Name: Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Naucz się wytwarzać ludzkie limfocyty T specyficzne dla alloantygenu z krwi obwodowej. Ta metoda pozwala na izolację i klonowanie komórek o określonej specyficzności alloantygenu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować NIH Tetramer Core Facility za produkcję tetrameru. Autor pragnie również podziękować E.D. O'Connorowi i K.E. Marquezowi z laboratorium cytometrii przepływowej UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility za pomoc w sortowaniu komórek. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

UWAGA: Ten protokół wymaga użycia próbek krwi obwodowej od ochotników. Wszystkie badania z udziałem ludzi powinny zostać zweryfikowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną ds. Badań nad Ludźmi w celu zapewnienia zgodności z Deklaracją Helsińską (2013) oraz Ustawą o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych z 1996 r.
1. Izolacja limfocytów T z krwi pełnej
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem podgrzej podłoże o gradiencie gęstości do temperatury pokojowej. Podaniec 4 ml pożywki o gradiencie gęstości do 2-4 sterylnych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml (1 probówka zostanie użyta na każde 10 ml całkowitej objętości rozcieńczonej krwi).</li>
	<li>Pobrać 10-20 ml krwi w 1-2 probówkach do pobierania krwi żylnej pokrytych heparyną sodową w sprayu (z zieloną górą). Zbieraj próbki ludzkie pod nadzorem przeszkolonych osób i zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną.</li>
	<li>Przetrzyj zewnętrzną część tub 70% etanolem. Ostrożnie zdjąć górną część napełnionych probówek zbiorczych i zdekantować krew do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej probówki do pobierania krwi. Zebrać PBS, dodać do zdekantowanej krwi pełnej i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 25 μl koktajlu wzbogacającego ludzkie limfocyty T / 2 ml całkowitej objętości. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie nałożyć do 10 ml krwi rozcieńczonej w stosunku 1:1 na podłoże o gradiencie gęstości. Uważaj, aby nie naruszyć powierzchni ośrodka o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Odwirować warstwową krew i pożywkę o gradiencie gęstości o sile 1 200 x g przez 20 minut w temperaturze 20 oC.</li>
	<li>Wyjąć probówki z wirówki, uważając, aby nie zakłócić granicy faz między pożywką o gradinie gęstości a warstwą leukocytów na granicy faz między pożywką o gradiencie gęstości a rozcieńczonym osoczem. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml ostrożnie zebrać warstwę leukocytów i przenieść do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać PBS, aby doprowadzić objętość zebranego PBL do 50 ml i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Zdekantować.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w 10 ml sterylnego buforu sortującego do cytometrii przepływowej (sterylnie przefiltrowany PBS zawierający 1% BSA). Pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórkowej, rozcieńczyć w stosunku 1:10 (dodać do 90 μl) błękitu trypanowego, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru (oczekiwana wydajność 1 – 4 x 106 komórek / probówka krwi pełnej).
