Name: Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę IMIT do nieinwazyjnego dostarczania bakterii bezpośrednio do płuc myszy. Technika ta umożliwia precyzyjne i powtarzalne badanie chorób układu oddechowego z odzyskiem ponad 98% inokulum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie ze strony Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller i Jennifer Kraenzle) oraz Microbiology (Daniel Cramer i Julie Sotsky) Core Facilities. Prace te były wspierane przez fundusze z NIH (HHSN272201000033I do M.B.L i J.M.W.).

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu w Louisville (protokół # 13-056) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (protokół # 13-064).
1. Przygotowanie barwnika
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue w PBS i wysterylizować filtrem za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μM.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury Pseudomonas aeruginosa 
<ol>
	<li>15 godzin przed wkropleniem zaszczepić 3 ml kultury bulionowej pojedynczą kolonią bakteryjną.</li>
	<li>Hoduj kulturę przez 15 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (200 obr./min).</li>
	<li>Odwirować 1 ml kultury w 1,5 ml probówce do mikrofuge 12 000 x g przez 30 sekund.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny bakteryjnej w stosunku 1:10 w PBS i zmierzyć OD600 rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej w celu określenia stężenia bakterii.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną w PBS do pożądanego stężenia inokulum bakteryjnego, używając objętości 50 μl do inokulacji IMIT.</li>
</ol>
3. Wkraplanie IMIT
<ol>
	<li>Umieść grupę myszy w komorze indukcyjnej znieczulenia izofluranem i znieczulenie za pomocą 2-3% mieszaniny izofluranu i tlenu.</li>
	<li>Na początkowym początku sedacji należy oczyścić mysz, trzymając ją w pozycji pionowej, i podać 10 μl 2% roztworu lidokainy za pomocą igły do tylnej części gardła i pozwolić, aby roztwór spłynął do nagłośni. Wróć mysz do komory anestezjologicznej.
	<ol>
		<li>Odczekaj co najmniej 5 minut, aby lidokaina mogła w pełni zadziałać jako środek znieczulający miejscowo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy myszy osiągną pożądany poziom uspokojenia (częstość oddechów ~60 uderzeń na minutę), zmniejsz izofluran do 2%, aby utrzymać uspokojenie.</li>
	<li>Wstępnie załaduj barwnik lub inokulum bakteryjne do gazoszczelnej, precyzyjnej strzykawki o pojemności 250 μl z igłą igłą o długości 22 G.
	<ol>
		<li>Najpierw pobrać 150 μl powietrza, odmierzonego za pomocą teflonowego tłoka strzykawki. Następnie pobrać 50 μl inokulum, przesuwając teflonowy tłok od oznaczenia 150 μl do oznaczenia 200 μl na korpusie strzykawki. 
		UWAGA: Gdy próbka zostanie wyrzucona do zaintubowanej myszy, najpierw zostanie dostarczona zawiesina o objętości 50 μl, a następnie poduszka powietrzna o pojemności 150 μl, która rozprowadzi inokulum po całym płucu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij jedną mysz z komory indukcyjnej i połóż się na wznak na platformie intubacyjnej. Przymocuj mysz do platformy, zaczepiając jej siekacze za pomocą O-ringu przymocowanego do paska na rzep i mocując rzep do platformy. Podnieś mysz do kąta nachylenia 45°.</li>
	<li>Za pomocą aplikatora z mikro bawełny cofnij język ruchem toczącym, używając dominującej ręki.</li>
	<li>W przypadku ręki niedominującej użyj otoskopu operacyjnego dopasowanego do wziernika intubacyjnego, aby zarówno utrzymać retrakcję języka, jak i uwidocznić głośnię.</li>
	<li>Ręką dominującą użyj przewodu prowadzącego przewleczonego przez cewnik 20 G, aby zaintubować mysz, osadzając cewnik na głębokość 10 mm w tchawicy myszy (cewnik jest wyposażony w silikonową osłonę z odsłoniętym cewnikiem o średnicy 10 mm). Usuń otoskop/wziernik.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz została prawidłowo zaintubowana, zabezpieczając cewnik ręką niedominującą, jednocześnie krótko podłączając przezroczystą rurkę Luer o długości 1/16" zawierającą kolorowy barwnik. 
	UWAGA: Barwnik będzie szybko migrował tam iz powrotem w odpowiedzi na oddychanie.</li>
	<li>Nie należy wykonywać kolejnych kroków, jeśli w tym momencie nie ustalono potwierdzenia intubacji. Jeśli próba intubacji nie powiodła się, zresetuj cewnik i przewód doprowadzający na jedną dodatkową próbę intubacji. 
	UWAGA: Niewskazane jest podejmowanie więcej niż dwóch prób intubacji myszy podczas jednej sesji bez spowodowania urazu myszy.</li>
	<li>Kontynuuj zabezpieczanie cewnika ręką niedominującą, jednocześnie wkładając precyzyjną strzykawkę/igłę zawierającą płynną zawiesinę/poduszkę powietrzną.</li>
	<li>Dozuj płyn/powietrze bezpośrednio do płuc jednym ruchem płynu i natychmiast wyjmij igłę/cewnik z myszy.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól jej dojść do siebie po znieczuleniu.</li>
</ol>
4. Charakterystyka dostawy IMT
<ol>
	<li>Po wkropleniu IMIT należy poddać mysz eutanazji przez uduszenie CO2 w odpowiednim czasie po zaszczepieniu.</li>
	<li>Zabezpiecz uśpioną mysz na desce sekcyjnej i namocz klatkę piersiową i brzuch 70% EtOH za pomocą butelki ze spryskiwaczem.</li>
