Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów
6 stycznia 2015
Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie hybrydyzacji DNA in situ do mapowania sekwencji heterochromatycznych na chromosomy mitotyczne. Osiąga się to poprzez najpierw preparację mózgów larw trzeciej w gwiaździstej larwie drosophila lub innej interesującej tkanki. Drugim krokiem jest utrwalenie tkanki na szkiełku nakrywkowym.
Następnie tkanka jest zgniatana między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Aby przygotować chromosomy do hybrydyzacji, ostatnim krokiem jest hybrydyzacja krótkich zsyntetyzowanych sond oligonuligostycznych ze zgniecioną tkanką. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do pokazania lokalizacji sekwencji komplementarnych do sond oligonukleostatycznych na chromosomach.
Główną przewagą tej metody nad istniejącymi metodami jest jej prostota. Większość innych metod hybrydyzacji chromosomów i C-dwóch obejmuje płukanie dużymi ilościami amidu formy, co może być kosztowne i kłopotliwe. Nasza metoda nie wymaga mycia IDE, dzięki czemu jest tańsza, czystsza i szybsza technika.
Chociaż metoda ta zapewnia prosty sposób na widoczne mapowanie sekwencji na chromosomach somatycznych mózgów drosophila, może być również stosowana do mapowania sekwencji na innych typach chromosomów z różnych tkanek w różnych organizmach. Do każdego preparatu, który ma być wykonany, przygotuj cztery lub pięć tkanek, ale nie więcej do sekcji mózgu. Zacznij od wybrania wędrujących larw trzeciego stadium rozwojowego i zebrania ich w kropli jednego XPBS.
Wybierz fiolki do zebrania, które nie są przepełnione. Pod lunetą sekcyjną użyj ultracienkiej pęsety, aby chwycić haczyki do ust, a drugiej pary, aby chwycić dwie trzecie długości ciała. Następnie delikatnie pociągnij za haczyki ustne, aby odsłonić mózg, zwoje brzuszne, gruczoły ślinowe i części przewodu pokarmowego.
Następnie odsuń mózg i brzuszne zwoje od innych tkanek i przenieś je do kropli jednego XPBT na plastikowej płytce. Do wycięcia jąder nosia zbiera się samca trzydniowego puy. Trzydniowe puy mają żółte ciała i czerwone oczy.
Te z mniejszymi poduszkami skrzydeł są samce. Chwyć poczwarkę w górnej części brzucha w pobliżu klatki piersiowej jedną parą pęsety i drugą parą pęset. Chwyć bardzo dystalny czubek brzucha, a następnie wyciągnij jądra w kształcie łzy.
Są one otoczone ciałami tłuszczowymi, które można delikatnie strząsnąć, odłączyć wszelkie zewnętrzne części ciała od jąder, co uniemożliwi prawidłowe zgniatanie i przenieść jądra do kropli jednego XPBT na czystej płytce. Po zebraniu wszystkich tkanek potraktuj je roztworem hipotonicznym, aby poprawić separację chromatyd siostrzanych. W obszarach chromatycznych e przenieś tkanki do kropli 0,5% cytrynianu sodu na 10 minut.
Aby uzyskać ten efekt, kolchicyna nie jest zalecana, ponieważ może powodować artefakty w morfologii chromosomów. Teraz napraw chusteczki za pomocą ultracienkiej pęsety. Przenieś je do 20-mikrolitrowej kropli świeżo przygotowanego 2,5% PFA w 45% kwasie octowym na czystym szkiełku nakrywkowym pokrytym powłoką sigma, równomiernie rozmieść tkanki w utrwalaczu i inkubuj je przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przystąp do zgniatania szkiełek nakrywkowych, zacznij od lekkiego umieszczenia szkiełka pokrytego polilizyną stroną zadrukowaną w dół na tkance i szkiełku nakrywkowym.
Pozwól, aby szkiełko nakrywkowe przykleiło się do spodu szkiełka bez naciskania. Leczeniu. Szkiełka nakrywkowe z powłoką sigma pomagają zapewnić, że tkanka dyni pozostaje na szkiełku po usunięciu szkiełka nakrywkowego. Jednakże w rzadkich przypadkach tkanka mogła pozostać przyczepiona do szkiełka nakrywkowego.
Na tym etapie zalecamy wykonanie replikacji zgniatania tkankowego. Teraz odwróć szkiełko i umieść je w złożonym kawałku grubego papieru. Następnie na stabilnej powierzchni, za pomocą kciuka, dociśnij bardzo mocno prosto w dół po szkiełku nakrywkowym.
Nie naciskaj w sposób, który przesuwa pokrywę, ponieważ spowoduje to rozmazanie tkanki. Bardzo mocne naciskanie zwykle skutkuje ładnie rozdzielonymi chromosomami w tkance squasha. Jednak czasami można napotkać zmienność jakości chromosomów, taką jak niekompletne, zgniecione lub pofragmentowane chromosomy.
