Name: Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę różnicowania nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek iPS przy użyciu techniki mikrowirowej i różnych rozmiarów ciał zarodkowych. Ta technika zwiększa wydajność uzyskiwania komórek RPE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opinie lub twierdzenia zawarte tutaj są prywatnymi poglądami autorów i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające poglądy Departamentu Armii lub Departamentu Obrony. Badania te zostały przeprowadzone w czasie, gdy autorzy Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene i Jae-Hyek Choi odbyli staż podoktorski w USAISR. Prace te były wspierane przez U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) oraz Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Przygotowanie odczynników do hodowli i płytek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez karmy, dodając 100 ml 5x suplementu bez surowicy do 400 ml pożywki bazowej dla komórek macierzystych. Pożywka jest stabilna w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni i w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.</li>
	<li>Dodać 10 μM roztworu związanego z rho, zwiniętego zwoju zawierającego inhibitor kinazy białkowej (Rock) (Y-27362) do dostępnej w handlu pożywki do tworzenia ciał zarodkowych (EB).</li>
	<li>Przygotować pożywkę różnicującą, dodając 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 2 mM L-glutaminy, 10% zamiennika surowicy nokautującej (KSR) i 10 μg/ml gentamycyny do zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę iPS-RPE, dodając 1x suplement N1, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 250 μg/ml tauryny, 13 ng/ml soli sodowej trójjodo-L-tyroniny, 20 ng/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml gentamycyny i 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) 21 do minimum niezbędnego orła (MEM). Dostosować pH do 7,4.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy soli sodowej trijodo-L-tyroniny. Rozpuścić 1 mg soli sodowej trijodo-L-tyroniny w 1 N wodorotlenku sodu, delikatnie obracając. Dodać 49 ml MEM, aby uzyskać 50 ml 20 μg/ml soli sodowej trójjodo-L-tyroniny. Przygotować porcje i zamrozić w temperaturze -20 °C do czasu, aż będą potrzebne. Użyj odpowiedniej objętości, aby osiągnąć pożądane stężenie w końcowej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy hydrokortyzonu. Rozpuścić 1 mg hydrokortyzonu w 1 ml 100% etanolu przez delikatne mieszanie. Dodać 19 ml MEM, aby uzyskać 20 ml roztworu podstawowego hydrokortyzonu o stężeniu 50 μg/ml. Porcjować i zamrażać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Użyj odpowiedniej objętości, aby osiągnąć pożądane stężenie w końcowej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy dypazy o stężeniu 1 mg/ml w DMEM/F12.</li>
	<li>Przygotowanie płyt pokrytych matrycą
	<ol>
		<li>Przygotować matrycę białkową ekstrahowaną z komórek mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) w DMEM/F12 do 0,08 mg/ml. Pokryj każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 1 ml roztworu matrycy. Inkubować powlekane płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Po 1 godzinnej inkubacji odessać nadmiar DMEM/F12. Dodać 0,5 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych bez podajnika, aby zapobiec wysuszeniu studzienek. Płyty pokryte matrycą są gotowe do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować płytki mikrodołkowe, przepłukując każdą studzienkę 2 ml DMEM/F12. Usunąć DMEM/F12 i dodać 0,5 ml pożywki do tworzenia EB uzupełnionej inhibitorem skał do każdej studzienki. Odwirować płytkę o masie 2 000 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Przygotować bufor barwiący FACS, mieszając 2% FBS i 0,09% azydku sodu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). Dostosować bufor do pH 7,4.</li>
	<li>Przygotuj roztwór neutralizujący trypsynę, dodając 10% FBS do DMEM/F12.</li>
</ol>
2. Kultura iPS
<ol>
	<li>Przed wysiewem komórek iPS należy podgrzać pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez karmnika do temperatury 37 °C i przygotować płytki pokryte matrycą.</li>
	<li>Szybko rozmrozić ogniwa IMR90-1 iPS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie wyjąć kriofiolkę z łaźni wodnej i przetrzeć fiolkę 70% etanolem. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 2 ml, aby zminimalizować pękanie grudek komórek.</li>
	<li>Kroplami dodaj 5 ml ciepłej pożywki do hodowli komórek macierzystych bez karmnika do komórek i delikatnie wymieszaj. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ostrożnie ponownie zawiesić grudki komórek w 2 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych bez podajnika i wysiać grudki komórek w dołkach płytki pokrytej matrycą. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C o wilgotności 5%CO 2 i wilgotności 95%.</li>
