Name: Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj dynamiczny clamp in vitro w neuronach kory mózgowej szczura przy użyciu oprogramowania LCG. Ta metoda umożliwia automatyzację protokołów elektrofizjologicznych i symulację zdarzeń synaptycznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe od Flandryjskiej Fundacji Badawczej FWO (umowa nr 12C9112N dla DL), 7. program ramowy Komisji Europejskiej (sieć Marie Curie "C7", umowa nr 238214; Projekt ICT Future Emerging Technology "ENLIGHTENMENT", umowa nr 306502), Interuniversity Attraction Poles Program zainicjowany przez Belgijskie Biuro Polityki Naukowej (umowa nr IUAP-VII/20) oraz Uniwersytet w Antwerpii.

Opisany tutaj protokół jest zgodny z zaleceniami i wytycznymi Komisji Etyki Wydziału Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w Antwerpii. Protokół ten wymaga przygotowania materiału niezdolnego do odczuwania z eksplantowanego mózgu młodych szczurów rasy Wistar, uzyskanego za pomocą zatwierdzonych technik humanitarnej eutanazji.
1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Zainstaluj i skonfiguruj system akwizycji i stymulacji danych.
	<ol>
		<li>Użyj komputera osobistego (PC) wyposażonego w kartę akwizycji danych (DAQ) obsługiwaną przez Comedi do nagrywania sygnałów i wysyłania analogowych napięć sterujących do wzmacniacza elektrofizjologicznego. 
		UWAGA: Comedi to moduł i biblioteka systemu Linux, która obsługuje wiele kart DAQ od najpopularniejszych producentów: odwiedź http://www.comedi.org, aby uzyskać więcej informacji.</li>
		<li>W przypadku, gdy używany jest sterowany komputerowo wzmacniacz z zaciskiem krosowym, należy użyć drugiego komputera oprócz tego dedykowanego do sterowania wzmacniaczem. 
		UWAGA: Podczas gdy ten ostatni może działać z konwencjonalnym systemem operacyjnym, dodatkowy komputer będzie działał w czasie rzeczywistym za pomocą specjalnego systemu operacyjnego. W tych warunkach wygodnie jest korzystać z jednego monitora, myszy i klawiatury podłączonych do dodatkowego komputera, jednocześnie łącząc się za pomocą aplikacji zdalnego pulpitu z dedykowanym komputerem.</li>
		<li>Pobierz obraz ISO płyty Live CD zawierającej system operacyjny Linux czasu rzeczywistego z preinstalowanym LCG z http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso i nagraj go na czystą płytę CD lub pamięć USB".</li>
		<li>Wystarczy włożyć płytę CD do napędu komputera zawierającego kartę DAQ i uruchomić go. Alternatywnie, zainstaluj LCG z jego internetowego repozytorium źródłowego na komputerze z systemem operacyjnym Linux (np. Debian lub Ubuntu). Zapoznaj się z instrukcją online, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury instalacji. Instrukcja jest dostępna online pod adresem http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.</li>
		<li>Uruchom z płyty Live CD: spowoduje to automatyczne załadowanie w pełni skonfigurowanego systemu. W tym celu umieść płytę CD LCG Live CD w napędzie CD-ROM komputera i uruchom komputer z płyty CD; Wybierz jądro w czasie rzeczywistym (opcja domyślna), gdy tylko pojawi się menu rozruchu i poczekaj na zainicjowanie systemu.</li>
		<li>Skalibruj kartę DAQ, wpisując w wierszu polecenia: 
		sudo comedi_calibrate 
		lub 
		sudo comedi_soft_calibrate 
		W zależności od tego, czy karta akwizycji danych obsługuje odpowiednio kalibrację sprzętową czy programową (użyj polecenia sudo comedi_board_info, aby uzyskać informacje na tablicy).</li>
		<li>Ustaw odpowiednie współczynniki konwersji analogowo-cyfrowej i cyfrowo-analogowej: wymaga to dostępu do instrukcji obsługi komórkowego wzmacniacza elektrofizjologicznego, a w szczególności do jego specyfikacji dotyczącej współczynników konwersji.</li>
		<li>Użyj edytora tekstu, aby określić odpowiednie wartości liczbowe w pliku /home/user/.lcg-env dla zmiennych środowiskowych AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. 
