tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr>Pożywka <td></td><td></td><td></td>do<td>hodowli ludzkich limfocytów</td></tr><tr><td>T Iscove's DMEM</td><td>351,6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie ludzka surowica AB</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg/ml)</td><td>0,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol (14,3 M)</td><td>1,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2 (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie ludzkich limfocytów t specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Badanie biologii ludzkich limfocytów T często obejmuje badanie reakcji na aktywację ligandów. Limfocyty T rozpoznają i reagują na przetworzone antygeny peptydowe prezentowane przez cząsteczki MHC (human ortholog HLA) przez receptor limfocytów T (TCR) w bardzo czuły i specyficzny sposób. Podczas gdy podstawową funkcją limfocytów T jest pośredniczenie w ochronnych odpowiedziach immunologicznych na obce antygeny prezentowane przez samo-MHC, limfocyty T silnie reagują na różnice antygenowe w tkankach allogenicznych. Odpowiedzi limfocytów T na alloantygeny można opisać jako alloreaktywność bezpośrednią lub pośrednią. W alloreaktywności limfocyt T reaguje poprzez wysoce specyficzne rozpoznawanie zarówno prezentowanego peptydu, jak i cząsteczki MHC. Silna odpowiedź oligoklonalna limfocytów T na stymulację allogeniczną odzwierciedla dużą liczbę potencjalnie stymulujących alloantygenów obecnych w tkankach allogenicznych. Chociaż zakres alloreaktywnych odpowiedzi limfocytów T jest ważnym czynnikiem inicjującym i pośredniczącym w patologii związanej z biologicznie istotnymi odpowiedziami alloreaktywnymi, takimi jak choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i odrzucenie przeszczepu allogenicznego, może to wykluczać analizę odpowiedzi limfocytów T na ligandy allogeniczne. W tym celu protokół ten opisuje metodę generowania alloreaktywnych limfocytów T z naiwnych ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL), które reagują na znane alloantygeny peptydowo-MHC (pMHC). W protokole stosuje się znakowanie multimerem pMHC, wzbogacanie kulkami magnetycznymi i cytometrię przepływową do metod hodowli in vitro pojedynczych komórek w celu wytworzenia klonów limfocytów T specyficznych dla alloantygenu. Umożliwia to badania biochemii i funkcji limfocytów T reagujących na stymulację allogeniczną.

Niniejszy protokół opisuje generowanie klonalnych kultur ludzkich limfocytów T o określonej swoistości wobec alloantygenów za pomocą strategii wzbogacania za pomocą kulek magnetycznych i sortowania przepływowego pojedynczych komórek. Rysunek 1 przedstawia schemat tego procesu.
<img alt="Schemat procesu wzbogacania limfocytów T; cytometria przepływowa, hodowle klonalne, testowanie swoistości alloantygenowej." src="/files/ftp_upload/52257/52...

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja, wyizolowanie i sklonowanie ludzkich limfocytów T o określonej swoistości allo antygenu. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie limfocytów T z całej krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. W drugim etapie limfocyty T specyficzne dla alloantygenu są znakowane sprzężonym peptydem Fluor four, HLA, tetramerami i wzbogacane przez separację magnetyczną.Następnie znakowane limfocyty T izoluje się za pomocą sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej pojedynczej komórki. Na koniec hodowle pojedynczych komórek są stymulowane przeciwciałami anty CD 3 i anty CD 25. Ostatecznie reaktywność allo limfocytów T specyficznych dla antygenu można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi technikami, takimi jak stymulacja limfocytów masowych i ograniczanie rozcieńczenia, jest to, że technika ta umożliwia generowanie klonów komórek T o specyficznej reaktywności na dobrze zdefiniowane antygeny allo. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności z hodowlą i ekspansją klonów komórek T. Wymaga to starannego codziennego monitorowania kultur przed

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wzrost ludzkich allocentrycznych komórek T z krwi obwodowej

W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Naucz się wytwarzać ludzkie limfocyty T specyficzne dla alloantygenu z krwi obwodowej. Ta metoda pozwala na izolację i klonowanie komórek o określonej specyficzności alloantygenu.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów