Name: Glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj model stresu siatkówki z użyciem glutaminianu i niedotlenienia do testowania neuroprotektorów. Metoda wykorzystuje izolowaną perfundowaną siatkówkę bydlęcą i rejestrację ERG.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten artykuł jest dedykowany mojej ukochanej żonie Maren i naszemu małemu Karlowi.

1. Przygotowanie oczu bydlęcych
<ol>
	<li>Oczy bydlęce należy uzyskać bezpośrednio po uboju zwierzęcia.</li>
	<li>Transportować chronione oczy w "roztworze sierpowym", specjalnym podłożu zawierającym 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2, 1,5 mM NaH2PO4, 13,5 mM Na2HPO4 i 5 mM glukozy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj przygotowanie siatkówki w ciemnych, dostosowanych warunkach przy słabym czerwonym świetle.</li>
	<li>Usuń przednią część oka. Wykonać nacięcie równikowe ok. 4 mm za rąbkiem. Następnie usuń rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe i soczewkę w jednym kawałku. Utrzymuj siatkówki w roztworze sierpowym.</li>
	<li>Mechanicznie poluzuj przyczepy ciała szklistego do powierzchni siatkówki i wyjmij ciało szkliste z otwartej muszli ocznej.</li>
	<li>Następnie podzielić oko na cztery ćwiartki i wyciąć okrągłe obszary o średnicy ok. 7 mm za pomocą trepanacji.</li>
	<li>Delikatnie oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego i umieść ją na urządzeniu nagrywającym w pudełku chronionym przed światłem. Urządzenie rejestrujące składa się z plastikowego uchwytu z siatką pośrodku; Umieść siatkówkę na siatce, a następnie przymocuj plastikowym pierścieniem bezpośrednio do elektrod. 
	UWAGA: Plastikowy konserwator posiada dwa kanały, które umożliwiają stały przepływ medium.</li>
</ol>
2. Zapis elektroretinogramu (ERG)
<ol>
	<li>W celu zarejestrowania elektroretinogramu należy użyć dwóch elektrod srebro/chlorek srebra po obu stronach siatkówki i wykonać perfuzję siatkówki ze stałą prędkością perfuzji ok. 1 ml/min i stałą temperaturą 37 °C. Należy użyć "roztworu sierpowatego" nasyconego tlenem.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem pomiaru należy dostosować ciemną siatkówkę (chronić ją przed światłem podczas wszystkich pomiarów) i stosować odstępy między bodźcami wynoszące pięć minut. Użyj pojedynczej białej lampy ksenonowej 1 Hz do stymulacji o intensywności ustawionej na 6,3 mlx na powierzchni siatkówki.</li>
	<li>Używaj skalibrowanych filtrów o neutralnej gęstości i bodźca świetlnego 10 μs kontrolowanego przez timer, aby uzyskać optymalne odpowiedzi.</li>
	<li>Aby zmierzyć i przetworzyć dane, przefiltruj ERG i wzmocnij go (filtr górnoprzepustowy 100 Hz, filtr wycinający 50 Hz, 100 000 x amplifikacja) za pomocą wzmacniacza Grass RPS312RM. Spróbuj odfiltrować ewentualne przeszkadzające częstotliwości, które mogą zakłócać sygnał. Aby przetworzyć dane, użyj analogowo-cyfrowej karty akwizycji danych na komputerze stacjonarnym (kompatybilnej z komputerem PC).</li>
	<li>Po okresie adaptacji do ciemności przy stałej perfuzji zmierz amplitudy sygnału elektrycznego, aż do zarejestrowania stabilnych amplitud fali b. 
	UWAGA: Amplitudy uważa się za stabilne, jeśli pięć pojedynczych pomiarów osiąga wartość średnią i odchyla się o mniej niż 10%. Dobry przykład pojedynczych pomiarów znajduje się na rysunku 1.</li>
	<li>Aby rozpocząć badanie, zastąp czysty tlen czystym azotem (liczba pojedynczych eksperymentów, n = 5) w celu zbadania niedotlenienia lub glutaminianem 250 μm (n = 5).</li>
	<li>Rejestruj reakcje elektryczne co 5 minut przez 45 minut.</li>
	<li>Po okresie testowym perfunduj siatkówki standardowym medium nasyconym tlenem przez 75 minut i obserwuj zmiany amplitudy fali b. To jest faza wypłukiwania. Zmierz amplitudę fali b od doliny fali a do szczytu fali b.</li>
	<li>Aby zbadać wpływ niedotlenienia lub glutaminianu na potencjał fotoreceptora w warunkach skotopowych, należy stłumić załamek b, dodając 1 mM do pożywki.</li>
	<li>Po zarejestrowaniu stabilnego potencjału fotoreceptora przez 30 minut, należy przeprowadzić procedurę jak poprzednio, wystawiając siatkówki na 45 minut na działanie różnych roztworów irygacyjnych z 1 mM asparaginianu. Użyj tego samego okresu wymywania (krok 2.8), jak wspomniano wcześniej.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Aby statystycznie ocenić dane, należy zapewnić rozkład normalny dla wszystkich danych, np. za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa15.</li>
	<li>Obliczyć zmniejszenie amplitud fal a i b w procentach po fazie ekspozycji w porównaniu z ostatnim pomiarem przed ekspozycją. Porównaj zmniejszenie amplitudy ERG po 45 minutach – na koniec okresu ekspozycji – z ERG zmierzonym przed zastosowaniem.</li>
	<li>Porównaj zafalowanie a i b na końcu fazy wymywania z odpowiednią amplitudą przed ekspozycją, aby zbadać możliwe odzysk.</li>
	<li>Do analizy statystycznej należy użyć oprogramowania JMP statistical software lub SPSS software. Obliczaj dane przez cały czas jako średnią ± odchylenie standardowe. Oszacować istotność za pomocą odpowiedniego testu statystycznego. 
	UWAGA: Testy te mogą się różnić w zależności od zakresu eksperymentu. W tym ustawieniu użyj sparowanego testu t Studenta.</li>
</ol>