		UWAGA: Reprezentują one wzmocnienia wejściowe (AI) i wyjściowe (AO) dla trybów cęgów prądowych (CC) i cęgów napięciowych (VC) oraz współczynniki konwersji między poleceniami napięcia dostarczanymi przez komputer a prądem lub napięciami generowanymi przez wzmacniacz.</li>
		<li>Alternatywnie, użyj dostarczonego skryptu LCG (lcg-find-conversion-factors), aby znaleźć współczynniki konwersji swojego systemu. 
		UWAGA: Wartości obliczane przez lcg-find-conversion-factors są domysłami, które w niektórych przypadkach muszą być numerycznie obcięte lub zaokrąglone, aby odzwierciedlić dokładne wartości współczynników konwersji.</li>
		<li>Aby użyć lcg-find-conversion-factors, zacznij od podłączenia "ogniwa modelowego", które często jest kupowane wraz ze wzmacniaczem, do odpowiedniego headstage'u. Następnie otwórz terminal na komputerze z systemem Linux, na którym uruchamiasz Live CD i wprowadź następujące polecenie w wierszu polecenia: 
		lcg-find-conversion-factors -i $HOME/.lcg-env -o $HOME/.lcg-env 
		UWAGA: W obu przypadkach (tj. ręczna modyfikacja /home/user/.lcg-env lub użycie lcg-find-conversion-factors), zamknij i otwórz terminal, aby zmiany zaczęły obowiązywać.</li>
		<li>Jeśli używanych jest wiele stopni napędu, ustaw współczynniki konwersji na te same wartości we wszystkich kanałach; jeśli nie jest to możliwe, zapoznaj się z instrukcją online LCG, aby dowiedzieć się, jak używać wielu współczynników konwersji w lcg-stimulus lub jak tworzyć pliki konfiguracyjne, które lepiej odpowiadają potrzebom użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu z kory somatosensorycznej
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów do elektrofizjologii.
	<ol>
		<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) przez zmieszanie (w mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 glukozy, 2 CaCl2 i 1 MgCl2. Przygotuj 10x roztwory podstawowe, aby skrócić czas przygotowania w dniu eksperymentu. Przygotuj 2 litry, z których jeden posłuży do przygotowania plastrów, a drugi do nagrywania.</li>
		<li>Nasycić ACSF 95%O2 i 5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu.</li>
		<li>Do bieżących zapisów cęgowych należy użyć roztworu wewnątrzkomórkowego (ICS) zawierającego (w mM) 115 K-glukoniana, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na 2-GTP, 10 Na2-fosfokreatynę. Przygotuj roztwór w lodzie i przefiltruj go przed rozpoczęciem zapisów, aby wyeliminować ryzyko zatkania pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja mózgu.
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę, umieszczając je w komorze indukcyjnej z 4% izofluranem i szybko odciąć mu głowę za pomocą gilotyny lub dużych nożyczek.</li>
		<li>Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej i przesuń ją do uszu.</li>
		<li>Za pomocą cienkich nożyczek przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej. Trzymaj ostrze jak najbliżej powierzchni, aby zminimalizować uszkodzenia leżącego pod spodem mózgu. Otwórz czaszkę pęsetą, użyj szpatułki, aby przeciąć nerw wzrokowy i pień mózgu, a następnie delikatnie wrzuć mózg do lodowatego ACSF.</li>
		<li>Oddziel móżdżek i dwie półkule skalpelem (ostrze 24).</li>
		<li>Usuń nadmiar wody z jednej z dwóch półkul i przyklej ją na pochyłej platformie za pomocą kropli superglue. Szybko dodaj kilka kropli ACSF na mózg i przenieś go do komory wibratomowej. 
		UWAGA: Podczas przygotowywania plastrów strzałkowych ważny jest kąt platformy, aby uniknąć uszkodzenia dendrytów komórek piramidalnych podczas procedury krojenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie plastrów.