Dlatego ponownie zalecamy wykonanie dwóch lub trzech powtórzonych zgniatarek tkankowych. Przenieś zespół na blok lodu na kilka minut, a następnie zanurz go w ciekłym azocie, aż azot przestanie wrzeć lub dłużej Po zdjęciu szkiełka bezpośrednio przed rozmrożeniem tkanki, użyj świeżej żyletki, aby przesunąć róg szkiełka nakrywkowego. W ten sposób go usuwając.
Uważaj, aby nie zarysować tkanki. Następnie szybko umieść szkiełko w słoiku z kopiną wypełnionym 100% etanolem i moczymy przez co najmniej pięć minut. Usuń szkiełko, usuń nadmiar etanolu bez dotykania chusteczki i pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę.
Szkiełka można następnie przechowywać przez tygodnie lub miesiące w komorze osuszającej. Zacznij od dodania 100 nanogramów każdej sondy do 20 mikrolitrów 1,1 x buforu hybrydyzacyjnego dla 22 mikrolitrów roztworu jednego x buforu hybrydyzacyjnego. Następnie odpipetować mieszaninę na utrwaloną tkankę, pozostawiając tkankę nietkniętą, i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe.
Mały pęcherzyk powietrza, który nie styka się z tkanką, nie będzie stanowił problemu, ale więcej pęcherzyków uzasadnia ponowne nałożenie szkiełka nakrywkowego. Ustaw szkiełko na płaskiej stronie bloku grzewczego o temperaturze 95 stopni Celsjusza i przykryj go folią. Odczekaj pięć minut, podczas których możesz przygotować komorę wilgotnościową, dodając mokre ręczniki papierowe do pudełka na napiwki.
Następnie wyjmij szkiełko. Ostrożnie zawiń szkiełko w rozciągnięty paraform i przenieś go do nawilżonej komory składającej się z wilgotnego ręcznika W pudełku na końcówki inkubuj szkiełko w komorze przez cztery godziny do nocy w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Ta temperatura działa dobrze w przypadku sond o niskiej zawartości GC, ale w przypadku sond o wyższej zawartości GC może być wymagane rozwiązywanie problemów z temperaturami hybrydyzacji.
Po inkubacji ostrożnie usunąć folię para, a następnie powoli podnieść szkiełko nakrywkowe o jeden róg. Następnie umyj szkiełko trzy razy w buforze 0,1 XSSC przez 15 minut na mycie. Przykryj słoik folią podczas prania, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
W przypadku długich sond biotynylowanych dodaj pręt domine avadon i umyj przed kontynuowaniem. Najpierw osusz obszar wokół tkanki i przykryj tkankę 100 mikrolitrami roztworu blokującego. Następnie delikatnie nałóż nowe szkiełko nakrywkowe, nie zatrzymując pęcherzyków powietrza.
Ponownie owiń slajd za pomocą param. Następnie inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po drugie, po inkubacji usuń szkiełko nakrywkowe i osusz tkankę chusteczką.
Następnie na tkankę nanieść 100 mikrolitrów jednego na 1000 avadonu żwacza rozcieńczonego w SBT. Następnie przykryj, owiń i inkubuj szkiełko, tak jak to zrobiono z blokiem. Na koniec ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe i umyj szkiełko.
Użyć trzech prań w czterech x SSC T, a następnie trzech prań w 0,1 XSSC. Każdy etap prania powinien trwać co najmniej pięć minut. Postępując zgodnie z protokołem, osusz szkiełka, usuwając nadmiar buforu bez dotykania tkanki.
Następnie umieść szkiełko chusteczką do góry w ciemnym miejscu na 10 do 15 minut lub do momentu, gdy wilgoć całkowicie się rozproszy. Teraz zamontuj suwak za pomocą 11 mikrolitrów osłony wektorowej z DPI i ostrożnie opuść na szkiełku nakrywkowym non sigma. Jeśli podłoże nie dotrze do wszystkich krawędzi, nałóż jeszcze kilka mikrolitrów podłoża od krawędzi i zetrzyj nadmiar.
Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i przechowuj szkiełko pionowo w ciemnym miejscu, aż lakier do paznokci wyschnie, co zwykle trwa co najmniej pół godziny. Następnie przechowuj szkiełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do tygodnia i zobrazuj tkankę tak szybko, jak to możliwe. Zestaw małych, komercyjnie zsyntetyzowanych oligonukleotydów z fluorescencyjnymi koniugatami i dłuższą biotynylowaną sondą wykonaną przez Nicka Translation'a został zhybrydyzowany z chromosomami z kilku różnych typów tkanek.