	<ol>
		<li>Usunąć 1 ml podwielokrotności, przenieść do probówki o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do analizy limfocytów T nieznakowanych tetramerem. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Magnetyczne wzbogacanie limfocytów T specyficznych dla alloantygenu
<ol>
	<li>Rozcieńczyć tetramer alloantygenu pMHC w stosunku 1:100 w sterylnym buforze sortującym.</li>
	<li>Zawiesinę komórek wirówki (9 ml od kroku 1.11) w dawce 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Zdekantować.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego tetrameru alloantygenu pMHC do komórek granulowanych (do 10,7 komórek). Wymieszać delikatnie pipetując. Przenieść do sterylnej probówki o pojemności 5 ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu sortującego. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Zdekantować.</li>
	<li>Zawieś komórki w buforze sortującym o pojemności 100 μl. Dodaj 10 μl koktajlu Biotin Selection i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 5 μl nanocząstek magnetycznych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml buforu do sortowania i delikatnie wymieszać, pipetując. Usunąć 100 μl podwielokrotności, przenieść do probówki o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do analizy komórek wstępnie wzbogacających.</li>
	<li>Umieścić probówkę o pojemności 5 ml zawierającą zawiesinę komórek w magnesie do separacji komórek. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, przelej zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki, aby usunąć ostatnie krople płynu.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z magnesu. Dodać 2 ml buforu do sortowania na zimno i delikatnie wymieszać pipetując. Pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórek, rozcieńczyć w stosunku 1:2 (dodać do 10 μl) błękitu trypanowego, aby zliczyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
3. Przygotowanie limfocytów T do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej jednokomórkowej
<ol>
	<li>Dodać bufor do sortowania na zimno do wszystkich probówek komórek (tetramer nieznakowany, znakowany tetramerem niewzbogacony i wzbogacony znakowany tetramerem), aby zwiększyć objętość do 3 ml.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC i zdekantować bufor w celu odzyskania komórek.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w 25 μl bufora do sortowania na zimno. Dodaj 5 μl ludzkiego bloku Fc. Inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Przygotuj przeciwciała do sortowania metodą cytometrii przepływowej. Wymieszaj 15 μl buforu sortującego, 15 μl anty-CD5, 15 μl anty-CD14 i 15 μl anty-CD19.</li>
	<li>Dodać 20 μl mieszaniny przeciwciał do każdej probówki z komórkami. Inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu do sortowania na zimno do każdej probówki.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC i zdekantować bufor w celu odzyskania komórek.</li>
	<li>Zawiesić komórki w stężeniu 1 -2 x 106 komórek/ml w buforze sortującym.</li>
	<li>Podać 100 μl pożywki do hodowli ludzkich komórek T (DMEM Iscove'a uzupełniony 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 μg/ml gentamycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB i 2,5 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-2) do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórek z okrągłym dnem. Trzymaj na lodzie.</li>
</ol>
4. Izolacja limfocytów T znakowanych tetramerem za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Ustal parametry bramkowania cytometrii przepływowej w celu identyfikacji limfocytów T znakowanych tetramerem alloantygenu-pMHC (ryc. 2.A). Użyj frakcji znakowanej tetramerem przed wzbogaceniem, aby ustalić strategie bramkowania w celu wyeliminowania dubletów, bramki na limfocytach, wykluczenia limfocytów z ekspresją CD19 i monocytów z ekspresją CD14 oraz identyfikacji limfocytów T na podstawie ekspresji CD5. Użyj próbki, która nie jest znakowana tetramerem, jako fluorescencji minus jedna kontrola, aby ustalić bramkowanie w celu identyfikacji limfocytów T wiążących tetramery (przy czym 0% komórek CD5 + CD14-CD19 z próbki nieznakowanej tetramerem powinno mieścić się w tej bramce). 
	UWAGA: Strategie bramkowania, które nie są odpowiednio rygorystyczne, spowodują izolację limfocytów innych niż T lub limfocytów T, które nie są specyficzne dla antygenu, podczas gdy zbyt restrykcyjne strategie bramkowania zmniejszą liczbę izolowanych limfocytów T.</li>
	<li>Zaprogramuj parametry płytki dla sortowania pojedynczych komórek. Skieruj sorter tak, aby umieścił 1 komórkę CD5 + CD14-CD19-tetramer + w każdym dołku. Skierować zestaw płytek tak, aby zawierały 1 studzienkę kontroli ujemnej (żadne komórki nie zostały posortowane w studzince) i 1 studzienkę kontroli dodatniej (100 komórek tetramerowych CD5 + CD14-CD19) w każdym rzędzie (rysunek 2.B).</li>
	<li>Korzystając z ustalonej strategii bramkowania cytometrii przepływowej i konfiguracji płytki, wyizoluj poszczególne limfocyty T wiążące tetramery bezpośrednio na 96-dołkowej płytce za pomocą sortera komórek cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Hodowla i ekspansja klonów limfocytów T specyficznych dla alloantygenu
<ol>
	<li>Po zakończeniu sortowania komórek, odwirować płytkę o masie 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 oC. Umieścić płytkę hodowlaną w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
	<li>Mikrogranulki anty-CD3/anty-CD28 stymulujące wirowo przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia kulek.</li>
	<li>Obliczyć objętość kulek aktywatora potrzebną do stymulacji pobranych limfocytów T (0,5 μl mikrokulek aktywatora / studzienkę). Przenieś obliczoną objętość kulek stymulatora do sterylnej probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml pożywki do hodowli ludzkich limfocytów T i odwirować.</li>
	<li>Umieść rurkę z zawieszeniem mikrokulek w magnesie. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, przelej zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z magnesu. Dodać pożywkę do hodowli ludzkich limfocytów T (początkowo dodano 100 μl pożywki / 0,5 μl mikrogranulek).</li>
	<li>Podwielokrotność 100 μl zawiesiny kulki aktywatora do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
	<li>Codziennie monitoruj wzrost komórek za pomocą badania mikroskopowego. Małe skupiska proliferujących komórek można obserwować pod mikroskopem po 5 – 7 dniach hodowli (ryc. 3.A). 
