Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie oczyszczonych komórek mięśniowych z biopsji mięśni ludzkiego pacjenta i unieśmiertelnienie ich do dalszych badań. Osiąga się to poprzez pierwsze zważenie, rozdrobnienie i strawienie pobranej tkanki w celu dysocjacji komórek jednojądrzastych. W drugim kroku komórki miogenne są oczyszczane z komórek niemiogennych na podstawie faktów.

Następnie komórki miogenne są infekowane zarówno CDK cztery, jak i H turt w celu wytworzenia unieśmiertelnionych komórek. Wyniki pokazują, że żywe komórki mięśniowe pochodzące od pacjentów mogą być rozszerzane przez kilka pasaży i różnicowane na podstawie testów fuzji komórek, obecności drgających rurki mięśniowej i ekspresji markerów miogennych. Implikacje tej techniki wykraczają poza diagnostykę chorób mięśni, ponieważ może ona potencjalnie dostarczyć nieograniczoną liczbę komórek miogennych do badań przesiewowych leków lub innych dalszych zastosowań, w których wymagana jest duża liczba komórek.

Będę demonstrował tę procedurę wraz z Jerome Robbinem, doktorem habilitowanym z laboratorium dr Woody'ego Wrighta w Dallas. Zacznij od dysocjacji biopsji mięśni, aby oczyścić komórki miogenne. Najpierw w kapturze bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej zapisz masę biopsji mięśnia.

Następnie w 10-centymetrowym naczyniu użyj sterylnych skalpeli, aby zmielić tkankę na drobno posiekane kawałki. Dodaj kilka kropli jednego X-H-B-S-S, aby tkanka nie wysychała na gram tkanki. Dodaj 3,5 mililitra pasty krążkowej dwa i 3,5 mililitra roztworów kolagenazy D.

Następnie wymieszaj komórki za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów i przenoś płytkę do inkubatora co 15 minut. Wymieszaj komórki za pomocą pięciomililitrowej pipety w ciągu 90 minut. Powinna nastąpić całkowita dysocjacja tkanek.

Po dysocjacji tkanki dodaj dwie objętości pożywki wzrostowej i przefiltruj ją przez sitko o wielkości 100 mikronów. Zebrać filtrat w probówce o pojemności 50 mililitrów. Osadzać komórki z filtratu o stężeniu 329 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie ponownie zawieś komórki w HBSS za pomocą 0,5% BS, A i policz je. Dostosuj głośność, aby uzyskać 1 milion komórek na 100 mikrolitrów. Odłóż na bok podwielokrotność 250 000 komórek jako niebarwioną kontrolę i odłóż dwie podobne podwielokrotności do kontroli pojedynczego barwienia.

Wszystkie te elementy są wymagane do analizy faksu. Teraz wybarwić komórki pięcioma mikrolitrami przeciwciała anty CD 56 na milion komórek i inkubować wszystkie próbki na lodzie przez pół godziny. Następnie szybko umyj próbki 10 mililitrami HBSS.

Następnie osadzaj komórki jak poprzednio, ale w temperaturze czterech stopni Celsjusza po granulowaniu komórek, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórek w jednym X-H-B-S-S przy 5 milionach komórek na mililitr. Następnie dodaj jodek propidyny do końcowego stężenia jednego mikrograma na mililitr. Teraz oczyść miogenne komórki CD 56 dodatnie z komórek niemiogennych, korzystając z faktów podążających za płytką oczyszczającą.

Komórki miogenne w ilości 50 000 na studzienkę na sześciodołkowych płytkach pokrytych 0,1% kulturą żelatyny, komórki do momentu ich przyłączenia, a następnie infekują je wirusem, aby linia komórkowa była nieśmiertelna. W protokole tekstowym znajduje się dodatkowy przegląd sposobu oczyszczania i hodowli fibroblastów skóry zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować komórki tropiku feniksa po inkubacji komórek tropikalnych feniksa przez noc za pomocą mieszaniny plazmidu PolyJet.

Podawaj komórki świeżemu, pożywce, składającej się z czterech części DME M1, części pożywki, 1 99 i 10% surowicy cielęcej. Przygotuj również opakowanie inotropowe. PA trzy 17 komórek w sześciodołkowej płytce z około 400 000 PA trzy 17 komórek na studzienkę.

12 godzin później zbierz wirus zawierający supernatant nad komórkami zwrotnika Phoenix i przepuść go przez filtr 0,45 mikrona. Następnie użyj jednego mililitra supernatantu do zainfekowania PA trzech 17 komórek i hoduj je przez noc. Następnego dnia wybierz linię komórkową produkującą wirusa z PA trzy 17 komórek, stosując antybiotyki w dawce 0,5 miligrama na mililitr do pożywki, gdy komórki są bliskie równopłynności, zbierz supernatant z komórek trzy razy w odstępach 12-godzinnych.