	<li>W przypadku oceny rozmieszczenia czynnika obrazującego w płucach, należy usunąć płuca zwierzęcia za pomocą sterylnej techniki i wyświetlić płuca zgodnie z potrzebami obrazowania. 
	UWAGA: Płuca mogą być przygotowane do dodatkowych technik barwienia histologicznego poprzez odpowiednie utrwalenie lub krioprezerwację.</li>
	<li>W przypadku oceny obciążenia bakteryjnego zakażoną tkanką płucną należy usunąć płuca zwierzęcia za pomocą sterylnej techniki. Umieść płuca w sterylnej, wstępnie zważonej torbie na próbki o pojemności 1 uncji. Zważyć i zanotować masę worka na próbkę + płuc.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml sterylnego 1x PBS do każdej torebki na próbkę + chusteczki. Ponownie zamknąć worek na próbki.</li>
		<li>Homogenizować tkanki, delikatnie tocząc pipetę serologiczną o pojemności 25 ml po worku na próbkę + tkanka.</li>
		<li>Wytwarzać seryjne rozcieńczenia homogenatu płucnego w sterylnym PBS i płytce na płytce agarowej (LB lub odpowiednio do badanej grupy bakterii):
		<ol>
			<li>Przeprowadzić sześciokrotne seryjne rozcieńczenie na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie wielokanałowo rozszczepić próbki na płytce agarowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C i wyliczyć jednostki tworzące kolonie następnego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Reznik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy%2C+physiology%2C+and+function+of+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract.</a> Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).</li>
<li>Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., et al. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoyt%2C+RFJ+%22The+Mouse+in+Biomedical+Research%2C+Volume+2%2C+Second+Edition%3A+Diseases+%28American+College+of+Laboratory+Animal+Medicine%29%22">The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine)</a>. Fox, J. G. 2, Academic Press. 23-90 (2007).</li>
<li>Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. O., Thanavala, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+tissue+distribution+of+marker+dye+following+intranasal+delivery+in+mice+and+chinchillas%3A+a+multifactorial+analysis+of+parameters+affecting+nasal+retention%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Tracking the tissue distribution of marker dye following intranasal delivery in mice and chinchillas: a multifactorial analysis of parameters affecting nasal retention.</a> Vaccine. 20, 3209-3220 (2002).</li>
<li>Eyles, J. E., Spiers, I. D., Williamson, E. D., Alpar, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+radioactivity+following+intranasal+administration+of+radioactive+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of radioactivity following intranasal administration of radioactive microspheres.</a> J Pharm Pharmacol. 53, 601-607 (2001).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 282, 833-839 (2002).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+murine+intranasal+dosing+efficiency+using+luminescent+Francisella+tularensis%3A+effect+of+instillation+volume+and+form+of+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Lathem, W. W., Crosby, S. D., Miller, V. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+primary+pneumonic+plague%3A+a+mouse+model+of+infection%2C+pathology%2C+and+bacterial+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17786-17791 (2005).</li>
<li>Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+diagnostic+imaging+to+characterize+altered+respiratory+tract+colonization+by+the+Burkholderia+pseudomallei+capsule+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent diagnostic imaging to characterize altered respiratory tract colonization by the Burkholderia pseudomallei capsule mutant.</a> Front Microbiol. 2, 133(2011).</li>
<li>Gutierrez, M., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+Secretion+System+cluster+3+is+a+critical+virulence+determinant+for+lung-specific+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Submitted%22%5BJournal%5D)">Type 3 Secretion System cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis.</a> Submitted. , (2014).</li>
<li>Fodah, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+Klebsiella+pneumoniae+comparative+genetic+analyses+with+virulence+profiles+in+a+murine+respiratory+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model.</a> PLoS ONE. In revision, (2014).</li>
<li>Soto-Montenegro, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+airway+distribution+of+transnasal+solutions+in+mice+by+PET%2FCT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging.</a> Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wkraplanie IMIT oferuje kluczowe ulepszenia istniejących modeli chorób układu oddechowego w zakresie zdolności do powtarzalnego wkraplania odczynników bezpośrednio do płuc. Jest to szybkie podejście, które idealnie nadaje się dla zespołu dwóch badaczy, z których jeden zarządza logistyką znieczulenia i klatki, a drugi wykonuje technikę IMIT. Duże badania można przeprowadzać za pomocą IMIT ze średnim zaangażowaniem czasowym wynoszącym 2 - 3 minuty na mysz. Ponieważ podejście to wykorzystuje izofluran jako środek znieczulający, myszy szybko wracają do zdrowia po znieczuleniu, skracając czas hodowli zwierząt poprzez powrót do zdrowia.