	UWAGA: Wizualizacja kultur komórek T w tym momencie może być trudna, a brak obserwowalnych klastrów komórkowych na tym etapie może nie wskazywać na brak rosnących limfocytów T.</li>
	<li>Po 14 dniach od izolacji komórek należy karmić hodowle, ostrożnie usuwając 100 μl pożywki z wierzchu hodowli i zastępując ją 100 μl świeżej pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Kontynuować inkubację płytki hodowlanej w temperaturze 37 oC w inkubatorze z 6% CO2 .</li>
	<li>Codziennie monitoruj wzrost komórek za pomocą badania mikroskopowego i oceny koloru pożywki hodowlanej. Duże skupiska komórek powinny być widoczne pod mikroskopem 2 – 3 dni po zmianie podłoża. Makroskopowo osady komórkowe powinny stać się widoczne w ciągu 14 dni po zmianie pożywki.</li>
	<li>Po 28 dniach od izolacji komórek zidentyfikuj rosnące klony za pomocą badania mikroskopowego. Przenieść objętość 200 μl 96-dołkowych kultur płytkowych z dodatnim wzrostem do indywidualnych dołków 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 200 μl pożywki do hodowli ludzkich limfocytów T.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawierających 12,5 μl stymulujących mikrogranulek anty-CD3/anty-CD28 (przygotowanych w sposób opisany w punktach 5.2 – 5.6). Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
	<li>Codziennie monitoruj wzrost kultury za pomocą badania mikroskopowego i oceny koloru pożywki hodowlanej. Gdy hodowla limfocytów T osiągnie >2x106/ml (zwykle 3-5 dni po ponownej stymulacji, można oszacować na dzień, w którym pożywka zaczyna zmieniać kolor na słomkowożółty), przenieś hodowlę do dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i dodaj 500 μl pożywki z ludzkich komórek T.</li>
	<li>Po 10-14 dniach od ponownej stymulacji należy pobrać 200 μl hodowli limfocytów T w celu oceny swoistości alloantygenu za pomocą analizy cytometrii przepływowej wiązania tetrameru pMHC (przy użyciu strategii znakowania i bramkowania opisanej w sekcjach 3 i 4.1).</li>
</ol>
6. Długotrwała restymulacja i hodowla klonów limfocytów T
<ol>
	<li>Ciągłe ponowne stymulowanie i rozszerzanie klonalnych hodowli komórek T o pożądanej swoistości może odbywać się co 14 dni. Zebrać hodowle limfocytów T do sterylnej probówki o pojemności 5 ml w 14 dniu po ostatniej stymulacji mikrokulkami anty-CD3/CD28. Połącz wiele dołków tego samego klonu limfocytów T w jednej probówce, do objętości 2,5 ml.</li>
	<li>Dodać pożywkę, aby doprowadzić końcową objętość do 2,5 ml i delikatnie wymieszać, pipetując.</li>
	<li>Umieść probówkę o pojemności 5 ml zawierającą hodowlę limfocytów T w magnesie do separacji komórek, aby usunąć stare mikrogranulki z hodowli. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, zdekantuj zawiesinę komórek do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki, aby usunąć ostatnie krople płynu.</li>
