Name: Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj hodowlę eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów przez elektroporację. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju ucha wewnętrznego i funkcji genów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Bradleyowi Schulte za komentarze na temat tego protokołu. Prace te były wspierane przez grant National Institutes of Health R00 (5R00DC010220). Projekt ten został zrealizowany w odnowionej przestrzeni laboratoryjnej wspieranej przez Grant C06RR014516.

UWAGA: Wszystkie protokoły z użyciem żywych zwierząt muszą być sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i muszą być zgodne z oficjalnie zatwierdzonymi metodami opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie preparacje powinny być wykonywane techniką sterylną na czystym stole z przepływem laminarnym. Podczas tej procedury należy nosić rękawiczki i maskę, jeśli to konieczne.
1. Sekcja embrionalnego ucha wewnętrznego myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie do narządów kultur eksplantatów Cortiego:
	<ol>
		<li>Wysterylizuj kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, włączając światło UV na około 30 minut i zdezynfekuj powierzchnię 70% etanolem przed użyciem. Ponadto przed użyciem należy wysterylizować wszystkie narzędzia do preparacji, w tym drobne narzędzia do preparowania i naczynia pokryte powłoką Sylgard do sekcji zarodków w autoklawie lub przez namoczenie w 70% etanolu przez co najmniej 20 minut. Przed użyciem odlej 70% etanolu i pozostaw naczynia i instrumenty do wyschnięcia na powietrzu w czystej, czystej ławce z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Przygotować sterylną mieszaninę Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)/(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) (HEPES) mieszaniny, dodając 10% 10x HBSS i 0,5% HEPES i dostosować pH do około 7,2 i przefiltrować, wysterylizować końcowy roztwór i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić wszystkie sekcje w schłodzonym roztworze HBSS/HEPES, aby lepiej zachować tkankę przez cały czas trwania zabiegu.</li>
		<li>Pokryj naczynia ze szklanym dnem matrycą membrany podstawnej, dodając 5 ml zimnego (4 °C) sterylnego zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do 300 μl podwielokrotności matrycy błony podstawnej w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Wymieszać przez wirowanie zawartości i dodać 150 μl mieszaniny macierzy błony podstawnej i DMEM do środka każdej naczyń hodowlanej, tak aby pokryła całą kulturę dobrze obecną w środku naczynia. Przykryj naczynia i przechowuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 45 minut przed użyciem.</li>
		<li>Wlej 4-5 ml schłodzonego HBSS do trzech sterylnych polistyrenowych szalek Petriego i pozostaw zamknięte w kapturze.</li>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, dodając 9 ml DMEM, 100 μl suplementów N2, 10 g/ml Cipro i 1 ml FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja zarodków: 
	UWAGA: W tej procedurze hodowli eksplantatów ślimaka od myszy zarodkowych, uszy wewnętrzne należy pobrać z 13 dni zarodkowych kości skroniowych dnia (E), przy czym dzień po zapłodnieniu uważa się dzień po zapłodnieniu za E19. Protokół może być również stosowany w przypadku embrionalnych uszu wewnętrznych myszy, począwszy od E12 do E18.
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji mysz w ciąży w czasie za pomocą CO2 i uśmierc zwierzę poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub odpowiednie zatwierdzone protokoły. Przeprowadzić eutanazję z dala od okapu do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność w pomieszczeniu do hodowli tkankowych.</li>
		<li>Umieść uśpioną mysz na ręczniku papierowym brzuchem skierowanym do góry i zdezynfekuj brzuch 70% etanolem.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną, chwytając skórę zakrzywionymi kleszczami jedną ręką, a drugą ręką przetnij naskórek i mięśnie wzdłuż linii środkowej nożyczkami. Wykonaj dwa prostopadłe nacięcia po obu stronach i ostrożnie wyciągnij macicę, podnosząc obustronne rogi macicy za pomocą kleszczy i odłącz je od spodu tkanki łącznej za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Umieścić łańcuch embrionalny na szalce Petriego zawierającej schłodzony roztwór preparacyjny (mieszanina HBSS/HEPES) i przenieść na czystą ławkę z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć zarodki z łożyska i umieścić je na jednej ze sterylnych szalek Petriego zawierających roztwór preparacyjny. Jeśli roztwór stanie się krwawy, przenieś je na nową szalkę Petriego. 
		UWAGA: W tym momencie zarodki mogą być klasyfikowane za pomocą przewodnika oceny stopnia zaawansowania Theilera.</li>
		<li>Odetnij zarodki, szczypiąc okolice szyi parą czystych kleszczy lub nożyczek i umieść głowy na świeżej szalce Petriego zawierającej schłodzony roztwór preparacyjny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie ucha wewnętrznego:
	<ol>
		<li>Umieść jedną główkę zarodka w sterylnym naczyniu sylgardowym zawierającym zimną sekcję</li>
		<li>rozwiązanie. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym przy powiększeniu ~1,6X, unieruchamiaj głowę zarodka, umieszczając szpilki Minutiena wokół lub bliżej okolicy oka (ryc. 1A).</li>
		<li>Używając dwóch par sterylnych kleszczy, ostrożnie usuń skórę i otwórz czaszkę po stronie grzbietowej wzdłuż linii środkowej (ryc. 1B). Na tym etapie można zidentyfikować usunięcie mózgu z jamy czaszkowej i uszu wewnętrznego znajdujących się w kościach skroniowych (ryc. 1C, D). Wyściółka naczynia krwionośnego, która zwykle znajduje się wokół ucha wewnętrznego, może być wykorzystana jako punkt orientacyjny do identyfikacji ucha wewnętrznego na tym etapie (ryc. 1D).</li>
		<li>Wypreparuj ucho wewnętrzne od kości skroniowych, umieszczając kleszcze pod tkanką i izolując ucho wewnętrzne od podstawy czaszki i przenosząc do nowego naczynia zawierającego zimny roztwór preparacyjny (ryc. 1E, F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generacja narządów kultur eksplantatów Cortiego
UWAGA: Na tym etapie rozwoju, tkanka jest chrzęstna i może być łatwo wypreparowana za pomocą kleszczy.
<ol>
	<li>Ustaw ucho wewnętrzne tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry (ryc. 2A) i ustabilizuj ucho wewnętrzne, delikatnie wkładając ostry koniec szpilek Minutiena przez przedsionkową część ucha wewnętrznego (ryc. 2B).</li>
	<li>Za pomocą ultracienkich kleszczyków rozetnij leżącą nad nim chrząstkę, wykonując nacięcie za pomocą jednego końca kleszczy w pobliżu owalnego okienka i ostrożnie usuń chrząstkę ze ślimaka (ryc. 2C). 
	UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że kleszcze nie są włożone zbyt głęboko w chrząstkę, ponieważ leżąca nad nią chrząstka jest czasami zrośnięta z przewodem ślimakowym, w takim przypadku pomocne jest użycie zamkniętych kleszczy w celu uwolnienia chrząstki z leżącego poniżej przewodu ślimakowego poprzez skrobanie pod powierzchnią chrząstki. Na tym etapie rozwoju spirala ślimakowa ma tylko trzy czwarte długości obrotu.</li>
	<li>Następnie odsłoń nabłonek czuciowy, umieszczając kleszcze w preferowanym obszarze przewodu ślimakowego, u podstawy lub na samym wierzchołku, i delikatnie wyciągając dach ślimaka (ryc. 2D). 
	UWAGA: Dach ślimaka musi zostać całkowicie usunięty, ponieważ może on zamaskować nabłonek czuciowy, utrudniając analizę. 
	UWAGA: Tę procedurę należy wykonać delikatnie, ponieważ łatwo jest rozerwać nabłonek czuciowy.</li>
	<li>W ostatnim kroku ostrożnie usuń leżącą pod spodem tkankę łączną z odsłoniętego nabłonka czuciowego, tak aby podstawa eksplantatu ślimaka była jednolicie płaska.</li>
	<li>Odizoluj wypreparowany ślimak od przedsionkowej części ucha wewnętrznego za pomocą kleszczy. Można to zrobić przed lub po kroku 2.4 (Rysunek 2E).</li>
	<li>Przenieś wypreparowany nabłonek czuciowy ślimaka do studzienki pokrytej matrycą błony podstawnej za pomocą sterylnej szpilki o średnicy 1,5 mm (ryc. 2F).</li>
	<li>Ustawić eksplant ślimakowy tak, aby powierzchnia światła nabłonka była skierowana do góry i odessać roztwór macierzy błony podstawnej-DMEM, aby ostrożnie spłaszczyć tkankę i zastąpić ją 150 μl świeżej pożywki hodowlanej, delikatnie dodając do naczynia. Należy zadbać o to, aby każdy eksplant dobrze przylegał do szkiełka nakrywkowego ze szkła powlekanego i nie unosił się w pożywce hodowlanej. Upewnij się, że końcówka kleszczy jest skierowana do góry podczas mocowania do szklanki, aby uniknąć uszkodzenia eksplantatu ślimakowego.</li>
	<li>Delikatnie przenieść szalkę hodowlaną do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 150 mm i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez żądany okres czasu, zwykle 3-6 dni in vitro (DIV). Po 1 DIV zbadaj kultury pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że eksplant ślimaka dobrze przylega do naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Po inkubacji in vitro przez żądany okres czasu, kultury są przetwarzane do immunohistochemii. 