Najtrudniejszym technicznie aspektem metody IMIT jest początkowy etap intubacji myszy. Osoby uczące się wykonywania IMIT są w stanie skupić się na tym pierwszym etapie zakładania cewnika i upewnieniu się, że intubacja została osiągnięta poprzez wizualne potwierdzenie ruchu barwnika. Zaletą tego podejścia jest to, że wkroplenie specyficzne dla płuc jest gwarantowane dzięki zastosowaniu potwierdzenia intubacji, co zwiększa pewność siebie zarówno nowego badacza, jak i eksperta próbującego zaintubować trudne zwierzę. Kluczowymi elementami optymalizacji prawdopodobieństwa udanej intubacji są: i) osiągnięcie głębokiej sedacji, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu pracy, ii) prawidłowe umieszczenie wzierników w jamie ustnej, aby umożliwić dobrą wizualizację nagłośni, iii) dobre umiejscowienie wzierników na głębokości, tak aby język pozostał cofnięty przez cały czas trwania zabiegu, oraz iv) wykorzystanie platformy uchylnej do podparcia rąk badacza, aby zabieg był prowadzony zrelaksowany i ze stałym podejściem.
Jedno z ograniczeń procedury IMIT jest związane z częstotliwością zakraplania IMIT. Ze względu na potencjalny uraz związany z pominiętą intubacją, nie zaleca się przeprowadzania więcej niż dwóch prób intubacji podczas jednej sesji (do dwóch nieudanych prób). IMIT ma doskonały potencjał pod względem zdolności do stosowania do dostarczania leków do płuc mysich, jednak schematy terapeutyczne, które wykorzystują bardzo częste dostarczanie odczynnika do płuc, mogą nie być odpowiednie dla IMIT. Możliwe, że IMIT może być używany codziennie do dostarczania odczynników do płuc myszy bez powodowania znacznego urazu, ale tylko wtedy, gdy jest przeprowadzany przez wysoko wykwalifikowanego badacza, ponieważ uważa się, że większość urazów związanych z intubacją jest związana z pominiętą intubacją. Taki IMIT o wysokiej częstotliwości powinien być omówiony z lokalnymi lekarzami weterynarii i IACUC.
Dodatkowym potencjalnym ograniczeniem IMIT jest rozmiar myszy, która jest intubowana. Opisana powyżej procedura IMIT została opracowana na myszach o masie około 17 - 22 g, przy czym stwierdzono, że cewnik 20 G ma odpowiedni rozmiar dla tchawicy myszy w tym zakresie wielkości. Większe cewniki są z powodzeniem stosowane u starszych myszy; początkowy rozwój IMIT wykorzystywał cewnik 18 G u myszy BALB/c o masie >20 g. Co ważne, jeśli stosowane są cewniki o alternatywnych rozmiarach, należy zaopatrzyć się w igły, które pasują do światła cewnika i są przycinane do długości wystającej zaledwie 1 mm poza końcówkę cewnika. Intubacja myszy mniejszych niż 17 g może być możliwa, ale nie jest zalecana ze względu na wymaganą wiedzę specjalistyczną i wymagałaby użycia mniejszych cewników i wzierników niż opisane powyżej.
Oprócz P. aeruginosa użyliśmy IMIT do dostarczania kilku patogenów układu oddechowego, w tym B. pseudomallei9 i Klebsiella pneumoniae10. Model IMIT poczynił ważne postępy w naszych badaniach nad chorobą układu oddechowego B. pseudomallei , identyfikując, że inokulacja donosowa powoduje wczesną, związaną z URT zachorowalność myszy, a nie punkt końcowy choroby ogólnoustrojowej obserwowany w chorobie u ludzi9. B. pseudomallei jest wybranym czynnikiem poziomu 1 o wpływie na obronę biologiczną i w związku z tym opracowywane są modele chorób układu oddechowego dla ekspozycji na aerozole, które modelują potencjalną drogę wejścia związaną z obroną biologiczną dla uzbrojonych patogenów. Ponieważ obecne modele aerozolowe powodują zakażenie zarówno URT, jak i LRT, te same potencjalne fenotypy wczesnej zachorowalności, które zidentyfikowaliśmy dla donosowego modelu choroby układu oddechowego B. pseudomallei , mogą mieć zastosowanie do modelu aerozolowego. Przyszłą adaptacją modelu IMIT może być dostarczanie aerozolu za pośrednictwem intubacji (IMAD), w którym myszy są intubowane w celu dostarczenia aerozolu docelowego tylko do płuc. Obecnie dostępne są respiratory mechaniczne do podtrzymywania znieczulenia izofluranem, które można dostosować do dostarczania prowokacji patogenami w aerozolu, a nie na bazie płynu.
IMIT został początkowo opracowany jako podejście do optymalizacji dostarczania bakterii do płuc, ale ma również zastosowanie do dostarczania innych odczynników do płuc myszy. Jak omówiono powyżej, donosowe dostarczanie związków do myszy powoduje niską wydajność, wysoce zmienne dostarczanie odczynników do docelowego narządu płuc. Donosowe podawanie odczynników do obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) do płuca myszy przyniosło 40% skuteczność dostarczania11, podczas gdy wykazaliśmy, że IMIT stanowi doskonałą alternatywę dla innych metod dostarczania do płuc dzięki skuteczności dostarczania >98% i dystrybucji wielopłatowej. Ta poprawa w zakresie celowanego dostarczania do płuc może potencjalnie zwiększyć powtarzalność dostarczania terapeutycznego w leczeniu chorób płuc. IMIT może w podobny sposób przynieść korzyści w badaniach: i) wpływu środowiskowych czynników drażniących płuca, ii) badań fenotypowych raka płuc, iii) specyficznego dla płuc knock-downu siRNA.

