Name: Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ do wizualizacji sekwencji heterochromatycznych na chromosomach Drosophila. Prosta technika wymagająca minimalnej ilości odczynników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Zhaohua Irene Tang z Działu Naukowego W. M. Keck za użycie jej mikroskopu epifluorescencyjnego oraz laboratorium Werren za przekazanie Nasonii do sekcji. Praca ta była częściowo wspierana przez stypendium NIH-NRSA (5F32GM105317-02) na rzecz AML.

1. Disekcja i fiksacja tkanek (60 min)
<ol>
	<li>W przypadku mózgów Drosophila, umieść larwy 3rd stadium w kropli 1x PBS (buforu fosforanowego). Wybierz duże larwy 3rd stadium, które aktywnie pełzają, z fiolek lub butelek, które nie są przeludnione.
	<ol>
		<li>Użyj jednej pary pęsety ultrafine, aby chwycić haki gębowe, i drugiej pary pęsety, aby chwycić ciało w 2/3 jego długości (Rysunek 1A, B). Delikatnie pociągnij za haki gębowe, aby odsłonić mózg, zwoje brzuszne, gruczoły ślinowe i część larwalnego przewodu pokarmowego. Użyj pęsety, aby oddzielić mózg i zwoje brzuszne (Rysunek 1A, B) od pozostałych tkanek i umieść je w kropli 1x PBT (buforu fosforanowego z Tweenem) na plastikowej płytce Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku sekcji jąder Nasonia, wybierz 3-dniowe poczwarki samców (żółte ciała z czerwonymi oczami). Samce Nasonia mają w stadium poczwarki krótsze zaklatki skrzydeł w porównaniu do samic (Rysunek 1C).
	<ol>
		<li>Przytrzymaj poczwarkę w górnej części odwłoka, blisko regionu torakalnego, jedną parą pęsety, a drugą parą pęsety chwyć samy dystalny koniec odwłoka i wyciągnij jądra o kształcie łzy (będą one otoczone ciałem tłuszczowym, które można delikatnie strząsnąć; Rysunek 1D). Oddziel od jąder wszelkie zewnętrzne części ciała, które mogłyby uniemożliwić prawidłowe zgniatanie, i umieść je w kropli 1x PBT na plastikowej płytce Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na każde szkiełko przygotuj łącznie cztery lub pięć próbek tkanki (t.j. mózgi larwalne Drosophila lub jądra Nasonia). 
	UWAGA: Więcej niż pięć próbek doprowadzi do nadmiernego zagęszczenia jąder i chromosomów.</li>
	<li>Opcjonalnie, aby uzyskać pewną separację chromatyd siostrzanych w regionach euchromatycznych chromosomów mitotycznych, potraktuj tkankę roztworem hipotonicznym: przenieś mózgi z 1x PBT do kropli 0,5% cytrynianu sodu na 5-10 (nie więcej niż 10) min. 
	UWAGA: Kolchicyna (inhibitor mitozy) może być pomocna w zwiększeniu liczby figur mitotycznych w metafazie11. Jednak jej stosowanie jest zbędne, jeśli używa się bardzo dużych, zdrowych larw, a nawet niewskazane, ponieważ może ona negatywnie wpływać na rozdzielczość chromosomów, ich rozprzestrzenianie się i morfologię.</li>
	<li>Na powierzchnię czystego szkiełka zakrywającego potraktowanego Sigmacote nałóż kroplę (~20 µl) roztworu utrwalającego (2,5% paraformaldehydu w 45% kwasie octowym). 