	<li>Dodać pożywkę, aby doprowadzić końcową objętość do 4 ml. Pobrać próbkę 10 μl, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odzyskać limfocyty T przez odwirowanie przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dekantacja supernatantu. Zawiesić limfocyty T w 106 komórkach / ml pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Przenieść 1 ml podwielokrotności do każdego dołka z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Ponownie stymulować limfocyty T, dodając 100 μl pożywki zawierającej 12,5 μl stymulujących mikrogranulek anty-CD3/anty-CD28 (jak opisano w punktach 5.2 – 5.6). Inkubować w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO2 .</li>
</ol>

<ol><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li>
<li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li>
<li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+estimation+of+the+human+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li>
<li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+%CE%B2-chain+diversity+in+%CE%B1%CE%B2+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+T-cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li>
<li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li>
<li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+APCs%2C+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%2B+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li>
<li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li>
<li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection%2C+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li>
<li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li>
<li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Alloreaktywność limfocytów T jest zjawiskiem od dawna badanym i istotnym klinicznie. Silna odpowiedź proliferacyjna i efektorowa limfocytów T na stymulację allogeniczną umożliwiła szeroko zakrojone analizy odpowiedzi ludzkich limfocytów T in vitro poprzez stosunkowo proste reakcje limfocytów mieszanych limfocytów krwi obwodowej przeciwko inaktywowanym komórkom allogenicznym. Jednak te pierwotne alloreaktywne odpowiedzi limfocytów T są oligoklonalne, składające się z dużej liczby pojedynczych limfocytów T reagują...

T limfocyty są kluczowymi składnikami adaptacyjnego układu odpornościowego. Limfocyty T są odpowiedzialne nie tylko za bezpośrednie pośredniczenie w ochronnych odpowiedziach immunologicznych na patogeny poprzez różne mechanizmy efektorowe, ale także za aktywne utrzymywanie samotolerancji immunologicznej i kierowanie odpowiedziami innych komórek w układzie odpornościowym. Funkcje te są kierowane przez szereg zintegrowanych sygnałów, w tym ligację receptora limfocytów T (TCR), cytokiny i chemokiny oraz metabolity1. Spośród tych sygnałów TCR ma szczególne znaczenie, ponieważ zapewnia charakterystyczną specyficzność, która określa rolę limfocytów T w odporności adaptacyjnej. TCR oddziałuje z liniowymi antygenami peptydowymi prezentowanymi przez cząsteczki MHC (ludzki ortolog HLA) (kompleksy pMHC) w wysoce specyficzny i czuły sposób, aby dostarczyć sygnały, które inicjują funkcję efektora limfocytów T. Parametry biochemiczne oddziaływań TCR z ligandami pMHC zapewniają nie tylko swoistość dla aktywacji limfocytów T, ale mają również jakościowy wpływ na późniejszą funkcję limfocytów T2. W związku z tym badanie funkcji limfocytów T często wymaga zbadania odpowiedzi klonalnych limfocytów T o określonej swoistości antygenowej.