	<li>Codziennie zmieniaj pożywkę do hodowli komórek iPS. Obserwuj niezróżnicowane kolonie od pięciu do siedmiu dni po wysianiu. Sprawdź, czy pod mikroskopem świetlnym nie ma niezróżnicowanych kolonii, które są gotowe do przejścia (kolonie o gęstym środku).</li>
</ol>
3. Pasażowanie komórek iPS
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem pasażu komórek iPS należy ogrzać roztwór dispazy, DMEM/F12 i pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez podawania do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przed pasażowaniem komórek iPS należy usunąć wszelkie obszary różnicowania, zeskrobując obszar i odsysając pożywkę. Ostrożnie przepłucz komórki iPS za pomocą 2 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1 mg/ml dypazy do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut. Odessać dypazę i delikatnie przepłukać kolonie komórkowe 2 ml DMEM/F12 dwa razy. Po wypłukaniu dodaj 2 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych bez podawania do każdego dołka.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 5 ml delikatnie zeskrobać kolonie płytki, aby utworzyć grudki komórek. Przenieść oderwane grudki komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj wystarczającą ilość pożywki do hodowli komórek macierzystych bez karmienia, aby zasiać następne pasaże komórek.</li>
</ol>
4. Generowanie EB za pomocą płytek Microwell
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki iPS
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z komórek iPS i przepłukać komórki iPS 2 ml DMEM/F12. Dodać 750 μl akutazy do komórek iPS w każdym dołku płytki 6-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić oderwaniu się komórek od płytki (około 5-10 min).</li>
		<li>Za pomocą pipety delikatnie oddzielić pozostałe komórki i odłączyć wszelkie pozostałe komórki na powierzchni płytki. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać płytkę 5 ml DMEM/F12 i połączyć przepłukany DMEM/F12 z komórkami w stożkowej probówce. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć wszelkie możliwe resztki skrzepów komórek.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia akutazy. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do tworzenia EB tak, aby stężenie komórek wynosiło około 0,5-1,0 x 107 komórek/ml.</li>
		<li>Określ liczbę żywotnych komórek, licząc komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja gęstości komórek w mikrostudzienkach w celu utworzenia EB o kontrolowanej wielkości
	<ol>
		<li>Dostosuj liczbę komórek do każdego dołka płytki mikrodołkowej, aby wygenerować pożądane rozmiary EB. Dodaj komórki do mikrostudzienek płytek przygotowanych w kroku 1.9, równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie pipetując komórki kilka razy. 
		UWAGA: Liczba komórek wymaganych na studzienkę = żądana liczba komórek na EB x liczba mikrodołków na studzienkę.</li>
		<li>Doprowadzić pożywkę do tworzenia EB uzupełnioną inhibitorem skały w studzienkach do końcowej objętości 2,0 ml. Rozprowadzić komórki, delikatnie pipetując każdą studzienkę. Odwirować płytki mikrodołkowe o masie 100 x g przez 3 minuty. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95% przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie EB z płytek mikrodołkowych
	<ol>
		<li>Zebrać EB z mikrostudzienek, pipetując pożywkę w studzience w górę i w dół za pomocą mikropipetora o pojemności 1 ml w celu usunięcia większości EB. Przepuścić zawiesinę EB przez odwrócone sitko o wielkości 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml w celu usunięcia pojedynczych komórek.</li>
		<li>Umyj płytkę mikrodołkową 5 razy 1 ml DMEM/F12, aby usunąć wszystkie EBs. Zebrać popłuczyny i przepuścić przez sitko z odwróconymi komórkami. Obróć sitko do komórek prawą stroną do góry do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zebrać EBs, przemywając pożywką do tworzenia EB. Policz EBs, aby określić wydajność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Poszycie EB i inicjowanie różnicowania
<ol>
	<li>Płytkować EB na matrycy białkowej pokrytej sześciodołkowymi płytkami (jak w kroku 1.8.1) o gęstości < 1,000 EB/studzienkę w pożywce do tworzenia EB plus 10 μM Inhibitor skały. Inkubować EB w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% przez 24 godziny.</li>
	<li>24 godziny po posiewie EB zastąp pożywką różnicującą, aby zainicjować różnicowanie. Zmieniaj połowę pożywki różnicującej co drugi dzień, aż komórki zostaną zebrane do dalszej analizy.</li>
	<li>Pobrać próbki w 6, 17, 29 i 60 dniu, aby przeprowadzić RT-PCR, immunocytochemię i FACS w celu walidacji ekspresji charakterystycznych genów i białek RPE.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja RNA i PCR
