Name: Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj izolację i unieśmiertelnienie komórek mięśniowych z biopsji pacjentów przy użyciu FACS oraz wirusa CDK4 i hTERT. Ta metoda umożliwia nieograniczoną ekspansję komórek do badań nad chorobami mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja jest finansowana przez Cure CMD, grant Association Contre Les Myopathies (AFM) (projekt 16297) oraz przez National Institutes of Health (granty o numerach K08 AR059750, L40 AR057721 i 2R01NS047727).

UWAGA: Protokoły pobierania tkanek ludzkich muszą być sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet IRB. Pobieranie wyrzuconych, pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację tkanek ludzkich zostało zatwierdzone przez Szpital Dziecięcy w Bostonie oraz Komitety IRB Brigham and Women's Hospital. Opisane poniżej metody zostały zastosowane do izolacji komórek miogennych z pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację, wyrzuconych tkanek. Opisane metody mają zastosowanie do tkanek pobranych z materiału pacjenta, który wyraził na to zgodę.
1. Izolacja komórek
<ol>
	<li>Dysocjacja biopsji mięśni i oczyszczanie komórek miogennych
	<ol>
		<li>Wstępnie zważyć 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej w kapturze bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej, a następnie ponownie zważyć płytkę zawierającą biopsję mięśnia, aby obliczyć ilość tkanki do dysocjacji.</li>
		<li>Używając sterylnych skalpeli, drobno zmiel tkankę mięśniową i dodaj kilka kropli sterylnego 1x HBSS, aby zapobiec wysychaniu tkanki.</li>
		<li>Dodać po 3,5 ml dypazy II i kolagenazy D na gram tkanki mięśniowej do strawienia. Kilkakrotnie odpipetować tkankę mieloną i roztwór enzymatyczny przez sterylną pipetę o pojemności 25 ml. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 15 minut i trawić tkankę do momentu, aż zawiesina łatwo przejdzie przez sterylną pipetę o pojemności 5 ml. 
		UWAGA: Dysocjację tkanek uzyskuje się zwykle przez trawienie enzymatyczne w ciągu 45-90 minut. Aby uzyskać dodatkowe informacje, zapoznaj się z sekcją "Reprezentatywne wyniki".</li>
		<li>Dodać 2 objętości sterylnej pożywki wzrostowej do zdysocjowanej tkanki, przefiltrować przez sitko do komórek 100 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i komórki osadu przez 10 minut przy 329 x g (~1,100 obr./min), temperaturze pokojowej. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu mediów.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1 objętości sterylnej pożywki wzrostowej i dodać 7 objętości roztworu do lizy czerwonych krwinek. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 40 μm, a następnie granulować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej 329 x g.</li>
		<li>Policz komórki w hemocytometrze i ponownie zawieś komórki w 1x HBSS 0,5% BSA w stężeniu 1 x 106 komórek/100 μl. Odłóż na bok ~ 250 000 komórek w jednej probówce, która zostanie użyta jako negatywna (niebarwiona) kontrola. Odłożyć na bok dodatkowe jednokolorowe barwione probówki kontrolne dla jodku propidyny i dla CD56, które są wymagane do prawidłowego bramkowania komórek CD56 dodatnich przez sortowanie FACS. Zapoznaj się z instrukcjami sortowania komórek lub skonsultuj się z ekspertami FACS ds. sortowania, aby upewnić się, że uwzględniono odpowiednie kontrole.</li>
		<li>Wybarwić komórki do sortowania 5 μl / 106 komórek przeciwciała anty CD56. Wszystkie próbki (w tym próbki kontrolne) należy inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Próbki myć w 10 ml 1x HBSS i granulkach przez 10 minut przy 329 x g (~1,100 obr./min) w wirówce z chłodzeniem, w temperaturze 4°C.</li>
		<li>Dodać jodek propidyny w końcowym stężeniu 1 μg/ml do próbki, która ma być sortowana w celu wykluczenia martwych komórek. Oczyść miogenne komórki CD56 dodatnie z komórek niemiogennych za pomocą sortera komórek aktywowanych fluorescencją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja biopsji skóry 
	UWAGA: Fibroblasty skórne można wyizolować z stempla skórnego od pacjentów, gdy biopsje mięśni nie są dostępne. Fibroblasty skórne mogą być wykorzystywane jako biomateriał do wielu badań, w tym transdukcji za pomocą MyoD w celu wytworzenia komórek miogennych. Dodatkowo fibroblasty skóry mogą być wykorzystywane do generowania komórek iPS, które można różnicować w różne typy komórek w celu dalszych badań.
