Name: Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji neuroprzekaźników do wyższej wzgórki szczura z jednoczesnym zapisem aktywności wielojednostkowej. Ta technika umożliwia badanie funkcji głębokich struktur mózgu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty z CIHR (MOP231122) i NSERC (RGPIN-2014-06503). Dziękujemy Geneviève Cyr za pomoc w przygotowaniu eksperymentów i nadzorowaniu prac laboratoryjnych. MAL otrzymał stypendium od The Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Ochrony Zwierząt i Komisji Rewizyjnej ds. Etyki Uniwersytetu w Montrealu.
1. Montaż pipety rejestrująco-iniekcyjnej
<ol>
	<li>Wyciągnąć szklaną kapilarnę o długości około 7 cm (średnica zewnętrzna 1 mm) za pomocą ściągacza do pipet.</li>
	<li>Przełam końcówkę kapilary i sprawdź otwór pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że średnica wewnętrzna wynosi od 30 μm do 40 μm.</li>
	<li>Włóż srebrny drut o długości 7 cm do szklanej kapilary tak, aby około 1 cm wystawał z niestożkowego końca szklanej pipety.</li>
	<li>Zegnij nadmiar filamentu prostopadle do szklanej kapilary.</li>
	<li>Nałożyć kroplę elastycznego kleju z tworzywa sztucznego na trzon igły podskórnej o sile 30 G.</li>
	<li>Wprowadzić igłę podskórną o sile 30 G do szklanej pipety zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 1.</li>
	<li>Dodaj drugą warstwę kleju, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie od połączenia szklanej pipety z igłą podskórną.</li>
	<li>Pozostaw pipetę do wyschnięcia z końcówką skierowaną do góry na około 12 godzin, aby zapewnić prawidłowe utwardzenie kleju. Końcowy wynik pokazano na rysunku 2.</li>
</ol>
UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w przypadku ostrych eksperymentów i sterylizacja końcówki pipety nie jest wymagana.
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Umieść szczura w pudełku anestezjologicznym.</li>
	<li>Wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu przez 5 do 10 minut.</li>
	<li>Umieść zwierzę na stole stereotaktycznym z poduszką grzewczą i sondą doodbytniczą, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C. Użyj stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie 2% izofluranem. Zabezpiecz głowę szczura za pomocą nauszników i uchwytu na zęby.</li>
	<li>Zastosuj maść okulistyczną lub krople do oczu, które zawierają 1% kropli atropiny, aby pomóc w rozszerzeniu źrenic. Aby zapobiec wysuszeniu, stosuj krople nawilżające mniej więcej co 30 minut.</li>
	<li>Ogol głowę i oczyść ją 10% powidonem-jodem.</li>
	<li>W celu znieczulenia miejscowego wstrzyknąć 0,5 ml 2% lidokainy pod skórę głowy w 2-3 miejsca, unosząc skórę do góry i wkładając końcówkę igły.</li>
	<li>Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i obserwując brak ruchu. Ponadto monitoruj tętno, aby upewnić się, że mieści się w normalnych wartościach (od 300 do 400 uderzeń/min).</li>
	<li>Naciąć skórę głowy w linii prostej wzdłuż mediany za pomocą ostrza skalpela #10, aby odsłonić zarówno szwy czołowe, jak i strzałkowe.</li>
	<li>Odsłoń punkty Lambda i Bregma, odsuwając na bok tkankę pokrywającą czaszkę za pomocą szpatułki chirurgicznej.</li>
	<li>Wypoziomuj czaszkę tak, aby pozycje Bregma i Lambda znajdowały się na tej samej płaszczyźnie.</li>
	<li>Aby ustawić punkt odniesienia, użyj urządzenia stereotaktycznego z zamontowaną szklaną rurką, aby ustawić go tuż nad Bregmą. Będzie to "zero" dla współrzędnych pomiarów przednio-tylnych i przyśrodkowo-bocznych.</li>
	<li>Ustaw interesujący Cię punkt, przesuwając montaż stereotaktyczny do wymaganych współrzędnych, zanotuj współrzędne stereotaktyczne i narysuj kwadrat wokół obszaru docelowego, który oznacza miejsce, w którym zostanie wykonana kraniotomia.</li>
	<li>Użyj wiertła chirurgicznego ze sterylizowanym wiertłem wzdłuż zaznaczonego kwadratu powoli bez nacisku, aby powoli usunąć materiał kostny. Uważaj, aby nie wiercić zbyt długo w tym samym obszarze, ponieważ spowoduje to wytwarzanie ciepła i spowodowanie zmian w korze.</li>
	<li>Gdy kość ograniczająca kraniotomię stanie się wystarczająco cienka, ostrożnie usuń część czaszki pęsetą, aby odsłonić korę.</li>
	<li>Często przepłukuj odsłoniętą korę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby zapobiec wysuszeniu tkanek. 
	UWAGA: Usuwanie opony twardej nie jest konieczne u szczura, ponieważ końcówka iniekcji jest wystarczająco mocna, aby ją przebić.</li>
</ol>
3. Napełnianie i montaż systemu wtryskowego
<ol>
	<li>Napełnij mikrostrzykawkę o pojemności 5-10 μl przez aspirację olejem mineralnym.</li>
	<li>Napełnij igłę podskórną stałą szklaną pipetą roztworem 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) i 300 μM kwasu γ-aminomasłowego (GABA) lub roztworem 2% lidokainy z 0,5% CSB 9. Rozcieńczyć wszystkie roztwory solą fizjologiczną.
	<ol>
		<li>W przypadku obfitej ilości substancji należy napełnić ją zwykłą strzykawką i zastosować zwykłe techniki ostrożności, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>W przypadku droższych substancji, do napełnienia wtryskiwacza należy użyć oleju mineralnego, a następnie można wprowadzić środek chemiczny przez aspirację. Ponieważ różnica gęstości między olejem mineralnym a wodą jest stosunkowo duża, substancja ta jest dobrym kandydatem do wstrzykiwania roztworów wodnych. 
		UWAGA: Można dodać barwnik, aby potwierdzić separację między obiema cieczami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby napełnić pipetę do wstrzykiwań, należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem przez aspirację, a następnie powoli wstrzyknąć roztwór do pipety iniekcyjnej.</li>
	<li>Zwrócić szczególną uwagę na nieszczelności w obszarach wskazanych na rysunku 1, pobierając wymaz z tych obszarów do czysta i obserwując wycieki, dalej powoli wstrzykując roztwór za pomocą strzykawki.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml. Należy przy tym lekko naciskać na tłok, aby podciśnienie nie usunęło roztworu z pipety iniekcyjnej.</li>
	<li>Napełnić mikrostrzykawkę olejem mineralnym przez aspirację i mocno przymocować ją do napełnionej pipety iniekcyjnej, a następnie ostrożnie zetrzeć gazą nadmiar roztworu ze zmontowanej iniekcji.</li>
	<li>Sprawdzić, czy końcówka nie jest zablokowana, wstrzykując bardzo małą objętość, wystarczającą do zobaczenia małej kropli tworzącej się na końcówce szklanej pipety.</li>
	<li>Zamontuj wtryskiwacz w układzie mikropompy i upewnij się, że jest dobrze zamocowany.</li>
	<li>Ostrożnie ustaw końcówkę wtrysku na współrzędnych docelowych i opuść końcówkę na powierzchnię kory.</li>
	<li>Powoli opuścić iniekcję za pomocą aparatu stereotaktycznego do struktury docelowej (w tym przypadku wzgórka górnego) za pomocą odpowiednich współrzędnych anatomicznych.</li>
	<li>Przykryj odsłoniętą korę ciepłym agarem, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.</li>
</ol>
4. Wtrysk i odwracalna dezaktywacja
<ol>
	<li>Ustawić pompę do mikroiniekcji tak, aby wstrzykiwała 400 do 800 nl przy 40 nl/min i nacisnąć przycisk Uruchom, aby rozpocząć wstrzykiwanie. Należy pamiętać, że szybkość skoku będzie wykazywać zmniejszenie podczas wstrzykiwania. 
	UWAGA: W konfiguracji eksperymentalnej aktywność neuronalna odzyskała się w ciągu godziny po zakończeniu dostarczania GABA. Każde skalibrowane urządzenie mechaniczne może być użyte do wywierania nacisku na strzykawkę do mikroiniekcji w celu przeprowadzenia wstrzyknięcia.</li>
	<li>Po uzyskaniu danych elektrofizjologicznych należy poddać się eutanazji przy użyciu metody zatwierdzonej przez lokalną Wspólnotę Etyki Zwierząt.</li>
</ol>

<ol><li>Martin, J. H., Ghez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inactivation+in+the+analysis+of+the+central+control+of+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).</li>
<li>Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+indirect+pathways+to+visual+response+properties+in+macaque+middle+temporal+area+MT%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT.</a> The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).</li>
<li>Lomber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+limitations+of+permanent+or+reversible+deactivation+techniques+in+the+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).</li>
<li>Malpeli, J., Schiller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).</li>
<li>Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoloop%3A+an+adaptable+reversible+cooling+deactivation+method+for+behavioral+or+electrophysiological+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+deep+brain+structures+with+microinjections+for+delivery+of+drugs%2C+viral+vectors%2C+or+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants.</a> Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).</li>
<li>Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+parameters+of+cortical+inactivation+by+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).</li>
<li>Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+Reorganized+Primary+Somatosensory+%28SI%29+Cortex+after+Local+Inactivation+of+Normal+SI+Cortex+in+Chronic+Spinal+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+%26+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats.</a> Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).</li>
<li>Malpeli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).</li>
<li>Minville, K., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+frequency+processing+in+posteromedial+lateral+suprasylvian+cortex+does+not+depend+on+the+projections+from+the+striate-recipient+zone+of+the+cat%E2%80%99s+lateral+posterior-pulvinar+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex.</a> Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).</li>
<li>Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+the+binocular+visual+field+in+the+superior+colliculus+of+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat.</a> Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Proponowany protokół został opracowany w celu rozwiązania problemów wynikających z obecnych metod odwracalnej inaktywacji. W szczególności projekt ten miał na celu udoskonalenie metod stosowanych do chemicznych mikroiniekcji substancji modulujących aktywność neuronalną, w szczególności w głębokich strukturach mózgu. Wyzwaniem technicznym wynikającym z tego typu konfiguracji jest konieczność kolokalizacji obu sond w tej samej ograniczonej przestrzeni in vivo w celu uzyskania precyzyjnych zapisów w miejscu wstrzyk...