<ol>
	<li>Ekstrahować RNA z próbek EB zgodnie z instrukcjami zawartymi w dostępnym na rynku zestawie. Określ stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję na 100 ng całkowitego RNA zgodnie z dostępnym na rynku zestawem odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR z 10 ng cDNA przy użyciu następujących starterów (Tabela 1) w stężeniu 10 μmol / 10 ng cDNA. Ustawić PCR w następujący sposób: denaturować DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut, amplifikować w 35 cyklach w temperaturze 95 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 1 minutę, a następnie cykl końcowy w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Uruchom produkt PCR na 1% żelu agarozowym.</li>
</ol>
7. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Przemyć EBs za pomocą PBS dwa razy w temperaturze pokojowej skutków. Utrwalić EBs w temperaturze pokojowej w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut. Spłukać raz PBS w temperaturze pokojowej stężenia. Przechowywać próbki w PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia do barwienia.</li>
	<li>W dniu barwienia potraktuj utrwalone komórki odczynnikami do utrwalania i przepuszczalności. Próbki inkubować z roztworem blokującym (10% surowica kozia w roztworze przepuszczalnym) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przeprowadzić immunochemię w 10% surowicy koziej w roztworze przepuszczalnym, stosując następujące przeciwciała pierwszorzędowe we wskazanych rozcieńczeniach: anty-Pax6 (1:10), anty-RX (1:200), anty-MITF (1:30) i anty-ZO1 (1:100). Inkubować próbki z odpowiednimi przeciwciałami O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia usuń pierwotne przeciwciało z komórek i trzykrotnie przepłucz próbki PBS. Próbki inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało drugorzędowe z komórek i przepłukać próbki trzykrotnie w PBS. Zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych z medium montażowym zawierającym DAPI i pozostawić próbki do zastygnięcia O/N w ciemnej komorze. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić barwienie.</li>
</ol>
8. Barwienie do analizy FACS
<ol>
	<li>Umyj wyhodowane EB w PBS dwa razy. Inkubować EB z 0,5 ml 0,25% trypsyny przez 5-10 minut, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Zneutralizować trypsynę roztworem neutralizującym trypsynę (1 ml/studzienkę).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę jednokomórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 600 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml DMEM/F12 do komórek w probówce. Delikatnie odwróć, aby wymieszać komórki. Wirować przy 600 x g. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym FACS.</li>
	<li>Policz łączną liczbę komórek. Wirować przy 600 x g przez 10 min. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Natychmiast utrwal komórki, dodając 0,5 ml 4% paraformaldehydu. Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Delikatnie wiruj, aby rozbić osad komórkowy. Przepuszczalność komórek przez dodanie 1 ml schłodzonego roztworu przepuszczalnego. Delikatnie mieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Dodać 3 ml buforu barwiącego FACS i ponownie zawiesić. Powtórz ten krok jeszcze raz. Zawiesić komórki w buforze barwiącym FACS w końcowym stężeniu 5 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieś 100 μl zawiesiny komórek (0,5 x 106 komórek) do każdej probówki do mikrofuge i dodaj zalecaną objętość przeciwciała pierwszorzędowego. W przypadku Pax6 dodaj 5 μl PE anty-Pax6 do 100 μl zawiesiny komórek. W przypadku MITF dodać 5 μl anty-MITF do 100 μl zawiesiny komórek.</li>
	<li>Wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Dodać 3 ml buforu barwiącego FACS. Mieszać i odwirowywać w sile 600 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i powtórzyć czynności opisane w 8.16 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>W przypadku barwienia MITF inkubować komórki w przeciwciałie drugorzędowym, kozie anty-mysim Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu 1:2,000 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. W przypadku barwienia Pax6 unikaj tego kroku.</li>
	<li>Przemyć komórki 5 ml buforu barwiącego FACS i odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Powtórzyć proces jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu barwiącego FACS i delikatnie odwirować, aby rozbić osad komórkowy. Próbki są gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
9. Izolacja i kultura iPS-RPE
<ol>