	<ol>
		<li>Umieść ostrze nad mózgiem i wyrzuć pierwsze 2,5 - 3 mm. Dostosuj prędkość i częstotliwość, aby ograniczyć uszkodzenia powierzchni plastru, jednocześnie minimalizując czas potrzebny na procedurę krojenia.</li>
		<li>Ustaw grubość na 300 μm i rozpocznij krojenie. Gdy ostrze przejdzie przez korę, użyj żyletki lub wygiętej igły, aby przeciąć powyżej hipokampa i na krawędziach interesującego obszaru kory</li>.
		<li>Umieścić plastry w wielodołkowej komorze inkubacyjnej utrzymywanej w temperaturze 32-34 °C.</li>
		<li>Wycofać ostrze i powtarzać punkty 2.3.2 i 2.3.3, aż do odcięcia 5-8 plastrów. Najlepsze plastry to zwykle te, w których naczynia krwionośne są równoległe do powierzchni.</li>
		<li>Inkubuj plastry przez 30 minut po umieszczeniu ostatniego plastra w komorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nagrania z warstwy 5 neuronów piramidowych
<ol>
	<li>Umieść plasterek w komorze rejestrującej i poszukaj zdrowych komórek. Komórki te mają zwykle niższy kontrast, gładki wygląd i nie są spuchnięte.</li>
	<li>Zbadaj wycinek pod mikroskopem za pomocą soczewki o powiększeniu 40X i poszukaj komórek w warstwie 5, znajdującej się około 600 do 1000 μm od powierzchni mózgu.</li>
	<li>Po znalezieniu odpowiedniej kuwety załadować jedną trzecią mikropipety ICS i umieścić ją w głowicy.</li>
	<li>Na komputerze osobistym, na którym zainstalowana jest płyta Live CD lub wstępnie skonfigurowany system operacyjny Linux, uruchom powłokę poleceń (np. bash) i w wierszu polecenia wpisz polecenie lcg-zero. Gwarantuje to, że płyta DAQ nie steruje wzmacniaczem.</li>
	<li>Zastosować nadciśnienie 30 - 50 mbar, naciskając na tłok zwykłej strzykawki, połączonej rurką z uchwytem na pipetę i za pomocą mikroskopu umieścić pipetę około 100 μm nad plasterkiem. 
	UWAGA: Umieść pipetę w pozycji umożliwiającej bezpośrednią drogę do celi docelowej, najlepiej przy użyciu trybu podejścia mikromanipulatora.</li>
	<li>Działając na elementy sterujące wzmacniaczem elektrofizjologii, wyreguluj przesunięcie pipety i wyprowadź impuls testowy (10 mV) w trybie cęgów napięciowych.</li>
	<li>Zmniejsz ciśnienie do 10 - 30 mbar (w zależności od rozmiaru pipety), wycofując tłok strzykawki; delikatnie podejdź do celi i sprawdź, czy nie tworzy się wgłębienie, obserwując obraz na monitorze kamery wideo. Monitoruj impuls testowy pod kątem wzrostu rezystancji przez cały czas, obserwując przebieg prądu wyświetlany na oscyloskopie podłączonym do wzmacniacza elektrofizjologicznego (alternatywnie możesz użyć polecenia lcg-seal-test do monitorowania rezystancji pipety).</li>
	<li>Zwolnij ciśnienie i w razie potrzeby delikatnie podciśnij pipetę, aby ułatwić uszczelnienie, gdy zauważysz wzrost oporu pipety i tworzenie się "wgłębienia" w kuwecie.</li>
	<li>Podczas formowania się uszczelki stopniowo zmniejszaj potencjał utrzymywania do -70 mV.</li>
	<li>Po uzyskaniu uszczelki gigaomowej upewnij się, że prąd podtrzymania wynosi od 0 do 30 pA. Zastosuj krótkie impulsy podciśnienia (ssania), aby przerwać membranę i ustalić konfigurację całej komórki. Alternatywnie można wstrzyknąć silne i krótkie impulsy napięcia (tj. za pomocą polecenia "ZAP" na wzmacniaczu lub trzymając ogniwo na bardzo ujemnym poziomie), aby rozerwać membranę, w zależności od użytego preparatu i szklanej pipety.</li>
	<li>Przełącz na bieżący tryb cęgowy i sprawdź, czy spoczynkowy potencjał błonowy jest typowy dla zdrowej komórki. W przypadku neuronów piramidowych korowych wykorzystujących roztwór na bazie glukonianu potasu wartość ta wynosi zwykle od -65 do -75 mV.</li>
</ol>
4. Półautomatyczna charakterystyka właściwości odpowiedzi elektrycznej neuronu
<ol>
	<li>Utwórz katalog do przechowywania danych użytkownika. W tym celu należy użyć skryptu dołączonego do płyty LCG Live CD, który tworzy foldery na podstawie daty. Aby z niego skorzystać, wpisz w wierszu polecenia 
	cd ~/eksperymenty 
	lcg-create-experiment-folder -s psp,in_vivo_like 
	Spowoduje to utworzenie folderu, w którym zostaną zapisane dane dla tej komórki (oraz podfolderów "psp" i "in_vivo_like") i wydrukuje jego nazwę w oknie terminala; Za pomocą tego skryptu można również przechowywać dodatkowe informacje, takie jak opór pipety i typ komórki.</li>
