Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania
17 listopada 2014
Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest nieinwazyjne dostarczenie bakterii bezpośrednio do płuc myszy. Osiąga się to poprzez załadowanie najpierw poduszki powietrznej o pojemności 150 mikrolitrów do gazoszczelnej strzykawki, a następnie 50 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny bakteryjnej. W drugim kroku znieczulona mysz jest intubowana cewnikiem o rozmiarze 20 za pomocą przewodu prowadzącego, aby pomóc w umieszczeniu.
Następnie, po potwierdzeniu powodzenia intubacji za pomocą prostego przepływomierza, inokulum bakteryjne jest dostarczane przez cewnik bezpośrednio do płuc za pomocą igły o długości 22 rozmiarów. Ostatecznie, inokulacja dotchawicza za pośrednictwem intubacji lub pominięcie może być wykorzystana do badania chorób dolnych dróg oddechowych u myszy, unikając jednoczesnego zajęcia górnych dróg oddechowych. Główną przewagą imit nad metodami inokulacji międzynosowej jest to, że technika ta pozwala na dokładne i powtarzalne dostarczanie inokulum bezpośrednio do płuc.
Ponieważ TIZ jest techniką niechirurgiczną, zmniejsza również ryzyko powikłań związanych z chirurgicznymi zabiegami dotchawiczymi. Chociaż metoda ta może zapewnić niezawodny mechanizm dostarczania bakterii do płuc w celu zbadania patogenezy, IMA może być również stosowana do dostarczania innych odczynników, takich jak związki środowiskowe do badania uszkodzenia płuc, docelowe dostarczanie leków do leczenia i dostarczanie sond obrazujących lub SRNA do badania podstawowej biologii płuc. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z etapem intubacji, ponieważ etap ten wymaga starannego ułożenia zwierzęcia i automatycznego zakresu do wprowadzenia prowadnika.
Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ początkowe umieszczenie prowadnika w tchawicy jest koncepcyjnie trudne do opisania nowym badaczom. 15 godzin przed instalacją zaszczepij trzy mililitry kultury bulionowej pojedynczą kolonią bakteryjną i hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wytrząsarkę przy 200 obr./min. Po 15 godzinach odwiruj jeden mililitr komórek w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej i ponownie zawieś podniebienie w jednym mililitrze PBS.
Następnie zmierz rozcieńczenie od 1 do 10 zawiesiny podstawowej bakterii przy OD 600, aby określić stężenie bakterii. Następnie rozcieńczyć komórki bakteryjne w PBS do pożądanego stężenia bakterii na 50 mikrolitrów inokulum. Do instalacji IIT myszy są przygotowywane do IIT, podając 2% roztwór lidokainy lekko znieczulonej myszy przez myszy z igłą do zgłębnika.
Powrót do znieczulenia, gdy zaczyna działać lidokaina. Teraz wciągnij 150 mikrolitrów powietrza do strzykawki o pojemności 250 mikrolitrów typu gazowego, wyposażonej w igłę o długości 22 rozmiarów. Następnie przesuń tłok teflonowy z oznaczenia 150 mikrolitrów do oznaczenia 200 mikrolitrów na korpusie strzykawki, aby pobrać 50 mikrolitrów inokulum bakteryjnego po załadowaniu strzykawki.
LA, uspokojona mysz leżąca na wznak na platformie intubacyjnej, zabezpieczająca zwierzę za siekacze na no-ringu przymocowanym do paska na rzep połączonego z platformą. Podnieś mysz do nachylenia 45 stopni, a następnie użyj aplikatora z mikrobawełny, aby cofnąć język ruchem toczenia dominującą ręką. Następnie, ręką niedominującą, użyj otoskopu operacyjnego dopasowanego do zwierciadła intubacyjnego, aby zarówno utrzymać retrakcję języka, jak i uwidocznić nagłośnię.
Następnie, trzymając w dominującej ręce drut doprowadzający przewleczony przez cewnik o rozmiarze 20, zaintubuj mysz na głębokość 10 milimetrów w tchawicy i wyjmij otoskop. Zabezpiecz cewnik ręką niedominującą. Następnie na krótko przymocuj do cewnika połączoną z przynętą długość jednej szesnastej przezroczystej rurki zawierającej kolorowy barwnik.