<ol><li>Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+central+retinal+artery+occlusion%3A+clinical+presentation+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management.</a> Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).</li>
<li>Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension-related+eye+disorders%29%5BTitle%5D)+AND+%22Orv+Hetil%22%5BJournal%5D)">Hypertension-related eye disorders).</a> Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).</li>
<li>Feltgen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+of+the+European+Assessment+Group+for+Lysis+in+the+Eye+%28EAGLE%29+for+the+treatment+of+central+retinal+artery+occlusion%3A+design+issues+and+implications.+EAGLE+Study+report+no.+1+%3A+EAGLE+Study+report+no.+1%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).</li>
<li>Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+glutamate+levels+in+the+vitreous+body+of+humans+and+monkeys+with+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma.</a> Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).</li>
<li>Bertram, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+levels+in+subretinal+and+vitreous+fluid+of+patients+with+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment.</a> Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).</li>
<li>Diederen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamate+levels+in+the+vitreous+of+patients+with+retinal+detachment%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment).</a> Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).</li>
<li>Ientile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+necrosis+occurring+in+excitotoxic+cell+death+in+isolated+chick+embryo+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina.</a> J Neurochem. 79, 71-78 (2001).</li>
<li>Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activators+promote+excitotoxicity-induced+retinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage.</a> FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).</li>
<li>Ambati, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+gamma-aminobutyric+acid%2C+glutamate%2C+and+vascular+endothelial+growth+factor+levels+in+the+vitreous+of+patients+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy.</a> Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).</li>
<li>Vorwerk, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+of+retinal+glutamate+transporter+function+leads+to+elevated+intravitreal+glutamate+levels+and+ganglion+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).</li>
<li>Schultheiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dulbecco%27s+Modified+Eagle+Medium+is+neuroprotective+when+compared+to+standard+vitrectomy+irrigation+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).</li>
<li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+effects+of+two+different+irrigation+solutions+on+an+isolated+perfused+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina.</a> Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).</li>
<li>Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+and+Electrical+Responses+to+Light+Simulation+in+the+Retina+of+the+Frog%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog.</a> Science. 148, 648-651 (1965).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.+Brain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research+protocols%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research.</a> Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).</li>
<li>Henderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+experimental+data+for+univariate+normality%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+chimica+acta%3B+international+journal+of+clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Testing experimental data for univariate normality.</a> Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).</li>
<li>Alt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+potential+of+Rho-kinase+inhibition+in+promoting+cell+survival+and+reducing+reactive+gliosis+in+response+to+hypoxia+in+isolated+bovine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina.</a> Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision research. 39, 2165-2177 (1999).</li>
<li>Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+standardization%3A+cure+or+cause+of+poor+reproducibility+in+animal+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments.</a> Nat Methods. 6, 257-261 (2009).</li>
<li>Dutescu, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+ERG+recordings+under+visual+control+of+the+stimulated+fundus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).</li>
<li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+retinal+toxicity+of+drugs+in+animal+models+using+electrophysiological+and+morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques.</a> Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Did+myocilin+evolve+from+two+different+primordial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Did myocilin evolve from two different primordial proteins.</a> Mol Vis. 8, 271-279 (2002).</li>
<li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+retinal+toxicity+of+a+new+heavy+intraocular+dye%2C+using+a+model+of+perfused+and+isolated+retinal+cultures+of+bovine+and+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu stwierdzono istotny wpływ na amplitudę załamka b po 45 minutach niedotlenienia. Redukcja ta była nadal znacząca po fazie wypłukiwania. Podobny wpływ na potencjał fotoreceptorów można zaobserwować.
Wyniki są poparte innymi opublikowanymi danymi16 i dają nam możliwość zbadania możliwych efektów neuroprotekcyjnych po niedotlenieniu.
Po 45-minutowej ekspozycji 250 μM glutaminianu stwierdziliśmy statystycznie istotny wpływ tylko na amplitudę fali...