	<ol>
		<li>Przetransportować biopsję skóry do laboratorium w podłożu transportowym. Po otrzymaniu próbki należy jak najszybciej przeprowadzić hodowlę pierwotną. Jeżeli nie można ustalić hodowli pierwotnej tego samego dnia, należy przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
		<li>Przenieść biopsję skóry na sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 mm w okapie z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Spłucz biopsję skóry na szalce Petriego sterylnym 1x PBS, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. Usuń tkankę tłuszczową za pomocą sterylnego skalpela.</li>
		<li>Dodać 2 ml roztworu kolagenazy i zmielić tkankę skalpelem, inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut do 1 godziny, w zależności od wielkości tkanki.</li>
		<li>Przenieść strawioną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dwukrotnie przepłukać szalkę Petriego 2 ml pożywki hodowlanej fibroblastów i zebrać pożywkę do tej samej probówki.</li>
		<li>Komórki osadu w ilości 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad 3 ml pożywki fibroblastów w celu usunięcia kolagenazy, a następnie ponownie rozsiać komórki osadu. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu mediów.</li>
		<li>Powtórz krok 1.2.7 jeszcze raz.</li>
		<li>Zawiesić osad w 5 ml pożywki fibroblastowej i komórkach płytki na sterylnej kolbie do hodowli tkanek T25. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Oceń kulturę pod kątem przyłączenia i wzrostu fibroblastów w ciągu najbliższych 1-3 dni. 
		UWAGA: Niektóre małe kawałki tkanki mogą również przyczepiać się do płytki, a fibroblasty migrują z tych fragmentów tkanki.</li>
		<li>Utrzymuj kulturę w tych samych warunkach, aż fibroblasty osiągną około 80% zbieżności.</li>
		<li>Zbierz fibroblasty przez trypsynizację i przenieś do świeżych kolb hodowlanych w celu dodatkowej ekspansji. Przeprowadź trypsynizację, myjąc kultury 3 razy w 1x PBS wolne od Ca++ i Mg++. Dodać trypsynę-EDTA (patrz tabela materiałów) do komórek (2 ml / kolba T25) przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Podziel odłączone komórki na dodatkowe kolby. Jeśli niektóre fragmenty tkanek pozostaną połączone z oryginalnymi kolbami T25, dodaj 5 ml świeżej pożywki hodowlanej do tej kolby, a więcej fibroblastów będzie migrować w sposób ciągły. 
		UWAGA: Ekspandowaną kulturę fibroblastów można zamrozić jako P1 i przechowywać w ciekłym azocie do przyszłych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Unieśmiertelnienie komórek miogennych
<ol>
	<li>Umieść 5 milionów komórek pakujących Phoenix Ecotropic (PE) przez noc na 10 cm sterylnej płytce do hodowli tkankowej w DMEM i pożywce 199 w stosunku 4:1, uzupełnionej 10% surowicą cielęcą.</li>
	<li>Nakarm komórki 30 minut przed transfekcją 5 ml świeżej pożywki uzupełnionej 10 mM kofeiny.</li>
	<li>Homogenizować mieszaninę 2 μg plazmidowego DNA z preparatu midi (plazmid CDK4 lub hTERT) i polyjet i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę plazmidu / polyjet do komórek PE na noc.</li>
	<li>Nakarm komórki świeżą pożywką (DMEM i Pożywką 199 w stosunku 4:1, uzupełnioną 10% surowicą cielęcą). Dwanaście godzin później zbierz supernatant zawierający wirusa i przefiltruj go przez filtr o wielkości porów 0,45 μm.</li>
	<li>Użyć 1 ml zebranego supernatantu do zakażenia przez noc amfotropowej linii komórkowej PA317 5 i uzyskać stabilną linię komórkową wytwarzającą wirusa po selekcji za pomocą 0,5 mg/ml neomycyny (G418) dla CDK4 lub 0,5 mg/ml higromycyny dla hTERT.</li>
	<li>Przygotuj działające supernatanty wirusowe, hodując stabilne komórki pakujące do poziomu bliskiego zrębowi, a następnie zbierając supernatant każdego ranka, wieczoru i ranka przez trzy zbiory.</li>
	<li>Przefiltrować supernatanty wirusa i albo użyć je bezpośrednio, albo podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Należy pamiętać, że supernatant wirusa traci 50% skuteczności infekcji przy każdym zamrażaniu-rozmrażaniu. Pamiętaj, aby wyprać wybielacz przed wyrzuceniem wszystkiego, co miało kontakt z cząsteczkami wirusa. 
