Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie hybrydyzacji DNA in situ do mapowania sekwencji heterochromatycznych w chromosomach mitotycznych. Jest to realizowane poprzez wstępne wypreparowanie mózgów trzecioinstarsalnych larw Drosophila lub innej wybranej tkanki. Drugim krokiem jest utrwalenie tkanki na szkiełku nakrywkowym.

Następnie tkankę rozgniata się pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakryweksem. Aby przygotować chromosomy do hybrydyzacji, ostatnim krokiem jest hybrydyzacja krótkich syntetycznych sond oligonukleotydowych z rozgniecioną tkanką. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną, aby wykazać lokalizację sekwencji komplementarnych do sond oligonukleotydowych w chromosomach.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami jest jej prostota. Większość innych metod hybrydyzacji chromosomów i C2 wiąże się z płukaniem dużymi ilościami formamidu, co może być kosztowne i uciążliwe. Nasza metoda nie wymaga płukania formamidem, co czyni ją techniką tańszą, czystszą i szybszą.

Chociaż metoda ta zapewnia prosty sposób na wizualne mapowanie sekwencji w chromosomach somatycznych mózgów drosofilego, może być również wykorzystana do mapowania sekwencji w innych typach chromosomów z różnych tkanek u różnych organizmów. Dla każdego preparatu do wykonania należy przygotować cztery lub pięć tkanek, ale nie więcej w przypadku wycinania mózgu. Rozpocznij od wyboru wędrujących larw trzeciego stadium i zgromadzenia ich w kropli 1x PBS.

Wybierz fiolki do pobrania materiału, które nie są przepełnione. Pod stereomikroskopem, używając ultraprecyzyjnej pęsety, chwyć haczyki gębowe, a drugą pęsetą chwyć ciało w 2/3 jego długości. Następnie delikatnie pociągnij za haczyki gębowe, aby odsłonić mózg, zwoje brzuszne, gruczoły ślinowe oraz fragmenty przewodu pokarmowego.

Następnie pęsetą oddziel mózg i zwoje brzuszne od pozostałych tkanek i przenieś je do kropli roztworu XPBT na plastikową płytkę. Do sekcji jąder nasia należy zebrać trzydniowe samce puy. Trzydniowe puy mają żółte ciała i czerwone oczy.

Osobniki z mniejszymi skrzydłami są samcami. Chwyć poczwarkę w górnej części odwłoka w pobliżu regionu klatki piersiowej za pomocą jednej pary pincet i drugą parą pincet chwyć samy dystalny koniec odwłoka, a następnie wyciągnij jajowate jądra.

Są one otoczone ciałami tłuszczowymi, które można delikatnie usuwać poprzez potrząsanie; należy oddzielić wszelkie zewnętrzne części ciała od jąder, co zapobiegnie prawidłowemu rozgnieceniu, a następnie przenieść jądra do kropli XPBT na czystą płytkę. Po zebraniu wszystkich tkanek należy poddać je działaniu roztworu hipotonicznego, aby poprawić separację chromatyd siostrzanych. W regionach chromatycznych przenieść tkanki do kropli 0,5% cytrynianu sodu na 10 minut.

Aby uzyskać ten efekt, nie zaleca się stosowania kolchicyny, ponieważ może ona powodować artefakty w morfologii chromosomów. Teraz unieruchomi tkanki, używając superprecyzyjnej pincety. Przenieś je do 20 µL kropli świeżo przygotowanego 2,5% PFA w 45% kwasie octowym na czystym szkiełku nakrywkowym pokrytym sigma coat; rozmieść tkanki równomiernie w utrwalaczu i inkubuj przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przystąp do rozgniatania szkiełek nakrywkowych; zacznij od delikatnego położenia szkiełka pokrytego polilizyną stroną roboczą do dołu na tkance i szkiełku nakrywkowym.

Pozwól lamelce przywrzeć do spodu szkiełka przedmiotowego bez dociskania. Potraktowanie lamelki preparatem sigma coat pomaga zapewnić, że rozgnieciona tkanka pozostanie na szkiełku po zdjęciu lamelki. Niemniej jednak zdarza się, że tkanka pozostaje przytwierdzona do lamelki.

Na tym etapie zalecamy wykonanie powtórnych preparatów rozgniatanych z tkanki. Teraz należy obrócić szkiełko i umieścić je w złożonym kawałku grubego papieru. Następnie, opierając się o stabilną powierzchnię, należy bardzo mocno docisnąć kciukiem pionowo w dół nad szkiełkiem nakrywką.

Należy unikać naciskania w sposób, który spowodowałby przesunięcie przykrywki, ponieważ może to doprowadzić do rozmazania tkanki. Bardzo mocny nacisk zazwyczaj pozwala uzyskać dobrze wyresolucjonowane chromosomy w preparacie typu squash. Niemniej jednak, sporadycznie mogą wystąpić różnice w jakości chromosomów, takie jak chromosomy niekompletne, zgniecione lub pofragmentowane.

W związku z tym ponownie zalecamy wykonanie dwóch lub trzech powtórzeń preparatów z rozgniecioną tkanką. Przenieść zestaw na blok lodu na kilka minut, a następnie zanurzyć go w ciekłym azocie, aż azot przestanie wrzeć lub na dłużej. Po wyjęciu szkiełka bezpośrednio przed rozmrożeniem tkanki, należy użyć nowej żyletki, aby podważyć róg szkiełka nakrywki, usuwając je w ten sposób.