Myszy były używane do modelowania licznych objawów chorób ludzkich, w tym niezliczonych chorób układu oddechowego. Zastępcze modele chorób często nie są w stanie odtworzyć wszystkich aspektów modelowanej choroby, zwykle z powodu ważnych różnic fizjologicznych lub immunologicznych w dwóch modelach gospodarza. W związku z tym celem ulepszenia systemów modelowych jest opracowanie podejść, które pozwolą surogatom na dokładniejsze odzwierciedlenie procesu chorobowego lub odpowiedzi gospodarza obserwowanej w pierwotnym systemie gospodarza. Istnieje kilka kluczowych różnic fizjologicznych między myszami a ludźmi w mechanizmie, za pomocą którego inspirują powietrze. Do różnic tych zaliczają się znaczące różnice ratiometryczne w wielkości między URT a LRT. Szacuje się, że myszy mają >100 razy większą powierzchnię URT w porównaniu z ludźmi, znormalizowaną w stosunku do całkowitej pojemności płuc1,2. W ten sposób małżowiny nosowe myszy pozwalają na bardziej rozległe filtrowanie wdychanego powietrza, aby ułatwić znacznie większe tempo oddychania, co może mieć znaczący wpływ na badania nad zapaleniem płuc, jeśli infekcja jamy nosowej odgrywa znaczącą rolę w postępie choroby.
Zastosowano kilka różnych podejść do wszczepiania bakterii do płuc myszy w celu zbadania chorób układu oddechowego podobnych do ludzkich. Najczęstszym z tych podejść jest inokulacja donosowa, w której płynną zawiesinę nakłada się na jedno lub oba nozdrza myszy. Chociaż jest to stosunkowo proste, zastrzeżenia, takie jak objętość wkraplania i rodzaj zastosowanego znieczulenia, mogą wpływać na skuteczność wkraplania do LRT poprzez inokulację donosową3-5. W szczególności Miller i wsp. wykazały, że donosowe wkroplenie Francisella tularensis w objętości mniejszej niż 50 μl nie spowodowało wkroplenia bakterii do LRT6. Ponadto zaobserwowali lepsze wkraplanie LRT podczas stosowania wziewnego izofluranu w przeciwieństwie do wstrzykiwanej ketaminy/ksylazyny do znieczulenia. Jednak nasze doświadczenia z inokulacją donosową Yersinia pestis wskazują, że można osiągnąć bardziej konsekwentną inokulację przy użyciu ketaminy/ksylazyny w porównaniu z izofluranem (MBL, dane niepublikowane). Różnice te można przypisać zastosowanemu patogenowi lub różnicom w procedurach laboratoryjnych, ale co ważne, podkreślają potencjalną zmienność tej techniki. Co więcej, płuca pobrane wkrótce po wkropleniu donosowym pokazują, że stosunkowo niewielki odsetek początkowego inokulum bakteryjnego dociera do płuc (w przypadku Y. pestis tylko 10% zostało odzyskanych 1 godzinę po wkropleniu7), co sugeruje, że duża liczba bakterii może zostać zatrzymana w URT (lub połknięta do przewodu pokarmowego). W niektórych modelach chorobowych to znaczne odkładanie się bakterii na błonie śluzowej URT może zaburzyć nasze rozumienie postępu choroby, jeśli organizm jest zdolny do kolonizacji mysiej jamy nosowej w sposób niezgodny z chorobą człowieka. Na przykład, stosując obrazowanie in vivo, zaobserwowano, że Burkholderia pseudomallei, która nie kolonizuje ludzkiego URT, powoduje przytłaczającą oportunistyczną infekcję mysiej jamy nosowej, gdy jest dostarczana metodą wkraplania donosowego8.
Inne metody wszczepiania bakterii do płuc myszy również zostały wykorzystane w badaniach nad chorobami zakaźnymi. Jednak w porównaniu z wkraplaniem donosowym, metody te zwykle wymagają większej wiedzy technicznej i/lub drogiego sprzętu, nie eliminując przy tym możliwości inicjacji infekcji w wielu miejscach (np. aerozol [URT i LRT]; przezustne [przewód pokarmowy i LRT]; oraz chirurgiczne dotchawicze [LRT i krwiobieg]). Biorąc pod uwagę potencjalne powikłania, które mogą być związane z wtórnymi miejscami infekcji, staraliśmy się opracować podejście dotchawicze, które omija URT i dostarcza patogen bezpośrednio do płuc znieczulonych myszy, ale także ogranicza niezamierzone inokulację do krwiobiegu lub przewodu pokarmowego. W tym celu opracowano intubację dotchawiczą (IMIT) jako procedurę niechirurgiczną, która gwarantuje wkroplenie inokulum LRT poprzez włączenie etapu pośredniego w celu sprawdzenia prawidłowego umieszczenia cewnika przed wkropleniem. Metoda ta jest opisana przy użyciu wkraplania barwnika w celu wizualnego zademonstrowania szerokiego rozmieszczenia inokulum w płucach oraz wkraplania P. aeruginosa w celu wykazania wysoce skutecznego dostarczania (>98% inokulum) tej metody do płuc. Co ważne, chociaż pierwotnie opracowany do dostarczania bakterii, IMIT oferuje również skuteczne narzędzie do: i) wkraplania różnych cząsteczek do badania innych modeli chorób układu oddechowego, ii) dostarczania terapeutycznego specyficznego dla płuc oraz iii) podstawowych badań funkcji płuc, w tym celowanego dostarczania siRNA do płuc.