Neuroprotekcja była ważnym obszarem badań w badaniach okulistycznych w ostatnich dziesięcioleciach. Siatkówka jest bardzo wrażliwą siecią neuronalną, która w znacznym stopniu zależy od natlenienia i jest pod silnym wpływem metabolizmu otaczających ją komórek. Główne patologie oczu związane z uszkodzeniem komórek nerwowych to niedrożność naczyń siatkówki, jaskra i odwarstwienie siatkówki.
Niedrożność tętnicy siatkówki, jako przykład dla niedrożności naczyniowej siatkówki, prowadzi do nagłej utraty wzroku z powodu niedotlenienia wewnętrznej siatkówki1. Często wiąże się z ogólnymi patologiami naczyniowymi2 i prowadzi do trwałej utraty wzroku1, przy czym tylko 8% pacjentów znacznie odzyskuje ostrość wzroku1. Chociaż fibrynoliza tętnic została zasugerowana jako opcja leczenia, korzyści nie można było wykazać w randomizowanym badaniu klinicznym3.
Jaskra i odwarstwienie siatkówki mają wzrost stężenia glutaminianu4-6. Glutaminian w warunkach fizjologicznych występuje jako przekaźnik pobudzający w całym ośrodkowym układzie nerwowym i wewnętrznej siatkówce7,8. Podwyższony poziom glutaminianu stwierdzono nie tylko w jaskrze i odwarstwieniu siatkówki5,6, ale także w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej9. Wzrost glutaminianu może prowadzić do ekscytotoksyczności, a tym samym do uszkodzenia komórek nerwowych10. W większości przypadków odwarstwienia siatkówki, a w niektórych przypadkach proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej, konieczna jest operacja siatkówki (pars plana vitrectomia). Podczas manipulacji mechanicznej witrektomii pars plana jasne światło światłowodu lub naprężenie ścinające wywierane przez duże natężenia przepływu roztworów irygacyjnych podczas długich operacji wywierają dodatkowe obciążenie na siatkówkę11,12.
Wszystkie wymienione choroby mają wspólną cechę, że patologia jest zlokalizowana wyłącznie w siatkówce i stawiają społeczność okulistyczną przed wyzwaniem znalezienia sposobów ochrony siatkówki jako systemu neurosensorycznego.
Elektroretinogram (ERG) jest standardową metodą oceny funkcji fotoreceptorów in vivo (fala a) i funkcji wewnętrznej siatkówki (fala b). ERG jest mierzony za pomocą srebrnych elektrod wprowadzanych do rogówki, a oczy są stymulowane przez rosnący poziom światła w celu wykrycia wad w pręcikach lub czopkach lub w wewnętrznej siatkówce. Różne defekty siatkówki można wykryć na podstawie zmian amplitudy (siły odpowiedzi) lub opóźnienia (interwału czasu do odpowiedzi) ERG. Różne protokoły ERG i metody pomiaru (wzorzec-ERG, wieloogniskowy-ERG lub ERG jasnego pola) pozwalają na dalsze różnicowanie defektów. Technika izolowanej siatkówki została wprowadzona niedawno, co umożliwia ocenę wpływu na siatkówkę bez zakłóceń spowodowanych np. ogólnymi reakcjami badanego zwierzęcia13,14.
Celem tego badania było oszacowanie i wprowadzenie zdefiniowanego i ustandaryzowanego modelu stresu dla niedotlenienia i stresu glutaminianu na superpołączonej izolowanej siatkówce. W związku z tym mamy nadzieję, że uda nam się położyć podwaliny pod przyszłe badania nad neuroprotekcyjnym działaniem niektórych środków lub roztworów do irygacji wewnątrzgałkowej.