	<li>W 29 dniu ostrożnie przeciąć wybrane pigmentowane kolonie z płytki hodowlanej za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl. Przenieść pływające kolonie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować kolonie przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić kolonie komórkowe w 10 ml DMEM/F12 i odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę jednokomórkową, inkubując kolonie z 2 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 7-10 minut. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, aby oddzielić kolonie.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę, dodając 2 ml pożywki iPS-RPE. Wirować przy 600 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant. Zawiesić pojedyncze komórki w 2 ml pożywki iPS-RPE. Przenieść komórki na 6-dołkową płytkę pokrytą matrycą białkową i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Ukrohne, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4+reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+outside+the+liver%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. 2012, 140427(2012).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li>
<li>Cour la, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Organ+Biology%22%5BJournal%5D)">The Retinal Pigment Epithelium.</a> Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).</li>
<li>Vaajassari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+defined+and+xeno-free+differentiation+of+functional+human+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Mol Vis. 17, 558-575 (2011).</li>
<li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+uptake%2C+processing%2C+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).</li>
<li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+embryoid+body+formation%3A+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust%2C+reproducible+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com">http://www.stemcell.com</a> (2010).</li>
<li>The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: 
 <a target="_blank" href="http://archive.today/0qTh">http://archive.today/0qTh</a> (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby w pełni wykorzystać potencjał pluripotencjalnych komórek macierzystych w terapii komórkowej, konieczne jest regulowanie ich różnicowania w sposób konsekwentny i powtarzalny. W niniejszym raporcie opisano protokoły tworzenia EB o kontrolowanej wielkości przy użyciu technologii płytek mikrodołkowych, inicjowania różnicowania w kierunku RPE oraz identyfikacji markerów białkowych i genowych RPE. Aby zsynchronizować różnicowanie in vitro , jednorodne rozmiary EB utworzono za pomocą znanej liczby komórek iPS odwir...

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) to rodzaj pluripotencjalnych komórek macierzystych uzyskanych przez przeprogramowanie dorosłych komórek za pomocą czynników zewnętrznych1. Natomiast embrionalne komórki macierzyste (ESC), inny rodzaj pluripotencjalnych komórek macierzystych, są generowane z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty2-3. Pomimo swojego odmiennego pochodzenia, komórki iPS i ESC są porównywalne pod względem nieograniczonej zdolności do replikacji in vitro oraz zdolności do różnicowania się w dowolny typ komórek4-5. Te cechy komórek iPS sprawiają, że są one idealnymi kandydatami do zastosowań w spersonalizowanej medycynie regeneracyjnej. Ostatnie wysiłki badawcze koncentrują się na opracowaniu solidnych protokołów różnicowania do wytwarzania wyspecjalizowanych dorosłych komórek, w tym nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE)6-11.
Dla potencjalnych zastosowań klinicznych komórek pochodzących z iPS, niezbędne jest ukierunkowane różnicowanie dla tego konkretnego typu komórek. Opublikowano różne metody ukierunkowanego różnicowania zarówno komórek ESC, jak i iPS w RPE, które różnią się znacznie pod względem wydajności6-7, 12-16. Nadal nie znamy wielu zdarzeń molekularnych, które rządzą losem komórki/tkanki podczas rozwoju lub różnicowania. W ostatnich latach podjęto wysiłki w celu opracowania protokołu różnicowania, który może w jak największym stopniu naśladować rozwój embrionalny. Podczas fazy blastocysty niezaangażowana populacja komórek macierzystych znajduje się razem w trójwymiarowym mikrośrodowisku. W związku z tym zastosowano różne strategie, aby komórki ESC/iPS zostały połączone ze sobą i wyhodowane w trzech wymiarach. Te agregaty komórek macierzystych nazywane są ciałami embrionoidalnymi (EB). Badania wykazały, że różnicowanie komórek macierzystych EB naśladuje wczesny etap rozwoju zarodka i może spontanicznie prowadzić do powstania prymitywnej endodermy na jego zewnętrznej powierzchni. Później, wraz z postępem rozwoju EB, pojawiają się zróżnicowane fenotypy komórek wszystkich trzech linii zarodkowych17-18. W związku z tym protokoły różnicowania oparte na EB przyciągnęły wiele uwagi w zakresie różnicowania in vitro komórek ESC/iPS i są dobrym kandydatem do generowania RPE z pluripotencjalnych komórek macierzystych13.
