Name: Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę profilowania polisomów do oceny selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków. Technika ta pozwala identyfikować mRNA o wysokiej i niskiej efektywności translacji w warunkach stresu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni byłym i obecnym członkom laboratorium, w szczególności Urszuli Liwak, za krytyczną dyskusję na temat protokołów profilowania polisomów i udostępniania danych. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem, Towarzystwa Badań nad Rakiem oraz Narodowej Rady Badań Naukowych i Inżynieryjnych Kanady dla MH. MDF była wspierana przez Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award i Ontario Graduate Scholarship, a praca ta stanowi część jej pracy doktorskiej.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Profilowanie polissomalne to potężna technika, która pozwala na ilościowe określenie stanu translacji określonych transkryptów w różnych warunkach leczenia. Jest to w zasadzie bardzo prosta technika, ale wymaga kilku etapów wykonania, z których niektóre mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych profili polisomowych. Te kluczowe kroki to: 1) użycie chemikaliów i tworzyw sztucznych wolnych od RNaz, 2) przygotowanie dobrych gradientów sacharozy (z naszego doświadczenia wynika, że 10-50% gradienty sacharozy najlepiej sprawdzają się do wydajnego rozwiązywania podjednostek 40/60S i mRNA ze związanymi rybosomami) oraz 3) użycie komórek, które rosną wykładniczo i nie więcej niż 80% zlewają się, aby uchwycić najwyższe wskaźniki translacji. Ten ostatni krok powinien być brany pod uwagę podczas wykonywania zabiegów z długimi komórkami, takich jak knockdown lub nadekspresja genów, tak aby ilość komórek do płytki była funkcją tego, jak bardzo komórki będą zlewać się w punkcie końcowym.
W przedstawionych tutaj wynikach analiza profilu polisomów była ważnym narzędziem do oceny roli PDCD4 w regulacji translacji mRNA XIAP i Bcl-xL12 zawierających IRES. Fakt, że nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian w ogólnych profilach polisomów po knock-down PDCD4 (Figura 1B), pozwolił nam stwierdzić, że PDCD4 nie upośledza globalnej translacji komórkowej w warunkach eksperymentu. Następnie wykorzystaliśmy analizę RT-qPCR, aby określić rozkład mRNA XIAP i Bcl-xL w komórkach traktowanych PDCD4 lub siRNA kontrolnym. qPCR jest metodą z wyboru do analizy profili polisomów, w przeciwieństwie do standardowego RT-PCR lub Northern blot, ponieważ pozwala na ilościową, a nie półilościową analizę dystrybucji mRNA oraz na wykrycie subtelnych zmian w wydajności translacyjnej między zabiegami. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie wykazać, że dystrybucja mRNA XIAP i Bcl-xL (wyrażona jako procent całkowitego docelowego mRNA w gradiencie) została znacznie przesunięta do ciężkich polirybosomów (mRNA z dużą liczbą rybosomów z nimi związanych) po knock-down PDCD4 (Figura 1D, E), wskazując w ten sposób na wzrost translacji tych mRNA. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez wzrost poziomów białek XIAP i Bcl-xL, ale nie ich poziomów RNA w stanie stacjonarnym (Figura 1F, G). Co ważne, rozkład polisomów wariantu XIAP innego niż IRES pozostał niezmieniony między komórkami leczonymi i nieleczonymi (Figura 1C). Alternatywnie, wydajność translacyjną można przedstawić jako stosunek zawartości mRNA w polisomach (zwykle frakcjach od 5 do 10) w porównaniu z monosomami (zwykle frakcjami od 2 do 4)14.
Stosowanie kontroli w całym protokole jest ważne dla walidacji wszelkich wyników profilowania polisomów, ponieważ piki obserwowane na podstawie odczytów absorbancji przy 254 nm nie mogą być same w sobie przypisane rybosomalnemu RNA (detergenty, takie jak Triton X-100 silnie absorbują w tym regionie widma i mogą zasłaniać piki 40/60S na szczycie gradientu). Należy przeprowadzić ślepe gradienty bez lizatu i/lub z buforem lizatu w celu określenia względnego udziału w absorbancji przy 254 nm. Sztuczne struktury wyższego rzędu mogą również prowadzić do błędnych interpretacji polisosomów tam, gdzie w rzeczywistości ich nie ma (np. "pseudopolisomy"20). Sekwestracja magnezu (stosowana w całej procedurze do stabilizacji rybosomów 80S) z chelatatorem kationów dwuwartościowych EDTA dodanym do lizatów i bufora gradientowego (20 mM przez 15 min) spowoduje rozdzielenie rybosomu na jego podjednostki składowe małe (40S) i duże (60S). Tak więc, jeśli piki absorbancji zarejestrowane przy 260 nm są rzeczywiście polisomami, traktowanie EDTA spowoduje załamanie profilu tak, że w pobliżu szczytu gradientu zostanie zaobserwowane pojedyncze maksimum odpowiadające wolnemu mRNA i jednostkom rybosomalnym (dane nie pokazane). Równolegle z zapadnięciem się profilu wywołanym przez EDTA, wszystkie konkretne cele analizowane za pomocą qPCR powinny teraz znajdować się na szczycie gradientu.