Barwnik powinien szybko migrować tam iz powrotem w odpowiedzi na oddech zwierzęcia, gdy zwierzę zostało pomyślnie zaintubowane. Włóż igłę o rozmiarze 22 do cewnika i dozuj inokulum bezpośrednio do płuc jednym ruchem płynu. Następnie natychmiast wyjmij igłę i cewnik ze zwierzęcia i wróć do klatki z monitorowaniem, aż zwierzę w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
Aby ocenić obciążenie bakteryjne zakażonej tkanki płucnej, usuń płuca za pomocą sterylnej techniki i umieść tkankę w sterylnej, wstępnie zważonej torbie na próbkę o wadze jednej uncji. Po zważeniu worka na próbkę wraz z płucami, dodaj jeden mililitr sterylnego PBS do tkanki i odsprzedaj worek na próbkę. Następnie delikatnie przetoczyć 25-mililitrową pipetę serologiczną po worku na próbkę, aby homogenizować tkankę.
Usunąć połączoną tkankę przez sterylny poliestrowy filtr ścienny i potraktować homogenat trittonem X 100 o końcowym stężeniu 1%, aby uwolnić bakterie. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przeprowadzić sześciokrotne seryjne rozcieńczanie homogenatu na płytce UBO 96-dołkowej. Następnie użyj ośmiodołkowego wielokanałowego roztworu, aby ułożyć homogenat trzykrotnie po 10 mikrolitrów na płytce agarowej LBA.
Na koniec inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i policz jednostki tworzące kolonię następnego dnia. Dostarczanie bakterii jest bardzo wydajne dzięki tej metodzie, ponieważ ponad 98% inokulum Pseudomonas aerogen zostało odzyskane z płuc wszczepionych zwierząt w tym reprezentatywnym doświadczeniu. Co więcej, instalacja IIT jest wysoce powtarzalna niezależnie od stężenia podawanego inokulum.
Aby zobrazować rozkład wkroplonego materiału za pomocą metody IIT, do płuc można dostarczyć 50 mikrolitrów 0,1% brylantowego niebieskiego barwnika Kumasi, jak właśnie wykazano dla inokulum. Zwróć uwagę, że dystrybucja barwnika do wszystkich płatów płuc po opanowaniu. Metodę tę można szybko wykonać w zespole dwóch badaczy w średnim czasie od dwóch do trzech minut, wliczając w to znieczulenie, inokulację IMA i powrót do zdrowia po znieczuleniu.
Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby nie podejmować więcej niż dwóch nieudanych prób intubacji myszy. Nieudana intubacja może spowodować potencjalny uraz spowodowany wprowadzeniem cewnika do przełyku, a nie do tchawicy. Wiele patogenów układu oddechowego, w tym te wymagające hermetyzacji abs L 3, może być skutecznie zwalczanych przez imed, ponieważ procedura ta może być wykonywana, jak pokazano w szafach bezpieczeństwa, a dodatkowo przez badaczy noszących pełną ochronę dróg oddechowych, w tym osłonę twarzy.
Wykazaliśmy, że imit jest bardzo dokładną i wydajną metodą dostarczania materiałów bezpośrednio do płuc myszy. Właściwości te sprawiają, że imit dobrze nadaje się do badań typu GLP, które wymagają wysoce powtarzalnych systemów modelowych.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nieinwazyjną metodę dostarczania bakterii bezpośrednio do płuc myszy za pomocą instylacji wewnątrztacheowej z wykorzystaniem intubacji (IMIT). Technika ta umożliwia dokładne i powtarzalne podawanie środków terapeutycznych i jest odpowiednia do badania chorób układu oddechowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad chorobami układu oddechowego
- Badania przedkliniczne
- Nieinwazyjne techniki dostarczania
Wstęp
- IMIT jest szybką i powtarzalną metodą prowadzenia badań nad płucami.
- Pozwala ona uniknąć powikłań związanych z procedurami chirurgicznymi.
- Metoda ta może być również wykorzystywana do podawania leków oraz w badaniach obrazowych.
- Wstępna nauka może być wymagająca ze względu na etap intubacji.
Cel badania
- W celu bezpośredniego podania inokulum bakteryjnego do płuc myszy.
- W celu badania chorób dolnych dróg oddechowych bez angażowania górnych dróg oddechowych.