	UWAGA: Kultury eksplantatów są zwykle inkubowane przez 6 DIV, co jest równoważne stadium rozwojowemu P0. Po inkubacji in vitro kultury można przetworzyć do dalszych zastosowań, takich jak immunohistochemia (Figura 3B), RT-PCR, hybrydyzacja in situ i / lub western blot.</li>
</ol>
3. Transfer genów za pośrednictwem elektroporacji
<ol>
	<li>Przygotowanie do elektroporacji:
	<ol>
		<li>Wysterylizuj jedno szklane naczynie o średnicy 100 mm pokryte Sylgardem przez autoklawowanie lub moczenie w 70% etanolu przez około 20 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w czystej ławce przed użyciem.</li>
		<li>Przygotuj DNA z wybranego wektora ekspresyjnego przy użyciu odpowiednich zestawów do przygotowania maxi lub midi. Wektory ekspresji używane w tym protokole to pIRES2-Atoh1.EGFP i pCLIG-NeuroD1.EGFP. Końcowe stężenie DNA powinno wynosić co najmniej 1 μg/μl w sterylnej wodzie wolnej od DNA/RNAzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroporacja DNA w embrionalnych eksplantatach ślimaka:
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl plazmidowego roztworu DNA do świeżego naczynia pokrytego powłoką Sylgarda o średnicy 100 mm i przenieść całkowicie wypreparowany eksplant ślimakowy (uzyskany z kroku 2.5) do roztworu DNA.</li>
		<li>Powierzchnią świetlną nabłonka skierowaną do góry lekko przechyl ślimak tak, aby był prostopadły do płaszczyzny naczynia.</li>
		<li>Umieść łopatki elektrod po obu stronach ślimaka z ujemną łopatką (katodą) w kierunku nabłonka czuciowego i dodatnią łopatką (anodą) znajdującą się w sąsiedztwie podstawy ślimaka. 
		UWAGA: Ponieważ DNA jest naładowane ujemnie, migruje z elektrody ujemnej do dodatniej oraz poprzez umieszczenie końca katody sondy w sąsiedztwie nabłonka czuciowego; DNA będzie w większości przechodzić przez powierzchnię nabłonka czuciowego.</li>
		<li>Za pomocą elektroporatora dostarczyć od 9 do 10 impulsów o napięciu 24 mV, czasie trwania impulsu 30 ms, za pomocą przełącznika nożnego na elektroportorze, a następnie dodać 100 μl ciepłej pożywki hodowlanej do elektroporowanego ślimaka.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.2.1-4 dla wszystkich eksplantatów ślimaka i dla DNA wszystkich genów będących przedmiotem zainteresowania, a następnie przenieść ślimaki poddane elektroporacji do naczynia pokrytego matrycą błony podstawnej w celu posiewu (krok 2.7). Hoduj wszystkie elektroporowane ślimaki w inkubatorze z wilgotnością 37 °C i 5% CO2 przez żądany okres czasu, który następnie zostanie przetworzony do immunocytochemii. 
		UWAGA: Ślimak z całego miotu myszy CD1 (około 8-12 młodych) można wyizolować, poddać mikrosekcji, elektroporacji i posiać w ciągu <4 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza kultur eksplantatów ślimaka
UWAGA: Kultury są zazwyczaj inkubowane dla 6 DIV, co jest równoznaczne z etapem rozwojowym, P0. Po inkubacji in vitro kultury są utrwalane i przetwarzane do immunocytochemii.