Liczba rybosomów związanych z mRNA nie zawsze jest wskaźnikiem tego, jak skutecznie ta konkretna mRNA jest translowana. Rzeczywiście, istnieją specyficzne konteksty, w których aktywna translacja na polisomach zostaje zatrzymana 21,22 , o czym czytelnik powinien wiedzieć. Ustalenie, czy transkrypty są aktywnie zaangażowane w maszynerię translacyjną, można przeprowadzić poprzez: a) potraktowanie próbki puromycyną, która w przeciwieństwie do EDTA powoduje "odpływ" rybosomów, które aktywnie przemieszczają się przez mRNA, lub b) potraktowanie próbki homoharringtoniną, która hamuje translokację tylko pierwszego rybosomu w kodonie startowym, ponownie powodując "spływanie" wszelkich translokujących się rybosomów w dół strumienia.
Kluczowe znaczenie ma również wykorzystanie transkryptów kontrolnych do analizy qPCR. Wybór transkryptów, na które nie mają wpływu różne warunki leczenia, takie jak niektóre geny porządkowe (GAPDH, aktyna, tubulina, nukleolina), rybosomalne mRNA (18S, RPL13A) lub w tym przypadku wariant ILES bez IRES, jest ważny dla sprawdzenia, czy wpływ leczenia na translację jest specyficzny czy uogólniony. Te transkrypty kontrolne można wykorzystać do normalizacji rozkładu analizowanych mRNA, tak jak to miało miejsce tutaj (mRNA XIAP i Bcl-xL znormalizowano do mRNA GAPDH i wyrażono jako procent całkowitej zawartości mRNA reprezentowanej przez sumę zawartości mRNA w każdej frakcji) lub alternatywnie, docelowe i kontrolne mRNA mogą być wyrażone jako wartości bezwzględne i pokazane osobno. Analiza qPCR wejściowych lizatów (zwykle 10% całkowitej objętości) jest kolejnym krokiem, który pozwoli kontrolować dystrybucję określonych mRNA. Idealnie, zawartość mRNA określonego transkryptu w lizacie wejściowym powinna być porównywalna z sumą zawartości mRNA we wszystkich 10 analizowanych frakcjach. Wreszcie, opcjonalnym krokiem do kontroli etapu ekstrakcji fenol:chloroform jest wzbogacenie każdej frakcji polisomów o mRNA reporterowe transkrybowane in vitro (takie jak CAT, acetylotransferaza chloramfenikolu), które zostanie następnie określone ilościowo za pomocą qPCR i może być nawet wykorzystane do normalizacji danych 14.