- W celu zaprezentowania niezawodnej metody oceny obciążenia bakteryjnego.
Zastosowane metody
- Przygotowanie hodowli bakteryjnej i inokulum.
- Intubacja znieczulonych myszy z wykorzystaniem drutu prowadzącego i cewnika.
- Podanie inokulum do płuc za pomocą tępej igły.
- Ocena miana bakterii poprzez homogenizację tkanek i wysiew na podłoża.
Główne wyniki
- Z płuc odzyskano ponad 98% inokulum.
- Metoda jest wysoce powtarzalna, niezależnie od stężenia inokulum.
- Demonstracja wizualna pomaga w opanowaniu techniki intubacji.
- Procedurę można przeprowadzić w 2-3 minuty przy udziale zespołu.
Wnioski
- IMIT jest skuteczną metodą badania chorób płuc u myszy.
- Zapewnia ona niezawodny mechanizm dostarczania terapeutyków.
- Szkolenie i praktyka są niezbędne do prawidłowego przeprowadzenia intubacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Instylacja IMIT umożliwia wysoce wydajne, swoiste dla płuc dostarczanie substancji w modelach mysich, bezpośrednio niwelując luki translacyjne wynikające z różnic w górnych drogach oddechowych między myszami a ludźmi. Ta nieinwazyjna metoda wspiera odtwarzalne modelowanie chorób dolnych dróg oddechowych oraz dostarczanie terapeutyków, zwiększając pewność prognostyczną w portfolio badań nad lekami na schorzenia układu oddechowego. Zgodność z zasadami GLP oraz powtarzalność operacyjna czynią tę metodę strategicznym zasobem w preklinicznych potokach badawczych nad układem oddechowym.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów chorób dolnych dróg oddechowych bez wpływu czynników zakłócających z górnych dróg oddechowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez izolowanie biologicznych odpowiedzi specyficznych dla płuc.
- Zwiększa pewność predykcyjną modeli chorób układu oddechowego stosowanych w wczesnej selekcji.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli mysich do późniejszych badań przesiewowych pod kątem skuteczności i toksyczności.
- Zapewnia wysoką powtarzalność i ilościowe wyniki w zakresie obciążenia bakteryjnego oraz rozkładu odczynników.
- Umożliwia standaryzowane i skalowalne procedury dostarczania związków lub sond do płuc.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Przybliża modele mysie do przebiegu chorób dolnych dróg oddechowych u ludzi, zwiększając istotność translacyjną.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając precyzyjne interwencje celowane w płuca.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez minimalizację dostarczania preparatów poza obszar docelowy oraz ograniczenie powikłań proceduralnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Instylacja IMIT znajduje zastosowanie na styku wczesnego etapu odkryć i walidacji przedklinicznej, umożliwiając rzetelne testowanie hipotez oraz standaryzację modeli w badaniach nad chorobami układu oddechowego.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do izolowania efektów specyficznych dla płuc i wyjaśniania ścieżek chorobowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki dotyczące obciążenia bakteryjnego i dystrybucji odczynników.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównanie warunków eksperymentalnych dzięki wysokiej wydajności dostarczania i odzyskiwania.
- Badania translacyjne: Zwiększa wierność modelu w badaniach przedklinicznych nad terapiami i interwencjami w obrębie układu oddechowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje standaryzowaną, zgodną z zasadami GLP metodę, którą można dostosować do różnorodnych potrzeb badawczych ukierunkowanych na płuca.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach układu oddechowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką powtarzalność, standaryzację i skalowalność w przypadku dostarczania substancji specyficznych dla płuc.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfelach produktów do chorób układu oddechowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów dotyczących chorób układu oddechowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza techniczna w zakresie intubacji myszy oraz zarządzania znieczuleniem.
- Konieczny jest dostęp do specjalistycznych strzykawek, cewników i przepływomierzy w celu zapewnienia dokładnego podawania.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa dla zapewnienia powtarzalności i zgodności z zasadami GLP.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych odczynników, jednak wstępne szkolenie jest kluczowe dla sukcesu procedury.
- Zastosowanie ograniczone do modeli, w których bezpośrednie podanie do płuc jest uzasadnione mechanistycznie i wsparte celami badania.