	UWAGA: Stabilną linię komórkową wytwarzającą wirusa PA317 można zamrozić i utrzymywać w temperaturze -150 °C w celu trwałego przechowywania (pożywka do zamrażania to 10% DMSO; 90% surowicy).</li>
	<li>Komórki miogenne oczyszczone metodą FACS (opisane w krokach 1.1-1.9) o gęstości 5 x 104 komórki / studzienkę na płytkach 6-dołkowych pokrytych 0,1% żelatyną. Upewnij się, że komórki są przymocowane do płytki przed przystąpieniem do infekcji wirusowej.</li>
	<li>Dodać 400 μl przefiltrowanego, świeżo wyprodukowanego supernatantu wirusowego lub zamrożonych podwielokrotności do każdej sześciodołkowej płytki przez noc (zachować 2 dołki jako kontrole).</li>
	<li>Zmień pożywkę, karmiąc komórki 2,5 ml / studzienkę świeżego podłoża mięśniowego (4:1 zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) i Pożywka 199 firmy Dulbecco uzupełnione 15% płodową surowicą bydlęcą; 0,02 M bufor HEPES; 1,4 mg/L witaminy B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/l deksametazonu, 2,5 μg/l czynnika wzrostu hepatocytów i 10 μg/l zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów). Wyrzuć media i pipety zawierające cząsteczki wirusa do pojemnika z wybielaczem. Pozostaw komórki w tym samym pożywce na 3 dni, aby wyzdrowiały po infekcji, a następnie poddaj je selekcji za pomocą 400 μg/ml neomycyny (zakażenie CDK4) lub 300 μg/ml higromycyny (zakażenie hTERT).</li>
	<li>Utrzymuj komórki pod selekcją leków, aż komórki w naczyniu kontrolnym obumrą (1-2 tygodnie).</li>
	<li>Pasaż komórek, zanim staną się zlewające (60-80% konfluencji; przy użyciu 0,05% trypsyny EDTA), nawet w okresie selekcji. Ponownie płytkować komórki w wielu 10-centymetrowych szalkach ze świeżą pożywką mioblastową (jak opisano w 2.11) uzupełnioną lekiem selekcyjnym. Utrzymuj unieśmiertelnione wybrane komórki jako heterogeniczną populację lub klon, aby uzyskać całkowicie jednorodne tło genetyczne (taka sama insercja transgenu w każdej komórce).</li>
	<li>Wykonaj selekcję klonalną, wykonując następujące czynności:
	<ol>
		<li>Wysiewaj komórki o małej gęstości (np. 300 do 500 komórek na 10 cm szalkach) i utrzymuj je przez około dwa tygodnie, aż utworzą się małe kolonie (10-20 komórek).</li>
		<li>W tym momencie usuń większość pożywki, pozostawiając tylko cienką warstwę, aby zapobiec wysychaniu komórek.</li>
		<li>Umieść pierścień klonujący (z jednym końcem zanurzonym w silikonowym smarze próżniowym) na każdym pożądanym klonie i dodaj kilka kropli trypsyny/EDTA.</li>
		<li>Zbieraj komórki, gdy już się zaokrąglą, ostrożnie odsysając komórki za pomocą końcówki o pojemności 1 ml lub pipety Pasteura i przenosząc je na najmniejszą dostępną płytkę wielodołkową (płytki 96 lub 48, 24 lub 12-dołkowe).</li>
		<li>Rozwiń klony zgodnie z potrzebami, aby zapobiec konfluencji lokalnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Flanigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).</li>
<li>Mercuri, E., Muntoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies.</a> Lancet. 381, 845-860 (2013).</li>
<li>Sharples, A. P., Stewart, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+models+of+skeletal+muscle+hypertrophy+and+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).</li>
<li>Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+skeletal+muscle+development+and+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).</li>
<li>Miller, A. D., Buttimore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+retrovirus+packaging+cell+lines+to+avoid+recombination+leading+to+helper+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production.</a> Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).</li>
<li>Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+antigen+Leu-19+as+a+molecular+marker+of+regeneration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).</li>
<li>Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+natural+killer+%28NK%29+cell-associated+antigen+CD56%28Leu-19%29%2C+which+is+identical+to+the+140-kDa+isoform+of+N-CAM%2C+in+neural+and+skeletal+muscle+cells+and+tumors+derived+therefrom%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom.</a> Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).</li>
<li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li>
<li>Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+human+and+mouse+satellite+cells+really+the+same%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Are human and mouse satellite cells really the same.</a> J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).</li>
