Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja, wyizolowanie i sklonowanie ludzkich limfocytów T o określonej swoistości allo antygenu. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie limfocytów T z całej krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. W drugim etapie limfocyty T specyficzne dla alloantygenu są znakowane sprzężonym peptydem Fluor four, HLA, tetramerami i wzbogacane przez separację magnetyczną.

Następnie znakowane limfocyty T izoluje się za pomocą sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej pojedynczej komórki. Na koniec hodowle pojedynczych komórek są stymulowane przeciwciałami anty CD 3 i anty CD 25. Ostatecznie reaktywność allo limfocytów T specyficznych dla antygenu można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi technikami, takimi jak stymulacja limfocytów masowych i ograniczanie rozcieńczenia, jest to, że technika ta umożliwia generowanie klonów komórek T o specyficznej reaktywności na dobrze zdefiniowane antygeny allo. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności z hodowlą i ekspansją klonów komórek T. Wymaga to starannego codziennego monitorowania kultur przed rozpoczęciem zabiegu.

Podziel cztery mililitry gradientu gęstości temperatury pokojowej na dwie do czterech sterylnych stożkowych probówek wirówek o pojemności 15 mililitrów, użyj 70% etanolu, aby wytrzeć zewnętrzną stronę jednej lub dwóch wypełnionych zielonych probówek do pobierania krwi zawierających krew od zdrowego ochotnika, a następnie ostrożnie usuń wierzchołki, zdekantuj krew do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej, a następnie ponownie zapełnić każdą probówkę zbiorczą 10 mililitrami PBS. Połączyć popłuczyny z zdekantowaną krwią pełną i delikatnie wymieszać roztwór, a następnie inkubować komórki z 25 mikrolitrami koktajlu wzbogacającego ludzkie limfocyty T na dwa mililitry całkowitej objętości rozcieńczonej krwi. Po 20 minutach użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie nałożyć do 10 mililitrów krwi na podłoże o gradiencie gęstości, uważając, aby nie naruszyć powierzchni gradientu.

Odwiruj komórki przez 10 minut, a następnie użyj pięciomililitrowej pipety, aby ostrożnie przenieść warstwę leukocytów z granicy gradientu gęstości i rozcieńczonego osocza do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Doprowadzić objętość pobranych limfocytów krwi obwodowej do 50 mililitrów za pomocą PBS i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową. Następnie policz komórki i usuń jednomililitrową porcję do analizy.

Następnie, po odwirowaniu rezyny komórek, zawiesić granulki w jednym mililitrze bufora cytometrii przepływowej i wymieszać 50 mikrolitrów rozcieńczonego tetrameru peptydu alloantygenu MHC z zawiesiną komórki. Przenieś komórki do sterylnej pięciomililitrowej probówki, a następnie po 30 minutach umyj komórki w dwóch mililitrach buforu sortującego. Zawieś podniebienie w 100 mikrolitrach buforu sortującego, a następnie inkubuj komórki w 10 mikrolitrach koktajlu selekcyjnego biotyny przez 15 minut.

Następnie inkubuj komórki w pięciu mikrolitrach cząstek magnetycznych przez 10 minut, a następnie delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek z 2,5 mililitra buforu sortującego. Usunąć 100 mikrolitrów podwielokrotności analizy komórek wzbogacających preen, a następnie umieścić probówkę w magnesie do separacji komórek. Po pięciu minutach przytrzymaj probówkę i magnes razem i przelej zawartość do świeżej pięciomililitrowej probówki.

Następnie wyjmij rurkę z magnesu i umyj komórki w dwóch mililitrach buforu sortującego, ponownie zawieś osad w buforze do sortowania na zimno i podziel komórki na dwa mililitry buforu do sortowania na zimno na typ próbki. Po ponownym odwirowaniu próbek, ponownie zawiesić granulki w 25 mikrolitrach buforu do sortowania na zimno i inkubować komórki w pięciu mikrolitrach ludzkiego bloku FC na lodzie przez 20 minut. Następnie inkubuj probówki z 20 mikrolitrami odpowiedniego koktajlu przeciwciał.