<table><tbody><tr><td>Gryzoń, uchylny stojak roboczy</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>Podstawa powinna być odłączona podczas pracy w głowicy</td></tr><tr><td>otoskopu operacyjnego</td> BSC <td>Bateria Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoskop 3,5 V Li</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Wziernik do intubacji myszy krótki, autoklawowalny</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S Pętle</td><td></td></tr><tr><td>siekacze</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A Bawełniany</td><td></td></tr><tr><td>aplikator z cienką końcówką</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&nbsp;</td><td>Służy do cofania języka</td></tr><tr><td>Cewnik dożylny, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>Opcjonalnie: załóż silikonową tuleję z odsłoniętą powierzchnią cewnika 10 mm</td></tr><tr><td>Gazoszczelna strzykawka, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Służy do dostarczania płynnego inokulum za pomocą IMIT</td></tr><tr><td>igła, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Przyciąć na długość, aby wystawać 1 mm z cewnika 20 G</td></tr><tr><td>Drut doprowadzający (drut światłowodowy, 0,5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>Cięte na długość 6": używany jako drut doprowadzający do intubacji</td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Montaż z przewodem światłowodowym jako przewodem doprowadzającym</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td><td>Rurka Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon, 1/16"</td><td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mężczyzna Luer 1/16" zadzior</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Żeński Luer 1/16" zadzior</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH lidokainy do roztworu przy 2% (w/v) pH7.0</td></tr><tr><td>Worek na próbki, 1 uncja</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U-bottom 96-dołkowa płytka, sterylna</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (imit): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Badania nad chorobami układu oddechowego zazwyczaj obejmują wykorzystanie modeli mysich jako systemów zastępczych. Istnieją jednak znaczne różnice fizjologiczne między mysim a ludzkim układem oddechowym, zwłaszcza w górnych drogach oddechowych (URT). W niektórych modelach te różnice w mysiej jamie nosowej mogą mieć znaczący wpływ na postęp choroby i jej prezentację w dolnych drogach oddechowych (LRT) podczas stosowania technik wkraplania donosowego, potencjalnie ograniczając przydatność modelu mysiego do badania tych chorób. Z tych powodów korzystne byłoby opracowanie techniki wkraplania bakterii bezpośrednio do płuc myszy w celu zbadania choroby LRT przy braku udziału URT. Nazwaliśmy tę specyficzną dla płuc technikę dostarczania intubacją za pośrednictwem intubacji (IMIT). Ta nieinwazyjna technika minimalizuje możliwość wkraplania do krwiobiegu, co może wystąpić podczas bardziej inwazyjnych tradycyjnych chirurgicznych infekcji dotchawiczych i ogranicza możliwość przypadkowego dostarczenia do przewodu pokarmowego. IMIT jest dwuetapowym procesem, w którym myszy są najpierw intubowane, z etapem pośrednim w celu zapewnienia prawidłowego umieszczenia cewnika w tchawicy, a następnie wprowadzaniem igły do cewnika, aby pośredniczyć w bezpośrednim dostarczaniu bakterii do płuc. Takie podejście ułatwia >98% skuteczność dostarczania do płuc przy doskonałej dystrybucji odczynnika w całym płucu. W związku z tym IMIT reprezentuje nowatorskie podejście do badania choroby LRT i dostarczania terapeutycznego bezpośrednio do płuc, poprawiając możliwość wykorzystania myszy jako substytutów do badania chorób układu oddechowego u ludzi. Co więcej, dokładność i powtarzalność tego systemu dostarczania sprawia, że jest on również podatny na Standardy Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLPS), a także dostarczanie szerokiej gamy odczynników, które wymagają wysokiej wydajności dostarczania do płuc.