<ol>
	<li>Po upływie pożądanej długości inkubacji należy usunąć pożywkę hodowlaną i szybko przepłukać eksplant ślimaka w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować w 4% paraformaldehydzie (przygotowanym w PBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj utrwalacz, dodając PBS i płucz w PBS trzy razy przez 15 minut.</li>
	<li>Przepuszczalność za pomocą PBS-T (PBS + 0,5% Tween) przez 30 minut przed zablokowaniem PBS-T zawierającym 10% koziej surowicy.</li>
	<li>Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe w PBS-T z 1% surowicą kozią przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj ślimak trzy razy w temperaturze pokojowej za pomocą PBS-T po 15 minut przed dodaniem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexą.</li>
	<li>Ponieważ eksplant ślimakowy jest hodowany na szklanym szkiełku nakrywkowym, można się z nim obchodzić indywidualnie, izolując szkiełko nakrywkowe od naczynia i montując go na szkiełku. Można to osiągnąć, mocząc naczynie hodowlane w rozpuszczalniku OS30 przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Za pomocą sterylnej żyletki odczep szkiełko nakrywkowe od naczynia i zamontuj na szkiełku podstawowym i zobrazuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+development+of+the+organ+of+Corti+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Organotypic development of the organ of Corti in culture.</a> J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes1+is+a+negative+regulator+of+inner+ear+hair+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation.</a> Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).</li>
<li>Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+regulates+development+of+the+sensory+epithelium+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea.</a> Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).</li>
<li>Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+differentiation+and+DNA+binding+%28Ids%29+regulate+Math1+and+hair+cell+formation+during+the+development+of+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti.</a> J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).</li>
<li>Dabdoub, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+signaling+in+prosensory+domain+specification+and+subsequent+hair+cell+differentiation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).</li>
<li>Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hey2+regulation+by+FGF+provides+a+Notch-independent+mechanism+of+maintaining+pillar+cell+fate+in+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti.</a> Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).</li>
<li>Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+induces+neuronal+formation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea.</a> J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press. San Diego. (1995).</li>
<li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).</li>
<li>Torres, M., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the vertebrate inner ear.</a> Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).</li>
<li>Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+inner+ear+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of inner ear induction.</a> Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).</li>
<li>Puligilla, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+world%E2%80%99s+best+hearing+aid%3B+regulation+of+cell+fate+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).</li>
<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).</li>
<li>Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-mediated+gene+transfer+to+study+the+molecular+physiology+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).</li>
<li>Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+hair+cells+and+support+cells+of+the+murine+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea.</a> Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Wszystkie komórki w błoniastym błędniku ucha wewnętrznego myszy, w tym neurony czuciowe, nieczuciowe i spiralne neurony zwojowe, pochodzą z otocysty pochodzącej z placodalnie położonej w sąsiedztwie tyłomózgowia ektodermy, około E810-14. W E11 brzuszny obszar otocysty rozciąga się, tworząc przewód ślimakowy, a wraz z postępem rozwoju grupa komórek nabłonkowych w ślimaku, a także w innych regionach otocysty, zostaje określona jako łaty prosensoryczne, które następnie dadzą początek różnym typom mechanosensorycz...

Ssaczy organ Cortiego składa się z mozaiki wyspecjalizowanych typów komórek, w tym dwóch typów mechanosensorycznych komórek rzęsatych, a także co najmniej czterech typów niesensorycznych komórek wspomagających, co czyni go idealnym systemem modelowym do badania normalnych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, specyfikacja losu, różnicowanie i wzorcowanie. Ponadto prawidłowy rozwój tych różnych typów komórek jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania słuchu. Dlatego tak ważne jest zrozumienie czynników, zarówno molekularnych, jak i komórkowych, które regulują ich rozwój. Jednak niewielki rozmiar ślimaka myszy oraz jego niedostępność stanowią szczególne wyzwanie dla badań nad ekspresją genów. Co więcej, większość zdarzeń związanych ze specyfikacją losu komórki i wzorcami ma miejsce w okresach embrionalnych i w większości przypadków kończy się przed urodzeniem. Dlatego identyfikacja i charakterystyka zdarzeń sygnalizacyjnych w okresach embrionalnych jest niezbędna do uzyskania wglądu w molekularne podstawy morfogenezy ślimaka. 