Jak w przypadku każdej techniki, profilowanie polisomów ma pewne ograniczenia. Fakt, że zwykle trzeba zebrać co najmniej 10 frakcji (bardziej subtelne zmiany w wydajności translacji mogą wymagać 20 lub więcej), aby uzyskać ładne rozkłady polysomów, sprawia, że ten krok jest ograniczający, w tym sensie, że tylko maksymalnie 4 próbki mogą być analizowane na raz, aby móc wygodnie obsłużyć ekstrakcję RNA i analizę qPCR 40 próbek i 4 kontrolnych wejść jednocześnie. Wielkość próbki może łatwo sumować się z liczbą transkryptów, które mają być analizowane i ile powtórzeń qPCR należy wykonać, co może być kosztowne. Innym ograniczeniem analizy profilowania polissomalnego opartej na qPCR jest to, że można ją przeprowadzić tylko w podejściu opartym na kandydatach (gdzie transkrypty do analizy są znane z wyprzedzeniem) i nie można jej zastosować do analizy translacji całego genomu. Jednak na początku XXIwieku badacze zaczęli badać ich polisomalne RNA na poziomie genomu za pomocą mikromacierzy DNA 15, a ostatnio za pomocą sekwencjonowania nowej generacji 16,17. W tym potężnym podejściu profilowanie polisomalne jest przeprowadzane zgodnie z opisem w tym protokole, z wyjątkiem tego, że zamiast przeprowadzać analizę qPCR poszczególnych frakcji, frakcje monosomów (zwykle frakcje 2-4) i frakcje polisomów (zwykle frakcje) są łączone razem, a zmiany w globalnej translacji analizowane za pomocą mikromacierzy DNA lub sekwencjonowania RNA całego genomu. W związku z tym dzięki takiemu podejściu możliwa jest ocena wszystkich mRNA, których dystrybucja przesuwa się z polisomów do monosomów (spadek translacji) lub odwrotnie (wzrost translacji) po określonym traktowaniu. Walidację i kwantyfikację rozkładu specyficznych polisomów mRNA można następnie przeprowadzić za pomocą qPCR. Jeszcze skuteczniejszym zastosowaniem zasady profilowania polissomalnego jest profilowanie rybosomów. Niedawno poinformowano o dalszym wysokowydajnym rozszerzeniu tej techniki, które pozwala na jednoczesne monitorowanie setek frakcji polisomów 23. Daje to wyraźną przewagę podczas sondowania wydajności translacji kolekcji zmutowanych lub w badaniach przesiewowych RNAi na dużą skalę. Profilowanie rybosomów to technika, która wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji do mapowania fragmentów RNA chronionych przez rybosomy (ślady rybosomów) zaangażowane w syntezę białek24,25. W tej technice translokacja rybosomów może być hamowana za pomocą cykloheksymidu (odwracalnego) lub emetyny (nieodwracalnego), a następnie lizy komórek i trawienia RNazy, aby uzyskać populację śladów rybosomów. Rybosomy są wzbogacane, izolowane jest całkowite RNA i usuwane jest zanieczyszczające rybosomalne i mitochondrialne rybosomalne RNA. Ślady RNA około 26-28 nukleotydów są izolowane, transkrybowane wstecznie, przekształcane do biblioteki cDNA i sekwencjonowane26. W przeciwieństwie do standardowego profilowania polisomów, podejście to nie tylko identyfikuje określone mRNA, które są regulowane translacyjnie, ale także dostarcza informacji specyficznych dla mRNA w rozdzielczości kodonów, takich jak dokładne zajęcie i gęstość rybosomów wzdłuż określonego transkryptu. Jest to szczególnie interesujące dla mRNA ze specyficznymi trybami translacji, takimi jak mRNA zawierające IRES, ponieważ może dostarczyć więcej informacji na temat tego, gdzie w transkryptie zachodzi rekrutacja rybosomów.

Regulacja syntezy białek (translacja) jest kluczowym procesem komórkowym, który jest ściśle związany z przetrwaniem komórki. Biorąc pod uwagę, że translacja pochłania ponad 50% energii komórki, nie jest zaskakujące, że translacja jest ściśle regulowana, a perturbacje w translacji nie są dobrze tolerowane. I odwrotnie, wiele nieprawidłowych procesów komórkowych wymaga modyfikacji maszynerii translacyjnej i wyniku translacji (tj. proteomu). Dzieje się tak często w różnych reakcjach na stres i stanach chorobowych, a najlepszym przykładem jest prawdopodobnie rak. Kluczową zaletą kontroli translacyjnej jest zdolność komórek do szybkiego przeprogramowania wyjścia białka w odpowiedzi na różne zewnętrzne i wewnętrzne wyzwalacze, a tym samym dostrojenie mechanizmu, który przechyla równowagę między przeżyciem a śmiercią komórki1.
Dwa aspekty kontroli translacyjnej są szczególnie interesujące; zrozumienie natury mechanizmów regulacyjnych i elementów kontrolnych, które pozwalają na specyficzną translację, oraz identyfikacja specyficznych mRNA i ich produktów białkowych, które uczestniczą w odpowiedzi komórkowej na konkretny wyzwalacz, który wywołał selektywną translację w pierwszej kolejności. Profilowanie polisomów jest techniką, która pozwala na skuteczne badanie obu procesów.
Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest badanie i ilościowe określenie stanu translacji określonych mRNA w różnych warunkach komórkowych. Zasada tej techniki polega na wychwyceniu translacji mRNA poprzez "zamrożenie" aktywnie translujących rybosomów na różnych transkryptach i oddzielenie powstałych polirybosomów przez ultrawirowanie na gradionym sacharozie, co pozwala na rozróżnienie między wysoce translacyjnymi transkryptami (związanymi przez kilka rybosomów) a słabo translacyjnymi (związanymi przez jeden lub dwa rybosomy). W tym konkretnym protokole antybiotyk cykloheksymimid, który wiąże się z podjednostką rybosomalną 60S i blokuje uwalnianie zdeacetylowanego tRNA z miejsca2 rybosomu E, jest używany do hamowania translokacji rybosomów i zatrzymywania rybosomów na translujących mRNA. Można jednak stosować inne środki blokujące, takie jak emetyna, która również blokuje wydłużenie translacji3.
W przeciwieństwie do technik western blotting i znakowania 35S-Metioniny, które mierzą końcowy wynik procesu translacji, profilowanie polisomów ma tę zaletę, że mierzy związek rybosomów z aktywnie translowanymi mRNA, co pozwala na bardziej szczegółowe badanie mechanizmów translacji w różnych warunkach. W związku z tym technikę tę można łatwo dostosować do specyficznego badania różnych trybów translacji4-6, czynników białkowych zaangażowanych w regulację translacji7-9, warunków stresowych wpływających na syntezę białek1,10,11 lub wpływu struktur mRNA, takich jak IRES lub otwarte ramki odczytu upstream na syntezę białek12-14. Obecnie zastosowania profilowania polisomów są jeszcze szersze dzięki zastosowaniu mikromacierzy DNA 15 lub sekwencjonowania nowej generacji 16,17 do analizy mRNA związanych z polisomami.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automatyczna maszyna do gradientów</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow dwukomorowa maszyna do gradientów</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultrawirówka&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Frakcjonator gradientu gęstości</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Składa się z: systemu przebijania rur,&nbsp; pompy perystaltycznej, detektora UA-6 z filtrami 254 i 280 nm oraz kolektora frakcji Foxy R1</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych WinDaq</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmProbówki wirówkowe Pollyallomer (do SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 2 ml bez nukleaz (nos delfina)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 2 ml bez nukleaz (płaskie dno)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza (bez nukleaz)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281,4 g/mol. Zawiesić w DMSO i utrzymywać w temperaturze -80C przez długi czas. Uwaga: TOKSYCZNY! Może powodować podrażnienia dróg oddechowych i skóry. Podczas ważenia noś maskę.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (bez nukleaz)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58,44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2,6H2O (bez nukleaz)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203,3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Zasada (bez nukleaz)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Uwaga: TOKSYCZNY! Może powodować układ moczowy i podrażnienie skóry</td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor rybonukleazy RNasin</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap roztwór do inaktywacji rnazy</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg / ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Uwaga: TOKSYCZNY ! Może powodować podrażnienie dróg moczowych, a także podrażnienie i korozję skóry</td></tr></tbody></table>

ocena selektywnej translacji mrna w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulacja syntezy białek stanowi kluczowy punkt kontrolny w odpowiedzi komórkowej na stres. W szczególności wykazano, że dyskretne elementy regulatorowe RNA umożliwiają selektywną translację określonych mRNA, które zazwyczaj kodują białka wymagane do określonej reakcji na stres. Identyfikacja tych mRNA, a także charakterystyka mechanizmów regulacyjnych odpowiedzialnych za selektywną translację od pewnego czasu znajduje się w czołówce biologii molekularnej. Profilowanie polisomów jest podstawową metodą w tych badaniach. Celem profilowania polisomów jest uchwycenie translacji mRNA poprzez unieruchomienie aktywnie translujących rybosomów na różnych transkryptach i oddzielenie powstałych polirybosomów przez ultrawirowanie na gradiencie sacharozy, co pozwala na rozróżnienie między transkryptami o wysokiej translacji a transkryptami słabo translowanymi. Można je następnie scharakteryzować za pomocą tradycyjnych metod biologii biochemicznej i molekularnej. Co ważne, połączenie profilowania polisomów z wysokoprzepustowymi podejściami genomicznymi pozwala na analizę regulacji translacyjnej na dużą skalę.

