Name: Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji bakteryjnych efektorów w komórkach ssaków do badania lokalizacji i funkcji białek. Technika ta umożliwia szybkie i efektywne wprowadzanie białek z minimalną cytotoksycznością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Znaczna część tych prac została wykonana w Laboratorium Środowiskowych Nauk Molekularnych, krajowym ośrodku naukowym DOE/BER zlokalizowanym w Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL jest eksploatowany dla DOE przez Battelle na podstawie umowy DE-AC05-76RLO1830.

1. Przygotuj się z wyprzedzeniem
<ol>
	<li>Ciepła sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Ciepła modyfikacja pożywki Eagle's Medium (DMEM) i pożywki Minimal Essential (MEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 I.U./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny do 37 °C. Uwaga: Reprezentują one pożywki normalnego wzrostu (NGM) odpowiednio dla komórek RAW i HeLa.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Hoduj komórki RAW 264.7 do 70-90% konfluencji w NGM.
	<ol>
		<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 95% powietrza/5%CO2</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki HeLa do 70-90% konfluencji w NGM.
	<ol>
		<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 95% powietrza/5%CO2</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Przed pobraniem należy raz umyć monowarstwę komórek sterylnym PBS.</li>
	<li>Zbierz wstępnie zlewające się komórki w sterylnej stożkowej probówce.
	<ol>
		<li>Delikatnie zeskrob ogniwa RAW za pomocą gumowego policjanta w PBS, z wielokrotnym pipetowaniem w celu rozproszenia agregacji komórek.</li>
		<li>Odłącz komórki HeLa z 0,25% roztworem trypsyny, aż badanie wzrokowe wykaże dysocjację od powierzchni hodowli. Na przykład użyj 2 do 3 ml dla kolby T-75. Dostosuj odpowiednio objętość, aby upewnić się, że roztwór trypsyny pokrywa całą powierzchnię wzrostu.
		<ol>
			<li>Reakcja dysocjacji gaszenia z NGM zawierającym 10% FBS.</li>
			<li>Do trypsyny należy użyć co najmniej dwukrotności objętości NGM, wielokrotnie pipetując w celu rozproszenia agregacji komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lekko granulować komórki przez odwirowanie przy 900 x g przez 4 min.</li>
	<li>Zawiesić w tej samej objętości co trypsyna/roztwór hartowniczy przy użyciu sterylnego PBS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika cząstek.</li>
	<li>Lekko granulować komórki przez odwirowanie przy 900 x g przez 4 min.</li>
	<li>Zawiesić w odpowiedniej objętości PBS dla 5,5 x 106 do 6,0 x 106 komórek/ml. Uwaga: Na przykład jedna kolba T-75 da około 7,5 x 106 komórek 29.</li>
	<li>Utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie do momentu elektroporacji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do elektroporacji
<ol>
	<li>Kuwety do elektroporacji należy wstępnie schłodzić (odstęp 0,4 cm) na lodzie.</li>
	<li>Włącz aparat do elektroporacji i ustaw napięcie na 0,3 kV. 
	UWAGA: Pojemność i rezystancja nie były regulowanymi ustawieniami w naszym elektroporatorze (ustawionymi na 10 μF i 600 Ω przez producenta).</li>
	<li>Napełnij płytki odzysku NGM i zrównoważ w nawilżonej atmosferze 95% powietrza/5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
4. Elektroporacja
<ol>
	<li>Umieść 400 μl zawiesiny komórkowej we wstępnie schłodzonej kuwecie i dodaj do niej 20 μg wybranego białka (50 μg/ml).</li>
	<li>Delikatnie przesuń kuwetę ~10 razy, aby wymieszać bez uszkadzania komórek. Uwaga: Kuwetę można również kilkakrotnie odwrócić w celu dokładnego wymieszania, ale nie należy pipetować w górę iw dół ani wirować, aby uniknąć uszkodzenia komórek.</li>
	<li>Osusz na zewnątrz kuwety ręcznikiem papierowym lub inną wycieraczką, aby uniknąć wyładowania elektrycznego w elektroporatorze.</li>
	<li>Elektroporacja próbki przy napięciu 0,3 kV przez 1,5-1,7 ms. Uwaga: Było to typowe dla tego badania.</li>
	<li>Natychmiast po elektroporacji delikatnie przetrząśnij kuwetę ~10 razy, aby dokładnie wymieszać.</li>
</ol>
5. Poszycie komórek
<ol>
	<li>Przechowuj kuwetę z elektroporowanymi ogniwami na lodzie, aż będzie gotowa do umieszczenia na płytkach regeneracyjnych.</li>
	<li>W przypadku większości dalszych analiz należy przemyć komórki 1x wstępnie podgrzanym NGM, aby usunąć obce białko efektorowe.
	<ol>
		<li>Usunąć komórki do analizy i zawiesić w 3-5 ml NGM.</li>
		<li>Komórki osadu przez odwirowanie przy 900 x g przez 4 min.</li>
		<li>Ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości NGM dla żądanego rozmiaru płytki (np. 2 ml dla naczynia 35 mm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń odpowiednią ilość komórek do dalszej analizy.
	<ol>
		<li>Przykład 1: płytka do naczyń ze szklanym dnem do analizy mikroskopowej.</li>
		<li>Przykład 2: płytka w plastiku hodowli komórkowej w celu analizy białek, takiej jak oczyszczanie powinowactwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól komórkom zregenerować się na zrównoważonych płytkach w wilgotnej atmosferze 95% powietrza/5% CO2 w temperaturze 37 ° C przez co najmniej 4 godziny.</li>
</ol>
6. Analiza mikroskopowa
6.1) Utrwalenie/Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Umyj komórki 1x sterylnym PBS po 4 godzinnym okresie rekonwalescencji.</li>
	<li>Utrwal komórki w 100% metanolu przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Użyj wystarczającej ilości metanolu, aby całkowicie pokryć komórki (np. 2 ml na szalkę 35 mm).</li>
	<li>Umyć 3x sterylnym PBS.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,4% Triton X-100 w PBS przez 15 min. Na przykład użyj 1 ml na płytkę o średnicy 35 mm.
	<ol>
		<li>Dostosuj długość przepuszczalności i siłę Triton X-100 w zależności od epitopu i lokalizacji docelowego białka. Uwaga: Najlepsze wyniki będą musiały zostać empirycznie określone dla każdego celu, jednak powyższe warunki powinny być odpowiednie dla większości celów cytozolowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blok z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 godzinę w RT. Na przykład użyj 1 ml na płytkę o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Umyj 3x PBS.</li>
	<li>Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze wiążącym przeciwciała (0,1% Triton X-100 i 1% BSA w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc. Na przykład użyj 0,5 ml na płytkę o średnicy 35 mm.
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania przeciwciał. Uwaga: Na przykład przeciwciało peptydowe wiążące streptawidynę (SBP-tag) zastosowano w rozcieńczeniu 1:1,000, podczas gdy przeciwciało PKN1 zastosowano w rozcieńczeniu 1:200.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć 4x PBS.</li>
	<li>Inkubować z odpowiednim fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym w roztworze wiążącym przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
	<ol>
		<li>Na przykład użyj Alexa 488 lub Alexa 647 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania przeciwciał. (np. około 1:1,000 dla tego badania).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W razie potrzeby dodaj inne plamy, na przykład 5 μM aglutinniny z kiełków pszenicy (WGA) sprzężonej z Alexa 647 lub DAPI zgodnie z zaleceniami producenta, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć 5x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do momentu przygotowania do obrazu.</li>
</ol>
6.2) Mikroskopia konfokalna i analiza obrazu
<ol>
	<li>Zobrazuj próbki w odwróconym mikroskopie konfokalnym przy użyciu obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63x.
	<ol>
		<li>Obraz kanału zielonego za pomocą linii 488 nm lasera argonowego, o emisji pasma w zakresie 492-542 nm.</li>
		<li>Obraz kanału czerwonego za pomocą lasera diodowego o długości fali 633 nm, o emisji pasma w zakresie 640-718 nm.</li>
		<li>Obraz kanału niebieskiego za pomocą lasera diodowego o długości fali 405 nm, o emisji w paśmie 407-453 nm.</li>
		<li>Upewnij się, że wielokanałowe stosy z obejmują cały wolumin komórkowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
</ol>
7. Oczyszczanie powinowactwa
<ol>
	<li>Po 4-godzinnym okresie rekonwalescencji umyć ogniwa poddane elektroporacji dwukrotnie roztworem PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Lizować z ~1,0 ml buforu do lizy (1% Triton X-100 z koktajlem inhibitorów proteazy i inhibitorem fosfatazy w PBS) na lodzie. Stosować inhibitory zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: Na przykład zarówno inhibitory fosfatazy, jak i proteazy użyte w tym badaniu były dostarczane w dawce 100x, ale inne preparaty powinny działać równie dobrze.</li>
	<li>Natychmiast zeskrob komórki gumowym policjantem i zbierz w stożkowe rurki.</li>
	<li>Liza przez energiczne wirowanie i sonikację. Uwaga: Inne metody lizy mogą działać równie dobrze, ale skuteczność będzie musiała zostać empirycznie określona co do przydatności wymagań testu.
	<ol>
		<li>Sonizacja 3 x 30 sekund z przerywanym wirowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania resztek komórkowych i nierozpuszczalnych agregatów; zachować supernatant.</li>
	<li>Połączyć równe objętości (~1,0 ml) elektroporowanego lizatu komórkowego z 50 μl zawiesiny żywicy agarozowej Streptawidyny w temperaturze 4 °C przez noc z rotacją od końca do końca. Uwaga: Żywica ta wychwytuje elektroporowane białko (i związane z nim kompleksy) poprzez znacznik powinowactwa peptydowego wiążącego streptawidynę.</li>
	<li>Wirować przy 2 500 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyć dwukrotnie 40 objętościami złoża (~1 ml) PBS.</li>
	<li>Dodaj 30 μl 4x bufor ładujący LDS (141 mM zasady Tris, 2% LDS, 10% glicerolu, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G, 0,175 mM czerwieni fenolowej, pH 8,5), 20 μl diH2O i 1 μl 0,5 M tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), pozwalając na pozostawienie pewnej objętości w kulkach.</li>
	<li>Podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 10 minut i schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Wirować >10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Zebrać supernatant.</li>
	<li>Wykonaj western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał Uwaga: W tym przypadku stosuje się przeciwciało pierwszorzędowe anty-PKN1.</li>
</ol>