Aby zwizualizować rozkład podanego materiału za pomocą metody IMIT, do płuc znieczurzonej myszy wprowadzono 50 µl 0,1% barwnika Coomassie Brilliant Blue. Mysz została natychmiast uśmiercona, a płuca usunięto podczas sterylnej nekropsji. Rycina 1 pokazuje, że barwnik został dostarczony do wszystkich płatów płuc.
Aby określić liczbę bakterii dostarczonych do płuc za pomocą metody IMIT, trzem grupom myszy (n = 3) podano wlewem trzy różne stężenia P. aeruginosa (1.21 x 108, 1.21x107 oraz 1.21 x 106 jednostek tworzących kolonie [CFU] w 50 µl). Bezpośrednio po wykonaniu wlewu IMIT myszy poddano eutanazji, wyjęto płuca, a następnie policzono bakterie i porównano ich liczbę z dawką inokulum (Rycina 2). Dostarczenie inokulum tą metodą jest wysoce efektywne, przy czym z płuc zwierząt po wlewie odzyskano &gt;98% inokulum. Ponadto wlew IMIT był wysoce powtarzalny, niezależnie od stężenia inokulum (R2 = 0.9951).
<img alt="Porównanie penetracji barwnika w płucach, wynik eksperymentalny, pomiar skali, analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Instylacja IMIT rozprowadza inokulum w całych płucach. Płuca myszy, którym winstylowano 50 µl 0,1% Coomassie Brilliant Blue, wykazują rozmieszczenie niebieskiego barwnika we wszystkich płatach.
<img alt="Wykres przedstawiający korelację odzysku CFU z podaniem; R²=0,9951, Odzysk=98,1%." src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Instylacja bakterii do płuc metodą IMIT. Myszy poddano instylacji P. aeruginosa, a liczbę bakterii wprowadzonych do płuc (Log10 CFU – odzyskane) porównano z szacowanym inokulum (Log10 CFU – podane). Każde koło reprezentuje CFU/płuco poszczególnej myszy (n = 3 dla każdej dawki bakterii).