	UWAGA: Roztwór utrwalający należy przygotowywać na świeżo każdego dnia użytkowania. Roztwory utrwalające zawierające od 1,8-3,7% paraformaldehydu w 45% kwasie octowym dają najlepsze wyniki w FISH. W przypadku stosowania tkanek innych niż mózgi lub jądra, lub adaptacji tego protokołu do immuno-FISH, konieczne może być eksperymentowanie z różnymi utrwalaczami (listę różnych utrwalaczy przedstawiono w12).</li>
	<li>Ostrożnie przenieś każdą próbkę tkanki z buforu do sekcji (1x PBT) do kropli utrwalacza za pomocą pęsety ultrafine, minimalizując przenoszenie buforu do roztworu utrwalającego. Rozmieść próbki tkanki tak, aby były równomiernie rozmieszczone względem siebie w kropli utrwalacza. Inkubuj tkanki w utrwalaczu przez 4 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie połóż szkiełko powlekane polilizyną stroną roboczą do dołu na tkankę i szkiełko zakrywająca. Na tym etapie nie dociskaj, lecz pozwól im lekko się stykać, tak aby szkiełko zakrywająca przykleiła się do spodniej strony szkiełka podstawowego. Odwróć szkiełko tak, aby szkiełko zakrywająca znalazło się na górze.</li>
	<li>Umieść zestaw szkiełko/tkanka/szkiełko zakrywająca pomiędzy złożonym kawałkiem papieru filtrowanego. Na stabilnej powierzchni, używając kciuka, naciśnij bardzo mocno pionowo w dół bezpośrednio nad szkiełkiem zakrywającym. Należy uważać, aby uniknąć bocznego przesunięcia szkiełka zakrywającego (spowoduje to rozmazanie tkanki).</li>
	<li>Zanurz zestaw szkiełko/tkanka/szkiełko zakrywająca w ciekłym azocie (patrz aparatura na Rysunku 1E, F) i pozostaw do momentu, aż azot przestanie wrzeć (można pozostawić dłużej). Wyjmij szkiełko i natychmiast odłam szkiełko zakrywająca świeżym ostrzem brzytwy, uderzając w róg szkiełka zakrywającego w kierunku góra (unikaj zarysowania utrwalonej tkanki brzytwą).
	<ol>
		<li>Wstępne schłodzenie zestawu szkiełko/tkanka/szkiełko zakrywająca na bloku suchego lodu, szkiełkiem zakrywającym do góry, przez 1-2 min przed zanurzeniem w ciekłym azocie pomoże zapobiec pękaniu szkiełek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szkiełko z tkanką umieść natychmiast w naczyniu Coplina wypełnionym 100% etanolem w temperaturze pokojowej i pozostaw na co najmniej 5 min (czas ten może być dłuższy, jeśli jest to konieczne). 
	UWAGA: Można również zastosować zimny 100% etanol.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z tkanką, usuń nadmiar etanolu chusteczką Kimwipe (nie dotykając utrwalonej tkanki) i pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez 1 h.
	<ol>
		<li>Przejdź bezpośrednio do kroku 2 lub przechowuj szkiełka w stanie suchym w powietrzu o niskiej wilgotności lub w komorze do suszenia przez tygodnie, a nawet miesiące przed przeprowadzeniem hybrydyzacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Etapy rozwoju embrionalnego, podpisane schematy, obrazy mikroskopowe, konfiguracja bioreaktora, badanie laboratoryjne." src="/files/ftp_upload/52288/52288fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: (A) Larwa Drosophila w 3rd stadium (po prawej), z zaznaczonymi miejscami chwytania haczyków gębowych (oznaczone *) oraz punktem w 2/3 długości larwy w celu wyizolowania mózgów; (po lewej) schemat larwy w tym samym stadium rozwojowym, przedstawiający względne położenie mózgu w głowie larwy. (B) Mózg i zwoje brzuszne wyizolowane z larwy Drosophila w 3rd stadium (po prawej) oraz schemat tej tkanki (po lewej). (C) 3-dniowa poczwarka Nasonia w stadium żółtego ciała i czerwonych oczu. (D) Para jąder wyizolowana z 3-dniowej męskiej poczwarki Nasonia (po prawej), z zaznaczonymi miejscami chwytania poczwarki w tylnej części odwłoka (oznaczone *) oraz w połowie ciała; (po lewej) schemat przedstawiający męskie i żeńskie poczwarki osy; poczwarki męskie można odróżnić po skrzydłach, które nie wykraczają poza profil strzałkowy (czarna strzałka), w przeciwieństwie do samic, których skrzydła wykraczają poza profil; względne położenie pary jąder pokazano u męskiej poczwarki. (E) Aparatura — łańcuch spinaczy — oraz (F) metoda stosowana do zanurzania szkiełek w naczyniu z ciekłym azotem. Można użyć wielu łańcuchów spinaczy do jednoczesnego zanurzenia wielu szkiełek.