Tutaj demonstrujemy metodę hodowli nienaruszonego ślimaka in vitro z embrionalnych uszu wewnętrznych myszy. Uzasadnieniem zastosowania tej techniki jest to, że hodowane ślimaki zachowują swoje cechy molekularne i morfologiczne, zapewniając tym samym cenny model do badania potencjalnych genów kandydujących i badania mechanizmów związanych z morfogenezą ślimaka. Chociaż myszy transgeniczne mogą być wykorzystywane do badań nad ekspresją genów, system in vitro jest często potrzebny do monitorowania określonych funkcji genów. Co więcej, na podstawie transgenicznych zarodków myszy można stworzyć posiewy ślimakowe, aby badać ich rozwój in vitro i reakcję na różne rozpuszczalne czynniki i antagonistów. Chociaż w tym protokole wykorzystuje się zarodki w dniu 13 (E13), posiewy od E12 lub E14 do wczesnych postnatalnych uszu wewnętrznych mogą dać podobne wyniki. 
Prezentujemy również technikę transferu genów w hodowanych embrionalnych eksplantatach ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Po wyizolowaniu eksplantatów ślimaka, elektroporacja może być wykorzystana do ekspresji plazmidów DNA interesujących genów w poszczególnych komórkach w przewodzie ślimakowym. Technika ta służy jako uzupełniające podejście do badań z wykorzystaniem myszy transgenicznych w celu uzyskania wglądu w szlaki molekularne leżące u podstaw fenotypu komórkowego. Za pomocą tej metody transferu genów transfekowane są różne typy komórek nabłonkowych w ślimaku embrionalnym, co umożliwia analizę utraty i wzmocnienia funkcji na poziomie pojedynczej komórki. Ponadto badania elektrofizjologiczne można również przeprowadzić w hodowlach eksplantatów ślimaka8. Ta metoda elektroporacji in vitro jest stosunkowo prosta i nieskomplikowana, w połączeniu z minimalnym uszkodzeniem tkanki, spowodowała szybki rozwój tej techniki.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek cyprofloksacyny</td><td>Cellgro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie szklane 60 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23062-6015/23064-6015</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie szklane 100 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10015/23062-10015</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki Minutien</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>Protech International Inc</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane, 60 x 15 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OS-30</td><td>Dow Corning</td><td>4021768</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Miozyna 6</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6791</td><td></td></tr><tr><td>Miozyna 7a</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>TuJ1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Słuchowe komórki rzęsate znajdujące się w narządzie myszy Cortiego wykrywają i przekazują informacje dźwiękowe do ośrodkowego układu nerwowego. Mechanosensoryczne komórki rzęsate są ustawione w jednym rzędzie wewnętrznych komórek rzęsatych i trzech rzędach zewnętrznych komórek rzęsatych, które rozciągają się wzdłuż osi podstawnej do wierzchołkowej ślimaka. Opisana tutaj technika hodowli eksplantatów zapewnia skuteczną metodę izolowania i utrzymywania eksplantatów ślimakowych z zarodka ucha wewnętrznego myszy. Ponadto morfologia i charakterystyka molekularna czuciowych komórek rzęsatych i nieczuciowych komórek podporowych w kulturach eksplantatów ślimaka przypomina te obserwowane in vivo i mogą być badane w wewnętrznym środowisku komórkowym. Eksplantaty ślimaka mogą służyć jako ważne narzędzia eksperymentalne do identyfikacji i charakterystyki szlaków molekularnych i genetycznych, które są zaangażowane w specyfikację komórkową i modelowanie. Chociaż transgeniczne modele myszy stanowią skuteczne podejście do badań nad ekspresją genów, znaczna liczba mutantów myszy umiera podczas rozwoju embrionalnego, utrudniając w ten sposób analizę i interpretację fenotypów rozwojowych. Narząd Cortiego od zmutowanych myszy, które umierają przed urodzeniem, można hodować, aby można było przeanalizować ich rozwój in vitro i reakcje na różne czynniki. Dodatkowo opisujemy technikę elektroporacji embrionalnych eksplantatów ślimaka ex vivo, która może być wykorzystana do obniżenia lub nadekspresji określonych genów oraz analizy ich potencjalnej funkcji endogennej i przetestowania, czy określony produkt genu jest konieczny lub wystarczający w danym kontekście, aby wpłynąć na rozwój ślimaka ssaków1-8.