Przedział ludzkich limfocytów T, zawierający około 1012limfocytów T αβ, zawiera około 107-10 8 różnych αβTCR3-4. Ten różnorodny repertuar daje możliwość rozpoznania szerokiej gamy peptydów potencjalnych patogenów, które wymagałyby odpowiedzi limfocytów T w celu uzyskania odporności ochronnej. Szacuje się, że częstość odpowiedzi limfocytów T na dany obcy antygen prezentowany przez samo-MHC jest rzędu 10-4-10-7 przy braku wcześniejszej odpowiedzi immunologicznej na ten antygen5. Repertuar naiwnych limfocytów T jest kształtowany przez selekcję grasicy, aby zapewnić zdolność do rozpoznawania antygenów peptydowych prezentujących własne MHC i ograniczać reaktywność przeciwko antygenom samopeptydowym, maksymalizując potencjalną użyteczność pośredniczenia w odporności ochronnej2. Jednakże, z naruszeniem tej zaprojektowanej reaktywności, stosunkowo duża częstotliwość, 10-3-10-4, limfocytów T od osób nieleczonych immunologicznie reaguje na stymulację komórkami allogenicznymi, rozpoznając zarówno obce cząsteczki MHC, jak i endogenne peptydy, które prezentują6. Rozpoznawanie allogenicznych ligandów pMHC jest strukturalnie podobne do rozpoznawania obcych antygenów prezentowanych przez samo-MHC; TCR zachodzi w krytycznych oddziaływaniach biochemicznych zarówno z allogeniczną cząsteczką MHC, jak i z prezentowanym peptydem7. Silny charakter odpowiedzi limfocytów T na stymulację allogeniczną wynika z różnorodności kompleksów pMHC obecnych na powierzchni komórek allogenicznych8. Szacuje się, że każdy MHC przedstawia około 2 x 104 różnych endogennych antygenów peptydowych9. Ten zakres odpowiedzi na stymulację allogeniczną jest istotnym aspektem klinicznie istotnej patologii, takiej jak odrzucenie przeszczepu allogenicznego lub choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), wynikająca z alloreaktywności limfocytów T.
Badanie alloreaktywnych odpowiedzi ludzkich limfocytów T tradycyjnie polegało na badaniu odpowiedzi poliklonalnych naiwnych limfocytów T po stymulacji komórkami allogenicznymi. Wielokrotna stymulacja tą samą allogeniczną linią komórkową w połączeniu z analizami rozcieńczeń ograniczających jest w stanie wygenerować klonalne limfocyty T ze zdefiniowanym rozpoznaniem allogenicznego HLA10. Podejście to jest jednak problematyczne w przypadku badania odpowiedzi na poszczególne allogeniczne ligandy pMHC, ponieważ duży i zróżnicowany repertuar endogennych kompleksów pMHC obecnych dla danego allogenicznego HLA stymuluje szeroki repertuar limfocytów T. To podejście polegające na masowej stymulacji populacji i ograniczaniu rozcieńczania wymagałoby badań przesiewowych dużej liczby klonów w celu wyizolowania limfocytów T o pożądanej reaktywności przeciwko pojedynczemu ligandowi pMHC. Ponadto częstość reakcji limfocytów T na pojedynczy allogeniczny ligand pMHC jest stosunkowo niska wśród naiwnych populacji komórek T, co stanowi barierę dla wydajnego generowania klonów ludzkich limfocytów T reagujących na dany antygen.
Identyfikacja i izolacja specyficznych dla antygenu limfocytów T z populacji poliklonalnych została umożliwiona dzięki rozwojowi znakowanych fluoroforem multimerów pMHC11. Podejście to wykorzystuje specyficzne antygeny peptydowe załadowane do rekombinowanych, rozpuszczalnych, biotynylowanych cząsteczek MHC, które są znakowane przez wiązanie się z fluoroforem znakowanym streptawidyną. Multimeryzacja pMHC zwiększa awidność, kompensując wewnętrznie niskie (μM) powinowactwo TCR do rozpuszczalnych ligandów pMHC. Znakowane komórki można zidentyfikować i wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak podejście to jest nadal ograniczone przez niską częstość limfocytów T specyficznych dla antygenu wśród naiwnych populacji limfocytów T, które są zwykle o rzędy wielkości mniejsze niż granica dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji na większości cytometrów przepływowych. Aby rozwiązać ten problem, opracowano metodę znakowania tetramerów pMHC, a następnie wzbogacania kulek magnetycznych dla komórek znakowanych tetramerem12. Metoda ta wykazała wiarygodne wykrywanie, wyliczanie i izolację limfocytów T specyficznych dla antygenu o niskiej częstotliwości.
Ten protokół opisuje skuteczny protokół generowania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na indywidualne allogeniczne ligandy pMHC. W protokole zastosowano znakowanie i wzbogacanie multimerów pMHC (HLA) w celu izolacji ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z sortowaniem komórek metodą cytometrii przepływowej oraz solidną metodą hodowli in vitro ludzkich komórek T w celu umożliwienia produkcji klonów komórek T z pojedynczych posortowanych komórek (przegląd na rysunku 1).