EBs można tworzyć za pomocą kilku metod z komórek ESC/iPS. Początkowo EB wytwarzano poprzez zeskrobywanie przylegających kolonii i utrzymywanie ich w nieprzylegającej kulturze zawiesinowej. Jednak takie podejście daje niejednorodną populację EB, która powoduje niską odtwarzalność. Hodowla komórek opadowych w zawieszeniu i tworzenie EB na bazie mikrostudzienek to inne popularne techniki tworzenia EB, które dają jednorodne EB o określonych rozmiarach, które są wysoce powtarzalne. Co więcej, technika mikrostudzienki może dać dużą liczbę kruszyw przy mniejszym wysiłku.
Różnicowanie komórek w obrębie EB jest regulowane przez multipleks morfogennych sygnałów z zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego mikrośrodowiska. W przeciwieństwie do różnicowania w formacie jednowarstwowym, EB stanowią platformę do złożonego składania komórek i zachodzenia sygnalizacji międzykomórkowej17. Co ciekawe, zaobserwowano, że liczba pluripotencjalnych komórek macierzystych wykorzystywanych do wytwarzania pojedynczych EB wpływa na losy komórek. Na przykład w badaniu różnicowania układu krwiotwórczego ludzkich ESC zaobserwowano, że 500-komórkowa EB promowała różnicowanie w kierunku linii szpikowej, podczas gdy 1000-komórkowa EB przesuwała się w kierunku linii erytroidalnej20. W innym badaniu mniejsze EB sprzyjały różnicowaniu endodermy, podczas gdy większe EB sprzyjały różnicowaniu neuroektodermy1, 17.
Te wcześniejsze badania zdecydowanie sugerują, że liczba komórek ESC/iPS używanych do wytwarzania indywidualnych EB wpływa na różnicowanie EB na podstawie dowolnych typów komórek. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, nie ma obecnie żadnych badań, które wyjaśniłyby wpływ wielkości EB na jej skłonność do różnicowania w kierunku RPE. Celem pracy jest scharakteryzowanie wpływu wielkości EB na różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) - nabłonka barwnikowego siatkówki (iPS-RPE) oraz określenie optymalnej liczby komórek do wytworzenia EB do ukierunkowanego różnicowania w kierunku linii RPE.

<table><tbody><tr><td>Pożywka mTeSR1 + 5x suplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Hyklon (Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N1</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bydło płodowe surowica</td><td>Hyclon (Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Trijodo-L-tyronina sodowa &nbsp; sól</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Hyklon (Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Aggrewell 400</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Zestaw do utrwalania/przepuszczalności</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-PAX6</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Przeciwciało anty-RX</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Mysz&nbsp; Przeciwciało anty-MITF</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Królik Przeciwciało anty-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNA do cDNA o dużej pojemności Life</td><td>Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (rpe) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ips) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotencjalne komórki macierzyste posiadają zdolność do nieograniczonego namnażania się i różnicowania w prawie każdy typ komórek. Ponadto rozwój technik przeprogramowywania komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) wzbudził zainteresowanie i podekscytowanie możliwością spersonalizowanej osobistej medycyny regeneracyjnej. Jednak skuteczność różnicowania komórek macierzystych w kierunku pożądanej linii pozostaje niska. Celem tego badania jest opisanie protokołu wyprowadzania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z komórek iPS (iPS-RPE) poprzez zastosowanie podejścia inżynierii tkankowej w celu wygenerowania jednorodnych populacji ciał zarodkowych (EB), powszechnego produktu pośredniego podczas różnicowania in vitro. W protokole stosuje się tworzenie określonej wielkości EB przy użyciu technologii płytek mikrodołkowych. Wyjaśniono również metody identyfikacji markerów białkowych i genowych RPE za pomocą immunocytochemii i reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Na koniec opisano skuteczność różnicowania w różnych rozmiarach EB monitorowaną za pomocą analizy markerów RPE za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Techniki te ułatwią różnicowanie komórek iPS w RPE do przyszłych zastosowań.

W tym eksperymencie hodowano komórki iPS i różnicowano je w kierunku linii RPE z ciał embrioidalnych (EB). EB o kontrolowanych rozmiarach formowano przy użyciu płytek z mikrowypustkami. Jak pokazano na Rysunku 1, tworzenie EB w płytkach z mikrowypustkami było homogeniczne. Następnie EB te zebrano i wysiano na płytki 6-dołkowe (Rysunek 2).