<ol><li>Mota, L. J., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+injection+kit%3A+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The bacterial injection kit: type III secretion systems.</a> Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).</li>
<li>Galan, J. E., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+secretion+machines%3A+bacterial+devices+for+protein+delivery+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells.</a> Science. 284, 1322-1328 (1999).</li>
<li>Hueck, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+bacterial+pathogens+of+animals+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).</li>
<li>Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+type+III+secretory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of type III secretory systems.</a> Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).</li>
<li>He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+plant+and+animal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).</li>
<li>Dean, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domains+and+motifs+of+bacterial+type+III+effector+proteins+and+their+roles+in+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).</li>
<li>Espinosa, A., Alfano, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disabling+surveillance%3A+bacterial+type+III+secretion+system+effectors+that+suppress+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).</li>
<li>Orchard, R. C., Alto, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+GEFs%3A+a+common+theme+for+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens.</a> Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).</li>
<li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+effector+protein%2C+VopQ%2C+forms+a+lysosomal+gated+channel+that+disrupts+host+ion+homeostasis+and+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Lafon, M., Lafage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+monoclonal+antibodies+specific+for+the+internal+proteins+N+and+NS+of+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus.</a> The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).</li>
<li>Kriegler, M. P., Livingston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+facilitated+microinjection+of+proteins+into+intact+monolayers+of+tissue+culture+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells).</a> Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).</li>
<li>Nossa, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+abundant+nuclear+factor+poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+by+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+Optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Electroporation+Is+a+Highly+Efficient+Method+for+Introducing+Restriction+Endonucleases+into+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells.</a> Mutation Research. 225, 49-53 (1989).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+damage+induced+by+restriction+endonucleases+recognizing+thymine-rich+DNA+sequences+in+electroporated+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chromosomal+aberrations+in+the+CHO+mutant+EM9+and+its+parental+line+AA8+by+EcoRI+restriction+endonuclease%3A+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments.</a> Mutation Research. 246, 221-226 (1991).</li>
<li>Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+antibodies%2C+DNA%2C+and+other+macromolecules+into+cells%3A+a+highly+efficient+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method.</a> Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).</li>
<li>Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+edges+toward+clinic+for+both+gene+therapy+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+and+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery.</a> Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).</li>
<li>Kotzamanis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+from+a+BAC+carrying+the+complete+human+gene+and+associated+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).</li>
<li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+unlabeled+proteins+into+living+cells+by+electroporation+and+isolation+of+viable+protein-loaded+cells+using+dextran-fluorescein+isothiocyanate+as+a+marker+for+protein+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake.</a> Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).</li>
<li>Prasanna, G. L., Panda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+Basic+principles%2C+practical+considerations+and+applications+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology.</a> Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory.+Concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory. Concepts and mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).</li>
<li>McAteer, J. A., Douglas, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture techniques.</a> Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).</li>
<li>Ho, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GtgE%2C+a+novel+virulence+factor+encoded+on+the+Gifsy-2+bacteriophage+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).</li>
<li>Niemann, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+secreted+virulence+factors+from+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+by+proteomic+analysis+of+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants.</a> Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).</li>
<li>Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+targeting+of+Rab29+by+an+effector+protein+distinguishes+the+intracellular+compartments+of+human-adapted+and+broad-host+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).</li>
<li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+PKN1%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology+%2F+Editorial+Board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science+%2F+Editorial+Board%2C+John+E.+Coligan+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Efektory wydzielane przez bakterie chorobotwórcze ewoluowały, aby funkcjonować w środowisku komórki gospodarza, dlatego pomocne jest ich badanie in situ w organizmie gospodarza. Wprowadzenie specyficznych efektorów będących przedmiotem zainteresowania do komórek gospodarza pozwala na badanie odpowiednich interakcji patogen-gospodarz w izolacji bez ingerencji ze strony innych białek bakteryjnych. Celem było zbadanie elektroporacji jako sposobu na wprowadzenie bakteryjnych białek efektorowych do eukariotycznych ko...