<table><tbody><tr><td>Probówka do pobierania krwi żylnej heparyny sodowej 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rozeta Sep Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>PBS firmy Dulbecco, 1x bez Ca lub Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejSigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Znakowany fluoroforem tetramer pMHC</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wyboru biotyny EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>Magnes selekcyjny EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Ludzkie rozwiązanie</td> <td>blokujące FcBiolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (klon UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (klon HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td> Anti-CD19 FITC (klon HIB19)Biolegend 302205 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM, bez b-ME i L-glutaminy</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Corning</td><td></td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB, dawca męski</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ludzki T-Aktywator CD3/CD28</td><td>Life Technologie</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td>do sortowania komórek</tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr>Pożywka <td></td><td></td><td></td>do<td>hodowli ludzkich limfocytów</td></tr><tr><td>T Iscove's DMEM</td><td>351,6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie ludzka surowica AB</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg/ml)</td><td>0,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol (14,3 M)</td><td>1,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2 (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie ludzkich limfocytów t specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Badanie biologii ludzkich limfocytów T często obejmuje badanie reakcji na aktywację ligandów. Limfocyty T rozpoznają i reagują na przetworzone antygeny peptydowe prezentowane przez cząsteczki MHC (human ortholog HLA) przez receptor limfocytów T (TCR) w bardzo czuły i specyficzny sposób. Podczas gdy podstawową funkcją limfocytów T jest pośredniczenie w ochronnych odpowiedziach immunologicznych na obce antygeny prezentowane przez samo-MHC, limfocyty T silnie reagują na różnice antygenowe w tkankach allogenicznych. Odpowiedzi limfocytów T na alloantygeny można opisać jako alloreaktywność bezpośrednią lub pośrednią. W alloreaktywności limfocyt T reaguje poprzez wysoce specyficzne rozpoznawanie zarówno prezentowanego peptydu, jak i cząsteczki MHC. Silna odpowiedź oligoklonalna limfocytów T na stymulację allogeniczną odzwierciedla dużą liczbę potencjalnie stymulujących alloantygenów obecnych w tkankach allogenicznych. Chociaż zakres alloreaktywnych odpowiedzi limfocytów T jest ważnym czynnikiem inicjującym i pośredniczącym w patologii związanej z biologicznie istotnymi odpowiedziami alloreaktywnymi, takimi jak choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i odrzucenie przeszczepu allogenicznego, może to wykluczać analizę odpowiedzi limfocytów T na ligandy allogeniczne. W tym celu protokół ten opisuje metodę generowania alloreaktywnych limfocytów T z naiwnych ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL), które reagują na znane alloantygeny peptydowo-MHC (pMHC). W protokole stosuje się znakowanie multimerem pMHC, wzbogacanie kulkami magnetycznymi i cytometrię przepływową do metod hodowli in vitro pojedynczych komórek w celu wytworzenia klonów limfocytów T specyficznych dla alloantygenu. Umożliwia to badania biochemii i funkcji limfocytów T reagujących na stymulację allogeniczną.

Niniejszy protokół opisuje generowanie klonalnych kultur ludzkich limfocytów T o określonej swoistości wobec alloantygenów za pomocą strategii wzbogacania za pomocą kulek magnetycznych i sortowania przepływowego pojedynczych komórek. Rysunek 1 przedstawia schemat tego procesu.
<img alt="Schemat procesu wzbogacania limfocytów T; cytometria przepływowa, hodowle klonalne, testowanie swoistości alloantygenowej." src="/files/ftp_upload/52257/52...