2. Hybrydyzacja in situ (30 min w dniu 1.; 1 godz.—2,5 godz. dla długich sond—w dniu 2.)
<ol>
	<li>Do 20 µl buforu do hybrydyzacji 1.1x dodać 1 µl (100 ng) każdej sondy. Nanieść pipetą sondę/bufor do hybrydyzacji na powierzchnię utrwalonej tkanki (unikając dotykania tkanki).</li>
	<li>Ostrożnie położyć szkiełko podstawowe bezpośrednio na sondzie/buforze do hybrydyzacji, upewniając się, że szkiełko jest wycentrowane bezpośrednio nad tkanką. Bufor powinien rozprzestrzenić się do zewnętrznej krawędzi szkiełka, nie pozostawiając pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Małe pęcherzyki, które nie stykają się z tkanką, nie stanowią problemu dla procedury. Duże pęcherzyki należy usunąć, ostrożnie podnosząc róg szkiełka i delikatnie opuszczając je z powrotem na preparat.</li>
	<li>Umieścić preparat/tkankę/szkiełko na powierzchni bloku grzejnego wstępnie podgrzanego do 95 °C (szkiełkiem do góry). Przykryć dużym kawałkiem folii aluminiowej, aby zapobiec ekspozycji na światło. Inkubować preparat w temperaturze 95 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Typowy blok grzejny z otworami na probówki można odwrócić, aby uzyskać płaską powierzchnię, na której można umieścić preparat/tkankę/szkiełko.</li>
	<li>Wyjąć preparat i pozwolić mu lekko ostygnąć, aż będzie ciepły w dotyku. Ostrożnie owinąć szkiełko kawałkiem naciągniętego Parafilmu, aby uszczelnić ciecz pod nim.</li>
	<li>Umieścić uszczelniony preparat w komorze wilgotnościowej, a następnie wstawić komorę do inkubatora wstępnie podgrzanego do 30 °C. Inkubować w temperaturze 30 °C od 4 h do całej nocy.
	<ol>
		<li>Komorę wilgotnościową można przygotować z pustego pudełka na końcówki lub szczelnego pojemnika typu Tupperware z wilgotnymi chusteczkami Kimwipes lub ręcznikami papierowymi umieszczonymi na dnie. 
		UWAGA: Jednoniciowe oligonukleotydowe sondy DNA zostały zaprojektowane tak, aby miały 28-33 zasady, co pozwala osiągnąć teoretyczną temperaturę topnienia (Tm) wynoszącą 45-47 °C. Zakresy długości i Tm odzwierciedlają fakt, że wiele badanych przez nas sekwencji powtórzeniowych jest bogatych w AT, a zatem mają bardzo niską zawartość GC. Dłuższe sondy prawdopodobnie będą miały wyższe wartości Tm, co może skutkować silniejszą hybrydyzacją tła w standardowej temperaturze hybrydyzacji 30 °C. W związku z tym może być konieczna optymalizacja temperatur hybrydyzacji w celu uzyskania najlepszych wyników. Aby znaleźć optymalną temperaturę hybrydyzacji, należy zwiększać (lub zmniejszać) temperaturę stopniowo o 5 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie usunąć Parafilm z preparatu, a następnie ostrożnie zdjąć szkiełko, powoli podnosząc jeden z jego rogów. Przemyć preparat trzy razy, każdorazowo przez 15 min, w buforze SSC 0.1x. Podczas płukania przykryć naczynie Coplina folią aluminiową, aby zminimalizować ekspozycję na światło.</li>
	<li>W przypadku nieużywania długiej sondy biotynilowanej przejść do kroku 2.8.
