Name: Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji funkcjonalnej zakończeń nerwowych w jelicie grubym myszy przy użyciu rejestracji jednowłóknowych. Technika ta pozwala klasyfikować mechanoczułe zakończenia i badać odpowiedzi na bodźce chemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wspierane przez nagrodę NIH R01 DK093525 (GFG). Bardzo doceniamy naukową recenzję i redakcję gramatyczną manuskryptu przez dr Amber Shaffer (University of Pittsburgh) i dziękujemy Michaelowi Burchamowi za pomoc w przygotowaniu rycin.

UWAGA: Ten protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu.
1. Przygotowanie zmodyfikowanego roztworu Krebsa i testowanych dawek leków
<ol>
	<li>Przygotować 6 l zmodyfikowanego roztworu Krebsa, który zawiera (w mM): 117,9 NaCl, 4,7 KCl, 25 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1,2 MgSO4, 2,5 CaCl2, 11,1 D-glukozy, 2 maślan sodu, 20 octan sodu, 0,004 nifedypina (w celu blokowania spontanicznych skurczów mięśni) i 0,003 indometacyny (w celu zablokowania syntezy endogennych prostaglandyn). Użyj lodowatych i ciepłych roztworów Krebsa odpowiednio do preparacji tkanek i zapisu pojedynczego włókna.</li>
	<li>Przygotować dowolne roztwory chemiczne (np. IS, kapsaicyna, ATP) w podwielokrotnościach w pożądanych stężeniach.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie tkanki jelita grubego
<ol>
	<li>Znieczulić i poddać eutanazji samce myszy (6-8 tygodni, 20-30 g) w komorze CO2 przy natężeniu przepływu, które przemieszcza 10-30% objętości komory na minutę, aż myszy całkowicie przestaną oddychać, na co wskazuje brak ruchu klatki piersiowej.</li>
	<li>Bezpośrednio po eutanazji wykrwawić się, rozcinając komorę piersiową, perforując prawy przedsionek i zanurzając tuszę myszy w dużej objętości (~500 ml) lodowatego roztworu Krebsa (4 °C) z bąbelkami karbogenu (95% O2, 5% CO2).</li>
	<li>Ostrożnie usuń wszystkie wnętrzności z wyjątkiem okrężnicy i narządów miednicy. Przeciąć mysz na pół przez segment rdzenia T12 nieco powyżej przepony piersiowej i przenieść połowę ogonową do komory preparacyjnej zawierającej lodowaty, bąbelkowy roztwór Krebsa.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym usuń pęcherz moczowy i narządy rozrodcze, przecinając je na ich połączeniach z cewką moczową, a następnie usuń aortę zstępującą/brzuszną, aż rozwidleje się na wspólne tętnice biodrowe. Uwolnij PN lub LSN od otaczających je tkanek przez rozwarstwienie i podążaj za nerwem od zewnątrz grzebienia biodrowego aż do jego brzusznego punktu wejścia do kręgosłupa L6 i S1 (dla PN) lub kręgosłupa T13 i L1 (dla LSN).</li>
	<li>Przetnij spojenie łonowe oraz prawy i lewy staw panewki i usuń kość biodrową. Ostrożnie uwolnij PN lub LSN z przyczepionego mięśnia i tkanki łącznej z okolic jelita grubego aż do miejsca, w którym nerw wchodzi do kręgosłupa.</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć kość biodrową, aby odsłonić dystalną część jelita grubego. Wypreparuj dystalną część jelita grubego z dołączonym PN lub LSN w ciągłości.</li>
	<li>Przenieś jelito grube z nerwem przyczepionym do komory kąpielowej komory tkankowej. Usuń nadmiar tkanki łącznej poprzez dalszą sekcję i otwórz jelito grube wzdłużnie wzdłuż granicy antykrezkowej.</li>
	<li>Stroną błony śluzowej skierowaną do góry, przypiąć krezkową krawędź jelita grubego przylegającą do komory zapisu w silikonowej podstawie komory i przymocować antykrezkową długość jelita grubego do grabi haczyków połączonych z siłownikiem siłowym (zilustrowanym na rysunku 1 i sfotografowanym na rysunku 2A).</li>
	<li>Wysuń PN lub LSN do komory nagrywania, która jest połączona z komorą wanny za pomocą otworu na mysz i bramki. Delikatnie połóż pień nerwowy na małym szklanym lusterku w komorze nagrywania, które zapewnia hydrofilową powierzchnię, do której nerw może przylegać. Komorę kąpielową przelać ciepłym (30 - 32 °C), natlenionym roztworem Krebsa i napełnić komorę nagrywania olejem mineralnym.</li>
</ol>
3. Zapis i lokalizacja pola recepcyjnego za pomocą jednego włókna
<ol>
	<li>Ostrożnie odklej epineurium (osłonkę nerwową) od PN lub LSN pod mikroskopem stereoskopowym przy dużym powiększeniu (50 - 60X). Za pomocą cienkich kleszczy rozdziel pień nerwowy na 5 - 8 wiązek nerwowych o grubości ~100 μm.</li>
	<li>Umieścić platynowo-irydową elektrodę odniesienia w kontakcie z roztworem Krebsa w komorze tkankowej. Kolejno umieść poszczególne wiązki nerwowe na elektrodzie rejestrującej wykonanej z tego samego materiału.</li>
	<li>Użyj miękkiego pędzla, aby wywołać AP z aferentów jelita grubego, delikatnie głaszcząc powierzchnię jelita grubego w górę iw dół. Zlokalizuj wiązki nerwowe, które unerwiają okrężnicę, za pomocą wykrywalnych zapisów AP (potencjału czynnościowego). 