<li>Belles-Isles, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+selection+of+donor+myoblast+clones+for+muscular+dystrophy+therapy+using+cell+surface+expression+of+NCAM%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM.</a> Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).</li>
<li>Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+human+muscle-derived+cells+to+skeletal+muscle+regeneration+in+dystrophic+host+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice.</a> PLoS One. 6, e17454(2011).</li>
<li>Zhu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+human+myoblasts+is+overcome+by+human+telomerase+reverse+transcriptase+and+cyclin-dependent+kinase+4%3A+consequences+in+aging+muscle+and+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies.</a> Aging Cell. 6, 515-523 (2007).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).</li>
<li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).</li>
<li>Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+myogenic+cell+populations+obtained+via+the+preplate+technique%3A+potential+for+rapid+isolation+of+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells.</a> Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+converts+primary+dermal+fibroblasts%2C+chondroblasts%2C+smooth+muscle%2C+and+retinal+pigmented+epithelial+cells+into+striated+mononucleated+myoblasts+and+multinucleated+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).</li>
<li>Huard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+dermal+fibroblasts+expressing+MyoD1+in+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).</li>
<li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li>
<li>Park, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+modulates+Wnt+signalling+by+association+with+target+gene+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin.</a> Nature. 460, 66-72 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki jako użyteczny zasób
Izolacja i hodowla populacji komórek miogennych jest niezwykle przydatna przy ustalaniu fenotypów choroby lub modeli choroby in vitro . Opisana tutaj procedura izolacji komórek miogennych umożliwia izolację mioblastów i fibroblastów z próbek mięśni szkieletowych, które można następnie rozmnażać, różnicować lub natychmiast analizować. Strukturę i funkcję mioblastów można ocenić za pomocą badania mikroskopowego, oceny przeżycia komórek, oceny fuzji komórek l...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Diagnostyka molekularna znacznie się rozwinęła w ciągu ostatnich 20 lat. Genomowe DNA jest obecnie rutynowo izolowane z plwociny lub wymazu z policzka, podczas gdy w przeszłości wymagało pobrania krwi. Przy obecnym krótkim czasie realizacji i łatwości sekwencjonowania genów, wiele mutacji chorobowych jest rutynowo identyfikowanych bez konieczności przeprowadzania dodatkowych badań. W przypadku diagnostyki chorób mięśni, identyfikacja dziesiątek nowych genów odpowiedzialnych za dystrofię mięśniową lub miopatię w ciągu ostatniej dekady radykalnie zmieniła sposoby diagnozowania tych chorób 1,2. Obecnie istnieją dziesiątki genów, które zostały zidentyfikowane jako przyczyny dystrofii mięśniowej i wrodzonej miopatii, chociaż mechanizmy, za pomocą których wiele z tych genów powoduje chorobę, pozostają niejasne. Wyzwaniem są zwłaszcza choroby rzadkie ze względu na niewielką liczebność populacji pacjentów. W tych przypadkach, a także w przypadku bardziej powszechnych chorób, wysoce pożądane jest stworzenie stabilnych narzędzi ułatwiających badania nad mechanizmem patogenezy i badaniami przesiewowymi leków terapeutycznych. 
Pomimo ogromnego postępu w diagnostyce DNA, biopsje mięśni są nadal wykonywane w celu ustalenia podstawowej diagnozy u wielu pacjentów, u których podejrzewa się pierwotną chorobę metaboliczną lub mięśniową. Gdy konieczna jest biopsja mięśnia, daje ona możliwość dodatkowego pobrania tkanek diagnostycznych i badawczych przy minimalnym dodatkowym ryzyku zachorowalności dla pacjenta. Ponieważ istnieje wiele zastosowań dla każdej próbki tkanki, wysoce pożądane jest ustanowienie technik pierwotnej hodowli komórek przy użyciu tkanki chirurgicznej, które są proste, wydajne i wymagają minimalnych ilości tkanki. Właściwa selekcja biopsji mięśni lub skóry jest wymagana, aby zmaksymalizować izolację komórek pierwotnych od tkanek i długotrwałe przechowywanie żywego materiału. Ponadto badania nad komórkami macierzystymi i badania przesiewowe leków są bardzo obiecujące w opracowywaniu terapii wielu chorób przy użyciu testów komórkowych 3,4.