	<ol>
		<li>W przypadku użycia długiej sondy biotynilowanej, osuszyć obszar wokół tkanki chusteczką Kimwipe, uważając, aby nie dotknąć samej tkanki. Nanieść 100 µl roztworu blokującego na tkankę i delikatnie przykryć szkiełkiem, dbając o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Owinąć szkiełko Parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
		<li>Ostrożnie zdjąć szkiełko i osuszyć obszar wokół tkanki chusteczką Kimwipe. Nanieść pipetą 100 µl rodaminy-awidyny rozcieńczonej 1:1 000 w SBT na tkankę i delikatnie przykryć szkiełkiem, dbając o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Owinąć szkiełko Parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
		<li>Ostrożnie zdjąć szkiełko i przemyć preparat 3 razy po 5 min w SSCT 4x, a następnie 3 razy po 5 min w SSC 0.1x. 
		UWAGA: Preparaty można płukać przez dłuższy czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć preparat i osuszyć obszar wokół tkanki suchą chusteczką Kimwipe, aby usunąć nadmiar buforu (unikając dotykania tkanki). Umieścić preparat stroną z tkanką do góry w ciemnym miejscu na 10-15 min lub do całkowitego odparowania wilgoci.</li>
	<li>Nanieść pipetą 11 µl medium montażowego Vectashield (z dodatkiem 4’,6-diamidino-2-fenyloindolu—DAPI) na tkankę. Ostrożnie położyć czyste szkiełko (niepotraktowane Sigmacote) bezpośrednio nad centrum medium montażowego i tkanki. Medium montażowe powinno powoli rozprzestrzeniać się na zewnątrz w stronę krawędzi szkiełka. 
	UWAGA: Jeśli medium montażowe nie dotrze do krawędzi szkiełka ze wszystkich stron, można nanieść dodatkowe 1-2 µl medium w jednym punkcie przy krawędzi szkiełka, aby uzupełnić brakującą objętość. W takim przypadku należy pamiętać o wytarciu nadmiaru medium z powierzchni preparatu przed uszczelnieniem.</li>
	<li>Uszczelnić krawędzie szkiełka lakierem do paznokci. Unikać malowania lakierem obszaru z próbką tkanki.</li>
	<li>Umieścić preparat pionowo w ciemnym miejscu i pozostawić lakier do wyschnięcia do całkowitego utwardzenia (zazwyczaj 30 min lub dłużej). Na tym etapie można wykonać obrazowanie tkanki lub przechowywać preparat w temperaturze -20 °C do 1 tygodnia przed późniejszym obrazowaniem.</li>
</ol>
Przepisy na bufory/roztwory
10x PBS
<ul>
	<li>80 g NaCl</li>
	<li>2.0 g KCl</li>
	<li>14.4 g Na2HPO4</li>
	<li>2.4 g KH2PO4</li>
	<li>pH do 7.4, H2O do 1 L</li>
</ul>
1x PBT
<ul>
	<li>5 ml 10x PBS</li>
	<li>45 ml H2O</li>
	<li>0,1% Tween 20</li>
</ul>
20x SSC
<ul>
	<li>175,3 g NaCl</li>
	<li>88,2 g cytrynianu sodu</li>
	<li>w 800 ml H2O</li>
	<li>pH do 7, dopełnić H2O do 1 L</li>
</ul>
4x SSCT
<ul>
	<li>200 ml 20x SSC</li>
	<li>799 ml H2O</li>
	<li>0,1% Tween 20</li>
</ul>
0,1x SSC
<ul>
	<li>5 ml 20x SSC</li>
	<li>995 ml H2O</li>
</ul>
Mieszanina do hybrydyzacji (20 µl; zmodyfikowana na podstawie 11)
<ul>
	<li>10 µl formamidu</li>
	<li>4 µl 50% siarczanu dekstranu</li>
	<li>2 µl 20x SSC</li>
	<li>4 µl H2O</li>
</ul>
SBT8 (10 ml)
<ul>
	<li>2 ml 20x SSC</li>
	<li>0,01 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</li>
	<li>10 µl Tween 20</li>
	<li>7,9 ml H2O</li>
</ul>
Roztwór blokujący8 (10 ml)
<ul>
	<li>0.3 g BSA</li>
	<li>10 µl Tween 20</li>
	<li>2 ml 20x SSC</li>
	<li>8 ml H2O</li>
</ul>
Roztwór utrwalający z paraformaldehydem (1 ml)
<ul>
	<li>393,75 µl H2O (najpierw dodać wodę)</li>
	<li>450 µl octowej lodowatej</li>
	<li>156,25 µl 16% paraformaldehydu</li>
</ul>

<ol><li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
<li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li>
<li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li>
<li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing%3A+computational+challenges+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li>
<li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li>
<li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li>
<li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).</li>
<li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+l%281%29zw10+gene+product%2C+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation%2C+is+redistributed+at+anaphase+onset%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li>
<li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie łączy ich konkurencyjny konflikt interesów finansowych ani żaden inny.