	UWAGA: PN i LSN unerwiają również pęcherz moczowy i inne narządy miednicy.</li>
	<li>Użyj pary końcówek igieł 30 G, aby dalej podzielić wiązkę nerwową na drobne włókna pęczkowe o grubości ~10 μm i umieść pojedynczy filament na elektrodzie rejestrującej.</li>
	<li>Umieść koncentryczną elektrodę z okrągłą końcówką prostopadle do powierzchni błony śluzowej, aby elektrycznie wzbudzić zakończenia aferentne przy ponadprogowej intensywności bodźca (wielkość 10 mA, czas trwania 0,5 ms @ 0,3 Hz), co powoduje promień rozchodzenia się prądu ~2 mm. Przesuwaj elektrodę systematycznie (co ~1,5 mm) wzdłuż długości i szerokości spłaszczonego jelita grubego, aby zlokalizować zakończenia receptywne.</li>
	<li>Gdy zakończenie aferentne jest wzbudzone, dostosuj położenie elektrody, aby wskazać miejsce aktywacji (pole recepcyjne, RF), które wymaga minimalnej intensywności bodźca (próg bodźca). Odrzuć zakończenia z progiem bodźca >3 mA19.</li>
	<li>Oblicz prędkość przewodzenia (CV) z 1) odległości między elektrodą stymulującą w polu recepcyjnym (RF) a miejscem rejestracji oraz 2) opóźnienia przewodzenia (np. Rysunek 2B) między artefaktem bodźca a początkiem potencjału czynnościowego. 
	CV (m/s) = odległość (mm) / opóźnienie przewodzenia (ms).</li>
</ol>
4. Klasyfikacja funkcjonalna mechanowrażliwych barwników jelita grubego
<ol>
	<li>Po zlokalizowaniu RF za pomocą stymulacji elektrycznej, zastosuj następujące trzy bodźce mechaniczne do RF:
	<ol>
		<li>Przeprowadź bodziec sondujący, naciskając końcówkę skalibrowanej żyłki nylonowej podobnej do von Freya (siła 0,4 i 1 g) prostopadle w kierunku RF na spłaszczonym jelitie grubym.</li>
		<li>Przeprowadź bodziec głaszczenia, delikatnie głaszcząc błonę śluzową jelita grubego cienkim nylonowym pasmem włókien (siła 10 mg), aby wytworzyć niewielkie powierzchniowe naprężenie ścinające przy RF.</li>
		<li>Przeprowadzić rozciąganie obwodowe za pomocą sterowanego komputerowo siłownika siły, który dostarcza narastającą siłę rozciągającą (0 - 170 mN przy 5 mN/s) w kierunku obwodowym wzdłuż krawędzi przeciwkrezkowej jelita grubego za pomocą nachylenia haczyków opisanych w kroku 2.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klasyfikuj aferenty jako surowicze (reagują tylko na sondowanie), błony śluzowe (reagują na głaskanie błony śluzowej i sondowanie), mięśniowe (reagują na rozciąganie obwodowe i sondowanie), mięśniowe/śluzówkowe (reagują na rozciąganie obwodowe, głaskanie błony śluzowej i sondowanie) lub MIA (nie reagują na żaden z trzech bodźców mechanicznych).</li>
	<li>W przypadku aferentów krezkowych (tylko w unerwieniu LSN), które są trudne do selektywnej aktywacji przez stymulację elektryczną, zlokalizuj ich końce receptywne poprzez mechaniczne głaskanie/sondowanie krezki.</li>
	<li>W przypadku aferentów wrażliwych na rozciąganie (mięśniowych i mięśniowo-śluzówkowych) określ próg odpowiedzi, który definiuje się jako siłę, która wywołuje pierwsze AP podczas rozciągania rampowego.</li>
	<li>W przypadku aferentów surowiczych należy zarejestrować ich reakcje na rosnące poziomy punktowego sondowania pola recepcyjnego napędzanego przez sterowany komputerowo siłownik siły.</li>
</ol>
5. Chemiczne zastosowanie/modulacja zakończeń receptywnych
<ol>
	<li>Zapisz wyjściową odpowiedź na bodziec mechaniczny (tj. odpowiedź na stopniowane rozciąganie, punktowe sondowanie lub głaskanie błony śluzowej).</li>
	<li>Pokryj dolną krawędź kawałka rurki (mosiężnej lub ze stali nierdzewnej, o wysokości 10 mm i 4 x 4mm2 kwadratowej lub średnicy 4 - 5 mm) wazeliną i umieść ją nad polem recepcyjnym na jelitie grubym.</li>
	<li>Usunąć roztwór Krebsa z wnętrza rurki i wystawić końcówkę receptywną na 3 - 5 minut do 170 μl roztworu zawierającego badaną substancję chemiczną</li>.
	<li>Monitoruj reakcję aferentu podczas aplikacji chemicznej (niektóre aferenty są wrażliwe na chemoterapię).</li>
	<li>Usuń roztwór chemiczny i rurkę, aby zakończyć działanie substancji chemicznej. W ciągu 4 - 6 minut przetestuj odpowiedź aferentną na ten sam bodziec mechaniczny, co w odpowiedzi wyjściowej.</li>
	<li>Ponownie nałóż bodziec mechaniczny po odpowiednim czasie wymywania (>15 min).</li>
</ol>
6. Nagrywanie i dyskryminowanie skoków AP
<ol>
	<li>Digitalizacja sygnałów elektrycznych zarejestrowanych z aksonów o częstotliwości 20 kHz i zapisywanie danych w komputerze. Monitoruj sygnał on-line za pomocą monitora audio.</li>
	<li>Analizuj skoki AP w trybie off-line i rozróżniaj pojedyncze jednostki na podstawie analizy głównych składowych poszczególnych przebiegów szczytów25. 
	UWAGA: Jeden rekord nie powinien zawierać więcej niż dwie łatwe do odróżnienia aktywne jednostki.</li>
</ol>