Opisujemy metodę izolacji ślimaka z embrionalnych ucha wewnętrznego oraz mikrodysekcji w celu odsłonięcia nabłonka sensorycznego. Po dysekcji może on zostać wysiany i hodowany jako nienaruszony przewód ślimaka (Rysunek 3) oraz analizowany za pomocą immunohistochemii. Hodowane eksplanty ślimaka stanowią użyteczny model do badania wpływu różnych czynników rozpuszczalnych i leków farmakologicznych na rozwój ślimaka. Po dysekcji eksplantów ślimaka można zastosować technikę elektroporacji w celu nadekspresji ...

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy. Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Celem tej procedury jest hodowla i elektrooperacja embrionalny myszy, ślimak exvivo. W celu zbadania różnych aspektów rozwoju ślimaka, w tym różnicowania morfogenezy i zdarzeń wzrostu, osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie głowy z zarodka myszy w 13 dniu zarodka. Następnie odsłoń uszy wewnętrzne, usuwając mózg i odizoluj je od rozwijającej się kości skroniowej, odłączając je od podstawy czaszki.Następnie usuń leżącą nad nią chrząstkę i otwórz przewód ślimakowy, aby uzyskać nabłonek czuciowy ślimaka. Ostatnim krokiem jest hodowla wypreparowanego ślimaka z elektroporacją lub bez elektroporacji przez okres do jednego tygodnia. Ostatecznie implanty mogą być analizowane pod kątem obrazowania żywych komórek lub utrwalonego barwienia immunologicznego i analizowane za pomocą obrazowania konfokalnego, hodowli embrionalnej myszy.Cochlear explan stanowi doskonały system do badania różnych aspektów organogenezy, takich jak proliferacja, specyfikacja siarczanów i polaryzacja w rozwijającym się ślimaku oraz sposób, w jaki te zdarzenia przyczyniają się do wzrostu i różnicowania. Tak więc ta technika pozwala na wykonywanie manipulacji farmakologicznych i monitorowanie funkcji genów ex vivo. Tak więc ta technika w połączeniu z transferem genów za pomocą elektroporacji, można zmienić ekspresję interesującego nas genu i monitorować jego funkcję na poziomie pojedynczej komórki.Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić głowę zarodka myszy E 13 w sterylnym naczyniu na mięso zawierające zimny roztwór preparacyjny. Pod mikroskopem preparacyjnym unieruchomij głowę zarodka, umieszczając drobne szpilki wokół okolicy oka. Następnie za pomocą dwóch par sterylnych kleszczy ostrożnie usuń skórę i otwórz czaszkę po stronie grzbietowej wzdłuż linii środkowej.Następnie usuń mózg z jamy czaszki. Uszy wewnętrzne znajdujące się w kościach skroniowych można zidentyfikować na podstawie wyściółki naczynia krwionośnego wokół nich. Następnie wypreparuj ucho wewnętrzne od kości skroniowych, umieszczając kleszcze pod tkanką i izolując ucho wewnętrzne od podstawy czaszki.Następnie przenieś wypreparowane uszy wewnętrzne do nowego naczynia zawierającego zimny roztwór preparacyjny. Teraz ustaw ucho wewnętrzne tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry. Ustabilizuj ucho wewnętrzne, delikatnie wkładając ostry koniec szpilek minuchin przez część przedsionkową.Za pomocą ultra cienkich kleszczy rozetnij leżącą nad nim chrząstkę, wykonując nacięcie w pobliżu owalnego okienka. Upewnij się, że kleszcze nie są włożone zbyt głęboko w chrząstkę, ponieważ leżąca nad nią chrząstka jest czasami zrośnięta z przewodem ślimakowym. Następnie ostrożnie usuń chrząstkę ze ślimaka.Następnie odsłoń nabłonek czuciowy, umieszczając kleszcze u podstawy lub na wierzchołku przewodu ślimakowego i delikatnie wyciągnij dach ślimaka. W ostatnim kroku ostrożnie usuń leżącą pod spodem tkankę łączną z odsłoniętego nabłonka czuciowego, tak aby podstawa wysięgnika ślimakowego była płaska. Następnie odizoluj wypreparowany ślimak od przedsionkowej części ucha wewnętrznego.Przenieś wypreparowany nabłonek czuciowy ślimaka do macierzy błony podstawnej Dobrze pokryta kultura za pomocą sterylnej szpilki o średnicy 1,5 milimetra, jeśli konieczne jest dalsze czyszczenie w celu usunięcia dodatkowej tkanki, można to wykonać na tym etapie. Następnie ustaw explan ślimaka tak, aby powierzchnia światła nabłonka była skierowana do góry. Odessać roztwór DMEM matrycy błony podstawnej, aby ostrożnie spłaszczyć tkankę i delikatnie dodać 150 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej do naczynia.Upewnij się, że każdy x explan a dobrze przylega do szkiełka nakrywkowego z powlekanego szkła i nie unosi się w pożywce hodowlanej. Następnie delikatnie przenieś mikro wypreparowany ślimak do sterylnego 150-milimetrowego naczynia hodowlanego i umieść go w inkubatorze do hodowli tkankowych. 