Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Celem tej procedury jest hodowla i elektrooperacja embrionalny myszy, ślimak exvivo. W celu zbadania różnych aspektów rozwoju ślimaka, w tym różnicowania morfogenezy i zdarzeń wzrostu, osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie głowy z zarodka myszy w 13 dniu zarodka. Następnie odsłoń uszy wewnętrzne, usuwając mózg i odizoluj je od rozwijającej się kości skroniowej, odłączając je od podstawy czaszki.

Następnie usuń leżącą nad nią chrząstkę i otwórz przewód ślimakowy, aby uzyskać nabłonek czuciowy ślimaka. Ostatnim krokiem jest hodowla wypreparowanego ślimaka z elektroporacją lub bez elektroporacji przez okres do jednego tygodnia. Ostatecznie implanty mogą być analizowane pod kątem obrazowania żywych komórek lub utrwalonego barwienia immunologicznego i analizowane za pomocą obrazowania konfokalnego, hodowli embrionalnej myszy.

Cochlear explan stanowi doskonały system do badania różnych aspektów organogenezy, takich jak proliferacja, specyfikacja siarczanów i polaryzacja w rozwijającym się ślimaku oraz sposób, w jaki te zdarzenia przyczyniają się do wzrostu i różnicowania. Tak więc ta technika pozwala na wykonywanie manipulacji farmakologicznych i monitorowanie funkcji genów ex vivo. Tak więc ta technika w połączeniu z transferem genów za pomocą elektroporacji, można zmienić ekspresję interesującego nas genu i monitorować jego funkcję na poziomie pojedynczej komórki.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić głowę zarodka myszy E 13 w sterylnym naczyniu na mięso zawierające zimny roztwór preparacyjny. Pod mikroskopem preparacyjnym unieruchomij głowę zarodka, umieszczając drobne szpilki wokół okolicy oka. Następnie za pomocą dwóch par sterylnych kleszczy ostrożnie usuń skórę i otwórz czaszkę po stronie grzbietowej wzdłuż linii środkowej.

Następnie usuń mózg z jamy czaszki. Uszy wewnętrzne znajdujące się w kościach skroniowych można zidentyfikować na podstawie wyściółki naczynia krwionośnego wokół nich. Następnie wypreparuj ucho wewnętrzne od kości skroniowych, umieszczając kleszcze pod tkanką i izolując ucho wewnętrzne od podstawy czaszki.

Następnie przenieś wypreparowane uszy wewnętrzne do nowego naczynia zawierającego zimny roztwór preparacyjny. Teraz ustaw ucho wewnętrzne tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry. Ustabilizuj ucho wewnętrzne, delikatnie wkładając ostry koniec szpilek minuchin przez część przedsionkową.

Za pomocą ultra cienkich kleszczy rozetnij leżącą nad nim chrząstkę, wykonując nacięcie w pobliżu owalnego okienka. Upewnij się, że kleszcze nie są włożone zbyt głęboko w chrząstkę, ponieważ leżąca nad nią chrząstka jest czasami zrośnięta z przewodem ślimakowym. Następnie ostrożnie usuń chrząstkę ze ślimaka.

Następnie odsłoń nabłonek czuciowy, umieszczając kleszcze u podstawy lub na wierzchołku przewodu ślimakowego i delikatnie wyciągnij dach ślimaka. W ostatnim kroku ostrożnie usuń leżącą pod spodem tkankę łączną z odsłoniętego nabłonka czuciowego, tak aby podstawa wysięgnika ślimakowego była płaska. Następnie odizoluj wypreparowany ślimak od przedsionkowej części ucha wewnętrznego.

Przenieś wypreparowany nabłonek czuciowy ślimaka do macierzy błony podstawnej Dobrze pokryta kultura za pomocą sterylnej szpilki o średnicy 1,5 milimetra, jeśli konieczne jest dalsze czyszczenie w celu usunięcia dodatkowej tkanki, można to wykonać na tym etapie. Następnie ustaw explan ślimaka tak, aby powierzchnia światła nabłonka była skierowana do góry. Odessać roztwór DMEM matrycy błony podstawnej, aby ostrożnie spłaszczyć tkankę i delikatnie dodać 150 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej do naczynia.