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Ogólnym celem tej procedury jest nieinwazyjne dostarczenie bakterii bezpośrednio do płuc myszy. Osiąga się to poprzez załadowanie najpierw poduszki powietrznej o pojemności 150 mikrolitrów do gazoszczelnej strzykawki, a następnie 50 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny bakteryjnej. W drugim kroku znieczulona mysz jest intubowana cewnikiem o rozmiarze 20 za pomocą przewodu prowadzącego, aby pomóc w umieszczeniu.Następnie, po potwierdzeniu powodzenia intubacji za pomocą prostego przepływomierza, inokulum bakteryjne jest dostarczane przez cewnik bezpośrednio do płuc za pomocą igły o długości 22 rozmiarów. Ostatecznie, inokulacja dotchawicza za pośrednictwem intubacji lub pominięcie może być wykorzystana do badania chorób dolnych dróg oddechowych u myszy, unikając jednoczesnego zajęcia górnych dróg oddechowych. Główną przewagą imit nad metodami inokulacji międzynosowej jest to, że technika ta pozwala na dokładne i powtarzalne dostarczanie inokulum bezpośrednio do płuc.Ponieważ TIZ jest techniką niechirurgiczną, zmniejsza również ryzyko powikłań związanych z chirurgicznymi zabiegami dotchawiczymi. Chociaż metoda ta może zapewnić niezawodny mechanizm dostarczania bakterii do płuc w celu zbadania patogenezy, IMA może być również stosowana do dostarczania innych odczynników, takich jak związki środowiskowe do badania uszkodzenia płuc, docelowe dostarczanie leków do leczenia i dostarczanie sond obrazujących lub SRNA do badania podstawowej biologii płuc. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z etapem intubacji, ponieważ etap ten wymaga starannego ułożenia zwierzęcia i automatycznego zakresu do wprowadzenia prowadnika.Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ początkowe umieszczenie prowadnika w tchawicy jest koncepcyjnie trudne do opisania nowym badaczom. 15 godzin przed instalacją zaszczepij trzy mililitry kultury bulionowej pojedynczą kolonią bakteryjną i hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wytrząsarkę przy 200 obr./min. Po 15 godzinach odwiruj jeden mililitr komórek w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej i ponownie zawieś podniebienie w jednym mililitrze PBS.Następnie zmierz rozcieńczenie od 1 do 10 zawiesiny podstawowej bakterii przy OD 600, aby określić stężenie bakterii. Następnie rozcieńczyć komórki bakteryjne w PBS do pożądanego stężenia bakterii na 50 mikrolitrów inokulum. Do instalacji IIT myszy są przygotowywane do IIT, podając 2% roztwór lidokainy lekko znieczulonej myszy przez myszy z igłą do zgłębnika.Powrót do znieczulenia, gdy zaczyna działać lidokaina. Teraz wciągnij 150 mikrolitrów powietrza do strzykawki o pojemności 250 mikrolitrów typu gazowego, wyposażonej w igłę o długości 22 rozmiarów. Następnie przesuń tłok teflonowy z oznaczenia 150 mikrolitrów do oznaczenia 200 mikrolitrów na korpusie strzykawki, aby pobrać 50 mikrolitrów inokulum bakteryjnego po załadowaniu strzykawki.LA, uspokojona mysz leżąca na wznak na platformie intubacyjnej, zabezpieczająca zwierzę za siekacze na no-ringu przymocowanym do paska na rzep połączonego z platformą. Podnieś mysz do nachylenia 45 stopni, a następnie użyj aplikatora z mikrobawełny, aby cofnąć język ruchem toczenia dominującą ręką. Następnie, ręką niedominującą, użyj otoskopu operacyjnego dopasowanego do zwierciadła intubacyjnego, aby zarówno utrzymać retrakcję języka, jak i uwidocznić nagłośnię.Następnie, trzymając w dominującej ręce drut doprowadzający przewleczony przez cewnik o rozmiarze 20, zaintubuj mysz na głębokość 10 milimetrów w tchawicy i wyjmij otoskop. Zabezpiecz cewnik ręką niedominującą. Następnie na krótko przymocuj do cewnika połączoną z przynętą długość jednej szesnastej przezroczystej rurki zawierającej kolorowy barwnik.Barwnik powinien szybko migrować tam iz powrotem w odpowiedzi na oddech zwierzęcia, gdy zwierzę zostało pomyślnie zaintubowane. Włóż igłę o rozmiarze 22 do cewnika i dozuj inokulum bezpośrednio do płuc jednym ruchem płynu. Następnie natychmiast wyjmij igłę i cewnik ze zwierzęcia i wróć do klatki z monitorowaniem, aż zwierzę w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.Aby ocenić obciążenie bakteryjne zakażonej tkanki płucnej, usuń płuca za pomocą sterylnej techniki i umieść tkankę w sterylnej, wstępnie zważonej torbie na próbkę o wadze jednej uncji. Po zważeniu worka na próbkę wraz z płucami, dodaj jeden mililitr sterylnego PBS do tkanki i odsprzedaj worek na próbkę. Następnie delikatnie przetoczyć 25-mililitrową pipetę serologiczną po worku na próbkę, aby homogenizować tkankę.Usunąć połączoną tkankę przez sterylny poliestrowy filtr ścienny i potraktować homogenat trittonem X 100 o końcowym stężeniu 1%, aby uwolnić bakterie. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przeprowadzić sześciokrotne seryjne rozcieńczanie homogenatu na płytce UBO 96-dołkowej. Następnie użyj ośmiodołkowego wielokanałowego roztworu, aby ułożyć homogenat trzykrotnie po 10 mikrolitrów na płytce agarowej LBA.Na koniec inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i policz jednostki tworzące kolonię następnego dnia. Dostarczanie bakterii jest bardzo wydajne dzięki tej metodzie, ponieważ ponad 98% inokulum Pseudomonas aerogen zostało odzyskane z płuc wszczepionych zwierząt w tym reprezentatywnym doświadczeniu. Co więcej, instalacja IIT jest wysoce powtarzalna niezależnie od stężenia podawanego inokulum.Aby zobrazować rozkład wkroplonego materiału za pomocą metody IIT, do płuc można dostarczyć 50 mikrolitrów 0,1% brylantowego niebieskiego barwnika Kumasi, jak właśnie wykazano dla inokulum. Zwróć uwagę, że dystrybucja barwnika do wszystkich płatów płuc po opanowaniu. Metodę tę można szybko wykonać w zespole dwóch badaczy w średnim czasie od dwóch do trzech minut, wliczając w to znieczulenie, inokulację IMA i powrót do zdrowia po znieczuleniu.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby nie podejmować więcej niż dwóch nieudanych prób intubacji myszy. Nieudana intubacja może spowodować potencjalny uraz spowodowany wprowadzeniem cewnika do przełyku, a nie do tchawicy. Wiele patogenów układu oddechowego, w tym te wymagające hermetyzacji abs L 3, może być skutecznie zwalczanych przez imed, ponieważ procedura ta może być wykonywana, jak pokazano w szafach bezpieczeństwa, a dodatkowo przez badaczy noszących pełną ochronę dróg oddechowych, w tym osłonę twarzy.Wykazaliśmy, że imit jest bardzo dokładną i wydajną metodą dostarczania materiałów bezpośrednio do płuc myszy. Właściwości te sprawiają, że imit dobrze nadaje się do badań typu GLP, które wymagają wysoce powtarzalnych systemów modelowych.