Opisujemy tutaj metody pierwotnej izolacji komórek z ludzkich biopsji mięśni lub skóry. Dodatkowo dołączamy protokół unieśmiertelnienia komórek miogennych, który jest przydatny do generowania dużej liczby komórek od osobnika. Komórki te mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak niestandardowe badania przesiewowe leków, które w innym przypadku są nieosiągalne przy ogólnie niskiej liczbie komórek uzyskanych z tkanki pierwotnej.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue&nbsp; kultura kaptur bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Model SterilGuard Hood</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa, taka jak Beckman Model&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model Allegra 6R</td><td>Jeśli przeprowadzane jest sortowanie komórek, preferowana jest wirówka z chłodzeniem</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Model Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych, podłączony do CO2 źródło</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>Sortownik komórek aktywowany</td> fluorescencją serii II <td></td></tr><tr><td>(FACS)</td><td>Odczynniki Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>do izolacji pierwotnych mioblastów z tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dyspasa II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td><td>Przygotuj roztwór skarpety o stężeniu 2,4U/ml w kolagenazie DMEM</td></tr><tr><td>D&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>#088882001</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x Sterylny motek' s Zrównoważony roztwór soli fizjologicznej (HBSS), wolny od wapnia i magnezu</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>Przygotuj sterylny&nbsp; roztwór 1X HBSS 0,5% BSA do sortowania FACS</td></tr><tr><td>Sterylna pożywka wzrostowa dla mioblastów: Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Pożywka (DMEM) z wysokim poziomem glukozy (4,5 g) uzupełniona 30% płodową surowicą bydlęcą</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Zawiera L-glutaminę</td></tr><tr><td>Roztwór do lizy RBC</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium 10 mg / ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Przygotuj roztwór podstawowy, rozcieńczając proszek w sterylnej wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD56 do cytometrii przepływowej Biolegend</td><td></td><td>318310</td><td>Przeciwciało sprzężone z APC, dostępne są inne etykiety</td></tr><tr><td>Odczynniki do unieśmiertelnienia pierwotnych mioblastów Ekotropowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>linia komórkowa</td><td>pakowania PE Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Amfotropowa linia komórkowa pakowania PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 0,1% żelatyny w wodzie. Posmaruj naczynie roztworem o temperaturze 37& C przez jedną godzinę. Usuń roztwór i dodaj pożywkę.</td></tr><tr><td>PolyJet&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>plazmidy pBabe zawierające mCDK4 i hTERT</td><td>niedostępne</td><td></td> na rynku <td>Stadler i wsp., 2013</td></tr><tr><td>Qiagen plasmid midiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Średni 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>Mix 4:1 DMEM:199</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa Myoblast: 4:1 Dulbecco' s zmodyfikowane Eagle Medium (DMEM) i Medium 199 uzupełnione 15% płodową surowicą bydlęcą; 0,02 M bufor HEPES; 1,4 mg/l witaminy B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/L deksametazon, 2,5 &mu; czynnik wzrostu hepatocytów g/L i 10 &mu; czynnik wzrostu g / L beta fibroblastów.</td><td>Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (siarczan); Sigma (witamina B12, deksametazon); Chemicon international (HGF); Biopionier (betaFGF)&nbsp;</td><td>#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>Przygotować pożywkę i roztwór podstawowy witaminy B12 (20 mg/ml); Siarczan (60&mikro; g/ml); Dex (55 i mikro; g/&mikro; l) oddzielnie dla łatwiejszego użytkowania. Roztwór podstawowy HGF (5&mikro; g/ml) i FGF (20&mikro; g/ml) powinny być dodawane świeżo co tydzień w końcowym stężeniu roboczym.