Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Ogólnym celem tej procedury jest ocena właściwości komórek macierzystych ludzkich komórek raka jajnika za pomocą testów sferycznych opartych na wielu i pojedynczych komórkach. Osiąga się to poprzez wybór najpierw dwóch reporterowych komórek transdukowanych lentiwirusem RFP SOX za pomocą leczenia Pur Mycyna, w drugim kroku komórki dodatnie i ujemne RFP są izolowane i powlekane na podstawie faktów jako kolonie jedno- lub wielokomórkowe na studzienkę. Następnie, formowanie się sfery pierwotnej jest analizowane pod mikroskopem, a następnie kultury sfery pierwotnej są dysocjowane i ponownie powlekane w celu analizy formowania się sfery wtórnej.

Ostatecznie te testy sferyczne są wykorzystywane do obliczenia proporcji domniemanych komórek macierzystych raka jajnika, które wykazują zdolność tworzenia kul. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworowych komórek macierzystych, takie jak potencjalne populacje rakowych komórek macierzystych i jaka jest ich częstość w całym worku guzakowym. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w identyfikację komórek macierzystych raka jajnika, może być również stosowana do izolowania rakowych komórek macierzystych od innych litych jednostek nowotworowych, takich jak rak piersi.

24 godziny po transdukcji ludzkich komórek raka jajnika cząstkami lentiwirusa należy usunąć supernatant wirusa i umyć komórki w hodowli PBS. Komórki w kompletnym pożywce przez 48 godzin. Następnie zmień pożywkę i dodaj 10 mikrogramów na mililitr piro mycyny po pięciu dniach.

Następnego dnia potraktuj kultury osłoną pojedynczo w rozcieńczeniu od jednego do 1000. Umyj komórki w PBS, a następnie odłącz je 0,05% trypsyną EDTA. Po trzech minutach zatrzymaj reakcję z kompletnym podłożem.

Policz komórki i odwiruj je przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i temperaturze pokojowej. Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w 0,5 do jednego mililitra sterylnego PBS, a następnie przecedzić powstałą zawiesinę komórek przez filtr o średnicy 40 mikrometrów. Dostosuj komórki do rozcieńczenia pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr, a następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki kulkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu, a następnie do testu kulkowego opartego na pojedynczej komórki.

Użyj trybu pojedynczej komórki, aby posortować jedną komórkę do każdego dołka płytki. Następnie należy dokonać mikroskopowej oceny komórek, aby ocenić wydajność posiewu. Inkubuj komórki w świeżych kulkach, pożywce o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 z codzienną suplementacją podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów i naskórkowego czynnika wzrostu.

Po tygodniu określ liczbę pojawiających się kul guza za pomocą mikroskopii świetlnej i obecność sygnału fluorescencyjnego ze zintegrowanego systemu reporterowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Kule o średnicy przekraczającej 100 mikrometrów należy policzyć jako duże kule, a kule o średnicy od 50 do 100 mikrometrów jako małe kule. Dbając o to, aby liczyć rzeczywiste sfery, a nie skupiska komórek.

Następnie oblicz proporcję sfery tworzącej komórki dodatnie lub ujemne RFP zgodnie ze wzorem do przejścia. Kule rozpoczynają się od przeniesienia zawartości każdej studzienki do pojedynczych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówek. Następnie przepłucz każdą studzienkę trzy do pięciu razy PBS, aby upewnić się, że zebrałeś wszystkie kulki i wiruj komórki przez 10 minut w temperaturze 300 razy G i temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu usuń snat i resus, zawieś granulki w 200 mikrolitrach 0,05% tripsin EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza w miękkim wytrząsarce na pięć minut. Jeśli po pięciu minutach nie widać żadnych dużych kulek, delikatnie rozdrobnij roztwór komórek końcówką pipety o pojemności 100 mikrolitrów i dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę. Odwiruj komórki, ostrożnie ponownie zasymij granulki w kulkach i odcedź powstałą zawiesinę komórek przez filtr o średnicy 40 mikrometrów, jak właśnie oceniono.

Wreszcie, w celu seryjnego ponownego powlekania pojedynczych komórek, należy zasiać pojedyncze komórki z jednej pierwotnej kulki w 100 mikrolitrach kulek, pożywkę na dołek na nową 96-dołkową płytkę o bardzo niskim mocowaniu. Następnie użyj tego samego wzoru, co dla testu sfer pierwotnych, aby ocenić proporcję komórek tworzących sfery w sferach drugorzędnych. Testy w sferach wielokomórkowych prawie 40% komórek ludzkiego raka jajnika z dodatnim wynikiem RFP w porównaniu do zaledwie 20% komórek ujemnych RFP spowodowało powstanie pojedynczej sfery nowotworowej w teście sfer pierwotnych.

Co zaskakujące, większa liczba kulek jest liczona z mniejszej liczby posianych komórek zarówno w pożywkach opartych na MGEM, jak i D-M-E-M-F 12, co pokazuje, że metody posiewu bardzo obciążyły wyniki w tym teście. W przeciwieństwie do tego, gdy komórki są unieruchomione przez dodanie 1% metylocelulozy, wydajność tworzenia kuli jest w większości niezależna od gęstości komórek w wielokomórkowych hodowlach sferycznych. Około 35% komórek z dodatnich sfer RFP traci swój czerwony sygnał fluorescencyjny po siedmiu dniach hodowli, co sugeruje, że komórki te uległy różnicowaniu, podczas gdy ponad 65% komórek zachowuje sygnał RFP, co sugeruje zdolność do samoodnawiania.

W przeciwieństwie do tego, komórki z kulek wygenerowanych z początkowo ujemnych komórek RFP pozostają ujemne RFP, co wskazuje, że nie mogą przywrócić potencjału komórek macierzystych w tych warunkach. Mikroskopia fluorescencyjna wykonana na kulach wygenerowanych z pojedynczych komórek potwierdza te dane, wykazując, że pojedyncze kule pochodzące z komórek dodatnich RFP zawierają zarówno komórki dodatnie, jak i ujemne RFP. Podczas gdy kule pochodzące z komórek ujemnych RFP zachowują brak czerwonego sygnału, postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak przeciwciała, barwienie lub analiza ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR, mogą być wykonane w celu dalszego scharakteryzowania komórek o silnej zdolności do formowania. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że testy przeszczepu in vivo u myszy z obniżoną odpornością muszą być wykonane w celu walidacji właściwości nowotworowych komórek macierzystych komórek inicjujących kulę.