DNA ISH jest często używany do mapowania określonych sekwencji na chromosomy. Opisaliśmy prostą metodę dla DNA ISH zoptymalizowaną pod kątem sekwencji heterochromatycznych o dużej liczbie kopii. Zamiast używać płukania w roztworze formamidu, co jest wymogiem w innych istniejących protokołach ISH DNA, umieszczamy szkiełka montowane na tkankach bezpośrednio na wstępnie podgrzanym bloku w celu denaturacji DNA. Ta metoda pozwala obejść stosowanie dużych ilości formamidu. Jednym z krytycznych kroków do uzyskania wyraźnych syg...

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Sondy do pojedynczych regionów kopii w euchromatynie można wygenerować za pomocą kilku podejść, w tym translacji lub znakowania końcowego długich produktów DNA1,2 oraz włączenia nukleotydów przyłączonych do deoksygeniny (DIG) i ich rozpoznawania przez szeroką gamę przeciwciał sprzężonych z grupami1-3. Wizualizacja sekwencji euchromatycznych w liczbie kilku lub pojedynczych kopii wymaga użycia pojedynczych, dużych sond o wysokiej aktywności właściwej lub koktajlu wielu, mniejszych sond, które łącznie wzmacniają sygnał.
Natomiast wysoce powtarzalne sekwencje występujące w heterochromatynie, takie jak satelitarne DNA, są łatwiejszym celem dla DNA ISH, ponieważ zwykle istnieją jako dziesiątki do tysięcy powtórzeń zgrupowanych w pojedynczych regionach chromosomowych znanych jako bloki. Elementy transpozycyjne można również znaleźć przy dużej liczbie kopii w różnych loci chromosomowych2. W takich przypadkach pojedyncze sondy o niskiej aktywności właściwej mogą skutecznie oznaczać sekwencje heterochromatyczne ze względu na ich hybrydyzację w wielu miejscach. Sondy do powtarzających się sekwencji mogą być syntetyzowane komercyjnie jako krótkie oligonukleotydy (30-50 pz) i chemicznie sprzężone z dowolną z wielu różnych grup fluorescencyjnych. Mapowanie powtarzających się sekwencji w obrębie heterochromatyny przy użyciu technologii sekwencjonowania genomu jest trudne ze względu na wyzwania napotkane przy budowie rusztowań w wysoce powtarzalnych blokach satelitarnych4-6,7. Obecnie ISH jest najskuteczniejszym sposobem mapowania tych sekwencji na poziomie subchromosomów. Strategia ta jest ważna dla mapowania dużej liczby powtarzających się sekwencji, które są odkrywane w trwających badaniach sekwencjonowania genomu i transkryptomu.