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało o łańcuchu ciężkim miozyny do barwienia immunologicznego</td><td>Rozwojowy Hybrydoma Bank</td><td>MF20</td><td>Klon MF20</td></tr><tr><td>Przeciwciało Desmin do barwienia immunologicznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Klon D33</td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do pierwotnej izolacji fibroblastów skóry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka transportowa: RPMI 1640 uzupełniony o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 0,2% penicyliny/streptomycyny</td><td>Pożywka RPMI 1640: GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli pierwotnych fibroblastów ludzkich: RPMI 1640 uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny</td><td>Płodowa surowica bydlęca: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kolagenazy: Kolagenaza typu 2 (100 mg) zawieszona w 12,5 ml pożywki hodowlanej fibroblastów i wysterylizowana filtrem</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny 1X Bufor Fosforanowy Sól Solna (PBS) bez wapnia i magnezu</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Materiały do izolacji pierwotnych mioblastów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml i 15 ml sterylne probówki stożkowe</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))Sterylne</td><td></td></tr> <tr><td>skalpele</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety 5, 10 i 25 ml Bellco</td><td>glass</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)</td><td>Pipety wielokrotnego użytku są myte, zatykane bawełniane i autoklawowane przed użyciem</td></tr><tr><td>Sterylne plastikowe naczynia poddane kulturze tkankowej (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne nylonowe sitka do komórek (100 &mikro; m oraz 40 i mikro; Rozmiar m)</td><td>BD Falcon</td><td>352340 (40 i mikro; m); 352360 (100 cali; m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Materiały do unieśmiertelniania</td><td></td><td></td><td></td>mioblastów</tr><tr><td>Sterylne 0,45 i mikro; m</td><td>filtry Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie klonujące</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>Do czyszczenia i autoklawowania przed i po użyciu</td></tr><tr><td>Materiały do linii komórkowych fibroblastów&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 35 mm plastikowe naczynia z kulturami tkankowymi</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne skalpele</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td> Sterylne kolby do hodowli <td></td></tr><tr><td>tkankowych T25</td><td>Produkt z tworzywa sztucznego, TPP</td><td>90026</td><td>sprzedawany w USA przez MIDSCI</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Generowanie specyficznych dla pacjenta linii komórkowych stanowi nieocenione narzędzie do badań diagnostycznych lub translacyjnych, a komórki te mogą być pobierane z tkanki biopsji skóry lub mięśni dostępnej podczas diagnostyki pacjenta. W tym protokole opisujemy technikę izolacji żywych komórek z niewielkich ilości tkanki mięśniowej lub skórnej w celu pierwotnej hodowli komórek. Dodatkowo udostępniamy technikę unieśmiertelniania miogennych linii komórkowych i linii komórkowych fibroblastów z komórek pierwotnych. Po uwiecznieniu linii komórkowych można osiągnąć znaczną ekspansję komórek pochodzących od pacjenta. Unieśmiertelnione komórki są podatne na wiele dalszych zastosowań, w tym badania przesiewowe leków i korektę mutacji genetycznej in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Rysunek 1 ilustruje niektóre z kluczowych etapów dysocjacji tkanki pierwotnej: dokładna ilość tkanki jest ważona w sterylnym naczyniu Petri do hodowli tkanek (Rysunek 1A, B). Następnie tkanka jest drobno siekana za pomocą sterylnych skalpeli, aż do uzyskania zawiesiny tkankowej (Rysunek 1C, D). Po dodaniu enzymów trawiennych dysocjacja pierwotnej tkanki mięśniowej jest zazwyczaj osiągana poprzez trawienie enzymatyczne w ciągu 45-90 min. Postęp trawienia tkanki jest zazwy...

