Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia
July 7th, 2015
Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.
Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie niedrogiej drogi do wstrzykiwania neuroprzekaźników mikro do wzgórka górnego szczura przy jednoczesnym monitorowaniu wieloczęściowej aktywności neuronalnej. W tym celu należy najpierw stworzyć szklaną pipetę za pomocą szklanej kapilary i pionowego ściągacza do mikropipet. Drugim krokiem jest włożenie srebrnego drutu do kapilary z odcinkiem drutu wystającym z niestożkowego końca.
Następnie za pomocą kleju tworzy się szczelne uszczelnienie między szklaną pipetą a igłą podskórną. Ostatnim krokiem jest napełnienie pipety roztworem GABA w kolorze Chicago w kolorze błękitnym, podłączonym do mikrostrzykawki wypełnionej olejem mineralnym i przymocowanej do mikrowstrzykiwacza. Ostatecznie, ta konstrukcja zastrzyku z dostępnymi i niedrogimi częściami może być wykorzystana do dezaktywacji głębokich struktur mózgu podczas rejestrowania aktywności neuronalnej inaktywowanego obszaru przed, w trakcie i po wstrzyknięciu leku.
Istnieje kilka zalet tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak impulsy ciśnienia oparte na gazie i systemy iniekcji fototycznej. Jednym z nich jest to, że jest to opłacalna metoda, która pozwala na funkcjonalną kontrolę dostarczania leku, co ogranicza uszkodzenia tkanek spowodowane nadmiernym wstrzyknięciem. Kolejną zaletą, jaką oferuje ten system, jest połączona możliwość nagrywania, która pozwala na efektywną kontrolę nad czasową składową dezaktywacji neuronalnej.
Aby przygotować nagrywające pipety iniekcyjne, najpierw pociągnij siedmiocentymetrową kapilarnę o średnicy zewnętrznej jednego milimetra w przypadku pionowego modelu cop. Siedem 20 lub podobna jednostka. Ustaw grzałkę na 18, a elektrozawór na następny, w rękawiczkach ręcznie złamij końcówkę, aby zrobić otwór i sprawdź pod mikroskopem, czy średnica wewnętrzna wynosi od 30 do 40 mikrometrów.
Zmierz to za pomocą linijki wizjera. Wytwarza stosunkowo niską impedancję od 0,3 do 0,6 megaoma. Następnie od niestożkowego końca włóż srebrny drut do pipety o długości około siedmiu centymetrów i pozostaw jeden do dwóch centymetrów zwisających z pipety.
Zegnij ten nadmiar drutu prostopadle do kapilary. Następnie weź igłę podskórną o rozmiarze 30 i nałóż elastyczny klej z tworzywa sztucznego na trzon. Następnie powoli włóż igłę do pipety.
O ile to możliwe. Dodaj więcej kleju, aby utworzyć uszczelnienie na styku pipety i igły. Końcówką pipety skierowaną do góry pozostaw zestaw do wyschnięcia na około 12 godzin.
Po znieczuleniu i umieszczeniu szczura w stereotaktycznej ramie, nałóż maść okulistyczną, ogol głowę do czysta. Po zastosowaniu znieczulenia miejscowego i potwierdzeniu znieczulenia chirurgicznego, przystąp do nacinania skóry głowy wzdłuż mediany za pomocą ostrza skalpela numer 10. Spowoduje to odsłonięcie szwów czołowych i strzałkowych.
Następnie za pomocą szpatułki chirurgicznej zidentyfikuj odniesienia anatomiczne Lambda i bgma. Dostosuj położenie głowy tak, aby te punkty orientacyjne znajdowały się poziomo w tej samej płaszczyźnie poziomej. Potem zero, cienka sztywna wskazówka jak szklana rurka na bgma.
Następnie dostosuj położenie rury do interesującej Cię lokalizacji, używając współrzędnych z bgma. Użyj sharpie, aby narysować kwadrat wokół obszaru docelowego dla kraniotomii. Teraz za pomocą chirurgicznego wysterylizowanego wiertła powoli usuń kość wzdłuż śladów.
Zacznij od jak najmniejszego nacisku i utrzymuj wiertło w ruchu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki spowodowanego tarciem, gdy kość stała się cienka, ostrożnie usuń kwadratowy przekrój pęsetą. Dora MA nie musi być usuwana, ponieważ wstrzyknięcie będzie ją penetrować w przyszłości. Utrzymuj odsłoniętą korę mózgową przepłukaną płynem mózgowo-rdzeniowym.
Przygotować wstrzyknięcie, najpierw napełniając strzykawkę o pojemności od 5 do 10 mikrolitrów olejem mineralnym. Następnie przygotuj interesujący Cię lek z barwnikiem w soli fizjologicznej. Tutaj 0,5% błękitu nieba Chicago miesza się z 300 mikromolowymi gabami.
Teraz napełnij pipetę iniekcyjną, najpierw ładując jednomililitrową strzykawkę przygotowanym roztworem, a następnie używając strzykawki do załadowania pipety. Podczas wyjmowania strzykawki należy lekko naciskać na tłok, aby podciśnienie nie usunęło roztworu z drogi wstrzykiwania. Sprawdź, czy w ewentualnych miejscach wycieków nie ulatnia się płyn
.Wytrzyj nadmiar płynu i ponownie sprawdź, czy nie ma wycieków. Teraz przymocuj mikrostrzykawkę z olejem mineralnym do drogi iniekcji. Następnie zetrzyj nadmiar roztworu.