Po 20 minutach umyj komórki w dwóch kolejnych mililitrach buforu do sortowania na zimno i ponownie zawieś granulki w ilości od jednego do 2 milionów komórek na mililitr. W większym buforze niż podwielokrotność 100 mikrolitrów pożywki do hodowli ludzkich komórek T do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórek o okrągłym dnie i przechowywać płytkę na lodzie do czasu zakończenia sortowania. Po posortowaniu odwirować płytkę, a następnie umieścić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 6% CO2.

Następnie wymieszaj odpowiednią objętość kulek aktywatora poprzez wirowanie i przenieś odpowiednią objętość kulek do sterylnej pięciomililitrowej probówki. Po umyciu kulek na magnesie zdekantować roztwór myjący i dodać do probówki 100 mikrolitrów hodowli ludzkich komórek T, pożywkę na 0,5 mikrolitra mikrogranulek. Następnie podamulować 100 mikrolitrów zawiesiny kulki aktywatora do każdego dołka płytki 96-dołkowej i zwrócić komórki do inkubatora.

Małe skupiska proliferujących komórek można obserwować pod mikroskopem po pięciu do siedmiu dniach hodowli, 14 dni po izolacji komórek. Ostrożnie zastąp 100 mikrolitrów pożywki z górnej części kultur 100 mikrolitrami świeżej hodowli ludzkich komórek T. Średnio duże skupiska komórek powinny być widoczne pod mikroskopem dwa do trzech dni po karmieniu, makroskopowo granulki komórkowe powinny stać się widoczne w ciągu 14 dni po zmianie pożywki.

Po 28 dniach od izolacji komórek przenieś całą objętość 200 mikrolitrów kultur dodatnich pod względem wzrostu do indywidualnych dołków 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 200 mikrolitrów pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Następnie dodaj 12,5 mikrolitra stymulujących mikrogranulek anty CD 3, anty CD 28 w 100 mikrolitrach pożywki do hodowli ludzkich komórek T i włóż płytkę z powrotem do inkubatora trzy do pięciu dni po ponownej stymulacji. Pożywka powinna zacząć zmieniać kolor na słomkowożółty.

W tym momencie przenieś kultury do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i dodaj 500 mikrolitrów pożywki z ludzkich komórek T do każdej hodowli. Na koniec, po 10 do 14 dniach od ponownej stymulacji, zbierz 200 mikrolitrów każdej hodowli komórek T, aby ocenić ich specyficzność allo antygenu za pomocą analizy cytometrii przepływowej ich peptydu. Wiązanie tetrameru MHC: Oczekiwana wydajność limfocytów T specyficznych dla alloantygenu będzie zależeć od dawcy, zastosowanego antygenu allo i odpowiedniej częstości reaktywnych limfocytów T u dawcy.

Na przykład przeciętny zdrowy dawca będzie miał od 4 500 000 do 10 milionów leukocytów na mililitr krwi, z czego około 20% to limfocyty T. Te wykresy kropkowe ilustrują wyniki pomiaru wiązania limfocytów T od dawcy HLAD z czterema ujemnymi do określonego antygenu allo. Na przykład w tym eksperymencie obliczono częstość jednego na 4 776 limfocytów T specyficznych dla antygenu allo z początkowej liczby 20 milionów leukocytów z tej początkowej populacji komórek.

88 pojedynczych limfocytów T znakowanych temerem udało się wyizolować, a następnie po dwóch rundach stymulacji i hodowli mikrogranulek, dwie kultury dodatnie pod względem wzrostu zidentyfikowano za pomocą badania mikroskopowego, a ich specyficzność alloantygenu oceniono, badając ich wiązanie A 2 30 48 HLA DR. Cztery tetramery. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o codziennym monitorowaniu kultur komórkowych, aby zapobiec śmierci komórek i ich przerostowi. Po tej procedurze klony limfocytów T można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak badanie biochemii rozpoznawania ligandów allogenicznych i tego, jak przekłada się to na skuteczne odpowiedzi immunologiczne.