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla dla trzech do sześciu DIV.Po 1D IV.Zbadaj kulturę pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że plan ślimakowy dobrze przylega do naczynia hodowlanego. Następnie kontynuuj inkubację kultury in vivo przez pożądany okres czasu przed przetworzeniem jej do immunohistochemii w celu przygotowania do elektroporacji. Najpierw wysterylizuj jedno szklane naczynie pokryte cygarem o grubości 100 milimetrów, sterylizując w autoklawie lub mocząc w 70% etanolu przez około 20 minut.Następnie pozostaw go do wyschnięcia na czystej ławce przed użyciem. Teraz przygotuj DNA z wybranego wektora ekspresyjnego za pomocą odpowiedniego zestawu przygotowawczego maxi lub MIDI. Wektory ekspresji używane w tym protokole to konstrukt wyrażenia H i konstrukt wyrażenia neuro D jeden konstrukt wyrażenia.A końcowe stężenie DNA powinno wynosić co najmniej jeden mikrogram na mikrolitr w sterylnej wodzie wolnej od RNA DNA, aby elektro operować DNA w enicznym ślimaku. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu DNA osocza do świeżego 100-milimetrowego naczynia pokrytego cygarem. Następnie przenieś w pełni wypreparowany wysiew ślimakowy do roztworu DNA z powierzchnią światła nabłonka skierowaną do góry.Lekko przechyl ślimak tak, aby był prostopadły do płaszczyzny naczynia. Następnie umieść łopatkę elektrody ujemnej w kierunku nabłonka czuciowego, a łopatkę elektrody dodatniej obok podstawy ślimaka za pomocą elektroatora. Dostarcz od dziewięciu do 10 impulsów o napięciu 24 miliwoltów i czasie trwania impulsu 30 milisekund.Następnie dodaj 100 mikrolitrów ciepłej pożywki hodowlanej do ślimaka o parametrze elektrycznym. Powtórz procedury dla całego planu ślimakowego i dla DNA wszystkich genów będących przedmiotem zainteresowania przed przeniesieniem ślimaka o ocenie elektrycznej do naczynia pokrytego macierzą błony podstawnej w celu posiewu. Następnie posadź cały ślimak oceniany elektrycznie w inkubatorze z wilgotnością dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez żądany okres czasu, który zostanie następnie przetworzony do chemii immunocytologicznej.Zdjęcia te pokazują embrionalne implanty ślimakowe dnia 13 z dzikich pubów myszy CD one, które są elektroporowane za pomocą konstruktów TH one, EEG FP lub neuro D one EGFP Reporter. Zostały one znakowane immunologicznie markerem specyficznym dla komórek rzęsatych, anty myo seven A lub markerem neuronalnym dwa do jednego na czerwono. Komórki oceniane elektrycznie, które można uwidocznić za pomocą ekspresji EGFP, są widoczne w większym grzbiecie nabłonka, mniejszym grzbiecie nabłonka i komórkach nabłonka czuciowego.Neuro D one transfekował komórki nabłonka ślimaka po pięciu DIV nabył fenotyp neuronalny z procesami dendrytycznymi, z których większość była dodatnia dla dwóch jeden lub T oh H. Transfekowane komórki były dodatnie dla myo seven. Wyrażenie Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin dla litra Intela od ośmiu do 10 trzasków.Zapewni to wystarczająco dużo czasu na hodowlę preparacyjną, elektroporację i poszycie eksplanu.

culture-embryonic-mouse-cochlear-explants-gene-transfer

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hodowla wysiewów zawiązków ślimakowych zarodków mysich i transfer genów przez elektroporację

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania, hodowli, leczenia i barwienia immunologicznego eksplantatów ślimakowych u noworodków myszy. Technika ta może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu.

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Poznaj hodowlę eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów przez elektroporację. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju ucha wewnętrznego i funkcji genów in vivo.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Przeglądaj więcej filmów