<ol><li>Naliboff, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+two+distinct+perceptual+alterations+in+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome.</a> Gut. 41, 505-512 (1997).</li>
<li>Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+visceral+and+cutaneous+hyperalgesia+by+local+rectal+anesthesia+in+irritable+bowel+syndrome+%28IBS%29+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients.</a> Pain. 105, 223-230 (2003).</li>
<li>Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarectal+lidocaine+is+an+effective+treatment+for+abdominal+pain+associated+with+diarrhea-predominant+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome.</a> Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).</li>
<li>Chey, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linaclotide+for+irritable+bowel+syndrome+with+constipation%3A+a+26-week%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial+to+evaluate+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+12-week%2C+randomized%2C+controlled+trial+with+a+4-week+randomized+withdrawal+period+to+evaluate+the+efficacy+and+safety+of+linaclotide+in+irritable+bowel+syndrome+with+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).</li>
<li>Busby, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+properties%2C+metabolism%2C+and+disposition+of+linaclotide%2C+a+novel+therapeutic+peptide+approved+for+the+treatment+of+irritable+bowel+syndrome+with+constipation+and+chronic+idiopathic+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).</li>
<li>Mei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intestinal chemosensitivity.</a> Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).</li>
<li>Mei, N., Lucchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+data+and+ideas+on+digestive+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Current data and ideas on digestive sensitivity.</a> J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).</li>
<li>Su, X., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat+are+polymodal+in+character%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character.</a> J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).</li>
<li>McMahon, S. B., Morrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+neurones+with+long+projections+activated+from+the+abdominal+viscera+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat.</a> J Physiol. 322, 1-20 (1982).</li>
<li>Cervero, F., Sann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+evoked+responses+of+afferent+fibres+innervating+the+guinea-pig%27s+ureter%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study.</a> J Physiol. 412, 245-266 (1989).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+properties+of+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+urinary+bladder+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat.</a> J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat.</a> J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).</li>
<li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+unmyelinated+afferent+fibres+by+mechanical+stimuli+and+inflammation+of+the+urinary+bladder+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat.</a> J Physiol. 425, 545-562 (1990).</li>
<li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+unmyelinated+chemosensitive+nociceptor+in+the+acutely+inflamed+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder.</a> Agents Actions. 25, 219-221 (1988).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).</li>
<li>Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+insensitive+afferents+%28MIAs%29+in+cutaneous+nerves+of+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey.</a> Brain Res. 561, 252-261 (1991).</li>
<li>Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unresponsive+afferent+nerve+fibres+in+the+sural+nerve+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat.</a> J Physiol. 435, 229-242 (1991).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).</li>
<li>Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irritable+bowel+syndrome%3A+methods%2C+mechanisms%2C+and+pathophysiology.+Neural+and+neuro-immune+mechanisms+of+visceral+hypersensitivity+in+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+sensitization+of+mechanosensitive+and+-insensitive+afferents+in+mice+with+persistent+colorectal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+colorectal+afferent+function+associated+with+TNBS-induced+visceral+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).</li>
<li>Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+stretch-sensitive+pelvic+nerve+afferents+innervating+mouse+distal+colon+and+rectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).</li>
<li>Jolliffe, I. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJolliffe%2C+IT+%22Principal+component+analysis%22">Principal component analysis</a>. , 2nd, Springer. New York, NY. (2002).</li>
<li>La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+hypertonicity+and+acidity+modulate+colorectal+afferents+and+induce+persistent+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).</li>
<li>Christianson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plasticity+and+modulation+of+visceral+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">plasticity and modulation of visceral afferents.</a> Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).</li>
<li>Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+genetic+and+pharmacological+inhibition+of+TRPV1+and+P2X3+attenuates+colorectal+hypersensitivity+and+afferent+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).</li>
<li>Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystitis+increases+colorectal+afferent+sensitivity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).</li>
<li>Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+P2X+receptor+contributions+to+colon+mechanosensitivity+and+hypersensitivity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse.</a> Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+visceral+hypersensitivity+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+family+receptor+%CE%B1-3+in+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj preparat do badania nerwów jelita grubego in vitro okazał się skutecznym podejściem do badania funkcji kodowania neuronalnego poszczególnych aferentów jelita grubego, które ładnie uzupełnia inne podejścia niefunkcjonalne (np. badania komórkowe, molekularne i histologiczne) na trzewnych neuronach czuciowych (szczegóły w przeglądzie 27 ). Ujawniono mechanizmy neuronalne przyczyniające się do nocycepcji i długotrwałej nadwrażliwości jelita grubego oraz przeprowadzono manipulacje fa...