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja, wyizolowanie i sklonowanie ludzkich limfocytów T o określonej swoistości allo antygenu. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie limfocytów T z całej krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. W drugim etapie limfocyty T specyficzne dla alloantygenu są znakowane sprzężonym peptydem Fluor four, HLA, tetramerami i wzbogacane przez separację magnetyczną.Następnie znakowane limfocyty T izoluje się za pomocą sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej pojedynczej komórki. Na koniec hodowle pojedynczych komórek są stymulowane przeciwciałami anty CD 3 i anty CD 25. Ostatecznie reaktywność allo limfocytów T specyficznych dla antygenu można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi technikami, takimi jak stymulacja limfocytów masowych i ograniczanie rozcieńczenia, jest to, że technika ta umożliwia generowanie klonów komórek T o specyficznej reaktywności na dobrze zdefiniowane antygeny allo. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności z hodowlą i ekspansją klonów komórek T. Wymaga to starannego codziennego monitorowania kultur przed rozpoczęciem zabiegu.Podziel cztery mililitry gradientu gęstości temperatury pokojowej na dwie do czterech sterylnych stożkowych probówek wirówek o pojemności 15 mililitrów, użyj 70% etanolu, aby wytrzeć zewnętrzną stronę jednej lub dwóch wypełnionych zielonych probówek do pobierania krwi zawierających krew od zdrowego ochotnika, a następnie ostrożnie usuń wierzchołki, zdekantuj krew do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej, a następnie ponownie zapełnić każdą probówkę zbiorczą 10 mililitrami PBS. Połączyć popłuczyny z zdekantowaną krwią pełną i delikatnie wymieszać roztwór, a następnie inkubować komórki z 25 mikrolitrami koktajlu wzbogacającego ludzkie limfocyty T na dwa mililitry całkowitej objętości rozcieńczonej krwi. Po 20 minutach użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie nałożyć do 10 mililitrów krwi na podłoże o gradiencie gęstości, uważając, aby nie naruszyć powierzchni gradientu.Odwiruj komórki przez 10 minut, a następnie użyj pięciomililitrowej pipety, aby ostrożnie przenieść warstwę leukocytów z granicy gradientu gęstości i rozcieńczonego osocza do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Doprowadzić objętość pobranych limfocytów krwi obwodowej do 50 mililitrów za pomocą PBS i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową. Następnie policz komórki i usuń jednomililitrową porcję do analizy.Następnie, po odwirowaniu rezyny komórek, zawiesić granulki w jednym mililitrze bufora cytometrii przepływowej i wymieszać 50 mikrolitrów rozcieńczonego tetrameru peptydu alloantygenu MHC z zawiesiną komórki. Przenieś komórki do sterylnej pięciomililitrowej probówki, a następnie po 30 minutach umyj komórki w dwóch mililitrach buforu sortującego. Zawieś podniebienie w 100 mikrolitrach buforu sortującego, a następnie inkubuj komórki w 10 mikrolitrach koktajlu selekcyjnego biotyny przez 15 minut.Następnie inkubuj komórki w pięciu mikrolitrach cząstek magnetycznych przez 10 minut, a następnie delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek z 2,5 mililitra buforu sortującego. Usunąć 100 mikrolitrów podwielokrotności analizy komórek wzbogacających preen, a następnie umieścić probówkę w magnesie do separacji komórek. Po pięciu minutach przytrzymaj probówkę i magnes razem i przelej zawartość do świeżej pięciomililitrowej probówki.Następnie wyjmij rurkę z magnesu i umyj komórki w dwóch mililitrach buforu sortującego, ponownie zawieś osad w buforze do sortowania na zimno i podziel komórki na dwa mililitry buforu do sortowania na zimno na typ próbki. Po ponownym odwirowaniu próbek, ponownie zawiesić granulki w 25 mikrolitrach buforu do sortowania na zimno i inkubować komórki w pięciu mikrolitrach ludzkiego bloku FC na lodzie przez 20 minut. Następnie inkubuj probówki z 20 mikrolitrami odpowiedniego koktajlu przeciwciał.Po 20 minutach umyj komórki w dwóch kolejnych