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej. Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie oczyszczonych komórek mięśniowych z biopsji mięśni pacjentów oraz ich unieśmiertelnienie do dalszych badań. Osiąga się to poprzez uprzednie zważenie, rozdrobnienie i trawienie zebranej tkanki w celu dysocjacji komórek jednojądrowych. W drugim kroku komórki miogenne są oczyszczane z komórek niemiogennych przy użyciu metody FACS.Następnie komórki mięśniowe są infekowane zarówno CDK4, jak i hTERT w celu wygenerowania komórek unieśmiertelnionych. Wyniki pokazują, że pochodzące od pacjenta żywe komórki mięśniowe mogą być namnażane przez kilka pasażów i różnicować się, co potwierdzono w testach fuzji komórkowej, obecnością drgających miotubul oraz ekspresją markerów miogennych. Znaczenie tej techniki wykracza poza diagnostykę chorób mięśni, ponieważ może ona potencjalnie dostarczyć nieograniczonej liczby komórek miogennych do przesiewowych badań leków lub innych zastosowań następczych, w których wymagana jest duża liczba komórek.Procedurę zaprezentuję wraz z Jerome'em Robbinem, pracownikiem postdoktorskim z laboratorium dr Woody'ego Wrighta w Dallas. Należy rozpocząć od dysocjacji biopsji mięśnia w celu oczyszczenia komórek miogennych. Najpierw, w dygestorium do hodowli tkankowych, należy zmierzyć masę biopsji mięśnia.Następnie, w szalce o średnicy 10 centymetrów, za pomocą sterylnych skalpeli posiekaj tkankę na drobne kawałki. Na każdy gram tkanki dodaj kilka kropli 1X-H-B-S-S, aby zapobiec jej wysychaniu. Dodaj 3,5 mililitrów pasty do krążków nr 2 oraz 3,5 mililitrów roztworu kolagenazy D.Następnie wymieszać komórki za pomocą pipety 25 ml i przekładać płytkę do inkubatora co 15 minut. W ciągu 90 minut wymieszać komórki za pomocą pipety 5 ml. Powinna nastąpić całkowita dysocjacja tkanki.Po dysocjacji tkanki należy dodać dwie objętości pożywki wzrostowej i przefiltrować zawiesinę przez sito o oczkach 100 µm. Filtrat należy zebrać do probówki o pojemności 50 ml. Komórki z filtratu należyy odwirować w celu uzyskania osadu przy 329 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie resuspender komórki w HBSS z 0,5% BS, A i policzyć je. Dostosować objętość, aby uzyskać 1 milion komórek na 100 µL. Odstawić alikwot zawierający 250 000 komórek jako kontrolę niebarwioną oraz dwa podobne alikwoty jako kontrole barwienia pojedynczego.Wszystkie te elementy są wymagane do analizy FACS. Teraz należy zbarwić komórki, dodając pięć µL przeciwciała anty-CD 56 na milion komórek, a następnie inkubować wszystkie próbki na lodzie przez pół godziny. Następnie szybko przemyć próbki 10 mL HBSS.Następnie odwiruj komórki w celu uzyskania osadu, analogicznie jak poprzednio, lecz w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu odlej nadsącz, a osad komórkowy resuspenduj w 1X HBSS do stężenia 5 milionów komórek na ml. Następnie dodaj jodek propidyny do stężenia końcowego 1 µg/ml. Teraz, korzystając z systemu FACS oraz płytki do puryfikacji, wyizoluj miogenne komórki CD56-dodatnie z komórek niemiogennych.Komórki miogenne wysiewane w zagęszczeniu 50 000 na dołek w płytkach sześciodołkowych pokrytych 0,1% żelatyną, hodowano do czasu ich przytwierdzenia, a następnie zainfekowano wirusem w celu uniezmiertelnienia linii komórkowej. W protokole tekstowym znajduje się dodatkowy opis sposobu oczyszczania i hodowli fibroblastów skóry właściwej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Komórki phoenix tropic przygotowano po inkubowaniu ich przez noc z mieszaniną plazmidową PolyJet.Nakarmione komórki świeżą pożywką składającą się z czterech części DME M1, części pożywki 1 99 oraz 10% surowicy cielęcej. Przygotuj również opakowania izotropowe. Wysiej komórki PA trzy 17 na płytkę sześciodołkową w ilości około 400 000 komórek PA trzy 17 na dołek.Po 12 godzinach zebrać supernatant zawierający wirusa z hodowli komórek Phoenix tropic i przefiltrować go przez filtr 0,45 mikrona. Następnie użyć 1 ml supernatantu do zainfekowania komórek PA three 17 i inkubować je przez noc. Następnego dnia, gdy komórki osiągną niemal pełną konfluencję, wyselekcjonować linię komórkową produkującą wirusa z komórek PA three 17 poprzez dodanie do pożywki antybiotyków w stężeniu 0,5 mg/ml, a następnie trzykrotnie zebrać supernatant z komórek w odstępach 12 godzin.Filtruj zawiesiny po każdym zbiorze. Filtrat stanowi roboczy nadsącz wirusowy. Podziel go na aliquoty o objętości 1 ml.Odstaw kilka alikwotów do natychmiastowego użycia. Pozostałe alikwoty można przechowywać w temperaturze -80°C, jednak z każdym cyklem zamrażania i rozmrażania stracą one 50% wydajności. Należy pamiętać, że w trakcie całego procesu sprzęt, który miał kontakt z cząsteczkami wirusa, musi zostać przemyty wybielaczem przed wyrzuceniem