Wydajność i łatwość mapowania powtarzających się sekwencji na chromosomach montowanych na szkiełku znacznie zwiększyłaby uproszczony protokół dla DNA ISH. Na przykład, istniejące protokoły dla DNA ISH obejmują wielokrotne płukanie zhybrydyzowanych tkanek w roztworze formamidu2,8, co znacznie wydłuża czas wymagany do mapowania sekwencji, a także wytwarza duże ilości odpadów chemicznych dla tego kosztownego odczynnika. Tutaj opisujemy poprawioną metodę DNA ISH, która omija potrzebę mycia formamidem i wykorzystuje podstawowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki. Metoda ta została pierwotnie zaprojektowana do szybkiego mapowania wysoce powtarzalnych sekwencji DNA w heterochromatycznych regionach neuroblastów larwalnych Drosophila przy użyciu komercyjnie zsyntetyzowanych oligonukleotydów, które są sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi. Jednak metoda ta sprawdza się również w przypadku mapowania powtarzających się sekwencji przy użyciu większych sond syntetyzowanych w inny sposób9,10 i w wielu różnych typach tkanek i chromosomów. Ponadto metoda ta może być używana do mapowania sekwencji euchromatycznych przy użyciu dłuższych lub wielu, krótkich sond w interesującej nas sekwencji euchromatycznej.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka pokryte poli-L-lizyną (można również stosować zwykłe szkiełka)</td><td>Pęseta Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine (rozmiar 5)</td><td>Szkiełka</td> nakrywkowe Dumont <td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Fisher</td><td></td><td></td><td>Sigmacote-traktowane przez zanurzenie na 15 sekund, osuszenie i wytarcie wszelkich śladów Sigmacote, aby szkiełko nakrywkowe było przezroczyste</td></tr> Bibuła filtracyjna <tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr>Papier <td></td><td></td><td></td><td>parafinowy woskowany</td></tr><tr><td>Blok grzewczy z termometrem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki Komora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> wilgotności <td>Puste pudełko na końcówki do pipet lub Tupperware, wyłożone zwilżonymi ręcznikami papierowymi lub Kimwipes</td></tr><tr><td>Słoiki z kopliny</td><td></td><td></td><td>z rowkami ślizgowymi</td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td>Pasteura</tr><tr><td>1,5 ml probówki</td><td></td><td></td><td></td>do mikrofuge</tr><tr><td>Lakier</td><td></td><td></td> do paznokci <td>Przezroczyste lub kolorowe</td></tr><tr><td>mikropipety P20 i plastikowe końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinacze do papieru</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standardowych metalowych spinaczy do papieru połączonych w formę chain</td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki</td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu klasy EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Odczynniki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol, klasa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> chemiczna<td colspan="4">Komercyjnie syntetyzowane, znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydowane</td></tr><tr><td>Długa biotynylowana sonda</td><td>Invitrogen; Alternatywne etapy 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>np. nick translowany i biotynylowany za pomocą BioNick z Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternatywne kroki 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>do wykrywania długiej sondy biotynylowanej</td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td>Receptura powyżej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Receptura powyżej</td><td></td><td>cytrynian soli fizjologicznej + Tween</td></tr><tr><td>0,1x SSC</td><td>Receptura powyżej</td><td></td><td>cytrynian soli fizjologicznej i sodu</td></tr><tr><td>Roztwór blokujący</td><td>Przepis powyżej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Przepis powyżej</td><td></td><td>SSC, albumina surowicy bydlęcej, Tween</td></tr><tr><td>1x</td><td>Receptura PBT powyżej</td><td></td><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanem + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td></tr><tr><td>Hipotoniczny</td><td></td><td></td><td>roztwór 0,5% cytrynian sodu w H2O</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield podłoże montażowe z wektorem DAPI</td><td> Laboratoria</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prosta metoda fluorescencji dna hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Podejście to jest szczególnie skuteczne w mapowaniu wysoce powtarzalnych sekwencji do regionów heterochromatycznych, w których podejścia obliczeniowe napotykają na zaporowe wyzwania. Tutaj opisujemy uproszczony protokół dla DNA ISH, który omija płukanie formamidu, które jest standardowym krokiem w innych protokołach DNA ISH. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem hybrydyzacji z krótkimi jednoniciowymi sondami DNA, które przenoszą barwniki fluorescencyjne, które skutecznie oznaczają powtarzające się sekwencje DNA w heterochromatycznych regionach chromosomowych w wielu różnych typach tkanek owadów. Aplikacje mogą być jednak rozszerzone o większe sondy i wizualizację pojedynczych kopii (niepowtarzalnych) sekwencji DNA. Demonstrujemy tę metodę, mapując kilka różnych powtarzających się sekwencji do zgniecionych chromosomów z komórek nerwowych Drosophila melanogaster i spermatocytów Nasonia vitripennis. Pokazujemy wzorce hybrydyzacji zarówno dla małych, komercyjnie zsyntetyzowanych sond, jak i dla większej sondy dla porównania. Ta procedura wykorzystuje proste materiały laboratoryjne i odczynniki i jest idealna dla badaczy, którzy mają niewielkie doświadczenie w wykonywaniu DNA ISH.