Opisaliśmy niedawno nową rolę supresora nowotworowego PDCD4 jako selektywnego inhibitora translacji mRNA zawierających IRES i kodujących inhibitory apoptozy XIAP oraz Bcl-xL12. Profilowanie polisomów było kluczową techniką służącą do wykazania specyficznego udziału PDCD4 w translacji zależnej od IRES. Komórki HEK293 poddano transfekcji przejściowej w celu obniżenia endogennych poziomów PDCD4 (Rysunek 1A), a następnie poddano je analizie profilu polisomów. Zaobserwowaliśmy, że redukcja poziomów PDCD4 nie upośledziła globalnej translacji komórkowej, co wynikało z braku zmian w profilu polisomów przy porównaniu komórek traktowanych siCTRL i siPDCD4 (Rysunek 1B). Podobnie rozkład polisomów dla wariantu XIAP pozbawionego IRES 19 nie uległ zmianie pomiędzy komórkami traktowanymi a nietraktowanymi (Rysunek 1C). W przeciwieństwie do tego, rozkład polisomów dla dwóch mRNA zawierających IRES, XIAP i Bcl-xL, uległ znaczącej zmianie. Wobec braku PDCD4 rozkład tych dwóch mRNA przesunął się w stronę ciężkich rybopolisomów (Rysunek 1D, E). Ponieważ nie towarzyszyło temu zmianom w stacjonarnych poziomach mRNA dla XIAP i Bcl-xL (Rysunek 1F), wyniki te wykazują zwiększoną translację XIAP i Bcl-xL w komórkach z obniżonymi poziomami PDCD4, co zostało dodatkowo potwierdzone za pomocą Western blottingu (Rysunek 1G).
<img alt="Wyniki eksperymentu z siRNA pokazujące poziomy PDCD4, XIAP i Bcl-xL; Western blot, wykresy analizy mRNA." src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Profilowanie polizomów identyfikuje PDCD4 jako selektywny inhibitor translacji XIAP i Bcl-xL. (A) Komórki HEK293 traktowano siRNA przeciwko PDCD4 lub kontrolnym (CTRL) niecelującym siRNA, po czym poddano je lizie i analizie Western blot z użyciem przeciwciał anty-PDCD4 i anty-Nukleolina w celu weryfikacji stopnia wyciszenia PDCD4. (B) PDCD4 wyciszono zgodnie z opisem w punkcie (A), a lizaty komórkowe poddano profilowaniu polizomów. Reprezentatywny profil polizomów przedstawiono w górnym panelu; rozkład mRNA dla XIAP non-IRES (C), Bcl-xL (D) oraz XIAP IRES (E) w stosunku do GAPDH przedstawiono jako procent całkowitego mRNA (% mRNA) w każdej frakcji. (F) Stacjonarne poziomy mRNA zmierzono metodą RT-qPCR w komórkach traktowanych siRNA przeciwko PDCD4 lub kontrolnym (CTRL) siRNA. (G) Lizaty z punktu (A) poddano również analizie Western blot z użyciem przeciwciał anty-XIAP, anty-Bcl-xL i anty-Nukleolina. (Uwaga: Dane przedstawione na Rycinie 1 zostały pierwotnie opublikowane w 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest rozróżnienie między mRNA o wysokim a niskim stopniu translacji poprzez unieruchomienie i rozdzielenie poliribosomów. Osiąga się to najpierw poprzez dodanie cykloheksydyny do komórek w celu zahamowania translokacji rybosomów i translacji RNA. W drugim kroku lizaty z potraktowanych komórek nanosi się na gradient sacharozy i poddaje ultrawirowaniu, aby rozdzielić zgromadzone poliribosomy w zależności od ich masy.Następnie gradient zostaje podzielony na równe frakcje, aby w końcowym kroku oddzielić transkrypty silnie i słabo translacyjne. Do wykrywania obecności interesujących nas mRNA w każdej frakcji wykorzystuje się technikę R-T-Q-P-C-R. Ostatecznie profilowanie rybosomów może być użyte do wykrywania zmian w globalnej, jak i specyficznej translacji mRNA w odpowiedzi na odmienne stresy fizjologiczne i patofizjologiczne.Profilowanie PolyOne pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej, takie jak: które mRNA są wybierane i translacyjne podczas stresu S oraz w jaki sposób pozwala to komórkom adaptować się do tych warunków. Demonstrację tej procedury przeprowadza student studiów doktoranckich w laboratorium. Aby użyć automatycznego urządzenia do tworzenia gradientów w celu przygotowania gradientu sacharozy, należy rozpocząć od włączenia urządzenia i wypoziomowania płyty, na której będą znajdować się gradienty; gdy płyta zostanie wypoziomowana, należy kliknąć przycisk gotowe.Następnie, aby wybrać program gradientu, otwórz menu grad i wybierz listę. Kliknij SW 41, a następnie przewiń listę, aż pojawi się program 10 to 50%gradient 11 steps, i naciśnij Use. Następnie umieść stożkową probówkę do ultrawirówki SW 41 w bloku znacznikowym i za pomocą dołączonego precyzyjnego znacznika do probówek narysuj linię na probówce wzdłuż górnego stopnia bloku.Umieścić probówki w odpowiednim statywie na stabilnej powierzchni, a następnie przymocować dwie dostarczone kaniule do dwóch strzykawek o pojemności 10 ml. Kilka razy zassać i wypuścić ciepłą wodę destylowaną zawierającą RNA w roztworze aktywacyjnym, aby wypłukać strzykawki. Po usunięciu wszystkich śladów wody jedną ze strzykawek napełnić 10% sacharozą z dodatkiem cykloheksydymidy i wprowadzić kaniulę do dna probówki do ultrawirówki.Powoli dozuj roztwór, aż znajdzie się on tuż za zaznaczoną kreską na probówce, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie napełnij drugą strzykawkę 50% sacharozą z dodatkiem cycloheksymidu i wytrzyj nadmiar cieczy z probówki za pomocą chusteczki.Za pomocą kaniuli ostrożnie wprowadź 50% roztwór sacharozy do probówki, zatrzymując się, gdy roztwór zrówna się z oznaczeniem, a następnie szybko i płynnie wyjmij kaniulę. Roztwór 10% sacharozy powinien podnieść się, tworząc menisk u góry probówki. Następnie lekko przechyl probówkę do ultrawirówki, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załóż zakrętkę, używając mikropipety do usunięcia nadmiaru cieczy z rezerwuaru zakrętki.Umieść probówki w urządzeniu do tworzenia gradientu, a następnie naciśnij przycisk start. Należy pamiętać, że płytka zostanie przechylona pod określonym kątem. Odczekaj pięć sekund, po czym rozpoczną się obroty w celu utworzenia gradientu.Po około dwóch minutach urządzenie wyemituje sygnał dźwiękowy, informujący o zakończeniu tworzenia gradientu. Ostrożnie przenieś probówki do statywu i szybko zdejmij zakrętki jednym ruchem w górę, aby nie zakłócić gradientu. Następnie ostrożnie nałóż po 260 jednostek wcześniej przygotowanego lizatu komórkowego na każdy gradient sacharozowy i wiruj probówki przez półtorej godziny przy 260 343 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius w ultracentryfudze.Aby przygotować instrument systemu frakcjonowania gradientowego, należy zacząć od włączenia spektrofotometru. Następnie dwukrotnie wybierz ikonę folderu, a potem dwukrotnie strzałkę powrotu, aby wrócić do ekranu głównego i ustawić kolektor frakcji na metodę PolyZone, co zapewni ustawienie zaworu kolektora frakcji na odpływ (waste). Kliknij strzałkę skierowaną w stronę ikony kosza, a następnie umieść kolbę MIA o pojemności 250 mililitrów zawierającą wodę destylowaną pod rurką odpływową.Następnie ustaw na rejestratorze następujące parametry: pokrętło czułości na ustawienie „lamp and optics”, filtr szumów na 1,5, pokrętło separatora pików na „off”, prędkość rejestrowania na 30 cm/h oraz pokrętło regulacji linii bazowej na górze spektrofotometru w pozycji „max open”. Następnie umieść strzykawkę i tłok w pompie i za pomocą dołączonych śrub oraz klucza imbusowego mocno je przykręć.Użyj polecenia rev z szybką prędkością, aby napełnić strzykawkę roztworem wypierającym. Następnie ustaw pompę w pozycji pionowej i użyj polecenia forward, aby przepchnąć powietrze przez cewkę. Następnie umieść w uchwycie probówkę do ultrawirówki wypełnioną wodą wolną od RNA, a następnie wprowadź kaniulę do probówki, aż widoczne będą dwa czarne oznaczenia.Otwór dozujący znajduje się pomiędzy dwiema znacznikami. Uruchom pompę strzykawkową w trybie manualnym (do przodu) z prędkością 6,0 mililitrów na minutę. Gdy roztwór wypierający wypełni jedną trzecią rurki, przełącz prędkość na zmienną z natężeniem przepływu 1,0 mililitrów na minutę.Następnie obróć pokrętło regulacji linii bazowej (baseline adjust) w spektrofotometrze, aż napięcie na wykresie osiągnie wartość zero. Woda zacznie wypływać z rurki odpływowej do kolby el Mya. Następnie ustaw żądaną czułość na 1,0 au.Po dostrojeniu czułości naciśnij przycisk baseline i obróć pokrętłem offset rejestratora, aby ustawić linię bazową na oznaczeniu 10% rejestratora wykresów. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej wyłącz przełącznik pompy oraz pokrętło prędkości zapisu. Po wyłączeniu pompy przełącz ją w pozycję rev, aby odessać roztwór wypierający, aż osiągnie on pierwszą oznaczenie na kaniuli nakłuwającej.Następnie wyjmij probówkę do wirowania, usuń pęcherzyki powietrza z kaniuli za pomocą niewielkiej ilości roztworu wypierającego i usuń resztki wody, która mogła wyciec z komory przepływowej podczas frakcjonowania gradientu. Następnie umieść probówkę do wirowania zawierającą gradient sacharozy w uchwycie i przebij ją kaniulą. Następnie umieść dziesięć probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL w pozycjach od 2 do 11 tacki kolektora frakcji, a probówkę odpadową w pozycji 1, tak aby nakrętki nie wystawały do góry.Ustaw pokrętło sterowania pompą w tryb ręczny, a szybkość przepływu w pompie strzykawkowej na 6,0 mililitrów na minutę. Następnie naciśnij przycisk start (play) w kolektorze frakcji, gdy tylko ramię dotrze do pierwszej probówki. Naciśnij przycisk pauzy, aby ustawić ramię i otworzyć zawór dozujący frakcje.Następnie należy użyć polecenia „forward” (do przodu), aby uruchomić pompę i monitorować rysik rejestratora wykresów. Gdy rysik zacznie odchylać się w górę, co wskazuje na przepływ próbki przez celę przepływową, należy szybko zastąpić rurkę odpływową rurką numer jeden. Po zebraniu pierwszej kropli należy szybko przełączyć polecenia na „remote start” (start zdalny), „stop” oraz „variable 1,0 milliliters per minute” (zmienna 1,0 ml/min) i nacisnąć przycisk „play”, aby umożliwić interfejsowi kolektora frakcji zbieranie frakcji o objętości 1 ml w każdej minucie.Na koniec, gdy niebieski roztwór wypłukujący wpłynie do ostatniej probówki, należy nacisnąć przycisk stop. Profilowanie PolyZone jest kluczową techniką pozwalającą wykazać specyficzny udział PD CD4 w mediowanej translacji IRAs. Na przykład w niniejszym eksperymencie komórki HEC 2 93 zostały przejściowo przetransfekowane w celu obniżenia endogennego poziomu PDC D four, a następnie poddane analizie profilu PolyZone.Zmniejszenie poziomu PDC D four nie upośledziło globalnej translacji genu, co oceniono na podstawie braku zmian w profilu PolyZone. Porównując komórki kontrolne SI oraz komórki traktowane IPD CD four, rozkład polisomów wariantu XIAP niebędącego IRAs pozostał niezmienny pomiędzy komórkami traktowanymi a nietraktowanymi. W przeciwieństwie do tego, rozkład polisomów dla dwóch mRNA zawierających IS, XIAP i BCL XL, uległ znaczącej zmianie.W przypadku braku PD CD4 rozkład tych dwóch mRNA przesunął się w stronę ciężkich rybosomów. Ponieważ nie towarzyszyły temu zmiany w stacjonarnych poziomach mRNA XIAP i BCL XL, wyniki te wykazują zwiększoną translację XIAP i BCL XL w komórkach z obniżonym poziomem PDC D cztery, co zostało dodatkowo potwierdzone metodą Western blot. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak mierzyć translację mRNA poprzez przygotowanie gradientu sacharozy i rozdzielenie polisomów metodą ultrawirowania.

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena selektywnego tłumaczenia mRNA w komórkach ssaków poprzez profilowanie polisomów

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Poznaj metodę profilowania polisomów do oceny selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków. Technika ta pozwala identyfikować mRNA o wysokiej i niskiej efektywności translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Przeglądaj więcej filmów