	<li>Zmień katalog na nowo utworzony folder za pomocą polecenia 
	cd ~/<nazwa_folderu> 
	Nazwa folderu jest wyświetlana przez polecenie lcg-create-experiment-folder i będzie miała sygnaturę czasową bieżącego dnia (tj. rok-miesiąc-dzień), na przykład 20140331A01.</li>
	<li>Upewnij się, że amplifier jest ustawiony na pracę w trybie prądu clamp, że są podłączone, a zewnętrzne napięcie polecenie amplifier, jeśli jest, jest włączone.</li>
	<li>Wprowadź polecenie lcg-ecodew wierszu polecenia. Wywołuje to szereg poleceń (a mianowicie lcg-ap, lcg-vi, lcg-ramp, lcg-tau i lcg-steps), używanych do scharakteryzowania podstawowych właściwości odpowiedzi komórki. LCG-ecode wymaga, aby użytkownik określił dwa parametry: amplitudę impulsu prądu o długości 1 ms, używanego do wywołania pojedynczego skoku w komórce, oraz maksymalną amplitudę rampy prądowej wstrzykiwanej do komórki w celu znalezienia jej reobazy. 
	Użyj następującej składni polecenia: 
	lcg-ecode --amplituda impulsu X --amplituda-rampy Y 
	z wyborem wartości X i Y (w pA), które są wystarczające do uruchomienia ogniwa w odpowiedzi odpowiednio na impuls o długości 1 ms i ciągły wtrysk prądu. 
	UWAGA: Protokoły te wymagają przeprowadzenia numerycznego oszacowania "jądra elektrody" w celu skorzystania z aktywnej kompensacji elektrody (AEC)15. Do oszacowania jądra używany jest zaszumiony wtrysk prądu, a użytkownik jest proszony o potwierdzenie liczby próbek tworzących jądro. Patrz 15, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat znaczenia jądra elektrody i sposobu wyboru liczby próbek jądra.</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie przewodnictwa za pomocą symulowanych synaps i symulacja aktywności tła podobnej do In vivo
<ol>
	<li>Wstrzykiwanie symulowanych pobudzających potencjałów postsynaptycznych
	<ol>
		<li>Przejdź do katalogu, w którym zapiszesz następny eksperyment, wpisując następujące polecenie w wierszu poleceń powłoki: 
		Płyta CD PSP/01</li>
		<li>Skopiuj plik konfiguracyjny LCG do bieżącego katalogu i otwórz go za pomocą edytora tekstu (w tym przykładzie Nano), wpisując następujące polecenia w wierszu poleceń powłoki (ten przykładowy plik konfiguracyjny jest zawarty w kodzie źródłowym i live cd): 
		cp ~/local/src/lcg/configurations/epsp.xml 
		nano epsp.xml 
		UWAGA: Jest to po prostu plik tekstowy z różnymi jednostkami połączonymi ze sobą. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz sekcję Reprezentatywne wyniki.</li>
		<li>W razie potrzeby zmodyfikuj inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor i outputConversionFactor w tym pliku, aby dopasować je do konfiguracji użytkownika.</li>
		<li>Oblicz jądro elektrody potrzebne do przeprowadzenia aktywnej kompensacji elektrody ' metody używanej przez LCG do wykonania dynamicznego zacisku pojedynczej elektrody ', wydając polecenie 
		lcg-kernel 
		Spowoduje to zapytanie o liczbę punktów w jądrze. Ponownie wybierz liczbę, aby jądro elektrody zakrywało koniec ogona rozpadu wykładniczego.</li>
		<li>Wykonaj eksperyment z zaciskiem dynamicznym za pomocą polecenia 
		lcg-eksperyment -c epsp.xml</li>
		<li>Wyświetl listę plików i zwizualizuj wyniki za pomocą polecenia 
		ls -l 
		lcg-plik-wydruku -f ostatni</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzykiwanie symulowanych hamujących potencjałów postsynaptycznych
	<ol>
		<li>Utwórz folder i skopiuj do niego plik epsp.xml, wpisując następujące polecenia w wierszu poleceń powłoki: 
		mkdir .. /02 
		cp epsp.xml .. /02/ipsp.xml 
		płyta CD.. /02</li>
		<li>Edytuj plik konfiguracyjny przy użyciu edytora tekstów: zmień potencjał odwrócenia synaptycznego oraz stałe czasu narastania i zaniku modelu synapsy Exp2Synapse na następujące: 
		parametry> 
		<E>-80</E> 
		<tauRise>0.8e-3</tauRise> 
		<tauDecay>10e-3</tauDecay> 
		<parametry> 
		Zamknij edytor tekstu.</li>
		<li>Oblicz jądro elektrody i przeprowadź eksperyment jak w 5.1, wpisując następujące polecenia w wierszu poleceń powłoki: 
		lcg-kernel 
		lcg-eksperyment -c ipsp.xml</li>
		<li>Wyświetl listę plików i zwizualizuj wyniki, wpisując następujące polecenia w wierszu poleceń powłoki: 
		ls -l 
		lcg-plot-file -f <nazwa_pliku.h5></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Symulacja aktywności tła podobnej do in vivo:
	<ol>