Należy uważać, aby nie porysować tkanki. Następnie szybko umieścić preparat w naczyniu Coplande'a wypełnionym 100% etanolem i pozostawić do namoczenia przez co najmniej pięć minut. Wyjąć preparat, odsączyć nadmiar etanolu, nie dotykając tkanki, i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę.

Przygotowane szkiełka można następnie przechowywać od kilku tygodni do kilku miesięcy w komorze suszącej. Należy rozpocząć od dodania 100 nanogramów każdej sondy do 20 mikrolitrów 1,1 x buforu hybrydyzacyjnego, aby otrzymać 22 mikrolitry roztworu 1 x buforu hybrydyzacyjnego. Następnie należy nanieść mieszaninę pipetą na utrwaloną tkankę, nie dotykając jej, a następnie delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe.

Mały pęcherzyk powietrza, który nie styka się z tkanką, nie będzie stanowił problemu, jednak pojawienie się większej liczby pęcherzyków wymaga ponownego nałożenia szkiełka nakrywnego. Umieść preparat płaską stroną na bloku grzejnym o temperaturze 95 °C i przykryj go folią. Odczekaj pięć minut, w czasie których możesz przygotować komorę wilgotnościową, dodając mokre ręczniki papierowe do pudełka na końcówki.

Następnie wyjmij szkiełko. Ostrożnie owiń szkiełko rozciągniętą parafirmą i przenieś je do komory nawilżającej wykonanej z wilgotnego ręcznika w pudełku na końcówki. Inkubuj szkiełko w komorze przez cztery godziny lub przez noc w temperaturze 30 °C. Temperatura ta sprawdza się w przypadku sond o niskiej zawartości GC, jednak w przypadku sond o wyższej zawartości GC może być konieczna optymalizacja temperatur hybrydyzacji.

Po inkubacji ostrożnie usuń parafilm i powoli podnieś szkiełko nakrywkę za jeden z rogów. Następnie przemyj preparat trzykrotnie w buforze 0,1 XSSC przez 15 minut każdego płukania. Podczas płukania przykryj naczynie folią, aby zminimalizować ekspozycję na światło.

W przypadku długich sond biotynilowanych, przed kontynuacją należy dodać rod domine avadon i przeprowadzić przemywanie. Najpierw osuszyć obszar wokół tkanki i pokryć tkankę 100 µL roztworu blokującego. Następnie ostrożnie nałożyć nowe szkiełko nakrywkowe, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza.

Ponownie przykryj preparat szkiełkiem podstawowym i dodaj param. Następnie inkubuj preparat w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji zdejmij szkiełko nakrywkowe i osusz obszar wokół tkanki za pomocą chusteczki.

Następnie na tkankę nanieś 100 µL roztworu rumine avadon w rozcieńczeniu od 1:100 do 1:1000 w SBT. Następnie przykryj, owiń i inkubuj preparat w sposób analogiczny do bloku. Na koniec ostrożnie usuń szkiełko przykrywcze i przemyj preparat.

Wykonaj trzy płukania w 4x SSC T, a następnie trzy płukania w 0,1X SSC. Każdy etap płukania powinien trwać co najmniej pięć minut. Kontynuując protokół, osusz preparaty, odsączając nadmiar buforu w taki sposób, aby nie dotykać tkanki.

Następnie umieść preparat stroną z tkanką do góry w ciemnym miejscu na 10 do 15 minut lub do czasu całkowitego odparowania wilgoci. Teraz zamocuj preparat, używając 11 µL vector shield z DPI, i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkę bez powłoki sigma coat. Jeśli medium nie dotarło do wszystkich krawędzi, nanieś kilka kolejnych µL medium przy krawędzi i usuń nadmiar.

Następnie należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i przechowywać preparat w pozycji pionowej w ciemnym miejscu do czasu wyschnięcia lakieru, co zazwyczaj trwa co najmniej pół godziny. Potem preparat należy przechowywać w temperaturze -20 °C do tygodnia i obrazować tkankę tak szybko, jak to możliwe. Zestaw krótkich, syntetyzowanych komercyjnie oligosów z koniugatami fluorescencyjnymi oraz dłuższa sonda biotynilowana, otrzymana metodą Nick Translation, zostały zhybrydyzowane z chromosomami z kilku różnych typów tkanek.

Stosując opisaną metodologię, sonda do 359-par zasadnego powtórzenia satelitarnego Drosophila Melanogaster rozpoznała duży blok wielomegabazowy na chromosomie X oraz znacznie mniejszy obszar na chromosomie 3. Dłuższa sonda przeciwko satelicie responder wykryła bloki powtórzeń składające się ze stosunkowo niskiej liczby kopii powtórzeń, wynoszącej około 700. Zatem metoda ta umożliwia wizualizację bardzo małych bloków satelitarnych.

Kiedy czas trwania etapu traktowania roztworem hipotonicznym dwukrotnie wydłużono do 10 minut, stopień rozdzielenia chromatyd siostrzanych zwiększył się. Procedurę tę można połączyć z innymi metodami, takimi jak barwienie przeciwciałami, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, czy określone białka chromatyny lokalizują się w konkretnych sekwencjach.