<table><tbody><tr><td>120 mM NaCl&nbsp;</td><td>Merck Pharma, Niemcy</td><td>1 064 041 000</td><td></td></tr><tr><td>2 mM KCl,&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck Pharma, Niemcy</td><td>1 050 010 250</td><td></td></tr><tr><td>0,1 mM MgCl2,&nbsp;</td><td>Merck Pharma, Niemcy</td><td>58 330 250</td><td></td></tr><tr><td>0,15 mM CaCl2</td><td>Merck Pharma, Niemcy</td><td>111 TA106282</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mM NaH2PO4/13,5 mM Na2HPO4&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck Pharma, Niemcy</td><td>1 065 860 500</td><td></td></tr><tr><td>5 mM glukozy</td><td>Merck Pharma, Niemcy</td><td>40 741 000</td><td></td></tr></tbody></table>

glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotekcja była silnym obszarem badań w badaniach okulistycznych w ostatnich dziesięcioleciach i wpływa na choroby takie jak jaskra, niedrożność naczyń siatkówki, odwarstwienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa. Celem tego badania było wprowadzenie ustandaryzowanego modelu stresu do przyszłych przedklinicznych testów terapeutycznych.
Siatkówki bydlęce zostały przygotowane i perfundowane roztworem wzorcowym nasyconym tlenem, a następnie zarejestrowano ERG. Po zarejestrowaniu stabilnych fal b przez 45 minut wywierano hipoksję (czysty N2) lub stres glutaminianu (250 μm glutaminianu). Aby zbadać wpływ na samą funkcję fotoreceptorów, dodano 1 mM asparaginian w celu uzyskania fal A. Odzyskiwanie ERG monitorowano przez 75 minut.
Dla niedotlenienia zauważono spadek amplitudy fali a o 87,0% (p <0,01) po czasie ekspozycji wynoszącym 45 minut (spadek o 36,5% po zakończeniu wymywania p = 0,03). Dodatkowo odnotowano początkowy spadek amplitudy załamka b o 87,23%, który osiągnął istotność statystyczną (p <0,01, spadek o 25,5% pod koniec wymłukiwania, p = 0,03).
Dla glutaminianu 250 μm, początkowa redukcja amplitudy fali a o 7,8% (p >0,05), a następnie redukcja o 1,9% (p >0,05). Odnotowano zmniejszenie amplitudy załamka b o 83,7% (p <0,01); Po wypłukaniu trwającym 75 minut redukcja wyniosła 2,3% (p = 0,62). W niniejszym badaniu przedstawiono standaryzowany model stresu, który może być przydatny do identyfikacji możliwych efektów neuroprotekcyjnych w przyszłości.