		<li>Przejdź do katalogu, w którym chcesz zapisać następujący eksperyment, jak pokazano wcześniej, wpisując następujące polecenia w wierszu poleceń powłoki: 
		płyta CD.. /.. /in_vivo_like/01</li>
		<li>Skopiuj plik konfiguracyjny z katalogu źródłowego LCG, wpisując następujące polecenia w wierszu poleceń powłoki: 
		cp ~/local/src/lcg/configurations/in_vivo_like.xml 
		nano in_vivo_like.xml 
		UWAGA: Ten plik jest po prostu konkatenacją poprzednich; dwa procesy punktu Poissona, które generują ciągi kolców, które z kolei zasilają synapsy hamujące i pobudzające, generują aktywność tła.</li>
		<li>Dostosuj parametry konfiguracyjne DAQ dla konfiguracji użytkownika, zgodnie z opisem w 5.1.3 i wyjdź z edytora.</li>
		<li>Oblicz jądro elektrody i przeprowadź eksperyment jak w 5.1, wpisując następujące polecenia w wierszu poleceń powłoki: 
		lcg-kernel 
		LCG-eksperyment -c in_vivo_like.xml -n 10 -I 3 
		Przełączniki '-n 10' i '-i 3' wskazują, że stymulację należy powtórzyć 10 razy w odstępach trzysekundowych.</li>
		<li>Wizualizację nieprzetworzonych śladów za pomocą następującego polecenia w wierszu polecenia powłoki: 
		lcg-plik-wydruku -f wszystko</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+visual+motion+and+locomotion+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex.</a> Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).</li>
<li>Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+neuronal+dynamics+during+motor+adaptation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish.</a> Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).</li>
<li>Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-loop+optogenetic+control+of+thalamus+as+a+tool+for+interrupting+seizures+after+cortical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury.</a> Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).</li>
<li>Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+response+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Neuronal response clamp.</a> Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3(2011).</li>
<li>Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Command-line+cellular+electrophysiology+for+conventional+and+real-time+closed-loop+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments.</a> Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).</li>
<li>Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).</li>
<li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).</li>
<li>Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+effects+of+the+persistent+Na%2B+current+on+neuronal+excitability+and+spike+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing.</a> Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).</li>
<li>White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+from+voltage-gated+ion+channels+may+influence+neuronal+dynamics+in+the+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex.</a> Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).</li>
<li>Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+synaptic+conductances+recreate+in+vivo-like+activity+in+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons.</a> Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).</li>
<li>Fellous, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Persistent+Activity+by+Background+Inhibition+in+an+In+Vitro+Model+of+a+Cortical+Microcircuit%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit.</a> Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).</li>
<li>Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+excitability+over+extended+timescales+in+cultured+cortical+neurons.+The+Journal+of+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience.</a> the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological+and+molecular+properties+of+Martinotti+cells+in+the+somatosensory+cortex+of+the+juvenile+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat.</a> The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+molecular+and+circuit+properties+of+nest+basket+cells+in+the+developing+somatosensory+cortex%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex).</a> Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).</li>