Inaktywacja obszarów korowych i jąder podkorowych jest ważna w badaniu funkcjonalnych relacji między różnymi strukturami mózgu2-4. W najnowszej literaturze do badania roli struktur mózgu wykorzystano techniki chemiczne lub kriogeniczne związane z utratą funkcji2,5. Jeśli chodzi o mikroiniekcje farmakologiczne, małe objętości leków mogą być podawane do obszaru mózgu w kontrolowanym tempie, przy jednoczesnym zminimalizowaniu ubocznych uszkodzeń otaczającej tkanki6,7. Technika ta może być stosowana do dostarczania określonych agonistów, odwrotnych agonistów lub antagonistów w celu zbadania wpływu różnych celów farmakologicznych na aktywność neuronalną. Takie efekty można również badać, mierząc zmiany w odpowiedziach neuronalnych z odległych lokalizacji, co pozwala naukowcom badać relacje między różnymi strukturami korowymi i podkorowymi.
Tutaj demonstrujemy montaż urządzenia, wtrysku, zdolnego zarówno do rejestrowania sygnałów elektrofizjologicznych, jak i dostarczania niewielkich ilości leków w miejscu docelowym. Demonstrujemy możliwości tego systemu, wstrzykując GABA, powszechny inhibitor aktywności neuronalnej, do wzgórka górnego szczura. Obszar ten jest wrażliwy na stymulację wzrokową, co pozwoliło nam na wykorzystanie wizualnie wywołanej aktywności wielojednostkowej w celu potwierdzenia lokalizacji iniekcji. Odwracalność inaktywacji oceniano na podstawie przywrócenia normalnej aktywności neuronalnej po zakończeniu wstrzyknięcia GABA.
Możliwość monitorowania aktywności wielu jednostek z miejsca wstrzyknięcia pozwala na precyzyjne dostrojenie szybkości i objętości iniekcji potrzebnych do osiągnięcia pożądanej odpowiedzi farmakodynamicznej. Dlatego zaletą tej techniki jest potencjalne ograniczenie uszkodzeń tkanek spowodowanych mikroperfuzją, ponieważ wstrzykiwane są najmniejsze efektywne objętości. Proponowany protokół zapewnia opłacalną metodę generowania jednorazowego sprzętu niezbędnego do przeprowadzania eksperymentów, w których pożądane jest dostarczanie leków i rejestrowanie lokalnej aktywności neuronalnej.