intubation-mediated-intratracheal-imit-instillation-noninvasive-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Intubacyjna wewnątrztchawiczna instilacja (IMIT): Nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Instylacje wewnątrzkrtaniowe pozwalają na dostarczanie substancji bezpośrednio do płuc. Procedura ta umożliwia wprowadzenie instylatu do dystalnych obszarów płuc, dlatego jest często stosowana w badaniach nad pęcherzykami pęcherzykowymi. Przedstawiamy szczegółowy protokół dla zwierząt przeżywalnych dotyczący wykonywania instylacji wewnątrzkrtaniowych u myszy.

Bezpośrednia instylacja substancji rozpuszczonych do tchawicy myszy w celu podania do płuc

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film opisuje podejście dooskrzelowe polegające na selektywnym podawaniu eksperymentalnego środka do dystalnego prawego i lewego płuca. W przedstawionym protokole będziemy podawać bleomycynę dooskrzelowo myszy, aby uzyskać lepszy model zwłóknienia płuc.

Podawanie dooskrzelowe: technika selektywnego podawania eksperymentalnego środka do płuc myszy

Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.

Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Preparaty suchego proszku do inhalacji mają ogromny potencjał w leczeniu chorób układu oddechowego. Przed przystąpieniem do badań na ludziach konieczna jest ocena skuteczności preparatu w postaci suchego proszku w badaniach przedklinicznych. Przedstawiono prostą i nieinwazyjną metodę podawania suchego proszku myszom drogą dotchawiczą.

Dotchawicze podawanie preparatu suchego proszku myszom

Ta technika bezpośredniego wstrzykiwania leków do tchawicy noworodków gryzoni jest ważna w badaniu wpływu lokalnie podawanych leków lub leków biologicznych na choroby płuc u noworodków. Dodatkowo metoda ta może być również stosowana do wywoływania uszkodzenia płuc w modelach zwierzęcych.

Minimalnie inwazyjna metoda dotchawniczego wkraplania leków u nowonarodzonych gryzoni w leczeniu chorób płuc

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

Ten protokół pokazuje, jak optymalne ustawienie myszy i transoralne wprowadzenie otoskopu opartego na kamerze umożliwia wizualizację głośni, szybką intubację przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i stałe dostarczanie płynu do płuc.

Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Poznaj metodę IMIT do nieinwazyjnego dostarczania bakterii bezpośrednio do płuc myszy. Technika ta umożliwia precyzyjne i powtarzalne badanie chorób układu oddechowego z odzyskiem ponad 98% inokulum.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Przeglądaj więcej filmów