<li>Brette, R., Piwkowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intracellular+recordings+using+a+real-time+computational+model+of+the+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode.</a> Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).</li>
<li>Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+closed-loop+presentation+of+sensory+stimuli+conditional+on+the+internal+brain-state+of+awake+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals.</a> Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).</li>
<li>Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).</li>
<li>Graham, L., Schramm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamic-Clamp+Manipulation+of+Extrinsic+and+Intrinsic+Conductances%3A+Functional+Roles+of+Shunting+Inhibition+and+I+BK+in+Rat+and+Cat+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Dynamic+Clamp%3A+From+Principles+to+Applications%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex.</a> Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. , (1995).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%22">Patch Clamping</a>. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).</li>
<li>Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).</li>
<li>Gold, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+R+%22The+Axon+Guide+for+Electrophysiolog.%2C+%26+Biophysics+Laboratory+Techniques..%22">The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques..</a>. , (2007).</li>
<li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+spike+timing+in+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reliability of spike timing in neocortical neurons.</a> Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li>
<li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoch%2C+C+%22Methods+in+Neuronal+Modeling%3A+From+Synapses+to+Networks%22">Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks</a>. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).</li>
<li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li>
<li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+networks+with+dynamic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+computation%22%5BJournal%5D)">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li>
<li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym tekście opisano pełny protokół realizacji eksperymentów elektrofizjologicznych w czasie rzeczywistym w pętli zamkniętej pojedynczej komórki, wykorzystujący technikę patch clamp i niedawno opracowany zestaw narzędzi programowych o nazwie LCG. Aby zoptymalizować jakość nagrań, ważne jest, aby zestaw do nagrywania był odpowiednio uziemiony, ekranowany i wolny od wibracji: zapewnia to stabilny i trwały dostęp całej komórki do komórki, co wraz z możliwością automatyzacji całych sekcji protokołów stymulacji pozwal...

W ostatnich latach elektrofizjologia komórkowa ewoluowała od tradycyjnego paradygmatu otwartej pętli stosowanego w eksperymentach z cęgami napięcia i prądu do nowoczesnych protokołów pętli zamkniętej. Najbardziej znaną techniką zamkniętej pętli jest prawdopodobnie dynamiczny zacisk6,7, który umożliwił syntetyczne wstrzykiwanie sztucznych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w celu określenia napięcia błony neuronalnej8, dogłębne badanie wpływu niedeterministycznego migotania na kanały jonowe na dynamikę odpowiedzi neuronalnej9, a także odtworzenie in vitro realistycznej aktywności tła synaptycznego podobnego do in vivo10.
Inne paradygmaty zamkniętej pętli, które zostały zaproponowane, to zacisk reaktywny11, do badania in vitro generowania samopodtrzymującej się trwałej aktywności, oraz zacisk odpowiedzi4,12, do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw pobudliwości neuronów.
Tutaj opisujemy potężny framework, który pozwala na zastosowanie różnych protokołów elektrofizjologicznych w pętli zamkniętej w kontekście nagrań z użyciem krostek na całej komórce wykonywanych w ostrych wycinkach mózgu. Pokazujemy, jak rejestrować napięcie błony somatycznej za pomocą nagrań patch clamp w neuronach piramidowych z kory somatosensorycznej młodych szczurów i stosować trzy różne protokoły zamkniętej pętli za pomocą LCG, zestawu narzędzi programowych opartych na wierszu poleceń opracowanego w laboratorium neurobiologii teoretycznej i neuroinżynierii.