<table><tbody><tr><td>Pompa wtryskowa (UltraMicroPump III)</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr>#UMP3 <tr><td>Konsola wtryskowa (sterownik Micro4)</td><td>WPI</td><td>#SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamliton</td><td>(80301) 701LT 10 &micro; L</td><td>Strzykawki SYR od 5 do 10 i mu; l</td></tr><tr><td>używany Elastyczny klej do tworzyw sztucznych</td><td>Lepage</td><td>393915</td><td>Forma żelu jest łatwiejsza do nałożenia na trzon 30&nbsp; G igła podskórna tworząca wodoodporne uszczelnienie po wyschnięciu.</td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>WPI</td><td>#TW100F-4</td><td>Cienkościenne, 1&nbsp; mm OD, 0,75&nbsp; mm ID z używanymi pipetami z filamentem</td></tr><tr><td>720 Ściągacz do pipet igłowych</td><td>Kopf</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>782500</td><td>Gołe 0,010"</td></tr></tbody></table>

jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Tutaj opisujemy metodę budowy jednorazowego "wtrysku" przy użyciu dostępnych na rynku i niedrogich części. Opracowano system sondowania, który pozwala na wstrzyknięcie leku przy jednoczesnym rejestrowaniu sygnałów elektrofizjologicznych z populacji neuronów dotkniętych chorobą. Ta metoda stanowi prostą i ekonomiczną alternatywę dla rozwiązań komercyjnych. Szklana pipeta została zmodyfikowana poprzez połączenie jej z igłą podskórną i srebrnym żarnikiem. Wstrzykiwacz jest podłączony do komercyjnej pompy mikrostrzykawkowej do podawania leku. W ten sposób uzyskuje się technikę, która zapewnia sprzężenie zwrotne farmakodynamiki w czasie rzeczywistym za pośrednictwem wielojednostkowych sygnałów zewnątrzkomórkowych pochodzących z miejsca dostarczania leku. Jako dowód słuszności koncepcji, zarejestrowaliśmy aktywność neuronalną z górnego wzgórka wywołaną przez błyski światła u szczurów, jednocześnie z dostarczaniem leków przez wstrzyknięcie. Zdolność zapisu iniekcji pozwala na funkcjonalną charakterystykę miejsca wstrzyknięcia, co sprzyja precyzyjnej kontroli nad lokalizacją podania leku. Zastosowanie tej metody wykracza również daleko poza to, co zostało tutaj zademonstrowane, ponieważ wybór substancji chemicznych ładowanych do wstrzykiwacza jest ogromny, w tym markery śledzące do eksperymentów anatomicznych.

Konstrukcja injectrody przedstawiona jest na Rysunku 1. Srebrny drut (C) wprowadza się do szklanej pipety (D), tak aby fragment drutu był zgięty i wystawał z otworu. Do otworu szklanej pipety za pomocą kleju przymocowuje się i uszczelnia igłę 30 G (B). Po napełnieniu pipety substancją do iniekcji, do igły podłącza się szklaną mikrosyringę (A). Ważne jest, aby zapewnić szczelne połączenie w miejscu styku mikrosyringi z igłą (E) oraz w miejscu, w którym srebrny drut wystaje ze szklanej pipety (F). ...