Komórki RPE można zidentyfikować po ich klasycznej sześciokątnej morfologii, pigmentacji oraz ekspresji markerów RPE. Po 12...

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie wpływu wielkości ciała zarodka na różnicowanie RPE od komórek IPS w celu ukierunkowania różnicowania ciała zarodka w kierunku linii RPE. Osiąga się to poprzez zastosowanie najpierw techniki mikrostudzienki w celu wygenerowania jednorodnych ciał zarodków o określonych rozmiarach. W drugim etapie inicjowane jest ukierunkowane różnicowanie komórek IPS w kierunku linii siatkówki, a następnie komórki I-P-S-R-P-E są identyfikowane i izolowane.W ostatnim etapie komórki I-P-S-R-P-E są wzbogacane i rozprężane. Ostatecznie komórki I-P-S-R-P-E można przeanalizować pod kątem ekspresji markerów specyficznych dla I-P-S-R-P-E. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak spontaniczne różnicowanie, jest to, że nasza technika skutkuje wyższym RP. Ta kwestia może pomóc w optymalizacji ukierunkowanego różnicowania komórek IPS w kierunku linii RP.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii chorób zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej, zapalenie siatkówki lub choroba Stargardta. Ponieważ zastąpienie chorego RPE zdrowym RPE pochodzącym z komórek IPS może być najlepszą opcją zapobiegania utracie wzroku, ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały problemy, ponieważ komórki macierzyste są bardzo delikatne i subtelne zmiany w ich uchwycie mogą wpływać na proces różnicowania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap pobierania ciała zarodka z miejsca mikrofalowego jest trudny.Przed wysiewem należy podgrzać pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez karmnika do 37 stopni Celsjusza, a następnie szybko podgrzać IMR 90 dash jedną komórkę IPS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki zostaną rozmrożone, dodaj pięć mililitrów ciepłej hodowli komórek macierzystych bez karmnika, pożywki do komórek, kroplami i delikatnie wymieszaj. Następnie odwiruj komórki, a następnie ostrożnie ponownie zawieś grudki komórek w dwóch mililitrach hodowli komórek macierzystych bez karmnika.Pożywkę wysiewa się grudki w pojedynczych dołkach płytki pokrytej matrycą, a następnie umieszcza się komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 95% oraz dziennymi zmianami podłoża. Pięć do siedmiu dni później obserwuj niezróżnicowane kolonie z gęstym środkiem, które są gotowe do przejścia pod mikroskopem świetlnym. Gdy komórki będą gotowe, dodaj jeden miligram na mililitr ciepłej przestrzeni o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem minut.Następnie odessać przestrzeń DYS i delikatnie przepłukać kolonie komórek dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego DM MF 12. Dwa razy. Po spłukaniu dodaj dwa mililitry pożywki do hodowli komórek macierzystych bez karmnika do każdej studzienki i użyj pięciomililitrowej pipety, aby delikatnie zeskrobać kolonie, uwalniając grudki komórek.Następnie przenieś oderwane grudki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i dodaj wystarczającą ilość pożywki do hodowli komórek macierzystych bez podajnika, aby zasiać następne przejście komórek w celu wytworzenia ciał zarodka. Najpierw przepłucz komórki IPS dwoma mililitrami DMMF 12, a następnie dodaj 750 mikrolitrów Accutane do każdej studzienki sześciodołkowej płytki przez pięć do 10 minut. W inkubatorze do hodowli komórkowych, gdy komórki zaczną się odłączać, użyj pipety, aby delikatnie zdysocjować komórki do zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Opłucz płytkę pięcioma mililitrami DM MF 12, łącząc popłuczynę z komórkami w stożkowej probówce. Następnie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby usunąć wszelkie resztki grudek komórek. Teraz odkręć komórki, aby usunąć Accutane i resus.Zawiesić osad w pożywce do tworzenia ciała zarodka do stężenia 0,5 do jednego razy 10 do siódmych komórek na mililitr. Po określeniu liczby żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trianowego, dodaj odpowiednią liczbę komórek do każdego dołka płytki mikrodołkowej, aby wygenerować pożądany zarodek. Rozmiary ciała.Delikatnie odpipetować kultury, aby ułatwić równomierne rozprowadzenie komórek, a następnie dostosować pożywkę do tworzenia ciała zarodka uzupełnioną inhibitorem skał do