do pojemnika na odpady.Aby trwale zmagazynować stabilną linię komórkową produkującą wirusa PA three 17, zamrozić komórki w 10% DMSO i 90% surowicy, a następnie przechowywać je w temperaturze -150 °C. Do każdego dołka z oczyszczonymi komórkami w płytce 6-dołkowej dodać 400 µL świeżo otrzymanego nadsączu wirusowego. Pozostawić dwa dołki bez wirusa jako kontrole.Inkubuj płytkę przez noc, a następnego dnia wymień pożywkę w każdej studience na 2,5 milliliters świeżej pożywki do mięśni. Pamiętaj, aby pożywkę i pipety zawierające cząsteczki wirusa wyrzucić do pojemnika z wybielaczem. Pozostaw komórki do inkubacji w świeżej pożywce do mięśni na trzy dni.Następnie przeprowadź selekcję komórek pod kątem oporności na antybiotyki, stosując 400 µg neomycyny/mL w przypadku infekcji CDK4 lub 300 µg hygromycyny/mL w przypadku infekcji ludzką odwrotną transkryptazą telomerazy przez okres jednego lub dwóch tygodni. Utrzymuj komórki w warunkach selekcyjnych do momentu, aż wszystkie komórki w studzienkach kontrolnych obumrą.Zawsze pasażuj komórki przed osiągnięciem przez nie pełnej konfluencji; nawet podczas selekcji, gdy osiągną 60 do 80% konfluencji, użyj 0,05% roztworu trypsyny EDTA do zebrania i pasażowania komórek. Przenieś komórki do szalek 10 cm z nową pożywką do mioblastów z antybiotykami. Początkowo wysiej komórki w bardzo niskiej gęstości, od 3 do 500 na szalkę 10 cm.Kultywuj komórki w tych szalkach przez około dwa tygodnie, aż pojawią się niewielkie kolonie składające się z 10 do 20 komórek. Odessij większość pożywki, pozostawiając jedynie cienką warstwę, aby zapobiec wysychaniu komórek. Następnie zanurz jedną stronę pierścienia do klonowania w silikonowym smarze próżniowym i nałóż pierścień na wybrany klon.Obrysuj okręgiem każdy wybrany klon w każdej obręczy. Dodaj kilka kropli roztworu trypsyny z EDTA. Gdy komórki przyjmą kulisty kształt, używając mikroskopu, ostrożnie odessij każdy skup komórek do końcówki pipety o pojemności 200 µL.Przenieś skupiska komórek do dołków najmniejszej dostępnej płytki wielodołkowej. Następnie powiększ każdą linię klonalną w razie potrzeby, aby zapobiec konfluencji. Stosując opisany protokół, wyizolowano komórki miogenne wraz z fibroblastami, komórkami adipogenicznymi oraz prawdopodobnie komórkami odpornościowymi, a następnie oczyszczono je metodą FACS.Następnie komórki uniesmiertelniono zgodnie z opisem, wykorzystując wirusy wykazujące ekspresję kinazy zależnej od cyklin 4, CDK4, oraz ludzkiej odwrotnej transkryptazy telomerazy hTERT. Kluczowe było utrzymanie gęstości hodowli w naczyniach poniżej poziomu pełnego zрастаcia (confluency) na każdym etapie, aby zapobiec wejściu komórek w program różnicowania i tworzeniu miotubul. Porównano tworzenie i skurcze miotubul w nieuniesmiertelnionych komórkach kontrolnych oraz w komórkach uniesmiertelnionych. Nie stwierdzono żadnych różnic.Unieruchomienie linii komórkowej potwierdzono poprzez pomiar długości telomerów oraz ich aktywności. Unieruchomienie było widoczne również na krzywych wzrostu komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak dysocjować pierwotne komórki mięśniowe z biopsji pacjenta.Unieruchom pierwotne mioblasty, a następnie wyizoluj i wyselekcjonuj unieruchomione klony miogenne. Należy pamiętać, że praca z wirusem wymaga użycia specjalistycznej komory do hodowli tkanek oraz bezpiecznego systemu wentylacyjnego. Ponadto wszystkie elementy wykorzystywane przy manipulacjach z wirusem, takie jak pipety, końcówki, szalki, strzykawki i filtry, muszą zostać poddane działaniu podchlorynu sodu, aby uniknąć niepożądanej kontaminacji.Cząsteczki wirusowe mogą być niebezpieczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności.

isolation-immortalization-patient-derived-cell-lines-from-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Izolacja i uwiecznienie linii komórkowych pochodzących od pacjenta z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.

Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych.  hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj izolację i unieśmiertelnienie komórek mięśniowych z biopsji pacjentów przy użyciu FACS oraz wirusa CDK4 i hTERT. Ta metoda umożliwia nieograniczoną ekspansję komórek do badań nad chorobami mięśni.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Przeglądaj więcej filmów