Wiele bakterii Gram-ujemnych wykorzystuje wyspecjalizowane systemy wydzielania do wstrzykiwania białek związanych z wirulencją (określanych jako efektory) bezpośrednio do komórek gospodarza 1-5. Te efektory mają szeroki zakres funkcji biologicznych, w tym: supresję odporności gospodarza, zmiany cytoszkieletu, modyfikację transportu i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, zmiany transkrypcyjne i zmiany proteasomu gospodarza 6-9. Funkcje niektórych efektorów są znane, jednak cele gospodarza i działania biochemiczne wielu innych pozostają do ustalenia. Chociaż porównywanie zakażeń bakteryjnych typu dzikiego i rekombinowanego jest ważnym podejściem do badania wewnątrzkomórkowych mechanizmów wirulencji efektorowej, często korzystne jest wprowadzenie pojedynczego efektora do komórki gospodarza. W związku z tym bardzo pożądane są proste metody wprowadzania i charakteryzowania bakteryjnych białek efektorowych w kontekście komórek gospodarza.
Uproszczenie analizy eksperymentalnej za pomocą jednego efektora jest krytyczne, ponieważ inne efektory mogą mieć przeciwstawne lub nadmiarowe funkcje. Aby osiągnąć to uproszczenie, naukowcy wcześniej wprowadzili makrocząsteczki do komórek za pomocą wielu różnych metod, w tym transdukcji wirusa 10, mikroiniekcji 11, obciążenia skrobaniem 12,13, fuzji komórek z chemicznie indukowaną mikroiniekcją 14, zastrzeżonych odczynników "transfekcji" białek 15, wytrącania fosforanu wapnia 16 i elektroporacji 17-20. Wprowadzone cząsteczki obejmują kwasy nukleinowe, w tym gatunki DNA, RNA i RNAi, białka, barwniki nieprzepuszczalne dla komórek i przeciwciała dla celów wewnątrzkomórkowych 21,22. Niektóre metody mają ograniczenia, w tym rodzaj makrocząsteczki, którą można wprowadzić, a niektóre dalsze analizy mogą być ograniczone ze względu na wysoką toksyczność komórkową, szkodliwe mechanizmy działania, niską skuteczność lub skuteczność wprowadzania. Transfekcja, często stosowana metoda ekspresji genów bakteryjnych w komórkach ssaków, ma również ograniczenie polegające na tym, że niektóre istotne typy komórek gospodarza, takie jak makrofagi i komórki pierwotne, są szczególnie odporne na transfekcję. Poza tym trudno jest kontrolować poziom białka bakteryjnego wytwarzanego po wprowadzeniu obcego DNA.
Wiele pracy przyczyniło się do tego, że elektroporacja kwasów nukleinowych w komórkach bakteryjnych i ssaków jest powszechną techniką laboratoryjną; jednak trwają badania nad najlepszymi metodami dostarczania białek do komórek w warunkach fizjologicznych. Doniesienia na temat transfekcji białek są obiecujące, ale wymagają drogich odczynników i optymalizacji. Chęć wprowadzenia potencjalnie toksycznych efektorów bakteryjnych do szerokiej gamy celów komórkowych przy minimalnych kosztach skłoniła nas do rozważenia elektroporacji jako metody badania tych białek in vivo. 
Elektroporacja białek 23-25 to metoda wprowadzania białek do żywych komórek poprzez elektropermeabilizację, znaną również jako elektrotransfekcja lub elektroiniekcja 26. Technika ta wykorzystuje impulsy elektryczne o dużej intensywności do tworzenia porów w błonach komórkowych. Te odwracalne pory umożliwiają makrocząsteczkom, które normalnie są wyłączone z przestrzeni wewnątrzkomórkowej, przedostanie się do komórki. Po usunięciu zewnętrznego pola elektrycznego błona może się ponownie uszczelnić, umożliwiając komórce zatrzymanie cząsteczek, które przeszły przez pory 27,28.
W tym badaniu użyto standardowego elektroporatora, aby konsekwentnie wprowadzać efektory bakteryjne zarówno do komórek podobnych do makrofagów myszy, jak i ludzkich komórek nabłonkowych. Metoda jest szybka, wydajna i niedroga, bez znaczącego spadku żywotności komórek. Wprowadzone białka można uwidocznić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej lub wykorzystać do testów funkcjonalnych. Wykazano to przy użyciu białka zielonej fluorescencji (GFP) jako nietoksycznego wzorca, a także dwóch białek efektorowych Salmonelli, SspH1 i GtgE. Proponujemy elektroporację białek jako dodatkowe narzędzie w repertuarze do badania białek wirulencji bakteryjnej i ich funkcji w eukariotycznych komórkach gospodarza.