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie przystępnej cenowo sondy do mikroiniekcji neurotransmiterów do górnego wzgórza ratów przy jednoczesnym monitorowaniu aktywności neuronalnej wielu jednostek. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie pipety szklanej przy użyciu kapilary szklanej i pionowego wyciągacza mikropipet. Drugim krokiem jest wprowadzenie srebrnego drutu do kapilary w taki sposób, aby odcinek drutu wystawał poza koniec nietrzałowy.Następnie używa się kleju, aby stworzyć szczelne połączenie między szklaną pipetą a igłą hipodermiczną. Ostatnie etapy polegają na napełnieniu pipety roztworem GABA w kolorze błękitu chicagowskiego (Chicago sky blue), podłączonej do mikrosstrzykawki wypełnionej olejem mineralnym i zamocowanej do mikroinjektora. W rezultacie ta konstrukcja iniektora, wykonana z dostępnych i niedrogich części, może być wykorzystana do inaktywacji głębokich struktur mózgu przy jednoczesnym rejestrowaniu aktywności neuronalnej w inaktywowanym obszarze przed, w trakcie i po wstrzyknięciu leku.Technika ta posiada kilka zalet w stosunku do innych istniejących metod, takich jak impulsy ciśnienia gazowego czy systemy wstrzykiwania fotonicznego. Po pierwsze, jest to metoda kosztowo efektywna, która umożliwia kontrolę dostarczania leku w oparciu o funkcję, co ogranicza uszkodzenia tkanki spowodowane nadmiernym wstrzyknięciem. Kolejną zaletą oferowaną przez ten system jest zintegrowana możliwość rejestracji, co pozwala na efektywną kontrolę komponentu czasowego deaktywacji neuronalnej.Aby przygotować pipety iniekcyjne do rejestracji, najpierw wyciągnij kapilarę o długości siedmiu centymetrów i średnicy zewnętrznej jednym milimetrem, korzystając z modelu pionowego COP Seven 20 lub podobnego urządzenia. Ustaw grzałkę na 18, a solenoid na jeden. Następnie, w rękawiczkach, ręcznie przełam końcówkę, aby utworzyć otwór, i sprawdź pod mikroskopem, czy średnica wewnętrzna mieści się w przedziale od 30 do 40 µm.Zmierz to za pomocą linijki w wizjerze. Powinno to dać stosunkowo niską impedancję od 0,3 do 0,6 megaomów. Następnie, od strony niez zwężonej, wprowadź do pipety srebrny drut o długości około siedmiu centymetrów, pozostawiając jeden do dwóch centymetrów wystających z pipety.Zagnij ten nadmiar drutu prostopadle do kapilary. Następnie weź igłę hipodermiczną o rozmiarze 30 G i nałóż elastyczny klej plastikowy na trzon. Następnie powoli wprowadź igłę do pipety.W miarę możliwości należy dodać więcej kleju, aby stworzyć uszczelnienie na połączeniu pipety z igłą. Trzymając końcówkę pipety skierowaną do góry, pozostawić cały zestaw do wyschnięcia na około 12 godzin.Po znieczuleniu i umieszczeniu szczura w aparacie stereotaktycznym, należy nałożyć maść oftalmiczną i wygolić skórę głowy. Po podaniu znieczulenia miejscowego i potwierdzeniu uzyskania chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, należy przystąpić do nacięcia skóry głowy wzdłuż linii pośrodkowej za pomocą ostrza skalpela nr 10. Pozwoli to na odsłonięcie szwów czołowego i strzałkowego.Następnie, używając szpatułki chirurgicznej, zlokalizuj punkty anatomiczne lambda i bgma. Dostosuj położenie głowy tak, aby punkty orientacyjne te znajdowały się na tym samym poziomie w jednej płaszczyźnie poziomej. Następnie ustaw zero precyzyjnego, sztywnego wskaźnika, takiego jak szklana rurka, na punkcie bgma.Następnie dostosuj położenie probówki do interesującego nas miejsca, korzystając z współrzędnych z bgma. Użyj markera, aby narysować kwadrat wokół obszaru docelowego kraniotomii. Teraz, używając wysterylizowanego chirurgicznie wiertła, powoli usuń kość wzdłuż zaznaczonych linii.Zacznij od wywiercenia otworu, używając jak najmniejszego nacisku i cały czas poruszając wiertłem, aby uniknąć uszkodzenia tkanek spowodowanego tarciem głowicy w miejscach, gdzie kość stała się cienka; następnie ostrożnie usuń kwadratowy fragment za pomocą pęsety. Nie ma potrzeby usuwania twardej opony (Dura Mater), ponieważ wstrzykiwany preparat przeniknie przez nią w kolejnym etapie. Utrzymuj odsłoniętą korę w stanie nawilżonym, używając płynu mózgowo-rdzeniowego.Przygotuj wstrzyknięcie, napełniając najpierw strzykawkę o pojemności od 5 do 10 µL olejem mineralnym. Następnie przygotuj badany lek z dodatkiem barwnika w soli fizjologicznej. W tym przypadku 0,5% Chicago sky blue miesza się z 300 µM gaba.Teraz napełnij pipetę wstrzykującą, najpierw pobierając przygotowany roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml, a następnie używając strzykawki do napełnienia pipety. Podczas wyjmowania strzykawki lekko naciskaj tłok, aby podciśnienie nie usunęło roztworu z kanału wtryskowego. Sprawdź, czy płyn nie wycieka w potencjalnych punktach nieszczelności.Usuń nadmiar płynu za pomocą tamponu i ponownie sprawdź, czy nie ma wycieków. Następnie przymocuj mikrosyringę z olejem mineralnym do drogi iniekcyjnej. Na koniec wytrzyj nadmiar roztworu.Używając gazy, sprawdź końcówkę wstrzykiwacza. Powinny z niej wypływać małe krople roztworu; w przeciwnym razie jest ona zablokowana. Jeśli jest drożna, należy teraz bezpiecznie zamocować wstrzykiwacz w systemie mikropompy.Następnie przesuń ramię do iniekcji do współrzędnych docelowych i opuść elektrodę do ciała słupowego (superior colliculus), które można zidentyfikować poprzez rejestrację potencjałów wywołanych wzrokowo. Podczas opuszczania elektrody zastosuj niewielkie nadciśnienie, utrzymując niską prędkość iniekcji, aby zapobiec zapchaniu igły. Przerwij iniekcję po dotarciu do struktury.Po wprowadzeniu kaniuli, pokryć odsłoniętą korę ciepłym agarem, aby zapobiec wysychaniu. Po ostatecznym umieszczeniu elektrody odczekać 30 minut w celu stabilizacji tkanki wokół elektrody. Następnie wstrzyknąć od 400 do 800 nanolitrów roztworu z prędkością 40 nanolitrów na minutę, aż do aktywacji aktywności neuronalnej w górnym wzgórzu; podczas wstrzykiwania roztworu hamującego elektroda powinna wykazać redukcję impulsów.Potencjały wywołane wzrokowo zarejestrowano w wzgórzu górnym. Po błysku trwającym 300 milisekund skierowanym do oka przeciwległego w momencie wstrzyknięcia gaba, aktywność impulsowa w odpowiedzi na bodziec świetlny była tłumiona przez 45 do 60 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest sprawdzenie szczelności podczas napełniania oraz weryfikacja, czy roztwór leku swobodnie przepływa przez końcówkę wtryskową.