Ból i nadwrażliwość są głównymi dolegliwościami pacjentów cierpiących na funkcjonalne zaburzenia żołądkowo-jelitowe, w tym zespół jelita drażliwego (IBS), które występują przy braku widocznej przyczyny patobiologicznej lub uszkodzenia tkanki. Na przykład pacjenci z IBS wykazują nadwrażliwość, w tym zwiększoną reakcję na rozdęcie balonu doodbytniczego i zwiększoną wrażliwość podczas normalnej pracy jelit, a także nadwrażliwość na skierowanie somatyczne (tj. tkliwość na badanie palpacyjne okolicy brzucha)1. Ponieważ celowanie w aferenty jelita grubego okazało się skuteczne w łagodzeniu bólu i nadwrażliwości u pacjentów z IBS (np. doodbytnicze wkraplanie środków miejscowo znieczulających2,3; doustne przyjmowanie agonisty cyklazy guanylanowej-C linaklotydu4-6), ważne jest lepsze zrozumienie aferentnego unerwienia jelita grubego.
Aferenty trzewne, w tym aferenty jelita grubego, są zdolne do reagowania na modalności chemiczne/odżywcze i termiczne (np. 7-9). Jednak aferenty trzewne reagujące na bodźce mechaniczne (tj. aferenty mechanowrażliwe) zostały najdokładniej przebadane, ponieważ bodźce mechaniczne (np. wzdęcia światła, rozciąganie) to te, które na ogół wywołują świadome odczucia, w tym dyskomfort i ból10-16. Ponadto wnętrzności są również unerwione przez niewrażliwe mechanicznie aferenty (MIA), powszechnie nazywane cichymi lub śpiącymi nocyceptorami17. W normalnych warunkach fizjologicznych MIA nie reagują na stymulację mechaniczną lub mają bardzo wysokie progi odpowiedzi18, ale mogą stać się aktywne i nabywać mechanowrażliwość w stanach patofizjologicznych i przyczyniać się do nadwrażliwości.
Korzystając z opisanego tutaj preparatu i protokołu in vitro, opracowaliśmy i zastosowaliśmy strategię bodźca elektrycznego do poszukiwania receptywnych zakończeń, umożliwiając bezstronną identyfikację zarówno zakończeń mechanowrażliwych, jak i MIA w jelitu grubym19. Unerwienie jelita grubego wywodzi się ze szlaków lędźwiowych splanchnicznych (LSN) i nerwów miednicznych (PN) i obejmuje aferenty jelita grubego, które można podzielić na pięć klas mechanowrażliwych (surowicze, śluzówkowe, mięśniowe, mięśniowo-śluzówkowe, krezkowe) i jedną MIA klasy20. Korzystając z tego preparatu in vitro, stwierdziliśmy, że MIA jelita grubego nabyły mechanowrażliwość (uczulają) po krótkiej ekspozycji ich pól recepcyjnych na zupę zapalną (IS), która uwrażliwiała 71% MIA w szlaku PN i 23% MIA w szlaku LSN19. Udokumentowaliśmy również długoterminowe uczulenie (do 28 dni) na MIA w kontekście długotrwałej behawioralnej nadwrażliwości trzewnej (tj. u myszy otrzymujących leczenie wewnątrzokrężnicowe zymosanem21 lub kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS)22).
Wśród aferentów mechanowrażliwych, aferenty mięśniowe i mięśniowo-śluzówkowe są jedynymi klasami, które tonicznie kodują obwodowe rozciągnięcie jelita grubego (tj. są wrażliwe na rozciąganie) i służą kodowaniu szkodliwego rozdęcia jelita grubego23,24. Za pomocą sterowanego komputerowo siłownika siły zastosowaliśmy standardowe, jednorodne i powtarzalne rozciąganie narastające w kierunku obwodowym spłaszczonej tkanki jelita grubego, a następnie sklasyfikowaliśmy wrażliwe na rozciąganie aferenty jako niskoprogowe i wysokoprogowe23. Ponadto przebieg w czasie uczulenia wrażliwych na rozciąganie aferentów po leczeniu zymosanem21 lub TNBS22 dojelitowym odpowiada wystąpieniu, utrzymywaniu się i/lub wyzdrowieniu behawioralnej nadwrażliwości trzewnej, co sugeruje rolę wrażliwych na rozciąganie aferentów jelita grubego w bólu trzewnym i nadwrażliwości.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Leica MZ16</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat Leica IC D Leica</td><td>Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Niskoszumowy wzmacniacz różnicowy</td></tr><tr><td>Dwukomorowa komora tkankowa</td><td>Wykonane</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Akwizycja danych, wejście/wyjście sygnału analogowego</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Pakiet oprogramowania współpracujący z monitorem audio Power1401</td></tr><tr><td></td><td>Natus</td><td>Am </td><td></td>8</tr><tr><td>Stymulator impulsów kwadratowych</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>Do dostarczania bodźców elektrycznych</td></tr><tr><td>Jednostka izolacji fotoelektrycznej</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Izolacja bodźca w celu redukcji hałasu</td></tr><tr><td>Koncentryczna mikroelektroda bipolarna</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>Do dostarczania bodźców elektrycznych</td></tr><tr><td>System dźwigni w dwóch trybach</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Seria 300C</td><td>Do dostarczania bodźców mechanicznych</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Kleszcze z cienkimi końcówkami</td></tr></tbody></table>