<table><tbody><tr><td>0,25% roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Jednorazowe kuwety do elektroporacji z luką</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>100% metanol</td><td>Dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td>Łatwopalna, toksyczna</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do liczenia komórek - Hemocytometr lub licznik redlic</td><td>Beckman Coulter</td> Inkubator do hodowli komórkowych <td>model Z1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td>Nawilżona 95% powietrza/5% CO2 atmosfera przy 37 stopniach; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastikowa hodowla komórkowa</td><td>Dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Kolby/płytki do hodowli komórkowych, pipety, probówki, guma</td></tr><tr><td>Modyfikacja orła policjanta Dulbecco" s Średni (DMEM)</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td>Ciepły do 37 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>E. coli Pulser</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Model Ziessa</td><td>&nbsp; LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem do mikroskopii</td><td>Wilco Wells</td><td>HBSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>HALT Inhibitor proteazy</td><td>Koktajl Pierce</td><td>78430</td><td>, toksyczna</td></tr><tr><td>linia komórkowa HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>LDS 4X Bufor ładujący</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>10-010</td><td>Ciepły do 37 & stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Inne barwniki fluorescencyjne (WGA, DAPI) w połączeniu z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu</td><td>Dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko celowi zainteresowania</td><td>Dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem</td><td>Dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td>Schładzanie do 4 & stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami</td><td>Dowolna</td><td>N/A</td><td>Ciepła do 37 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Zawiesina żywicy agarozowej streptawidyny&nbsp;</td><td>Wirówka</td> stołowa Pierce <td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Zdolna do przyjmowania rurek stożkowych (preferowane wiadro wahadłowe)</td> <td>Dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td>, toksyczny</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8585</td><td>Drażniący, toksyczny</td></tr></tbody></table>

elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Badanie interakcji białek w kontekście żywych komórek może generować kluczowe informacje o lokalizacji, dynamice i oddziałujących partnerach. Informacje te są szczególnie cenne w kontekście interakcji gospodarz-patogen. Wiele białek patogennych funkcjonuje w komórkach gospodarza na różne sposoby, na przykład umożliwiając unikanie układu odpornościowego gospodarza i przetrwanie w środowisku wewnątrzkomórkowym. Aby zbadać te interakcje patogen-białko-komórka gospodarza, powszechnie stosuje się kilka podejść, w tym: zakażenie in vivo szczepem eksprymującym znakowane lub zmutowane białko lub wprowadzenie genów patogenu poprzez transfekcję lub transdukcję. Każde z tych podejść ma zalety i wady. Szukaliśmy sposobu na bezpośrednie wprowadzenie białek egzogennych do komórek. Elektroporacja jest powszechnie stosowana do wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek, ale rzadziej stosuje się ją do białek, chociaż podstawy biofizyczne są dokładnie takie same. Do wprowadzenia do komórek ssaków efektorów bakteryjnych znakowanych powinowactwem użyto standardowego elektroporatora. Ludzkie komórki nabłonkowe i mysie makrofagi wyhodowano tradycyjnymi metodami, odłączono i umieszczono w kuwetach do elektroporacji o odstępie 0,4 cm z interesującym egzogennym białkiem patogenu bakteryjnego (np. Salmonella Typhimurium GtgE). Po elektroporacji (0,3 kV) i krótkim (4 godziny) okresie rekonwalescencji, białko wewnątrzkomórkowe zweryfikowano poprzez fluorescencyjne znakowanie białka za pomocą znacznika powinowactwa oraz zbadanie rozmieszczenia przestrzennego i czasowego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wykazano również, że elektroporowane białko działa wewnątrz komórki i jest zdolne do prawidłowego transportu subkomórkowego i interakcji białko-białko. Podczas gdy białka egzogenne miały tendencję do gromadzenia się na powierzchni komórek, próbki poddane elektroporacji wykazywały duży wzrost stężenia efektorów wewnątrzkomórkowych w porównaniu z samą inkubacją. Protokół jest na tyle prosty i szybki, że można go wykonać w sposób równoległy, co pozwala na wysokoprzepustową charakterystykę białek patogennych w komórkach gospodarza, w tym celowanie subkomórkowe i funkcję białek wirulencji.

W ramach wstępnego potwierdzenia koncepcji, za pomocą elektroporacji pomyślnie wprowadzono oczyszczone zielone białko fluorescencyjne do komórek ssaków. GFP, białko o masie cząsteczkowej około 27 kD, jest powszechnie wprowadzane do komórek ssaków (zazwyczaj ekspresowane z plazmidowego DNA) jako narzędzie biologii molekularnej, nie wykazując przy tym istotnej toksyczności komórkowej. Komórki HeLa inkubowano (Rysunek 1A) lub poddano elektroporacji (Rysunek 1B) z użyciem 25 µg/ml GFP, a nas...