końcowej objętości 2,0 mililitrów. Po delikatniejszym pipetowaniu należy odwirować mikrodołkowe hodowle komórkowe i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny. Następnego dnia pipetować pożywkę w górę i w dół do każdej mikrostudzienki za pomocą mikropipetera o pojemności jednego mililitra, aby zebrać większość ciał zarodków, a następnie przepuścić zawiesinę ciała zarodka przez odwrócone sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów w celu usunięcia wszelkich pojedynczych komórek.Następnie przepłukać płytkę mikrodołkową pięć razy jednym mililitrem DMMF 12, aby usunąć resztę ciał zarodków, przepuszczając popłuczyny przez sitko. Następnie odwróć sitko do komórek do góry nogami na szalce Petriego i przefiltruj zebrane ciała zarodków za pomocą większej ilości pożywki do tworzenia ciał zarodków. Po zliczeniu pobranych komórek inkubuj ciała zarodków na pokrytych matrycą białkową płytkach z sześcioma dołkami w ilości mniejszej niż 1000 ciał zarodków na studzienkę w pożywce do tworzenia ciał zarodków, uzupełnionych 10 mikromolowym inhibitorem skał w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny.Na koniec zastąp pożywkę do tworzenia ciała zarodka pożywką różnicującą, aby zainicjować różnicowanie. Pobieranie próbek w 6., 17., 29. i 60. dniu w celu przeprowadzenia odpowiedniej dalszej analizy. Po 12 tygodniach hodowli 200 ciał zarodków komórkowych rozwija morfologię astrocytów i fibroblastów bez widocznej pigmentacji, podczas gdy większe ciała zarodków rozwijają monowarstwę klasycznej morfologii i pigmentacji RPE, jak pokazano na tych obrazach immunochemia w celu wykrycia markerów RPE, MITF i ZO jeden ujawnia koekspresję tych białek pochodzących z 500 komórek i 3000 komórek ciał zarodków.Na tym wykresie marker neuroektodermalny PAC 6 mierzono w ciałach zarodków o różnej wielkości w różnych punktach czasowych za pomocą cytometrii przepływowej. Na przykład w 3000 komórkowych ciałach zarodkowych około 50% analizowanych komórek było dodatnich dla PAC 6 w szóstym dniu hodowli. Dodatkowo, faksowa analiza markera RPE MITF na ciałach zarodków o różnych rozmiarach wykazała, że 20% komórek wyrażało MITF do 60 dnia różnicowania.Hodowane RPE charakteryzują się również zdolnością do utraty pigmentu i morfologii wielokątów oraz do uzyskania fenotypu fibroblastów po zapakowaniu. Na przykład tutaj pokazano nowo pasujące komórki, które utraciły pigment i uzyskały morfologię fibroblastów. Komórki te następnie namnażają się, odzyskując swoją klasyczną wielokątną morfologię po konfluencji, a w ciągu kilku tygodni odzyskują pigmentację.Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o prawidłowej identyfikacji i izolacji kolonii IPS RP po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych do zbadania ukierunkowanego różnicowania w kierunku wielu typów dorosłych komórek poprzez naśladowanie normalnego rozwoju embriologicznego. Nie zapominaj, że praca w tkankach, wirtualne laboratoria mogą być niezwykle niebezpieczne i że podczas wykonywania tych procedur należy zawsze brać pod uwagę konsekwencje, takie jak noszenie osłon na nogi, rękawiczek i okularów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować jednorodne ciała zarodkowe o pożądanej wielkości, aby skierować wylesianie w kierunku I-P-S-R-P-E oraz wyizolować i wzbogacić komórki RPE.

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wytwarzanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z komórek pluripotencjalnych indukowanych (iPS) przez zastosowanie embrioidalnych ciał o różnych rozmiarach

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych posiadających mutacje pochodzące od pacjenta. Zmutowane linie komórkowe mogą być wykorzystywane do analiz funkcjonalnych, w tym immunoblottingu, immunofluorescencji i patch clamp. To podejście typu "choroba w naczyniu" pozwala uniknąć trudności związanych z uzyskaniem natywnych ludzkich komórek RPE.

Różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji BEST1

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek iPS przy użyciu techniki mikrowirowej i różnych rozmiarów ciał zarodkowych. Ta technika zwiększa wydajność uzyskiwania komórek RPE.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych (Wideo) | JoVE Journal

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Przeglądaj więcej filmów