mililitrach buforu do sortowania na zimno i ponownie zawieś granulki w ilości od jednego do 2 milionów komórek na mililitr. W większym buforze niż podwielokrotność 100 mikrolitrów pożywki do hodowli ludzkich komórek T do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórek o okrągłym dnie i przechowywać płytkę na lodzie do czasu zakończenia sortowania. Po posortowaniu odwirować płytkę, a następnie umieścić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 6% CO2.Następnie wymieszaj odpowiednią objętość kulek aktywatora poprzez wirowanie i przenieś odpowiednią objętość kulek do sterylnej pięciomililitrowej probówki. Po umyciu kulek na magnesie zdekantować roztwór myjący i dodać do probówki 100 mikrolitrów hodowli ludzkich komórek T, pożywkę na 0,5 mikrolitra mikrogranulek. Następnie podamulować 100 mikrolitrów zawiesiny kulki aktywatora do każdego dołka płytki 96-dołkowej i zwrócić komórki do inkubatora.Małe skupiska proliferujących komórek można obserwować pod mikroskopem po pięciu do siedmiu dniach hodowli, 14 dni po izolacji komórek. Ostrożnie zastąp 100 mikrolitrów pożywki z górnej części kultur 100 mikrolitrami świeżej hodowli ludzkich komórek T. Średnio duże skupiska komórek powinny być widoczne pod mikroskopem dwa do trzech dni po karmieniu, makroskopowo granulki komórkowe powinny stać się widoczne w ciągu 14 dni po zmianie pożywki.Po 28 dniach od izolacji komórek przenieś całą objętość 200 mikrolitrów kultur dodatnich pod względem wzrostu do indywidualnych dołków 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 200 mikrolitrów pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Następnie dodaj 12,5 mikrolitra stymulujących mikrogranulek anty CD 3, anty CD 28 w 100 mikrolitrach pożywki do hodowli ludzkich komórek T i włóż płytkę z powrotem do inkubatora trzy do pięciu dni po ponownej stymulacji. Pożywka powinna zacząć zmieniać kolor na słomkowożółty.W tym momencie przenieś kultury do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i dodaj 500 mikrolitrów pożywki z ludzkich komórek T do każdej hodowli. Na koniec, po 10 do 14 dniach od ponownej stymulacji, zbierz 200 mikrolitrów każdej hodowli komórek T, aby ocenić ich specyficzność allo antygenu za pomocą analizy cytometrii przepływowej ich peptydu. Wiązanie tetrameru MHC: Oczekiwana wydajność limfocytów T specyficznych dla alloantygenu będzie zależeć od dawcy, zastosowanego antygenu allo i odpowiedniej częstości reaktywnych limfocytów T u dawcy.Na przykład przeciętny zdrowy dawca będzie miał od 4 500 000 do 10 milionów leukocytów na mililitr krwi, z czego około 20% to limfocyty T. Te wykresy kropkowe ilustrują wyniki pomiaru wiązania limfocytów T od dawcy HLAD z czterema ujemnymi do określonego antygenu allo. Na przykład w tym eksperymencie obliczono częstość jednego na 4 776 limfocytów T specyficznych dla antygenu allo z początkowej liczby 20 milionów leukocytów z tej początkowej populacji komórek.88 pojedynczych limfocytów T znakowanych temerem udało się wyizolować, a następnie po dwóch rundach stymulacji i hodowli mikrogranulek, dwie kultury dodatnie pod względem wzrostu zidentyfikowano za pomocą badania mikroskopowego, a ich specyficzność alloantygenu oceniono, badając ich wiązanie A 2 30 48 HLA DR. Cztery tetramery. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o codziennym monitorowaniu kultur komórkowych, aby zapobiec śmierci komórek i ich przerostowi. Po tej procedurze klony limfocytów T można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak badanie biochemii rozpoznawania ligandów allogenicznych i tego, jak przekłada się to na skuteczne odpowiedzi immunologiczne.

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wzrost ludzkich allocentrycznych komórek T z krwi obwodowej

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Naucz się wytwarzać ludzkie limfocyty T specyficzne dla alloantygenu z krwi obwodowej. Ta metoda pozwala na izolację i klonowanie komórek o określonej specyficzności alloantygenu.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów