Name: Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę oceny właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu testów sferycznych. Technika ta pozwala dokładnie identyfikować populacje komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Fundacji Baden-Württemberg (Program Dorosłych Komórek Macierzystych II) przyznany C.L. Dziękujemy dr Martinie Konantz za krytyczny wkład i recenzję manuskryptu. Dziękujemy Emmanuelowi Trauneckerowi i Toniemu Krebsowi z Zakładu DBM FACS (Szpital Uniwersytecki w Bazylei) za pomoc w sortowaniu FACS.

1. Generacja komórek ludzkiego raka jajnika OVCAR-3 stabilnie transdukowanych lentiwirusami zawierającymi konstrukt reporterowy regionu regulatorowego SOX2
<ol>
	<li>Generowanie cząstek lentiwirusowych poprzez transfekcję linii komórkowej pakującej HEK 293T za pomocą konstruktu reporterowego rozpoznającego region regulatorowy SOX2, jak opisano10,21. 
	UWAGA: Konstrukt reporterowy zawiera ponadto domenę destabilizacji systemu ProteoTuner Shield przed białkiem fluorescencji tdTomato. Shield1 wiąże się z domeną destabilizacji, zapobiegając w ten sposób degradacji białka fluorescencji22 przez proteasom.</li>
	<li>Transdukować komórki OVCAR-3 cząstkami lentiwirusa przez okres 24 godzin. Następnie usunąć supernatant wirusa i przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i wyhodować w kompletnej pożywce (RPMI uzupełnione 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny).</li>
	<li>48 godzin później do kultur dodano 10 μg/ml puromycyny i utrzymywano przez 5 dni, aby umożliwić selekcję prawidłowo transdukowanych komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sortowania komórek i posiewu
<ol>
	<li>Dodaj Shield1 w rozcieńczeniu 1:1,000 na 24 godziny przed sortowaniem komórek. Użyć stabilnie transdukowanych komórek OVCAR-3 bez leczenia Shield1 jako kontroli ujemnych (ryc. 1). Odessać pożywkę z kolby, przemyć komórki 1x PBS i trypsynizować komórki 0,05% Trypsin-EDTA przez 3 min.</li>
	<li>Zatrzymaj trypsynę za pomocą kompletnej pożywki (patrz wyżej), policz liczbę komórek, odwiruj komórki przy 300 x g w temperaturze RT (15 - 25 °C) przez 5 minut.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ostrożnie zawiesić komórki w 0,5 - 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Użyj filtra siatkowego o średnicy 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Dostosuj liczbę komórek do 5 milionów komórek na ml.</li>
	<li>Przygotować 96-dołkowe płytki o bardzo niskiej przyczepności z podłożem o kulkach 100 μl (MEGM uzupełniony czynnikami wzrostu, cytokinami i suplementami, B-27, heparyną sodową; lub DMEM/F12 uzupełniony czynnikami wzrostu, cytokinami i suplementami, B-27, heparyna-sód z dodatkiem lub bez dodatku 1% metylocelulozy, patrz również Tabela 1). Opcjonalnie dodać do pożywki antybiotyki w stężeniu 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, aby zminimalizować ryzyko ewentualnego zanieczyszczenia.</li>
	<li>Posortuj komórki RFP+ i RFP- na przygotowane 96-dołkowe płytki od góry, odpowiednio 1 komórka na dołek (test kulek na pojedynczej komórkach) i 100 komórek na dołek (test sferek wielokomórkowych). Wykonaj sortowanie na dostępnym na rynku sortowniku komórek (patrz Materiały) w trybie pojedynczej komórki, konfiguracja sortowania: dysza 100 μ, ciśnienie osłony 20 psi i maska wydajności 0, maska czystości 32, maska fazowa 16.</li>
	<li>Ocenić wydajność posiewu poprzez mikroskopowe nacinanie studzienek zawierających komórki (w przypadku testu opartego na pojedynczej komórki) oraz poprzez zliczanie liczby komórek w poszczególnych studzienkach (w przypadku testu wielokomórkowego; Rysunek 2).</li>
	<li>Inkubować komórki w normalnych warunkach w pożywce kulistej (skład patrz krok 2.6) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Suplementuj codziennie bFGF (20 ng/ml) i EGF (20 ng/ml).</li>
	<li>Po tygodniu policz liczbę pojawiających się kul guza za pomocą standardowego mikroskopu z powiększeniem 4X lub 10X oraz mikroskopu fluorescencyjnego w celu wykrycia sygnału fluorescencji ze zintegrowanego systemu reporterowego. Kule o średnicy przekraczającej 100 μm należy policzyć jako "duże" kule, a kule o średnicy 50 - 100 μm jako "małe" kule (rysunek 3). Upewnij się, że liczysz rzeczywiste sfery, a nie klastry komórek. 
	UWAGA: W testach jednokomórkowych tworzenie kul jest łatwiejsze do oceny mikroskopowej po 10 (w porównaniu z 7) dniami hodowli.</li>
	<li>Oblicz proporcję komórek tworzących kule w RFP+ i odpowiednio komórkach RFP- w testach opartych na pojedynczych komórkach (jedna 96-dołkowa płytka dla każdego indywidualnego eksperymentu) lub testach sferycznych opartych na wielu komórkach (jedna studzienka dla każdego indywidualnego eksperymentu), jak przedstawiono przez Shaw i wsp.16 
	UWAGA: Proporcja komórek tworzących kule (%) = (liczba kulek) / (liczba komórek zasianych) x 100</li>
</ol>
3. Seryjne przechodzenie sfer
<ol>
	<li>Umieścić zawartość każdej studzienki w odpowiedniej sterylnej probówce i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku testów kulek opartych na wielu komórkach należy zebrać razem kulki z jednej studzienki. Umyj studzienkę 3 - 5 razy PBS i odwiruj 2 minuty dłużej. W przypadku testów sferycznych opartych na pojedynczych komórkach należy zebrać pojedyncze kulki. Ze względu na małą liczbę komórek do wirowania i mycia należy używać probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl 0,05% Trypsyny-EDTA.</li>
	<li>W celu uzyskania optymalnego oddzielenia komórek należy inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 37 °C przez 5 minut w miękkim wytrząsaczu. Zoptymalizuj czas trypsynizacji dla swojej linii komórkowej, aby obniżyć wskaźnik umierania komórek: jeśli nie widać dużych kulek, delikatnie rozetrzyj za pomocą końcówki do pipety o pojemności 100 μl. W przypadku, gdy duże kule są nadal obecne, inkubuj z trypsyną przez kolejne 3 minuty, a następnie przejdź do etapu rozcierania. W przypadku testów jednokomórkowych należy zoptymalizować czas dla optymalnej wydajności żywych komórek na etapie trypsynizacji.</li>
	<li>Aby dezaktywować trypsynę, dodać 500 μl kompletnej pożywki i wirować przy 300 x g przez 10 minut, w przypadku testów jednokomórkowych wirować przez dodatkowe 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić komórki w pożywce kulkowej.</li>
	<li>Użyj filtra siatkowego o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>W przypadku stosowania komórek RFP+ i RFP- w testach wielokomórkowych należy ocenić procentową zawartość komórek fluorescencyjnych w każdym dołku po ponownym zawieszeniu za pomocą analizy cytometru przepływowego.</li>
	<li>W przypadku seryjnych testów ponownego powlekania pojedynczych komórek, należy wysiać 1 komórkę na dołek na nową 96-dołkową płytkę o bardzo niskim mocowaniu, przygotowaną zgodnie z powyższym opisem. Z jednej pojedynczej kuli wysiewaj około 20 pojedynczych dołków. Do testów powtórnych wielokomórkowych sfer pierwotnych, komórki nasienne uzyskane z jednego dołka sfer pierwotnych umieszcza się na nowej 96-dołkowej płytce i następnego dnia policza liczbę komórek za pomocą mikroskopii.</li>
	<li>Oceń proporcję komórek tworzących kule w testach sfer wtórnych, korzystając ze wzoru opisanego w kroku 2.11.</li>
</ol>
4. Analiza wyników
<ol>
	<li>Analizuj wyniki eksperymentów przeprowadzonych w niezależnych trzech próbach i używaj dwustronnego testu t-Studenta do analizy wartości o rozkładzie normalnym, a w przeciwnym razie testów Manna-Whitneya do analizy statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+the+principles+of+stem-cell+biology+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applying the principles of stem-cell biology to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+Molecular+concepts+and+relevance+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets.</a> Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).</li>
<li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).</li>
<li>Kryczek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aldehyde+dehydrogenase+and+CD133+defines+ovarian+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.</a> Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).</li>
<li>Stewart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+and+instability+of+human+ovarian+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+expression+correlates+with+favorable+prognosis+in+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers.</a> Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).</li>
<li>Cannistra, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+variant+expression+is+a+common+feature+of+epithelial+ovarian+cancer%3A+lack+of+association+with+standard+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors.</a> J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).</li>
<li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+associates+with+stem+cell+state+in+human+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma.</a> Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).</li>
<li>Pham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+and+prognostic+significance+in+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Pathol%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma.</a> Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).</li>
<li>Lengerke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+embryonic+stem+cell+marker+SOX2+in+early-stage+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 11, 42(2011).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
<li>Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+assays+for+assessment+of+benign+and+malignant+pancreatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).</li>
<li>Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+identification+of+colon+cancer+stem+cell-derived+spheres+from+the+Colo205+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line.</a> Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+phenotypically+distinct+breast+cancer+cell+subsets+based+on+Sox2+transcription+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity.</a> Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+reversible%2C+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+skin%3A+transforming+growth+factor-beta+%28TGF-beta%29+facilitates+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth.</a> Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).</li>
<li>Walia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+breast+epithelial+marker+hCLCA2+promotes+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+indicates+higher+risk+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis.</a> Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).</li>
<li>Leung, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-small+cell+lung+cancer+cells+expressing+CD44+are+enriched+for+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties.</a> PLoS One. 5 (11), e14062(2010).</li>
<li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133%2B+cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).</li>
<li>Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem-like+cells+can+be+isolated+with+drug+selection+in+human+ovarian+cancer+cell+line+SKOV3%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+and+breast+cancer+spheres+are+similar+in+transcriptomic+features+and+sensitive+to+fenretinide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide).</a> Biomed Res Int. 2013, 510905(2013).</li>
<li>Du, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+mechanisms+of+anti-CD44+monoclonal+antibody+A3D8+on+proliferation+and+apoptosis+of+sphere-forming+cells+with+stemness+from+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer.</a> Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).</li>
<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+produced+by+tumor+microenvironment+promotes+self-renewal+of+CD133+cancer+stem-like+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer.</a> Oncogene. , (2013).</li>
<li>Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+ovarian+cancer+cells+in+different+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems.</a> Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).</li>
<li>Soritau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chemoresistance+and+tumor+sphere+formation+as+a+laboratory+model+for+peritoneal+micrometastasis+in+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryol%22%5BJournal%5D)">Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer.</a> Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).</li>
<li>Shi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cancer+stem+cell-like+cells+from+human+epithelial+ovarian+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic+microenvironment+upgrades+stem-like+properties+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 201(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowle kulkowe są szeroko stosowaną metodą oznaczania potencjału nowotworowych komórek macierzystych i wzbogacania o komórki macierzyste w szerokim zakresie ludzkich komórek nowotworowych15,25,26. W tych warunkach hodowli oczekuje się, że komórki rakowe, które nie mają zdolności do samoodnawiania, będą się różnicować i ostatecznie ulegną śmierci komórkowej. Chociaż mogą początkowo tworzyć skupiska komórek, a nawet sfery nowotworowe, zwłaszcza w testach pierwotnych, nie są w stanie utrzymać zdolności do tworze...

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że raki jajnika składają się z heterogenicznych mieszanin komórek i zawierają tak zwane "rakowe komórki macierzyste" (CSC) odpowiedzialne za inicjację, utrzymanie i nawroty choroby po konwencjonalnych terapiach cytotoksycznych1-3. Dlatego opracowanie strategii molekularnych ukierunkowanych na CSC jajników jest ważnym celem i daje nadzieję na poprawę terapii pacjentek z rakiem jajnika.
Warunkiem wstępnym do zrozumienia cech molekularnych CSCs jest ich niezawodna izolacja od nie-CSCs. Jednak identyfikacja CSC jajników wydaje się trudna. Podczas gdy ekspresja CD133 i aktywność dehydrogenazy aldehydowej (ALDH)4,5 została zgłoszona w celu oznaczenia CSC jajników, niektóre dane wskazują, że markery te są niestabilne6. Konsekwentnie, w raku jajnika, innym niż na przykład w raku piersi7, ekspresja ALDH1 wiąże się z korzystnym wynikiem8, a ekspresja proponowanego markera komórek macierzystych wariantu CD44 nie ma wartości prognostycznej9. Niedawno wykazaliśmy, że ekspresja białka embrionalnych komórek macierzystych SOX2 nadaje komórkom raka jajnikazdolność macierzystą 10, a wysoka ekspresja SOX2 wiąże się z klinicznie agresywnymi rakami jajników i piersi11,12. Dlatego w tym raporcie używamy konstruktu reporterowego lentiwirusa zawierającego białko czerwonej fluorescencji (RFP), którego ekspresja jest kontrolowana przez region regulatorowy SOX2, jako metodę izolacji przypuszczalnych CSC jajników.
Z definicji, CSC mogą zarówno samoodnawiać się, jak i różnicować, dając początek wszystkim typom komórek nowotworowych. Przypuszczalne populacje CSC muszą być analizowane w testach funkcjonalnych wykonywanych in vivo. Z oczywistych względów w komórkach ludzkich takie testy funkcjonalne ograniczają się do testów ksenoprzeszczepów, obejmujących głównie przeszczepianie ludzkich komórek nowotworowych myszom z obniżoną odpornością10,13.
Alternatywna metoda in vitro została zaproponowana przez Brenta Reynoldsa i Sama Weissa, którzy jako pierwsi opisali tzw. test neurosfery jako test zastępczy oceniający potencjał macierzysty w komórkach nerwowych14. Dontu i współpracownicy potwierdzili później zastosowanie tego testu do oceny potencjału komórek macierzystych w komórkach piersi15,16. W tym przypadku ludzkie komórki sutka zostały posiane w różnej liczbie w pożywce bez surowicy, uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF), B-27 i heparyną i hodowane w warunkach nieprzylegających przez siedem do dziesięciu dni, zanim utworzenie kuli zostało ocenione pod mikroskopem. Zgodnie z tym protokołem z pewnymi korektami liczby komórek, pożywki wzrostowej i suplementów, kilka grup zbadało potencjał komórek macierzystych in vitro z kilku typów raka, takich jak rak piersi17, mózg18, trzustka19 i jelito grube20. W przypadku raka jajnika niedawno informowaliśmy o wykonalności testu kulkowego i porównaliśmy jego wyniki z wynikami zebranymi w modelach mysich ksenoprzeszczepów in vivo 10. Odkryliśmy, że nadekspresja białka komórek macierzystych SOX2 zwiększyła zarówno tworzenie kul in vitro, jak i rakotwórczość in vivo ludzkich komórek raka jajnika10. Jednak częstość komórek inicjujących kulę była wyższa niż częstość komórek inicjujących nowotwór mierzona in vivo10, co sugeruje, że albo test sferyczny może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników z przyczyn technicznych, albo, alternatywnie, test in vivo może być nieskuteczny i skutkować fałszywie ujemnymi wynikami.
W tym raporcie analizujemy bardziej szczegółowo testy wielokomórkowych sfer jajnikowych, przeglądamy różne protokoły dostępne w literaturze i porównujemy je z testem opartym na pojedynczej komórce. Pokazujemy, że test oparty na pojedynczych komórkach zapewnia dokładniejsze i bardziej powtarzalne wyniki niż testy wielokomórkowe, na które duży wpływ może mieć gęstość posianych komórek, chyba że do kultur dodaje się metylocelulozę w celu unieruchomienia komórek. Jednak również w testach jednokomórkowych potencjał inicjowania sfery in vitro obserwuje się z większą częstością niż potencjał inicjowania guza in vivo.

<table><tbody><tr><td>Płyta o niskim mocowaniu</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Zestaw</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Zestaw</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Zestaw</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>stężenie końcowe: 20 ng / ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>stężenie końcowe: 20 ng / ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen / Gibco</td><td>17504-044</td><td>stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (proszek)</td><td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Komórka sortownik</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III sortownik komórek analizator</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FACS</td> BD <td>Accuri c6 cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Lata badań wskazują, że rak jajnika zawiera niejednorodną mieszaninę komórek, w tym subpopulację tak zwanych "rakowych komórek macierzystych" (CSC) odpowiedzialnych za inicjację, utrzymanie i nawroty guza po konwencjonalnej chemioterapii. Identyfikacja CSC jajników jest zatem ważnym celem. Powszechnie stosowaną metodą oceny potencjału CSC in vitro jest test sferyczny, w którym komórki są siane w warunkach hodowli nieprzylegającej w pożywce wolnej od surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu, a tworzenie kulek jest oceniane po kilku dniach. W tym miejscu dokonujemy przeglądu obecnie dostępnych protokołów oznaczania kulek raka jajnika u ludzi i przeprowadzamy analizę równoległą między powszechnie stosowanymi testami wielokomórkowymi a dokładniejszym systemem opartym na posiewaniu pojedynczych komórek. Nasze wyniki wskazują, że zarówno testy sfer wielokomórkowych, jak i jednokomórkowych mogą być wykorzystywane do badania powstawania kul in vitro. Bardziej pracochłonne i kosztowne testy oparte na pojedynczych komórkach są bardziej odpowiednie do oceny funkcjonalnej pojedynczych komórek i prowadzą do ogólnie dokładniejszych wyników, podczas gdy testy wielokomórkowe mogą być pod silnym wpływem gęstości posianych komórek i wymagać wcześniejszych eksperymentów miareczkowych. Suplementacja metylocelulozy do testów wielokomórkowych może być skutecznie stosowana w celu zmniejszenia artefaktów mechanicznych.

W konwencjonalnych testach tworzenia sfer prawie 40% komórek OVCAR-3 RFP+ w porównaniu do 20% komórek RFP- doprowadziło do powstania pojedynczej sfery nowotworowej w pierwotnym teście tworzenia sfer (Rysunek 4A). Co więcej, sfery utworzone przez komórki RFP+ były większe niż te utworzone przez komórki RFP-.
W testach opartych na pojedynczych komórkach komórki RFP+ tworzyły również więcej sfer niż komórki RFP-, co potwierdziło powyższe wyniki. Odnotowano jednak tendencję do gen...

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena właściwości komórek macierzystych ludzkich komórek raka jajnika za pomocą testów sferycznych opartych na wielu i pojedynczych komórkach. Osiąga się to poprzez wybór najpierw dwóch reporterowych komórek transdukowanych lentiwirusem RFP SOX za pomocą leczenia Pur Mycyna, w drugim kroku komórki dodatnie i ujemne RFP są izolowane i powlekane na podstawie faktów jako kolonie jedno- lub wielokomórkowe na studzienkę. Następnie, formowanie się sfery pierwotnej jest analizowane pod mikroskopem, a następnie kultury sfery pierwotnej są dysocjowane i ponownie powlekane w celu analizy formowania się sfery wtórnej.Ostatecznie te testy sferyczne są wykorzystywane do obliczenia proporcji domniemanych komórek macierzystych raka jajnika, które wykazują zdolność tworzenia kul. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworowych komórek macierzystych, takie jak potencjalne populacje rakowych komórek macierzystych i jaka jest ich częstość w całym worku guzakowym. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w identyfikację komórek macierzystych raka jajnika, może być również stosowana do izolowania rakowych komórek macierzystych od innych lit

evaluation-stem-cell-properties-human-ovarian-carcinoma-cells-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika za pomocą testów opartych na pojedynczych i wielu komórkach tworzących kuliste struktury

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Rakowe komórki macierzyste (CSC) są zaangażowane w nawroty nowotworu z powodu chemooporności. Zoptymalizowaliśmy protokół selekcji i namnażania CSC z linii komórkowych raka jajnika. Poprzez traktowanie komórek chemoterapeutykiem cisplatyną i hodowlę w pożywce promującej komórki macierzyste, wzbogacamy je o nieprzylegające hodowle CSC.

Wzbogacanie w chemooporne komórki macierzyste raka jajnika z ludzkich linii komórkowych

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Komórki macierzyste raka trzustki (CSC) mogą być namnażane in vitro za pomocą techniki hodowli sferycznej niezależnej od zakotwiczenia, która stanowi potężne narzędzie do badania biologii CSC i może służyć jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na CSC. W tym miejscu przedstawiono metodologię rozszerzania, analizowania i celowania w CSC trzustki.

Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Komórki macierzyste raka jajnika (OCSC) są odpowiedzialne za inicjację, nawrót, oporność terapeutyczną i przerzuty. Uważa się, że nisza naczyniowa OCSC sprzyja samoodnowie OCSC, co prowadzi do chemooporności. Protokół ten stanowi podstawę do ustanowienia odtwarzalnego modelu niszy naczyniowej OCSC in vitro.

Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Poznaj metodę oceny właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu testów sferycznych. Technika ta pozwala dokładnie identyfikować populacje komórek nowotworowych.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych (Wideo) | JoVE Journal

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Przeglądaj więcej filmów