Aby zademonstrować tę metodę, przeprowadziliśmy hybrydyzację zestawu krótkich, komercyjnie syntetyzowanych oligosów, które zostały zmodyfikowane chemicznie koniugatami fluorescencyjnymi (Rycina 2), oraz dłuższej sondy biotynilowanej (wykonanej poprzez translację nacięć produktu PCR; Rycina 2B) z chromosomami pochodzącymi z kilku różnych typów tkanek (patrz Tabela 1). Sekwencje docelowe obejmowały powtórzenia satelitarne zlokalizowane w regionach pericentrycznych (heteroc...

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie hybrydyzacji DNA in situ do mapowania sekwencji heterochromatycznych w chromosomach mitotycznych. Jest to realizowane poprzez wstępne wypreparowanie mózgów trzecioinstarsalnych larw Drosophila lub innej wybranej tkanki. Drugim krokiem jest utrwalenie tkanki na szkiełku nakrywkowym.Następnie tkankę rozgniata się pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakryweksem. Aby przygotować chromosomy do hybrydyzacji, ostatnim krokiem jest hybrydyzacja krótkich syntetycznych sond oligonukleotydowych z rozgniecioną tkanką. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną, aby wykazać lokalizację sekwencji komplementarnych do sond oligonukleotydowych w chromosomach.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami jest jej prostota. Większość innych metod hybrydyzacji chromosomów i C2 wiąże się z płukaniem dużymi ilościami formamidu, co może być kosztowne i uciążliwe. Nasza metoda nie wymaga płukania formamidem, co czyni ją techniką tańszą, czystszą i szybszą.Chociaż metoda ta zapewnia prosty sposób na wizualne mapowanie sekwencji w chromosomach somatycznych mózgów drosofilego, może być również wykorzystana do mapowania sek

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prosta metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ DNA z rozgniecionymi chromosomami

Zespoły genomowe oparte na technologiach masowego równoległego sekwencjonowania DNA są zazwyczaj silnie pofragmentowane. Opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów. W niniejszej pracy prezentujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz obrazowania, które znacząco zwiększają wydajność tworzenia map fizycznych.

Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Połączenie preparatów halo DNA z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ umożliwia analizę interakcji genomowych z nukleoszkieletem w wysokiej rozdzielczości. Przyłączony genom prowadzi do zhybrydyzowanych sygnałów fluorescencyjnych zlokalizowanych w resztkowych wyekstrahowanych jądrach, podczas gdy nieprzyłączony genom znajduje się w halo DNA otaczającym resztkowe jądra.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

Ten protokół ilustruje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu tworzenia kondensatów na chromatynie. Pokazano tworzenie ciała jądrowego białaczki promielocytowej (PML) na telomerach za pomocą chemicznych dimeryzatorów. Wzrost, rozpuszczanie, lokalizacja i skład kropel są monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek, immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

Poznaj metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ do wizualizacji sekwencji heterochromatycznych na chromosomach Drosophila. Prosta technika wymagająca minimalnej ilości odczynników.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Przeglądaj więcej filmów