Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Witamy w sekcji krążków źrenicowych i okołoźniacowych u Drosophila melanogaster. Należy wybrać odpowiednio dopasowaną poczwarkę do HD. Sekcja rozpoczyna się od przekłucia obudowy źrenicy i usunięcia poczwarki z etui.

Cięcie wykonuje się po przekątnej w połowie klatki piersiowej w poczwarce. Po przecięciu poczwarki, mózg i iis zostaną odizolowane i przetworzone przed zamontowaniem iis. Do mikroskopii rozpoczyna się proces preparacji i odpowiednio dobiera się poczwarkę.

Umieść poczwarkę w dużej kropli PBS na naczyniu preparacyjnym. Najlepszą praktyką jest ustawienie poczwarki tak, aby haczyki ustne były skierowane w dół. Są to haczyki do ust skierowane do haczyków do ust w dół.

Chwyć poczwarkę delikatnie jedną parą kleszczy. Uważając, aby nie ścisnąć rozwijającej się poczwarki wewnątrz obudowy źrenicy zbyt mocno za pomocą ostrych kleszczy. Przebij obudowę źrenicy i pozwól, aby cztery kroki się rozłożyły, aby oderwać koniec.

Sięgnij do środka i chwyć rozwijającą się poczwarkę z otworu, który właśnie powstał. Następnie weź nożyczki i odetnij poczwarkę mniej więcej w połowie poziomu klatki piersiowej. Wykonaj cięcie po przekątnej.

Następnie najlepiej jest usunąć zanieczyszczenia lub przenieść PU przed sobą do nowej kropli PBS. Czyszczenie można wykonać za pomocą rurki dmuchawy pipet, a w razie potrzeby należy dodać dodatkowy PBS, upewniając się, że nie ma odwodnienia. Następnie mocno chwyć górną część naskórka główki źrenicy za pomocą kleszczy.

Pamiętaj, aby nie chwytać żadnej tkanki w obrębie naskórka za pomocą końcówki rurki dmuchawy. Delikatnie naciśnij obudowę źrenicy, aby wysunąć mózg i wysunąć dysk oka z obudowy źrenicy. Aby pomóc w tym procesie, użyj PBS w rurze dmuchawy, aby delikatnie wydmuchać zanieczyszczenia, jak pokazano tutaj, z obudowy głowy, aby umożliwić wyraźne oddzielenie i identyfikację mózgu i dysków I kontynuuj ten proces pchania i w razie potrzeby, aż dysk mózg i I zostaną oddzielone od otaczającej tkanki i łatwo zidentyfikowane, dysk I można teraz zobaczyć tutaj, a ta pigmentacja poczwarki ma już się zaczęły, a I diss mają lekki kolor.

Oczy są obrysowane na czerwono, a mózg jest podświetlony pomiędzy. Przy większym powiększeniu każdy dysk I można łatwo zidentyfikować. Ponownie, dyski I zostały obrysowane na czerwono z mózgiem pomiędzy nimi.

Mózg i I.Discs powinny być nadal czyszczone i oddzielane od pozostałej tkanki za pomocą optymalnych kleszczy i rurki dmuchawy, dysk oka i mózg powinny nadal pozostać przymocowane do naskórka głowy, aby mogły działać jako uchwyt dla kleszczy do przyszłej manipulacji. Chociaż w procesie i pchania często dochodzi do oderwania dysku mózgowego i oka od naskórka głowy. Po dokładnym wyizolowaniu I dis i mózgu, delikatnie umieść tkankę w ustalonym roztworze.

Początkowo pozwól dyskowi I unosić się na górze poprawki, aby nie zapadły się na siebie i nie zostały naprawione W zamkniętej orientacji najlepszą praktyką jest przeanalizowanie I dis i pozwolenie im unosić się na poprawce. Pozostają one w powietrzu, podczas gdy następny zestaw dysków I jest preparowany, a następnie są zanurzane w utrwaleniu po utrwaleniu dysku I. Są one przetwarzane w razie potrzeby, np. barwienie immunologiczne, a następnie montowane na szkiełku w celu wizualizacji.

Oto nieruchome dyski źrenicy I z mózgiem nadal przyczepionym do dużej kropli PBS. Montaż i glicerol jest bardzo trudny do wykonania, chociaż z powodzeniem zamontowaliśmy iis i 50% glicerolu i PBS. Jeśli montujesz w PBS, pamiętaj, aby uniknąć odwodnienia.

Zauważ, że naskórek głowy został usunięty. Na czerwono zaznaczony jest każdy dysk I. Pomiędzy nimi wyróżnia się mózg.

Weź ostre kleszcze i przerwij połączenie między dyskiem oka a mózgiem. Osiąga się to poprzez przytrzymanie mózgu i umieszczenie ostrych kleszczy w miejscu połączenia. To może być bardzo trudne.

Ważne jest, aby używać ostrych kleszczy, ponieważ znacznie ułatwiają one ten proces. Możliwe jest również wykonanie tej separacji za pomocą cienkiej igły preparującej, jak również można je zobaczyć. Czasami łatwiej jest oderwać mózg, jednocześnie stabilizując krążek oka na połączeniu.

Na tej tarczy oka pozostało sporo obcej tkanki, która nie powinna wpływać na obrazowanie dysku oka, o ile dysk I jest zamontowany na szkiełku mikroskopowym tą stroną do góry. Pozwala to na to, aby wierzchołkowa powierzchnia dwuteownika była płaska na szkiełku mikroskopowym. Odkryliśmy, że dalsze usuwanie tej tkanki zwykle prowadzi do uszkodzenia tkanki I dysku.

Dlatego lepiej jest pozostawić tę tkankę i unikać jej na etapie obrazowania. Inna technika usuwania mózgu polega na przygwożdżeniu dysku oka do połączenia za pomocą igły preparacyjnej lub ostrej pary kleszczy, jak pokazano tutaj, a następnie odciągnięcie mózgu. To oderwanie było znacznie czystsze, a na dysku I pozostało mniej tkanki.

Kiedy skończysz przygotowywać wszystkie dyski dwuteowe, ustaw je w rzędzie z torem optycznym skierowanym do góry. Wyjmij PBS i zastąp go osłoną VTA lub innym nośnikiem montażowym i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Dyski I są teraz gotowe do obrazowania za pomocą opisanych tutaj technik wraz ze szczegółowym protokołem barwienia immunologicznego.

W manuskrypcie dysk I można uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej pod kątem cech morfologicznych, jak widać tutaj z barwieniem fosfotyrozyną, ujawniając wierzchołkową morfologię komórek omla w krążku I. Inne przeciwciała i techniki genetyczne można zastosować do identyfikacji rur komórkowych i wzorców ekspresji, jak widać tutaj w przypadku ekspresji przeciętego czynnika transkrypcyjnego w czopkach dysku I. Ten film stanowi remastering filmów szkoleniowych, które zostały wyprodukowane w celu instruowania studentów studiów licencjackich w tej technice.

Wielu naszych uczniów zostało z powodzeniem przeszkolonych w tej technice za pomocą tego filmu i mamy nadzieję, że pomoże on również Tobie. Życzymy powodzenia w eksperymentach i mamy nadzieję, że ta technika przyniesie Ci korzyści.