Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest rozróżnienie między mRNA o wysokiej i złej translacji poprzez unieruchomienie i oddzielenie polirybosomów. Osiąga się to poprzez najpierw dodanie cyklo heide do komórek w celu zahamowania ich rybosomu, translokacji i translacji RNA. W drugim etapie lizaty z leczonych komórek są ładowane do gradientu sacharozy i ultrawirowane w celu oddzielenia przechowywanych polirybosomów zgodnie z ich masą.

Następnie gradient jest dzielony na równe frakcje, aby oddzielić wysoce i słabo przetłumaczone transkrypty w ostatnim kroku. R-T-Q-P-C-R służy do wykrywania obecności interesujących mRNA w każdej frakcji. Ostatecznie profilowanie rybosomów może być wykorzystane do wykrywania zmian w globalnej, a także specyficznej translacji mRNA w odpowiedzi na różne stresy fizjologiczne i patofizjologiczne.

Profilowanie PolyOne może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej, takie jak to, które mRNA są wybierane, ulegają translacji podczas stresu S i w jaki sposób pozwala to komórkom przystosować się do tych warunków. Demonstracja tej procedury jest mamą Dar doktoranta w laboratorium Aby użyć automatycznego ekspresu gradientowego do przygotowania gradientu sacharozy, zacznij od włączenia ekspresu gradientu i wypoziomowania płytki, która utrzyma gradienty, gdy płyta zostanie wypoziomowana. Kliknij Gotowe.

Następnie, aby wybrać program gradientu, otwórz menu grad i wybierz listę. Kliknij SW 41, a następnie przewiń listę, aż pojawi się program 11 kroków o nachyleniu od 10 do 50% i naciśnij. Używać. Następnie umieść stożkową probówkę ultrawirówki SW 41 w bloku znacznika i użyj dołączonego markera z cienką probówką, aby narysować linię na probówce wzdłuż górnego stopnia bloku.

Umieść probówki w stojaku montażowym na stabilnej powierzchni, a następnie przymocuj dwie dostarczone kaniule do dwóch 10-mililitrowych strzykawek. Odpipetować kilka razy ciepłą wodę destylowaną zawierającą RNA w roztworze aktywacyjnym w górę i w dół, aby umyć strzykawki. Następnie, po usunięciu wszystkich śladów wody, napełnij jedną ze strzykawek 10% sacharozą plus cyclo heide i włóż kaniulę na dno probówki ultrawirówki.

Delikatnie dozuj roztwór, aż przejdzie tuż obok znaku umieszczonego na probówce. Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Następnie napełnij drugą strzykawkę 50% sacharozą i cyklo heide i usuń nadmiar płynu z tubki chusteczką.

Za pomocą kaniuli delikatnie włóż 50% roztwór sacharozy do probówki, zatrzymując się, gdy roztwór znajdzie się na poziomie znaku, a następnie szybko i płynnie wyjmij kaniulę. 10% roztwór sacharozy powinien unieść się, tworząc łąkotkę w górnej części probówki. Następnie lekko przechyl probówkę ultrawirówki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i włóż nasadkę za pomocą mikropipety, aby usunąć nadmiar płynu ze zbiornika nasadki.

Umieść tuby na maszynie do tworzenia gradientów, a następnie naciśnij przycisk uruchamiania. Zwróć uwagę, że płyta przechyli się pod określonym kątem. Zatrzymaj się na pięć sekund, a następnie rozpoczną się obroty, aby utworzyć gradient.

Po około dwóch minutach maszyna wyda sygnał dźwiękowy wskazujący, że tworzenie gradientu zostało zakończone. Delikatnie przenieś rurki na stojak i szybko zdejmij nasadki podczas ruchu w górę, aby nie zakłócać nachylenia. Następnie delikatnie załaduj równe 260 jednostek wcześniej przygotowanego lizatu komórkowego na każdy gradient sacharozy i wiruj probówki przez półtorej godziny w temperaturze 260, 343 razy G i czterech stopniach Celsjusza w ultrawirówce.

Aby skonfigurować przyrząd do systemu frakcjonowania gradientowego, zacznij od włączenia spektrofotometru. Następnie dwukrotnie wybierz ikonę folderu, a następnie dwukrotnie strzałkę powrotu, aby powrócić do ekranu głównego i ustawić kolektor frakcji na metodę PolyZone, aby upewnić się, że zawór na kolektorze frakcji jest ustawiony na marnotrawstwo. Kliknij strzałkę wskazującą ikonę kosza na śmieci, a następnie umieść 250-mililitrową kolbę MIA zawierającą wodę destylowaną pod rurką do zbierania odpadów.

Teraz wybierz następujące ustawienia na rejestratorze wykresów, pokrętło czułości, aby ustawić lampę i optykę filtr szumów. Przełącz na 1.5 pokrętło separatora szczytów, aby wyłączyć prędkość wykresu, wybierz na 30 centymetrów na godzinę i linię bazową i wyreguluj pokrętło na górze spektrofotometru, aby maksymalnie się otworzyło. Następnie umieść strzykawkę i lufę w pompie i użyj dostarczonych i klucza Alana, aby dokręcić je na miejscu.

Użyj komendy prędkości obrotowej z dużą prędkością, aby napełnić strzykawkę roztworem chase. Następnie ustaw pompę w pozycji pionowej i użyj polecenia do przodu, aby przepchnąć powietrze przez rurkę. Następnie zainstaluj probówkę ultrawirówki wypełnioną wodą wolną od RNA w uchwycie, a następnie przebij probówkę kaniulą, aż widoczne będą dwa czarne znaki.

Otwór dozujący znajduje się między dwoma znakami. Uruchomić pompę strzykawkową w trybie ręcznym do przodu z prędkością 6,0 mililitrów na minutę. Gdy roztwór bruzdy wypełni jedną trzecią rurki, przełącz się na prędkość na zmienną z natężeniem przepływu 1,0 mililitra na minutę.

Teraz obracaj pokrętłem regulacji linii bazowej na spektrofotometrze, aż napięcie na wykresie spadnie do zera. Woda zacznie wypływać z rurki odpływowej do kolby el Mya. Następnie ustaw żądaną czułość na 1,0 au.

Po wyregulowaniu czułości naciśnij również przycisk linii bazowej i obróć pokrętło przesunięcia rejestratora, aby dostosować ustawienie linii bazowej do znaku 10% na rejestratorze wykresów. Następnie, po osiągnięciu stabilnej linii bazowej, wyłącz przełącznik pompy i pokrętło prędkości wykresu. Po wyłączeniu pompy przełącz ją w pozycję obrotów, aby odzyskać roztwór chase, aż dotrze do pierwszego znaku na kaniuli przebijającej.

Następnie wyjmij probówkę wirówkową, rozprosz wszelkie pęcherzyki w kaniuli za pomocą niewielkiej ilości roztworu bruzdy i usuń resztki wody, które mogły wycieknąć z komory przepływowej, aby sfrakcjonować gradient. Następnie zainstaluj probówkę wirówkową zawierającą gradient sacharozy w uchwycie i przebij probówkę kaniulą. Następnie umieść dziesięć dwumililitrowych mikroprobówek wirówkowych w tacce na frakcję w pozycjach od drugiej do 11, a rurkę biodrową w pozycji pierwszej, tak aby nakrętki nie wystawały do góry.

Ustaw pokrętło sterowania pompą w pozycji ręcznej, a natężenie przepływu na pompie strzykawkowej na 6.0 mililitrów na minutę. Następnie naciśnij play na kolektorze frakcji, gdy tylko ramię dotrze do pierwszej rurki. Naciśnij przycisk pauzy, aby ustawić ramię i otworzyć zawór dozujący frakcję.

Następnie użyj polecenia do przodu, aby uruchomić pompę i monitorować pióro rejestratora wykresów. Gdy pisak zacznie odchylać się do góry, wskazując, że próbka przechodzi przez celę przepływową, szybko wymień rurkę odpływową na rurkę numer jeden. Następnie, gdy zbierze się pierwsza kropla, szybko przełącz polecenia na zdalny start, stop i zmienną 1,0 mililitra na minutę, a następnie naciśnij przycisk odtwarzania, aby umożliwić interfejsowi kolektora frakcji zbieranie ułamków o jednym mililitrze co minutę.

Na koniec, po tym, jak roztwór niebieskiego bruzdy dostanie się do ostatniej probówki, naciśnij stop. Profilowanie PolyZone jest kluczową techniką demonstrowania specyficznego udziału PD CD4 w translacji za pośrednictwem IRA. Na przykład w tym eksperymencie komórki HEC 2 93 zostały przejściowo transfekowane w celu wyczerpania endogennych poziomów PDC D cztery, a następnie poddane analizie profilu PolyZone.

Zmniejszenie poziomu PDC D 4 nie zaburzyło globalnej translacji genu, co ocenia się na podstawie braku zmian w profilu PolyZone. Porównując kontrolę SI i IChP CD cztery leczone komórki, podobnie rozkład polisomów wariantu XIAP bez IRA pozostał niezmieniony między komórkami leczonymi i nieleczonymi. W przeciwieństwie do tego, dystrybucja polisomów dwóch IS zawierających mRNA XIAP i BCL XL została znacząco zmieniona.

W przypadku braku PD CD4 dystrybucja tych dwóch mRNA została przesunięta do ciężkich rybosomów. Ponieważ nie towarzyszą temu zmiany w poziomach mRNA XIAP i BCL XL w stanie stacjonarnym, wyniki te wykazują zwiększoną translację XIAP i BCL XL w komórkach o obniżonych czterech poziomach PDC D, co dodatkowo potwierdza kwitnienie zachodnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć translację mRNA, przygotowując region sacharozy i oddzielając polisom za pomocą ultrawirowania.