Po 1 hr perfuzji preparatów siatkówki standardowym roztworem nasyconym tlenem (Ryc. 1A i B) amplitudy ERG wykazywały stabilizację oraz mniejszą zmienność amplitud pomiędzy pojedynczymi pomiarami. pH, ciśnienie osmotyczne, temperatura oraz pO2 (z wyjątkiem testów hipoksji) pozostawały stałe dla wszystkich prób.
Aby wyizolować sygnał fotoreceptorów z sygnału wewnętrznej warstwy siatkówki, do standardowego roztworu dodano 1 mM aspartanu w celu stłumienia fali b (Rycina...

Dzięki temu badaniu wprowadzamy standaryzowany model stresu dla izolowanej superkrwistej siatkówki bydlęcej do przyszłych przedklinicznych testów terapeutycznych. Oceniano wpływ hipoksji (czysty N2) lub stresu glutaminianu (250 μM glutaminianu) na funkcję siatkówki reprezentowaną przez amplitudy załamków a i b.

Glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie stresu wywołanego glutaminianem lub hipoksją jako potencjalnego modelu do badania skuteczności czynników neuroprotekcyjnych. Osiąga się to poprzez pobranie świeżych, znukleowanych oczu bydlęcych i przeprowadzenie szybkiego, lecz wciąż traumatycznego wyłuszczenia siatkówki. Następnie, po inkubacji siatkówek w specjalnym roztworze odżywczym, za pomocą elektrod rejestruje się serię stabilnych bazowych elektroretinogramów (ERG).Następnie do roztworu odżywczego dodaje się glutaminian lub indukuje hipoksję poprzez podanie 100% azotu zamiast tlenu. Na koniec rejestruje się ERG, aby ocenić wpływ stresu glutaminianowego lub hipoksji na amplitudy fal A i B. Wyniki uzyskane w badaniu ERG wykazują zmianę funkcji siatkówki po narażeniu na hipoksję lub stres glutaminianowy.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak hodowle komórkowe czy rejestracje ERG in vivo, jest możliwość przeprowadzenia testów funkcjonalnych (w przeciwieństwie do hodowli komórkowych) bez zmienności wynikającej z rozmieszczenia elektrod lub zastosowania znieczulenia ogólnego (w porównaniu do eksperymentów in vivo). Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie farmakologii, na przykład podczas testowania agentów neuroprotekcyjnych. Zastosowania tej techniki obejmują terapię oraz diagnostykę chorób ostrych i przewlekłych.Za pomocą tego modelu stresu można obecnie testować potencjalne środki neuroprotekcyjne. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat neuroprotekcji w dziedzinie okulistyki, może być również stosowana w innych obszarach medycyny, takich jak choroby neurodegeneracyjne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na technikę przygotowania.Sam model został opracowany przez profesora Sickle w Kolonii, który był wybitnym neurofizjologiem. Po pobraniu oczu bydlęcych od zwierzęcia ubojowego, należy umieścić je w roztworze Sickle w temperaturze pokojowej w celu transportu do laboratorium, korzystając ze słabego czerwonego światła w warunkach adaptacji do ciemności. Należy usunąć przednią część oka, a następnie wykonać nacięcie równikowe około czterech milimetrów za limbusie i usunąć rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe oraz soczewkę w jednym kawałku.Siatkówki należy przechowywać w roztworze sickle. Następnie mechanicznie poluzować przyczepy ciała szklistego do powierzchni siatkówki i usunąć ciało szkliste z otwartej czaszy gałki ocznej. Potem podzielić oko na cztery kwadranty i za pomocą wycinaka TR refine wyciąć okrągłe fragmenty o średnicy około siedmiu milimetrów.Ostrożnie oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego, a następnie, aby umieścić ją na urządzeniu rejestrującym, przenieś