Korzystając z opisanej metodologii, sonda do powtórzenia satelitarnego par zasad Drosophila Melanogaster 359 rozpoznała duży blok wielu par megazasad na chromosomie x i znacznie mniejszy region na chromosomie trzecim. Dłuższa sonda skierowana przeciwko satelicie reagującemu wykryła powtarzające się bloki składające się ze stosunkowo niskiej liczby powtórzonych kopii, wynoszącej około 700. Dzięki temu metoda ta pozwala na wizualizację bardzo małych bloków satelitarnych.
Gdy etap leczenia roztworem hipotonicznym został podwojony do 10 minut, separacja chromatyd siostrzanych wzrosła na wschód. Procedura ta może być połączona z innymi metodami, takimi jak barwienie przeciwciał, w celu udzielenia odpowiedzi na pytania, takie jak niektóre białka chromatyny zlokalizowane w określonych sekwencjach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę hibrydyzacji in situ DNA z fluorescencyjnym znacznikiem (DNA ISH) do wizualizacji powtarzających się heterochromatycznych sekwencji na chromosomach. Technika ta jest przystosowana do różnych typów tkanek i długości sond, wykorzystując mikroskopi fluorescencyjną do wykrywania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genetyka
- Biologia komórki
Tło
- Hibrydyzacja DNA in situ jest potężną techniką do badania struktur chromosomowych.
- Heterochromatyna odgrywa krytyczną rolę w regulacji genów i stabilności chromosomów.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację określonych sekwencji DNA.
- Ta metoda może być zastosowana do różnych tkanek, co zwiększa jej wszechstronność.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody mapowania sekwencji heterochromatycznych.
- Wizualizacja tych sekwencji na chromosomach mitotycznych.
- Dostarczenie protokołu wymagającego minimalnej ilości reagentów.
Stosowane metody
- Sekcjonowanie mózgów larw Drosophila trzeciego stadium lub innych tkanek.
- Fiksacja tkanki na szkiełku pokrywnym.
- Ugniatanie tkanki między szkiełkiem pokrywnym a szlabanem.
- Hibrydyzacja krótkich syntetyzowanych sond oligo do przygotowanych chromosomów.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja sekwencji heterochromatycznych na chromosomach.
- Demonstracja wszechstronności metody z różnymi długościami sond.
- Skuteczna lokalizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Minimalne wymagania dotyczące reagentów poprawiają dostępność dla badaczy.
Wnioski
- Rozwijana metoda jest skuteczna w badaniu heterochromatyny.
- Może być dostosowana do różnych warunków eksperymentalnych.
- Ta technika przyczynia się do zrozumienia dynamiki chromosomów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This streamlined DNA ISH method enables rapid, cost-effective mapping of repetitive DNA sequences to heterochromatic regions, addressing a key challenge in target validation where computational approaches fail. By eliminating formamide washes, the protocol reduces technical complexity and reagent burden, supporting early-stage mechanistic de-risking of chromosomal targets. The approach is particularly valuable for phenotypic screening workflows requiring reliable visualization of satellite repeats in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of repetitive DNA sequences in heterochromatic regions, supporting target validation in genomic regions inaccessible to computational methods.
- Operational Value: Eliminates formamide wash steps, reducing protocol time, cost, and technical variability for high-throughput target interrogation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for repetitive sequence localization, enabling assay standardization across insect tissue types.
- Operational Value: Uses simple laboratory supplies and short fluorescent oligo probes, facilitating assay scalability and reuse in screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system analysis by mapping sequences in Drosophila neural cells and Nasonia spermatocytes, providing mechanistic insight into chromosomal organization.
- Operational Value: Adaptable to larger probes and single-copy sequences, allowing translational extension to non-repetitive targets in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing of repetitive elements and enabling progression to lead identification through chromosomal target de-risking.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis interrogation of heterochromatic regions by providing direct visualization of repeat localization on mitotic chromosomes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support reliable compound or genetic perturbation screening in chromosomal contexts.
- Analytics: Generates measurable hybridization signals (e.g., multi-megabase pair blocks) that allow comparative analysis across conditions or genetic backgrounds.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by visualizing targets in disease-relevant tissues such as neural cells and germline cells.
- Enterprise Reuse: Requires only basic lab equipment (dissection tools, cover slips, hybridization buffer, fluorescence microscope), positioning it as a reusable platform across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterochromatic regions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through elimination of variable formamide wash steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by lowering reagent costs and technical training barriers for target validation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets located in repetitive, heterochromatic genomic regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection (e.g., Drosophila larval brains, insect testes) and chromosome preparation techniques.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and basic molecular biology reagents (fluorescent oligos, hybridization buffer, SSC buffers).
- Necessitates standardization of squashing pressure and incubation times to ensure consistent chromosome resolution across users.
- Adaptation to larger probes or single-copy sequences may require optimization of hybridization temperature and blocking steps.
- Practical limitations include potential variability in chromosome quality (incomplete or fragmented squashes), mitigated by performing replicate tissue squashes.