simultaneous-electrophysiological-recording-micro-injections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednoczesne rejestrowanie elektrofizjologiczne i mikroiniekcje inhibitorów w mózgu gryzoni

Opracowaliśmy metodę jednoczesnego wykonywania funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym oraz rejestracji elektrofizjologicznej w mózgu gryzoni, co stanowi platformę do badania zależności między aktywnością neuronalną a sygnałem fMRI zależnym od poziomu utlenowania krwi (BOLD).

Jednoczesne badanie fMRI i elektrofizjologii w mózgu gryzoni

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ten protokół opisuje montaż i użycie iniekcji do precyzyjnego dostarczania leku do wybranych obszarów mózgu znieczulonego szczura, a następnie monitorowanie aktywności neuronalnej za pomocą zarejestrowanych sygnałów elektrycznych.

Mikroiniekcja leku z zapisem elektrofizjologicznym w mózgu szczura

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Wideo demonstruje jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z wielu obszarów mózgu u szczura przy użyciu zintegrowanego układu mikronapędów. Elektrody rejestrujące są umieszczone w opuszce węchowej, elektrody referencyjne w korze czołowej, a elektrody układu mikronapędów w hipokampie. Szczur może swobodnie żerować, a jednoczesny zapis ze wszystkich wszczepionych elektrod jest rejestrowany za pomocą matrycy.

Metoda Micro-drive Array do zapisu elektrofizjologicznego z wielu obszarów mózgu

Ten film demonstruje procedurę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i lokalnych potencjałów pola (LFP) u znieczulonego szczura. Proces polega na przygotowaniu szczura i przymocowaniu elektrod stymulujących do jego opuszków wąsów. Elektroda pająka EEG jest umieszczana na czaszce szczura w celu powierzchniowych pomiarów EEG. W tym samym czasie wielokanałowa mikroelektroda jest wprowadzana do określonego obszaru mózgu przez otwór w czaszce, aby rejestrować...

Równoczesne zapisy potencjału elektroencefalograficznego i lokalnego potencjału pola u znieczulonego szczura

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Ten protokół opisuje prostą metodę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i wielolaminarnego potencjału pola lokalnego u znieczulonego szczura. Wykazano, że otwór w czaszce wywiercony w czaszce w celu wprowadzenia mikroelektrody powoduje znikome zniekształcenia sygnału EEG.

Jednoczesna rejestracja kolokalizowanej elektroencefalografii i lokalnego potencjału pola u gryzoni

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Prezentujemy system mikroiniekcji przeznaczony do elektrofizjologii i wspomaganego dostarczania eksperymentalnych sond (tj. nanosensorów, mikroelektrod), z opcjonalnym wlewem leku. Powszechnie dostępne składniki mikroprzepływowe są sprzężone z kaniulą zawierającą sondę. Dołączony jest protokół krok po kroku dotyczący budowy mikroiniekcji, z wynikami podczas infuzji muscymolu w korze makaka.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Poznaj metodę mikroiniekcji neuroprzekaźników do wyższej wzgórki szczura z jednoczesnym zapisem aktywności wielojednostkowej. Ta technika umożliwia badanie funkcji głębokich struktur mózgu w czasie rzeczywistym.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Przeglądaj więcej filmów