Z gazą. Sprawdzić końcówkę wtrysku. Powinno być możliwe przepuszczenie przez niego małych kropel roztworu, w przeciwnym razie zostanie on zablokowany lub teraz bezpiecznie zamontuj wtryskiwacz do układu mikropompy.
Następnie przesuń położenie drogi iniekcji do współrzędnych docelowych i opuść elektrodę do górnej kolumny, którą można zidentyfikować poprzez rejestrację wizualnych potencjałów wywołanych. Gdy elektroda jest opuszczona, zastosuj niewielkie nadciśnienie, stosując niską szybkość wtrysku, aby uniknąć zatkania. Przerwij wstrzykiwanie, gdy struktura zostanie osiągnięta.
Po wstrzyknięciu wstrzyknięcia należy przykryć odsłoniętą korę ciepłym agarem, aby zapobiec wysuszeniu. Po ostatecznym umieszczeniu elektrody należy odczekać 30 minut, aby umożliwić ustabilizowanie się tkanki otaczającej elektrodę. Następnie wstrzyknąć od 400 do 800 nanolitrów roztworu w tempie 40 nanolitrów na minutę, aż do aktywacji aktywności neuronalnej w górnej okrężnicy, elektroda powinna wykazywać zmniejszenie skoków podczas wstrzykiwania roztworu hamującego.
Wizualnie wywołane potencjały uzyskano w górnej części jelita grubego. Po 300-milisekundowym błysku do przeciwległego oka po wstrzyknięciu gaba, aktywność impulsowa w odpowiedzi na bodziec błyskowy została stłumiona na 45 do 60 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków podczas ładowania i sprawdzić, czy roztwór leku swobodnie przepływa przez końcówkę iniekcji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje konstrukcję szklanej pipety przeznaczonej do dwóch celów: dostarczania leków w celu inhibicji głębokich struktur mózgu oraz monitorowania aktywności neuronowej poprzez rejestrację elektrofizjologiczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Neurofarmakologia
Tło
- Rozumienie głębokich struktur mózgu jest kluczowe dla badań neuronaukowych.
- Mikrowstrzykiwania umożliwiają ukierunkowane dostarczanie leków.
- Przeprowadzenie jednoczesnego monitorowania aktywności neuronowej poprawia dokładność danych.
- Niedrogi narzędzia mogą ułatwić szersze zastosowania badań.
Cel badania
- Stworzenie opłacalnej metody mikrowstrzykiwania neuroprzekaźników.
- Monitorowanie aktywności wielo-jednostkowej neuronów podczas podawania leków.
- Poprawa dostępności technik eksperymentalnych w neuronauce.
Stosowane metody
- Konstrukcja szklanej pipety przy użyciu szkła kapilarnego.
- Włożenie srebrnego drutu do rejestracji elektrycznej.
- Uszczelnienie pipety z igłą podskórną za pomocą kleju.
- Wypełnienie pipety roztworem GABA do mikrowstrzykiwań.
Główne wyniki
- Konstruowana pipeta skutecznie dostarczała leki do górnego wzgórza szczurów.
- Przeprowadzono jednoczesne rejestracje aktywności neuronowej.
- Metoda wykazała niezawodność w inaktywacji docelowych struktur mózgu.
- Wyniki wskazują na potencjalne szersze zastosowania w badaniach neuronaukowych.
Wnioski
- Pipeta o podwójnym działaniu jest cennym narzędziem w badaniach neuronaukowych.
- Pozwola na dostarczanie leków oraz monitorowanie aktywności neuronowej w czasie rzeczywistym.
- To podejście może poprawić wyniki eksperymentów w neurofarmakologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables real-time functional validation of drug effects on neuronal circuits, supporting target de-risking in early neuropharmacology discovery. By combining microinjection with electrophysiological readout, it provides mechanistic confidence for inhibitory compound screening. The approach offers a low-cost, adaptable platform for probing brain region-specific pharmacodynamics prior to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets through site-specific drug delivery and concurrent neuronal activity monitoring.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven validation of neuronal pathway involvement in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time electrophysiological readouts as functional biomarkers of drug engagement.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through reproducible microinjection and recording parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges in vitro findings to intact circuit function by validating drug effects in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Supports go/no-go decisions by linking target inhibition to measurable changes in neural network activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement and functional consequence must be established before compound advancement.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by confirming that target modulation produces expected electrophysiological outcomes.
- Screening: Enables primary screening of inhibitory agents using neuronal silencing as a functional readout.
- Analytics: Provides spike suppression metrics and latency-to-effect measurements for compound comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by demonstrating target-mediated effects in vivo.
- Enterprise Reuse: The injectrode design is adaptable across brain regions and chemical compounds, supporting broad reuse in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking pharmacological intervention to functional neural output.
- Operational Value: Reduces reliance on separate injection and recording systems, improving workflow efficiency and data synchronization.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by minimizing false positives through functional target confirmation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent electrophysiological responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, electrophysiology, and stereotaxic targeting.
- Depends on access to microinjectors, amplifiers, and signal acquisition systems capable of multi-unit recording.
- Necessitates standardization of injection volumes, rates, and post-injection stabilization periods across studies.
- Adaptation to different brain regions may require recalibration of coordinates and electrode positioning.
- Potential limitations include tissue damage from repeated insertions and variability in seal integrity affecting drug delivery accuracy.