Upewnij się, że każdy x explan a dobrze przylega do szkiełka nakrywkowego z powlekanego szkła i nie unosi się w pożywce hodowlanej. Następnie delikatnie przenieś mikro wypreparowany ślimak do sterylnego 150-milimetrowego naczynia hodowlanego i umieść go w inkubatorze do hodowli tkankowych. 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla dla trzech do sześciu DIV.

Po 1D IV.Zbadaj kulturę pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że plan ślimakowy dobrze przylega do naczynia hodowlanego. Następnie kontynuuj inkubację kultury in vivo przez pożądany okres czasu przed przetworzeniem jej do immunohistochemii w celu przygotowania do elektroporacji. Najpierw wysterylizuj jedno szklane naczynie pokryte cygarem o grubości 100 milimetrów, sterylizując w autoklawie lub mocząc w 70% etanolu przez około 20 minut.

Następnie pozostaw go do wyschnięcia na czystej ławce przed użyciem. Teraz przygotuj DNA z wybranego wektora ekspresyjnego za pomocą odpowiedniego zestawu przygotowawczego maxi lub MIDI. Wektory ekspresji używane w tym protokole to konstrukt wyrażenia H i konstrukt wyrażenia neuro D jeden konstrukt wyrażenia.

A końcowe stężenie DNA powinno wynosić co najmniej jeden mikrogram na mikrolitr w sterylnej wodzie wolnej od RNA DNA, aby elektro operować DNA w enicznym ślimaku. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu DNA osocza do świeżego 100-milimetrowego naczynia pokrytego cygarem. Następnie przenieś w pełni wypreparowany wysiew ślimakowy do roztworu DNA z powierzchnią światła nabłonka skierowaną do góry.

Lekko przechyl ślimak tak, aby był prostopadły do płaszczyzny naczynia. Następnie umieść łopatkę elektrody ujemnej w kierunku nabłonka czuciowego, a łopatkę elektrody dodatniej obok podstawy ślimaka za pomocą elektroatora. Dostarcz od dziewięciu do 10 impulsów o napięciu 24 miliwoltów i czasie trwania impulsu 30 milisekund.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów ciepłej pożywki hodowlanej do ślimaka o parametrze elektrycznym. Powtórz procedury dla całego planu ślimakowego i dla DNA wszystkich genów będących przedmiotem zainteresowania przed przeniesieniem ślimaka o ocenie elektrycznej do naczynia pokrytego macierzą błony podstawnej w celu posiewu. Następnie posadź cały ślimak oceniany elektrycznie w inkubatorze z wilgotnością dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez żądany okres czasu, który zostanie następnie przetworzony do chemii immunocytologicznej.

Zdjęcia te pokazują embrionalne implanty ślimakowe dnia 13 z dzikich pubów myszy CD one, które są elektroporowane za pomocą konstruktów TH one, EEG FP lub neuro D one EGFP Reporter. Zostały one znakowane immunologicznie markerem specyficznym dla komórek rzęsatych, anty myo seven A lub markerem neuronalnym dwa do jednego na czerwono. Komórki oceniane elektrycznie, które można uwidocznić za pomocą ekspresji EGFP, są widoczne w większym grzbiecie nabłonka, mniejszym grzbiecie nabłonka i komórkach nabłonka czuciowego.

Neuro D one transfekował komórki nabłonka ślimaka po pięciu DIV nabył fenotyp neuronalny z procesami dendrytycznymi, z których większość była dodatnia dla dwóch jeden lub T oh H. Transfekowane komórki były dodatnie dla myo seven. Wyrażenie Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin dla litra Intela od ośmiu do 10 trzasków.

Zapewni to wystarczająco dużo czasu na hodowlę preparacyjną, elektroporację i poszycie eksplanu.