Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest rozróżnienie między mRNA o wysokim a niskim stopniu translacji poprzez unieruchomienie i rozdzielenie poliribosomów. Osiąga się to najpierw poprzez dodanie cykloheksydyny do komórek w celu zahamowania translokacji rybosomów i translacji RNA. W drugim kroku lizaty z potraktowanych komórek nanosi się na gradient sacharozy i poddaje ultrawirowaniu, aby rozdzielić zgromadzone poliribosomy w zależności od ich masy.

Następnie gradient zostaje podzielony na równe frakcje, aby w końcowym kroku oddzielić transkrypty silnie i słabo translacyjne. Do wykrywania obecności interesujących nas mRNA w każdej frakcji wykorzystuje się technikę R-T-Q-P-C-R. Ostatecznie profilowanie rybosomów może być użyte do wykrywania zmian w globalnej, jak i specyficznej translacji mRNA w odpowiedzi na odmienne stresy fizjologiczne i patofizjologiczne.

Profilowanie PolyOne pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej, takie jak: które mRNA są wybierane i translacyjne podczas stresu S oraz w jaki sposób pozwala to komórkom adaptować się do tych warunków. Demonstrację tej procedury przeprowadza student studiów doktoranckich w laboratorium. Aby użyć automatycznego urządzenia do tworzenia gradientów w celu przygotowania gradientu sacharozy, należy rozpocząć od włączenia urządzenia i wypoziomowania płyty, na której będą znajdować się gradienty; gdy płyta zostanie wypoziomowana, należy kliknąć przycisk gotowe.

Następnie, aby wybrać program gradientu, otwórz menu grad i wybierz listę. Kliknij SW 41, a następnie przewiń listę, aż pojawi się program 10 to 50%gradient 11 steps, i naciśnij Use. Następnie umieść stożkową probówkę do ultrawirówki SW 41 w bloku znacznikowym i za pomocą dołączonego precyzyjnego znacznika do probówek narysuj linię na probówce wzdłuż górnego stopnia bloku.

Umieścić probówki w odpowiednim statywie na stabilnej powierzchni, a następnie przymocować dwie dostarczone kaniule do dwóch strzykawek o pojemności 10 ml. Kilka razy zassać i wypuścić ciepłą wodę destylowaną zawierającą RNA w roztworze aktywacyjnym, aby wypłukać strzykawki. Po usunięciu wszystkich śladów wody jedną ze strzykawek napełnić 10% sacharozą z dodatkiem cykloheksydymidy i wprowadzić kaniulę do dna probówki do ultrawirówki.

Powoli dozuj roztwór, aż znajdzie się on tuż za zaznaczoną kreską na probówce, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie napełnij drugą strzykawkę 50% sacharozą z dodatkiem cycloheksymidu i wytrzyj nadmiar cieczy z probówki za pomocą chusteczki.

Za pomocą kaniuli ostrożnie wprowadź 50% roztwór sacharozy do probówki, zatrzymując się, gdy roztwór zrówna się z oznaczeniem, a następnie szybko i płynnie wyjmij kaniulę. Roztwór 10% sacharozy powinien podnieść się, tworząc menisk u góry probówki. Następnie lekko przechyl probówkę do ultrawirówki, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załóż zakrętkę, używając mikropipety do usunięcia nadmiaru cieczy z rezerwuaru zakrętki.

Umieść probówki w urządzeniu do tworzenia gradientu, a następnie naciśnij przycisk start. Należy pamiętać, że płytka zostanie przechylona pod określonym kątem. Odczekaj pięć sekund, po czym rozpoczną się obroty w celu utworzenia gradientu.

Po około dwóch minutach urządzenie wyemituje sygnał dźwiękowy, informujący o zakończeniu tworzenia gradientu. Ostrożnie przenieś probówki do statywu i szybko zdejmij zakrętki jednym ruchem w górę, aby nie zakłócić gradientu. Następnie ostrożnie nałóż po 260 jednostek wcześniej przygotowanego lizatu komórkowego na każdy gradient sacharozowy i wiruj probówki przez półtorej godziny przy 260 343 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius w ultracentryfudze.

Aby przygotować instrument systemu frakcjonowania gradientowego, należy zacząć od włączenia spektrofotometru. Następnie dwukrotnie wybierz ikonę folderu, a potem dwukrotnie strzałkę powrotu, aby wrócić do ekranu głównego i ustawić kolektor frakcji na metodę PolyZone, co zapewni ustawienie zaworu kolektora frakcji na odpływ (waste). Kliknij strzałkę skierowaną w stronę ikony kosza, a następnie umieść kolbę MIA o pojemności 250 mililitrów zawierającą wodę destylowaną pod rurką odpływową.

Następnie ustaw na rejestratorze następujące parametry: pokrętło czułości na ustawienie „lamp and optics”, filtr szumów na 1,5, pokrętło separatora pików na „off”, prędkość rejestrowania na 30 cm/h oraz pokrętło regulacji linii bazowej na górze spektrofotometru w pozycji „max open”. Następnie umieść strzykawkę i tłok w pompie i za pomocą dołączonych śrub oraz klucza imbusowego mocno je przykręć.