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wprowadzenie egzogennych, potencjalnie cytotoksycznych białek, takich jak efektory bakteryjne, do komórek ssaków w celu zbadania ich działania i funkcji. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę komórek ssaków w standardowych warunkach hodowlanych, aby uzyskać odpowiednie komórki gospodarza, do których wprowadzony zostanie oczyszczony białko zainteresowania. W drugim kroku przeprowadzana jest elektroporacja hodowanych komórek gospodarza w obecności oczyszczonego efektora bakteryjnego, co umożliwia białku wniknięcie do komórek gospodarza i wejście z nimi w interakcje.Następnie przeprowadza się wizualizację lub inny test funkcjonalny w celu oceny lokalizacji subkomórkowej i funkcjonalności białka efektorowego. Wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej, metod immunochemicznych lub innych technik analitycznych wykazują lokalizację funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w ich oczekiwanych miejscach subkomórkowych oraz wiązanie z ich znanymi partnerami interakcyjnymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja czy transdukcja, jest to, że protokół ten stanowi szybkie, proste i niedrogie podejście pozwalające przezwyciężyć potencjalną cytotoksyczność.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii patogenów, takie jak odkrywanie lub walidacja funkcji bakteryjnych białek efektorowych. Choć metoda ta została wykorzystana do uzyskania wglądu w bakteryjne białka efektorowe, można ją również zastosować do innych białek lub małych cząsteczek. Wizualizacja wyników jest kluczowa.W celu weryfikacji oczekiwanej lokalizacji subkomórkowej białka wprowadzonego metodą elektroporacji, należy przeprowadzić kolokalizację z znanymi strukturami komórkowymi. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś 400 µL zawiesiny komórek do schłodzonej wcześniej probówki. Następnie dodaj 20 µg wybranego białka, aby uzyskać stężenie końcowe 50 µg/mL.Delikatnie potrząśnij probówką około 10 razy w celu wymieszania zawartości i uniknięcia uszkodzenia komórek. Następnie osusz zewnętrzną stronę probówki Q Vet ręcznikiem papierowym, aby zapobiec powstaniu łuku elektrycznego w elektroporatorze. Umieść próbkę w elektroporatorze i ustaw napięcie na 0,3 kilovolts przez 1,5 do 1,7 milliseconds bezpośrednio przed przeprowadzeniem elektroporacji.Delikatnie potrząśnij probówką około 10 razy, aby dokładnie wymieszać próbkę przed przystąpieniem do fiksacji i barwienia immunofluorescencyjnego lub oczyszczania powinowactwem. Po czterech godzinach regeneracji po elektroporacji przemyj komórki sterylnym PBS. Następnie utrwal komórki w 100% metanolu przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Następnie komórki należy przemyć sterylnym PBS 3 razy. Przeprowadzić permeabilizację komórek za pomocą 0,4% Triton X 100 w PBS przez 15 minut. Czas permeabilizacji oraz stężenie Triton X 100 należy dostosować do epitopu i lokalizacji białka docelowego.Następnie zablokuj komórki, stosując 5%BSA w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie przemyj je trzykrotnie PBS. Następnie inkubuj je z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze wiążącym przeciwciała przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy delikatnym kołysaniu, a następnie kontynuuj procedurę następnego dnia.Przemyj komórki czterokrotnie PBS. Następnie inkubuj je z odpowiednim wtórnym przeciwciałem koniugowanym z fluoresceiną w roztworze do wiązania przeciwciał. W razie potrzeby dodaj inne barwniki, takie jak pięć mikromolarnych lektyn aglutynina z zarodków pszenicy lub WGA koniugowana z Alexa 6 47 lub DPI, i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem.Następnie przemyć komórki pięciokrotnie PBS i przechowuj w temperaturze 4°C w ciemności do momentu wykonania obrazowania w tym kroku. Przemyj elektroporowane komórki dwukrotnie PBS w temperaturze 4°C. Po czterogodzinnej regeneracji poddaj komórki lizie, dodając 1 mL buforu lizującego na lodzie.Bezzwłocznie zeskrob komórki za pomocą gumowego skrobaka (tzw. rubber policeman) i zbierz je do probówek stożkowych. Następnie poddaj komórki lizie poprzez sonikację i intensywne mieszanie w wibratorze typu vortex. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 10 000 ×g.Wirować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać debris komórkowy oraz agregaty nierozpuszczalne, a następnie zachować nadsącz. Połączyć 1 ml klarownego lizatu komórek poddanych elektroporacji z 50 µL zawiesiny żywicy Strep-Tactin. Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy rotacji end-over-end, aby wyizolować białko poddane elektroporacji oraz powiązane z nim kompleksy za pomocą powinowactwa znacznika wiążącego białko Strep-Tactin.Następnie odwiruj próbkę przy 2 500 ×g przez dwie minuty i odlej supernatant. Potem przemyj próbkę dwukrotnie za pomocą 1 ml PBS. Następnie do próbki dodaj 30 µL buforu do ładowania 4X LDS, 20 µL destylowanej H2O oraz 1 µL 0,5 M TCEP, pozostawiając niewielką ilość supernatantu.Podgrzewaj próbkę w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Następnie schłodź ją na lodzie przez około jedną minutę. Po tym odwiruj próbkę przy 10 000 ×g w temperaturze czterech °C przez pięć minut.Na koniec należy zebrać nadsącz do analizy western blot z użyciem odpowiednich przeciwciał. Komórki HeLa inkubowano lub poddano elektroporacji z użyciem 50 µg/mL efektora salmonelli z tagiem powinowactwa, GTGE, a następnie barwiono przeciwciałem przeciwko tagowi efektora dpi oraz maską jądrową i WGA w celu wyznaczenia granic cytozolu. Inkubowane komórki HeLa wykazują brak zielonej fluorescencji, co wskazuje na brak internalizacji GTGE. Jest to reprezentatywna fotomikrografia elektroporowanego GTG, która przedstawia wewnątrzkomórkowe białko efektorowe wprowadzone metodą elektroporacji.Oto analiza western blot służąca do wykrycia eukariotycznego partnera oddziaływania dla białka kinazy N1. Należy zauważyć, że skrajna prawa ścieżka zawiera dwie połączone kuwety. Sygnał z jednej kuwety zlał się z tłem, jednak poziom pkn1 był nadal wyższy niż brak wiązania zaobserwowany w kontroli bez przynęty w badaniu mikroskopią konfokalną po elektroporacji z użyciem 50 µg/mL.Komórki HeLa S sph one wykazują kolokalizację białek pkn one i S SPH one. Ten nakład optyczny wskazuje, że efektor i białko gospodarza znajdują się wystarczająco blisko siebie, aby wejść w interakcję fizyczną. Fakt, że interakcję tę wykazano po raz pierwszy w jądrze komórkowym, stanowi dodatkowy dowód na to, że białko zostało prawidłowo przetransportowane przez gospodarza.Po opanowaniu ta technika może być wykonywana w sposób wysokoprzepustowy w celu zbadania wielu pojedynczych białek. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby empirycznie określić optymalne warunki elektroporacji dla każdego typu komórek i białka docelowego. Procedura ta może umożliwić multipleksowanie z użyciem kilku białek, małych cząsteczek lub ich kombinacji, co pozwoli na lepsze zrozumienie procesów komórkowych w różnych systemach modelowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, w jaki sposób elektroporacja może być wykorzystywana do wprowadzania makrocząsteczek, takich jak białka, do komórek ssaków.