siatkówkę na siatkę i użyj plastikowego pierścienia do jej przymocowania do elektrod. Następnie umieść urządzenie rejestrujące w pudełku chroniącym przed światłem. Przed wykonaniem pomiarów poddaj siatkówkę adaptacji do ciemności, a następnie, używając skalibrowanych filtrów neutralnych i bodźca świetlnego o czasie trwania 10 mikrosekund, stosuj w odstępach pięciominutowych pojedyncze błyski białego ksenonu o częstotliwości 1 Hz do stymulacji, z intensywnością 6,3 dopasowanej intensywności światła lub MLX na powierzchni siatkówki.Po okresie adaptacji do ciemności przy stałej perfuzji, pomierz amplitudy sygnału elektrycznego aż do momentu zarejestrowania stabilnych amplitud fali a. Aby rozpocząć testy, zastąp czysty tlen czystym azotem w celu zbadania hipoksji lub 250 µM glutaminianu. Rejestruj odpowiedzi elektryczne co pięć minut przez 45 minut.Zmierz amplitudę fali B od dołka fali A do szczytu fali B, aby zbadać wpływ hipoksji lub glutaminianu na potencjał fotoreceptorów. W warunkach skotopowych dodaj jeden milimol aspartanu do roztworu odżywczego, aby stłumić falę B. W celu statystycznej oceny danych zastosuj test Coof Smirnoff, aby upewnić się, że wszystkie dane mają rozkład normalny. Oblicz redukcję amplitud fal A i B oraz ich wartości procentowe po fazie ekspozycji.W porównaniu do ostatniego pomiaru przed ekspozycją, porównaj redukcję amplitud ERG po 45 minutach na koniec okresu ekspozycji do wartości ERG zmierzonej przed aplikacją. Porównaj falę a i b na koniec fazy wypłukiwania do odpowiadającej im amplitudy przed ekspozycją. Aby zbadać możliwą regenerację na potrzeby analizy statystycznej, użyj oprogramowania statystycznego JMP lub oprogramowania SPSS.Wszystkie dane należy obliczać jako średnią plus lub minus odchylenie standardowe. Do oceny istotności statystycznej należy zastosować odpowiedni test statystyczny, zgodnie z przedstawionym schematem. Po godzinnej perfuzji preparatów siatkówki standardowym roztworem nasyconym tlenem amplituda ERG ustabilizowała się i wykazała mniejszą zmienność amplitud pomiędzy poszczególnymi pomiarami.Wartości pH, ciśnienie osmotyczne, temperatura oraz PO₂ były utrzymywane na stałym poziomie we wszystkich testach. Aby wyizolować sygnał fotoreceptorowy od sygnału wewnętrznej siatkówki, do roztworu standardowego dodano 1 mM aspartanu w celu stłumienia fali B. W warunkach hipoksji odnotowano spadek amplitudy fali a o 87,0%.Po 45 minutach ekspozycji pod koniec fazy wypłukiwania odnotowano spadek o 36,5%. Było to statystycznie istotne. Ponadto w tych warunkach zarejestrowano statystycznie istotny początkowy spadek amplitud fali B o 87,23%.Odnotowano statystycznie istotną redukcję o 25,5%. Po ekspozycji na 250 micromolar glutaminianu, po zdefiniowanym odstępie czasu, wykryto nieistotną statystycznie redukcję amplitud fal o 7,8%. Następnie nastąpiła nieistotna statystycznie redukcja o 1,9%. Ostatecznie zarejestrowano spadek amplitud ERG o 83,7%, a pod koniec etapu wypłukiwania zaobserwowano powrót BWA, co skutkowało nieistotną statystycznie redukcją o 2,3% po 75 minutach perfuzji standardowym roztworem.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby monitorować linię bazową ERG. Po zakończeniu tej procedury można przetestować czynniki neuroprotekcyjne lub toksyczne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak toksyczność po opracowaniu metody. Ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny XV zajmującym się elektrofizjologią do badania zmian ERG w ustandaryzowanym modelu.

glutamate-hypoxia-as-stress-model-for-isolated-perfused-vertebrate

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Glutaminat i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) wiąże się z wysokim wskaźnikiem zachorowalności i śmiertelności. Celem opisanego tutaj modelu deprywacji i reoksygenacji tlenu i glukozy (OGD-R) in vitro jest ocena wpływu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego na różne komórki, szczególnie w komórkach śródbłonka bariery krew-mózg (BBB).

Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg

Ten artykuł opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe u myszy. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne siatkówki spowodowane podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym służy do modelowania ludzkich patologii charakteryzujących się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki, umożliwiając naukowcom zbadanie potencjalnych mechanizmów komórkowych i metod leczenia chorób układu...

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego

Stworzono tani, łatwy w użyciu i potężny system do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby złagodzić naruszenie bariery siatkówki krwi wywołane przez histaminę. Nieszczelność naczyń krwionośnych, aktywacja komórek Müllera i ciągłość procesów neuronalnych są wykorzystywane do oceny odpowiedzi na uszkodzenie i jej odwrócenia za pomocą potencjalnego leku, lipoksy A4.

Model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia

Udar niedokrwienny jest złożonym zdarzeniem, w którym trudno jest zbadać specyficzny wpływ astrocytów na dotknięty obszar mózgu narażony na tlen, deprywację glukozy (OGD). W artykule przedstawiono metodologię otrzymywania izolowanych astrocytów oraz badania ich reaktywności i proliferacji w warunkach OGD.

Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

Ten protokół opisuje nowatorską metodę badania formy chemicznej neurostymulacji całych siatkówek szczurów in vitro za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu. Neurostymulacja chemiczna jest obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej neurostymulacji elektrycznej neuronów siatkówki w leczeniu nieodwracalnej ślepoty spowodowanej chorobami zwyrodnieniowymi fotoreceptorów.

Metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro

Tutaj opisujemy mysi model niedokrwienia siatkówki poprzez przejściowe obustronne zamknięcie tętnicy szyjnej za pomocą prostych szwów i zacisku. Model ten może być przydatny do zrozumienia patologicznych mechanizmów niedokrwienia siatkówki spowodowanego nieprawidłowościami sercowo-naczyniowymi.

Mysi model niedokrwiennego uszkodzenia siatkówki wywołanego przejściowym obustronnym zamknięciem tętnicy szyjnej wspólnej

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Ten protokół modeluje uszkodzenie niedokrwienia siatkówki i reperfuzji w oku myszy poprzez wywołanie niedokrwienia siatkówki poprzez kaniulację przedniej komory i podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego, a następnie normalizację ciśnienia wewnątrzgałkowego w celu zainicjowania reperfuzji.

Indukcja uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki w modelu oka myszy

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj model stresu siatkówki z użyciem glutaminianu i niedotlenienia do testowania neuroprotektorów. Metoda wykorzystuje izolowaną perfundowaną siatkówkę bydlęcą i rejestrację ERG.

Glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców

Przeglądaj więcej filmów