Użyj polecenia rev z szybką prędkością, aby napełnić strzykawkę roztworem wypierającym. Następnie ustaw pompę w pozycji pionowej i użyj polecenia forward, aby przepchnąć powietrze przez cewkę. Następnie umieść w uchwycie probówkę do ultrawirówki wypełnioną wodą wolną od RNA, a następnie wprowadź kaniulę do probówki, aż widoczne będą dwa czarne oznaczenia.

Otwór dozujący znajduje się pomiędzy dwiema znacznikami. Uruchom pompę strzykawkową w trybie manualnym (do przodu) z prędkością 6,0 mililitrów na minutę. Gdy roztwór wypierający wypełni jedną trzecią rurki, przełącz prędkość na zmienną z natężeniem przepływu 1,0 mililitrów na minutę.

Następnie obróć pokrętło regulacji linii bazowej (baseline adjust) w spektrofotometrze, aż napięcie na wykresie osiągnie wartość zero. Woda zacznie wypływać z rurki odpływowej do kolby el Mya. Następnie ustaw żądaną czułość na 1,0 au.

Po dostrojeniu czułości naciśnij przycisk baseline i obróć pokrętłem offset rejestratora, aby ustawić linię bazową na oznaczeniu 10% rejestratora wykresów. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej wyłącz przełącznik pompy oraz pokrętło prędkości zapisu. Po wyłączeniu pompy przełącz ją w pozycję rev, aby odessać roztwór wypierający, aż osiągnie on pierwszą oznaczenie na kaniuli nakłuwającej.

Następnie wyjmij probówkę do wirowania, usuń pęcherzyki powietrza z kaniuli za pomocą niewielkiej ilości roztworu wypierającego i usuń resztki wody, która mogła wyciec z komory przepływowej podczas frakcjonowania gradientu. Następnie umieść probówkę do wirowania zawierającą gradient sacharozy w uchwycie i przebij ją kaniulą. Następnie umieść dziesięć probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL w pozycjach od 2 do 11 tacki kolektora frakcji, a probówkę odpadową w pozycji 1, tak aby nakrętki nie wystawały do góry.

Ustaw pokrętło sterowania pompą w tryb ręczny, a szybkość przepływu w pompie strzykawkowej na 6,0 mililitrów na minutę. Następnie naciśnij przycisk start (play) w kolektorze frakcji, gdy tylko ramię dotrze do pierwszej probówki. Naciśnij przycisk pauzy, aby ustawić ramię i otworzyć zawór dozujący frakcje.

Następnie należy użyć polecenia „forward” (do przodu), aby uruchomić pompę i monitorować rysik rejestratora wykresów. Gdy rysik zacznie odchylać się w górę, co wskazuje na przepływ próbki przez celę przepływową, należy szybko zastąpić rurkę odpływową rurką numer jeden. Po zebraniu pierwszej kropli należy szybko przełączyć polecenia na „remote start” (start zdalny), „stop” oraz „variable 1,0 milliliters per minute” (zmienna 1,0 ml/min) i nacisnąć przycisk „play”, aby umożliwić interfejsowi kolektora frakcji zbieranie frakcji o objętości 1 ml w każdej minucie.

Na koniec, gdy niebieski roztwór wypłukujący wpłynie do ostatniej probówki, należy nacisnąć przycisk stop. Profilowanie PolyZone jest kluczową techniką pozwalającą wykazać specyficzny udział PD CD4 w mediowanej translacji IRAs. Na przykład w niniejszym eksperymencie komórki HEC 2 93 zostały przejściowo przetransfekowane w celu obniżenia endogennego poziomu PDC D four, a następnie poddane analizie profilu PolyZone.

Zmniejszenie poziomu PDC D four nie upośledziło globalnej translacji genu, co oceniono na podstawie braku zmian w profilu PolyZone. Porównując komórki kontrolne SI oraz komórki traktowane IPD CD four, rozkład polisomów wariantu XIAP niebędącego IRAs pozostał niezmienny pomiędzy komórkami traktowanymi a nietraktowanymi. W przeciwieństwie do tego, rozkład polisomów dla dwóch mRNA zawierających IS, XIAP i BCL XL, uległ znaczącej zmianie.

W przypadku braku PD CD4 rozkład tych dwóch mRNA przesunął się w stronę ciężkich rybosomów. Ponieważ nie towarzyszyły temu zmiany w stacjonarnych poziomach mRNA XIAP i BCL XL, wyniki te wykazują zwiększoną translację XIAP i BCL XL w komórkach z obniżonym poziomem PDC D cztery, co zostało dodatkowo potwierdzone metodą Western blot. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak mierzyć translację mRNA poprzez przygotowanie gradientu sacharozy i rozdzielenie polisomów metodą ultrawirowania.