metody in vitro charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Ten film szczegółowo demonstruje protokół zapisu elektrofizjologicznego in vitro z pojedynczym włóknem przy użyciu preparatu nerwu jelita grubego u myszy. Podejście to pozwala na bezstronną identyfikację i funkcjonalną charakterystykę poszczególnych aferentów jelita grubego. Zewnątrzkomórkowe zapisy propagowanych potencjałów czynnościowych (AP), które pochodzą z jednego lub kilku aferentnych (tj. jednowłóknowych) pól recepcyjnych (RF) w jelitie grubym, są wykonane z drażnionych pęczków włókien nerwowych. Jelito grube jest usuwane z przyczepionym nerwem miednicznym (PN) lub lędźwiowym (LSN) i otwartym wzdłużnie. Tkankę umieszcza się w komorze rejestracyjnej, przypina na płasko i perfunduje natlenionym roztworem Krebsa. Ogniskowa stymulacja elektryczna służy do zlokalizowania zakończeń aferentnych jelita grubego, które są dalej testowane za pomocą trzech różnych bodźców mechanicznych (sondowanie, głaskanie błony śluzowej i rozciąganie obwodowe) w celu funkcjonalnej kategoryzacji aferentów do pięciu klas mechanowrażliwych. Zakończenia nie reagujące na żaden z tych bodźców mechanicznych są klasyfikowane jako aferenty niewrażliwe mechanicznie (MIA). Zarówno mechanowrażliwe, jak i MIA mogą być oceniane pod kątem uczulenia (tj. wzmocnionej odpowiedzi, obniżonego progu i / lub nabycia mechanowrażliwości) poprzez miejscową ekspozycję RF na chemikalia (np. zupę zapalną (IS), kapsaicynę, adenozynotrójfosforan (ATP)). Opisujemy sprzęt i przygotowanie do zapisu jelita grubego, pobieranie jelita grubego z dołączonym PN lub LSN, identyfikację RF w jelicie grubym, zapis jednowłóknisty z pęczków nerwowych oraz miejscowe zastosowanie chemikaliów do RF. Ponadto omówiono również wyzwania związane z przygotowaniem i zastosowaniem standaryzowanej stymulacji mechanicznej.

Układ przedstawiono na Rysunku 1. Obejmuje on wykonaną na zamówienie komorę tkankową, w której jelito grube znajduje się w przedziale kąpieli wyłożonym silikonem, a dołączony nerw w sąsiednim przedziale wypełnionym olejem mineralnym. Dwuprzedziałowa komora została wykonana z litego bloku tworzywa akrylowego za pomocą maszyny CNC; dno obu przedziałów zostało następnie wyłożone twardym silikonem, aby umożliwić łatwe przypięcie tkanki jelita grubego. Pozakomórkowe potencjały czynnościowe (AP) z rozdzielonyc...

Ten film demonstruje protokół przeprowadzania jednowłóknistych zapisów elektrofizjologicznych na preparacie in vitro mysiego nerwu jelita grubego.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest funkcjonalna charakterystyka zewnętrznych zakończeń nerwów doprowadzających w odbytnicy myszy in vitro. Osiąga się to poprzez pobranie odbytnicy oraz przymocowanego do niej pnia nerwu miednicznego lub lędźwiowego w sposób ciągły i umieszczenie tkanki w komorze rejestracyjnej in vitro. W drugim kroku pień nerwu miednicznego lub lędźwiowego zostaje rozdzielony na cienkie włókna, co umożliwia wykonanie elektrofizjologicznych pomiarów pojedynczych włókien z poszczególnych aksonów nerwowych. Następnie poszczególne zakończenia nerwów odbytnicy są identyfikowane poprzez bezstronną stymulację elektryczną pól receptorowych i klasyfikowane funkcjonalnie na podstawie profili odpowiedzi na trzy różne bodźce mechaniczne.Dodatkowo, odpowiedzi na substancje chemiczne w zakończeniach nerwowych można badać poprzez izolację pola recepcyjnego za pomocą mosiężnej rurki i zastąpienie roztworu roztworem zawierającym substancję chemiczną lub mieszaninę substancji chemicznych. Wyniki pokazują, że jelito grube myszy jest unerwione przez pięć różnych klas mechanosensywnych zakończeń. Ponadto około 25% zakończeń w jelicie grubym jest niewrażliwych mechanicznie lub s

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In vitro Charakterystyka funkcjonalna mysich nerwowych zakończeń aferentnych w kolorektalnym układzie nerwowym

Ten film demonstruje protokół wykonywania biopsji szczypty pod kontrolą kolonoskopu u myszy. Ta technika pomaga wizualnie analizować światło okrężnicy i pobierać próbki tkanek do szczegółowych badań.

Kolonoskopowa biopsja szczypty pod kontrolą w modelu mysim: technika wizualizacji i ekstrakcji próbek tkanek z okrężnicy myszy

W tym filmie opisujemy procedurę chirurgiczną polegającą na generowaniu pętli proksymalnej okrężnicy myszy lub segmentu pcLoop, po której następuje doświetlna iniekcja markerów fluorescencyjnych do segmentu w celu zbadania przepuszczalności nabłonka jelitowego.

Generowanie mysiego modelu pętli proksymalnej jelita grubego: procedura chirurgiczna mająca na celu wygenerowanie pętli proksymalnej jelita grubego i pomiar przepuszczalności jelit poprzez wykrycie markerów fluorescencyjnych w surowicy po wstrzyknięciu doświetlnym

Ten film demonstruje metodę rejestrowania aktywności nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczura ex-vivo, kaniulowanej na obu końcach i podawanej solą fizjologiczną w celu zwiększenia ciśnienia śródświetlnego. Wraz ze wzrostem ciśnienia sygnał nerwowy wzrasta, wskazując na jego stymulację.

Zapis elektrofizjologiczny nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczurzej okrężnicy

Ten film pokazuje proces rejestrowania sygnałów elektrycznych z krezkowych nerwów doprowadzających w wypreparowanym segmencie jelita czczego myszy w celu zbadania wpływu ciśnienia w tkance i zmian ruchu na aktywność nerwu doprowadzającego.

Zapis aktywności nerwu doprowadzającego krezki w segmencie jejunum myszy ex vivo

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

W ciągu ostatnich kilku lat, endoskopy nowej generacji stały się ważnymi diagnostycznymi pomocami badawczymi do oceny mysiego zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół endoskopowej oceny stanu zapalnego i guzów jelita grubego u myszy, a także nowatorski system punktacji, który wykorzystuje identyfikatory dziesiętne do dokumentowania endoskopowego nasilenia zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego.

Elastyczna kolonoskopia u myszy w celu oceny ciężkości zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego przy użyciu zwalidowanego systemu punktacji endoskopowej

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Ten artykuł opisuje technikę obrazowania wideo i mapowanie czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian w neuronalnej regulacji ruchliwości okrężnicy u dorosłych myszy. Subtelny wpływ na czynność przewodu pokarmowego (GI) można wykryć przy użyciu tego podejścia w izolowanych preparatach tkankowych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób przewodu pokarmowego.

Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

Nerwy doprowadzające krezkowe przekazują informacje z przewodu pokarmowego w kierunku mózgu dotyczące normalnej homeostazy, jak również patofizjologii. Aktywność nerwów doprowadzających przewodu pokarmowego można ocenić, montując izolowane segmenty jelita z przyczepionymi nerwami doprowadzającymi do kąpieli narządowej, izolując nerw i oceniając aktywność podstawową i stymulowaną.

In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy

Nieprawidłowa funkcja czuciowa leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit. Przedstawiono protokół elektrofizjologicznego zapisu nerwów doprowadzających okrężnicy w preparacie ex vivo jelita grubego szczura.

In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

Poznaj metodę charakteryzacji funkcjonalnej zakończeń nerwowych w jelicie grubym myszy przy użyciu rejestracji jednowłóknowych. Technika ta pozwala klasyfikować mechanoczułe zakończenia i badać odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Przeglądaj więcej filmów