Filtruj kolekcje po każdym zbiorze. Przesącz jest działającym supernatantem wirusowym. Podziel to na jeden mililitr. Podwielokrotności.

Odłóż na bok kilka porcji do natychmiastowego użycia. Dodatkowe porcje mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, ale będą tracić 50% wydajności z każdym cyklem zamrażania i rozmrażania. Należy pamiętać, że w trakcie całego procesu sprzęt, który miał kontakt z cząsteczkami wirusa, musi zostać umyty wybielaczem, zanim zostanie wyrzucony do kosza na śmieci.

Aby trwale przechowywać stabilną linię komórkową wytwarzającą wirusa PA three 17, zamroź komórki w 10% DMSO 90% surowicy i przechowuj je w temperaturze minus 150 stopni Celsjusza do każdej studzienki komórek oczyszczonych faksem. Do płytki sześciodołkowej dodać 400 mikrolitrów świeżo wyprodukowanego supernatantu wirusowego. Pozostaw dwie studzienki bez wirusa jako kontrolę.

Inkubuj płytkę przez noc, a następnego dnia zmień podłoże w każdym dołku na 2,5 mililitra świeżego podłoża mięśniowego. Pamiętaj, aby wyrzucić media i pipety zawierające cząsteczki wirusa do pojemnika z wybielaczem. Pozwól komórkom inkubować się w świeżym pożywce mięśniowej przez trzy dni.

Następnie wybierz komórki pod kątem oporności na antybiotyki, używając 400 mikrogramów neomycyny na mililitr w przypadku infekcji CDK four lub 300 mikrogramów higromycyny na mililitr w przypadku ludzkiej telomerazy. Zakażenie odwrotną transkryptazą przez tydzień lub dwa. Utrzymuj komórki w warunkach selektywnych, aż wszystkie komórki i studzienki kontrolne będą martwe.

Zawsze przechodź komórki, zanim staną się zlewne, nawet podczas selekcji, gdy osiągną płynność od 60 do 80%, użyj 0,05% roztworu EDTA, aby zebrać i przekazać komórki. Przełóż komórki do 10-centymetrowych szalek ze świeżymi mioblastami, pożywką z antybiotykami. Najpierw wysiewaj komórki w bardzo niskiej gęstości od trzech do 500 na 10-centymetrową płytkę.

Utrzymuj komórki w tych naczyniach przez około dwa tygodnie, aż utworzą się małe kolonie składające się z 10 do 20 komórek, gdy małe kolonie będą widoczne. Usuń większość pożywki, pozostawiając tylko cienką warstwę nośnika, aby zapobiec wysychaniu komórek. Teraz zanurz jedną stronę pierścienia klonującego w silikonowym smarze próżniowym, a pierścień na żądanym klonie.

Umieść inny pierścień wokół każdego żądanego klonu w każdym pierścieniu. Dodaj kilka kropli roztworu EDTA trypsyny. Gdy komórki się zaokrąglą, użyj mikroskopu, aby ostrożnie zassać każdą kulkę komórek do końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Przenieść kulki komórkowe do studzienek na najmniejszej dostępnej płytce wielodołkowej. Następnie rozwiń każdy klon zgodnie z potrzebami, aby zapobiec płynności. Korzystając z opisanego protokołu, komórki miogenne zostały wyizolowane wraz z fibroblastami, komórkami adipogennymi i prawdopodobnie komórkami odpornościowymi, a następnie oczyszczone na podstawie faktów.

Komórki zostały następnie unieśmiertelnione zgodnie z opisem przy użyciu wirusów eksprymujących kinazę zależną od cykliny czwartą, CDK czwartą i ludzką odwrotną transkryptazę telomerazy h turt. Kluczowe było utrzymanie naczyń poniżej płynności komilicznej na każdym kroku, ponieważ mogły one wejść do programu różnicowania i utworzyć rurki myo, porównując tworzenie i kurczenie się rurki myo w nieunieśmiertelnionych komórkach kontrolnych i komórkach unieśmiertelnionych. Nie zaobserwowano żadnych różnic.

Nieśmiertelność linii komórkowej potwierdzono mierząc długość telomerów i aktywność telomerów. Nieśmiertelność była również widoczna na podstawie krzywych wzrostu komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić pierwotne komórki mięśniowe od biopsji pacjenta.

Unieśmiertelnij pierwotny mioblast oraz wyizoluj i wybierz unieśmiertelnione klony miogenne. Nie zapominaj, że praca z wirusem wymaga użycia specjalnej hodowli tkankowej i bezpiecznego systemu wentylacji. Ponadto wszystko, co jest związane z manipulacją wirusem, takie jak pipety, końcówki, naczynia, strzykawki i filtry, musi zostać wybielone, aby uniknąć niepożądanego zanieczyszczenia.

Cząsteczki wirusa mogą być niebezpieczne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.