electroporation-of-functional-bacterial-effectors-into-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych do komórek ssaczych

Strategie patogenności prątków są wciąż słabo poznane. Powolny tempo wzrostu większości gatunków, nieprzenikniona natura ściany komórkowej oraz zagrożenia związane z pracą z patogenami sprawiają, że prątki są trudne do badania, co w dużej mierze odpowiada za naszą ograniczoną wiedzę na temat tych organizmów. W tym filmie zaprezentujemy technikę elektroporacji, która polega na poddaniu komórek krótkiemu impulsowi o wysokim napięciu elektrycznym w celu umożliwienia wniknięcia DNA. Jest to...

Elektroporacja Mycobacterium

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Źródło: Berens, C. i in. Zastosowanie systemu indukowalnej ekspresji do badania interferencji czynników zjadliwości bakteryjnej z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do identyfikacji, gdzie bakteryjne białko efektorowe CaeB zakłóca apoptotyczną kaskadę gospodarza. Opisuje ona kroki transfekujące komórki ekspresujące CaeB za pomocą systemu reagującego na tetracyklinę, aby indukować ekspresję genów pro-apoptotycznej w...

Transfekcja indukowalnego systemu ekspresji genów do komórek ekspresujących bakteryjne białko efektorowe

W tym filmie pokazujemy wprowadzanie białek efektorowych bakterii do komórek ssaków za pomocą elektroporacji. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja bakteryjnych białek efektorowych jest wykrywana za pomocą mikroskopii konfokalnej po barwieniu specyficznymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.

Wprowadzenie bakteryjnych białek efektorowych do komórek ssaków za pomocą elektroporacji

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Elektroporacja plazmidowego DNA w mięśniach szkieletowych jest realną metodą modulowania ekspresji genów bez naruszania kurczliwości mięśni u myszy.

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metodę elektroporacji bakteryjnych efektorów w komórkach ssaków do badania lokalizacji i funkcji białek. Technika ta umożliwia szybkie i efektywne wprowadzanie białek z minimalną cytotoksycznością.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów