Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest funkcjonalne scharakteryzowanie zewnętrznych zakończeń nerwowych doprowadzających w odbytnicy myszy in vitro. Osiąga się to poprzez pobranie jelita grubego i przyczepionego nerwu szyjnego miednicznego lub lędźwiowego Splunk w ciągłości i umieszczenie tkanki w komorze rejestracyjnej in vitro W drugim kroku pień nerwu szyjnego miednicy lub odcinka lędźwiowego Splunk jest dzielony na drobne włókna, dzięki czemu można wykonać zapisy elektrofizjologiczne pojedynczych włókien z poszczególnych aksonów nerwowych. Następnie poszczególne zakończenia nerwów jelita grubego są identyfikowane przez bezstronną stymulację elektryczną pól recepcyjnych i funkcjonalnie klasyfikowane na podstawie profili odpowiedzi na trzy różne bodźce mechaniczne.

Ponadto reakcje na substancje chemiczne stosowane do zakończeń nerwowych można przetestować, izolując pole recepcyjne kawałkiem mosiężnej rurki i zastępując roztwór roztworem zawierającym substancję chemiczną lub mieszaninę chemikaliów. Wyniki pokazują, że jelito grube myszy jest unerwione przez pięć różnych klas wrażliwych na mechanizm ens. Ponadto około 25% pacjentów jelita grubego to nocyceptory niewrażliwe mechanicznie lub ciche.

Ta metoda jest stosowana przez nas i innych do badania unerwienia czuciowego jelita grubego. Jesteśmy zainteresowani wykorzystaniem tego podejścia badawczego, ponieważ wiele zaburzeń żołądkowo-jelitowych wiąże się z uczuleniem lub zmianą pobudliwości unerwienia czuciowego. Nasze zainteresowanie zrozumieniem mechanizmów uczulenia wiąże się z naszym pragnieniem pomocy w opracowaniu strategii terapeutycznych, które mogą być przydatne do modulowania bólu i dyskomfortu, które są zwykle związane z tymi zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi, takimi jak zespół jelita drażliwego.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy rozwarstwiania tkanek i rozszczepienia nerwów są bardzo trudne do opanowania. Nerwy wprowadzają innowacje. Dystalna część jelita grubego może zostać łatwo uszkodzona podczas rozwarstwienia.

Dlatego staranna sekcja i etapy dzielenia są naprawdę kluczowe dla tych, którzy chcą powtórzyć ten eksperyment. Natychmiast po eutanazji myszy należy ją wykrwawić, rozciąć klatkę piersiową, przebić prawe przedsionek i zanurzyć tuszę myszy oraz około pół litra lodowatego roztworu Creb. Następnie ostrożnie usuń wszystkie wnętrzności z wyjątkiem okrężnicy i narządów miednicy.

Następnie należy przeciąć ciało myszy na poziomie około T 12 nieco powyżej przepony piersiowej i przenieść rozpieszczoną połowę ciała do komory rozwarstwiania zawierającej lodowaty roztwór pęcherzyków krwi. Pod stereoskopem usuń pęcherz moczowy i narządy rozrodcze, przecinając je na ich połączeniach z cewką moczową. Usuń również aortę zstępującą, aż rozwidleje się na wspólne tętnice biodrowe.

Teraz uwolnij nerwy szyjki miednicy lub lędźwiowej z otaczających tkanek. Podążaj za nerwami od zewnątrz grzebienia biodrowego do ich punktu wejścia do kręgosłupa. Nerwy miednicy wchodzą do L sześć i S jeden kręgosłup, a nerwy lędźwiowe deski wchodzą do T 13 i L jeden, co pokazano.

Oto rozwarstwienie lewego i prawego nerwu miednicznego. Następnie przeciąć syntezę łonową i przeciąć prawy i lewy staw panewki. Następnie usuń kość biodrową Po usunięciu biodra wypreparuj dystalną część jelita grubego z przyczepionym nerwem Wolny.

Nerw przyczepiony z otaczającego mięśnia i tkanki łącznej. Nerw jest podatny na uszkodzenia mechaniczne. Jesteśmy uwolnieni od otaczającej nas tkanki, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby nie ciągnąć ani nie szczypać nerwu.

Następnie przenieś jelito grube z przyczepionym nerwem do komory tkankowej. Otwórz jelito grube wzdłużnie wzdłuż granicy krezki i ustaw błonę śluzową jelita grubego stroną do góry. Następnie rozciągnij nerw do komory nagrywającej, która jest połączona z komorą wanny za pomocą otworu na mysz i bramki.

Umieść pień nerwu na małym szklanym lustrze. Lustro jest hydrofilowe i nerw będzie do niego przylegał. Teraz obok komory nagraniowej przypnij krezkową krawędź jelita grubego.

Teraz połącz komorę kąpielową ciepłym natlenionym roztworem Creb i napełnij komorę nagrywania olejem mineralnym, aby zakończyć konfigurację. Przymocuj długość przeciwkrezkową jelita grubego do grabi haczyków połączonych z siłownikiem siłowym pod mikroskopem stereoskopowym przy dużym powiększeniu. Ostrożnie odklej osłonkę nerwową od izolowanego nerwu szyjnego miednicy lub odcinka lędźwiowego za pomocą cienkich kleszczy.

Podziel pień nerwowy na pięć do ośmiu wiązek nerwowych, z których każdy ma grubość około 100 mikronów. Teraz umieść elektrodę referencyjną w kontakcie z roztworem Krebsa w komorze tkankowej. Następnie sekwencyjnie umieść poszczególne wiązki nerwowe na elektrodzie rejestrującej, aby wywołać potencjały czynnościowe z ensów jelita grubego.

Delikatnie pogłaszcz powierzchnię jelita grubego za pomocą miękkiego pędzla. W ten sposób zidentyfikuj wiązkę lub wiązki nerwowe, które unerwiają okrężnicę. Teraz używając pary końcówek igieł o rozmiarze 30, dalej podziel wiązkę nerwową na włókna o grubości 10 mikronów i umieść jedno z włókien na elektrodzie rejestrującej.

Ten krok wymaga wysokiego poziomu koordynacji wzrokowo-ruchowej i zręczności. Następnie, aby elektrycznie wzbudzić doprowadzające zakończenia nerwowe, ustaw okrągłą elektrodę koncentryczną prostopadłą do powierzchni błony śluzowej i stymuluj z intensywnością ponadprogową. W ten sposób powstaje prąd rozchodzący się w promieniu dwóch milimetrów.

Aby znaleźć zakończenia recepcyjne, przesuwaj elektrodę systematycznie w krokach co 1,5 milimetra wzdłuż długości i szerokości spłaszczonej odbytnicy. Kiedy zakończenie aferentne jest wzbudzone, dostosuj położenie elektrody i intensywność bodźca, aby wskazać pole recepcyjne, które wymaga najmniejszej intensywności bodźca do odpowiedzi. Jeśli próg bodźca jest większy niż trzy miliampery, odrzuć to zakończenie nerwowe i przejdź do badania innego włókna nerwowego.

Teraz oblicz prędkość przewodzenia na podstawie odległości między elektrodą stymulującą w polu recepcyjnym a miejscem rejestracji oraz na podstawie opóźnienia przewodzenia między artefaktem bodźca a początkami potencjału czynnościowego. Po zlokalizowaniu pola recepcyjnego za pomocą bodźca elektrycznego zastosuj trzy bodźce mechaniczne. Najpierw zastosuj bodziec sondujący, naciskając końcówkę skalibrowanego włókna von fray, takiego jak nylonowa żyłka, prostopadle do pola recepcyjnego na spłaszczonym jelitie grubym.

Używaj żyłek, które wytwarzają siłę 0,4 grama i jeden gram. Po drugie, wytwórz bodziec do głaskania, delikatnie głaszcząc błonę śluzową jelita grubego cienkim nylonowym pasmem włókna, wytwarzając siłę 10 miligramów, aby wytworzyć niewielkie powierzchniowe naprężenie ścinające w polu recepcyjnym. Po trzecie, przeprowadź rozciąganie obwodowe za pomocą sterowanego komputerowo siłownika siły.

Niech dostarcza rampę rozciągniętą siłę w kierunku obwodowym wzdłuż krawędzi przeciw krezce jelita grubego. Teraz sklasyfikuj ENS jako surowicze, błonowe, mięśniowe, mięśniowe, śluzówkowe lub MIAA mechanicznie niewrażliwe aferentne. Na podstawie wyników trzech testów.

Rozpocząć od zarejestrowania podstawowej odpowiedzi na bodziec mechaniczny, jak w poprzednim rozdziale, za pomocą wznoszonego obwodu, rozciągania lub prostopadłego sondowania mechanicznego w celu zbadania wrażliwości chemicznej. Najpierw pokryj dolną krawędź kawałka rurki z mosiądzu lub stali nierdzewnej ropą naftową i umieść ją nad polem recepcyjnym na jelitie grubym. Teraz odessać roztwór Krebsa z wnętrza rurki i zastąpić roztwór 170 mikrolitrami roztworu testowego.

Pozostaw rurkę na miejscu na trzy do pięciu minut, monitorując reakcje w aferencie. Natychmiast po wyjęciu rurki w ciągu czterech do sześciu minut należy przetestować reakcję aferentną na ten sam bodziec mechaniczny, co w odpowiedzi wyjściowej. Po 15 lub więcej minutach odczynniki można uznać za wypłukane.

Następnie ponownie stosuje się bodziec mechaniczny. Aby porównać z mrówkami wyjściowymi, wypreparowany nerw został pobudzony w celu znalezienia pola recepcyjnego. Pole recepcyjne zidentyfikowano na podstawie odpowiedzi potencjału czynnościowego z wykorzystaniem opóźnienia przewodzenia potencjału czynnościowego.

Obliczona prędkość przewodzenia wynosiła 43 metry na sekundę, co mieści się w zakresie niezmielinizowanego włókna C. Po zidentyfikowaniu pola recepcyjnego, było ono badane prostopadle za pomocą ręcznych włókien von fray, a także delikatnie głaskane przez trzymane w ręku cienkie nylonowe włókno. Reakcje AFR na sondowanie oceniano również za pomocą sterowanego komputerowo siłownika siły, który dostarcza do tego samego miejsca na jelitu grubym serię precyzyjnie zsynchronizowanych i powtarzalnych sił mechanicznych.

Podobnie, obwodowe rozciągnięcie jelita grubego zostało zapewnione przez ten sam wysiłek aktywatora. Odpowiedzi można rozróżnić na podstawie odpowiedzi na sondowanie, głaskanie i rozciąganie odpowiedzi z wrażliwego na rozciąganie aferentu, które zostały wywołane przez trzy kolejne odcinki obwodowe oddalone od siebie o pięć minut. Liczby skoków zostały równomiernie przypięte i wyświetlone jako funkcje reakcji na bodziec, ujawniające wysoką odtwarzalność oraz zarówno wielkość odpowiedzi, jak i próg odpowiedzi.

Następnie zastosowano środki chemiczne. Bezpośrednia aktywacja ens nastąpiła po zastosowaniu kwaśnego roztworu hipertonicznego po zastosowaniu zupy zapalnej do niewrażliwego mechanicznie aferentu. Nie nastąpiła aktywacja zakończenia, ale widoczne było nabycie wrażliwości na meno.

Wrażliwy na rozciąganie, wrażliwy na meno aferent był również uczulony na mechaniczne rozciąganie pola recepcyjnego po zastosowaniu zupy zapalnej Po opanowaniu zwykle zajmuje to od trzech do czterech godzin, aby zakończyć sekcję tkanki i uzyskać zapis pojedynczego włókna. Typowy eksperyment trwa cały dzień od początku do końca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak chirurgicznie usunąć i zebrać jelito grube z przyczepionymi nerwami.

Następnie być w stanie nagrywać z pojedynczych włókien Ahern w nerwie miednicznym lub nerwie lędźwiowym, unerwiając okrężnicę za pomocą bezstronnej strategii wyszukiwania elektrycznego. Powinieneś wtedy być w stanie zidentyfikować zakończenia receptywne w odbytnicy i przetestować je pod kątem wrażliwości mechanicznej, a także wrażliwości na chemioterapię, stosując chemikalia bezpośrednio do zakończeń receptywnych. Preparat ten jest silnym preparatem, który pozwala badać mechanizmy patofizjologiczne, a także podstawowe pytania fizjologiczne w jelitie grubym.