Krótko mówiąc, opisane protokoły to, po pierwsze, automatyczne wstrzykiwanie serii przebiegów bodźców cęgowych, istotnych dla charakterystyki dużego zestawu aktywnych i pasywnych właściwości membrany. Sugeruje się, że mają one na celu uchwycenie elektrofizjologicznego fenotypu komórki pod względem jej właściwości odpowiedzi na stereotypową serię fal bodźców. Znany jako e-kod komórki (np. patrz 13,14), taki zbiór odpowiedzi elektrycznych jest używany przez kilka laboratoriów do obiektywnej klasyfikacji neuronów na podstawie ich właściwości elektrycznych. Obejmuje to analizę stacjonarnej zależności przenoszenia wejścia-wyjścia (krzywa f-I) za pomocą innowacyjnej techniki, która obejmuje kontrolę szybkości wypalania w czasie rzeczywistym w pętli zamkniętej za pomocą regulatora proporcjonalnej pochodnej całkującej (PID), a następnie odtworzenie realistycznej aktywności synaptycznej tła podobnego do in vivo w preparatach in vitro 10 i po trzecie, sztuczne połączenie w czasie rzeczywistym dwóch jednocześnie zarejestrowanych neuronów piramidowych za pomocą wirtualnego interneuronu GABA-ergicznego, który jest symulowany przez komputer.
Dodatkowo, LCG implementuje technikę znaną jako Aktywna Kompensacja Elektrod (AEC)15, która pozwala na implementację dynamicznych protokołów zaciskowych przy użyciu pojedynczej elektrody. Pozwala to na kompensację niepożądanych efektów (artefaktów) elektrody rejestrującej, które powstają, gdy jest ona używana do dostarczania bodźców wewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na nieparametrycznym oszacowaniu równoważnych właściwości elektrycznych obwodu rejestrującego.
Techniki i protokoły eksperymentalne opisane w tym artykule mogą być łatwo stosowane w konwencjonalnych eksperymentach z cęgami napięcia i prądu w otwartej pętli i mogą być rozszerzone na inne preparaty, takie jak zewnątrzkomórkowe4,16 lub wewnątrzkomórkowe zapisy in vivo17,18. Staranny montaż zestawu do elektrofizjologii zacisków krosowych całych ogniw jest bardzo ważnym krokiem dla stabilnych, wysokiej jakości nagrań. W dalszej części zakładamy, że taka konfiguracja eksperymentalna jest już dostępna dla eksperymentatora i skupiamy naszą uwagę na opisaniu użycia LCG. Czytelnik jest kierowany do punktów 19–22, aby uzyskać dodatkowe wskazówki dotyczące optymalizacji i debugowania.

<table><tbody><tr><td>Krajalnica do tkanek</td><td>Leica</td><td>VT-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>1,5/0,84 mm OD/ID, z żarnikiem</td></tr><tr><td>Stół do izolacji drgań</td> Mikroskop serii <td></td><td>TMC</td><td>20</td></tr><tr><td></td><td>Manipulatory obiektywów zanurzeniowych Leica</td><td>DMLFS</td><td>40X</td></tr><tr><td></td><td>Scientifica</td><td>Wzmacniacze PatchStar</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Sterowana komputerowo</td></tr><tr><td>karta akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6229</td><td>Obsługiwane przez Comedi Linux</td></tr><tr><td>Sterowniki Komputer stacjonarny</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010 Tower</td><td>System operacyjny:</td></tr><tr><td>oscyloskopy</td> Linux w czasie rzeczywistym <td>Perfuzja Tektronix</td><td>TDS-1002</td><td></td></tr><tr><td> Pompa</td><td>Gibson</td><td>MINIPULS3</td><td>używana z głowicą pompy R4 (F117606)</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>TC02</td><td>PH01 Manometr kaniuli perfuzyjnej</td></tr><tr><td></td><td>Testo</td><td>510</td><td>Opcjonalny</td></tr><tr><td>inkubator</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>ACSF, ICS</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>ICS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-Fosfokreatyna</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>ICS</td></tr></tbody></table>

elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Neuronauka eksperymentalna jest świadkiem zwiększonego zainteresowania rozwojem i zastosowaniem nowych i często skomplikowanych protokołów zamkniętej pętli, gdzie zastosowany bodziec zależy w czasie rzeczywistym od odpowiedzi systemu. Najnowsze zastosowania obejmują zarówno wdrażanie systemów rzeczywistości wirtualnej do badania reakcji motorycznych zarówno u myszy1, jak i u danio pręgowanego2, a także kontrolę napadów padaczkowych po udarze korowym przy użyciu optogenetyki3. Kluczową zaletą technik pętli zamkniętej jest możliwość badania właściwości o wyższych wymiarach, które nie są bezpośrednio dostępne lub które zależą od wielu zmiennych, takich jak pobudliwośćneuronów4 i niezawodność, przy jednoczesnej maksymalizacji przepustowości eksperymentu. W tym artykule i w kontekście elektrofizjologii komórkowej opisujemy, w jaki sposób można zastosować różne protokoły zamkniętej pętli do badania właściwości odpowiedzi neuronów kory piramidalnej, zarejestrowanych wewnątrzkomórkowo za pomocą techniki zacisku łatowego w ostrych wycinkach mózgu z kory somatosensorycznej młodych szczurów. Ponieważ żadne komercyjnie dostępne oprogramowanie typu open source nie zapewnia wszystkich funkcji wymaganych do efektywnego przeprowadzania opisanych tutaj eksperymentów, opracowano nowy zestaw narzędzi programowych o nazwie LCG5, którego modułowa struktura maksymalizuje ponowne wykorzystanie kodu komputerowego i ułatwia wdrażanie nowatorskich paradygmatów eksperymentalnych. Przebiegi stymulacji są określane za pomocą kompaktowego meta-opisu, a pełne protokoły eksperymentalne są opisane w tekstowych plikach konfiguracyjnych. Dodatkowo LCG posiada interfejs wiersza poleceń, który jest przystosowany do powtarzania prób i automatyzacji protokołów eksperymentalnych.

W poprzednich sekcjach opisaliśmy, jak wykorzystać zestaw narzędzi programistycznych LCG do charakterystyki właściwości elektrofizjologicznych komórek piramidalnych warstwy L5 oraz do odtworzenia aktywności synaptycznej przypominającej warunki in vivo w preparacie skrawkowym. Zastosowanie interfejsu wiersza poleceń oraz półautomatycznego protokołu sprzyja powtarzalności i efektywności eksperymentu, co może mieć istotny wpływ na wydajność i jakość uzyskanych danych. Ponadto, dzięki spójnemu sposobowi zapisu danyc...

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie dynamicznego zacisku in vitro w neuronach korowych przy użyciu ogólnodostępnego zestawu narzędzi programistycznych LCG. Osiąga się to poprzez przygotowanie skrawków kory somatosensorycznej szczura do rejestracji metodą patch clamp z komórek parametalnych. W drugim kroku do rejestrowanej komórki stosuje się serię zautomatyzowanych protokołów elektrofizjologicznych, co zapewnia standardową charakterystykę komórki, która będzie przydatna w późniejszych analizach i porównaniach między typami komórek.Następnie symulowana jest injekcja pobudzających i hamujących zdarzeń synaptycznych. Aby odtworzyć stan wysokiej przewodności występujący w neuronach neocortexu in vivo, wyniki pokazują, w jaki sposób tła synaptyczna injekcja moduluje wzmocnienie komórek korowych. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami jest możliwość włączania rejestracji eksperymentalnych w bardziej złożone przepływy pracy poprzez wykorzystanie, na przykład, wyniku jednego protokołu eksperymentalnego jako danych wejściowych do innego protokołu.Ta metoda może pomóc w standaryzacji protokołów elektrofizjologicznych, przyspieszyć analizę danych i utorować drogę do wymiany danych pomiędzy laboratoriami. Chociaż metoda ta została pierwotnie opracowana dla rejestracji CLA w technice whole-cell patch clamp in vitro, może być ona również wygodnie stosowana w innych preparatach i protokołach doświadczalnych, takich jak rejestracje patch CLA in vivo lub rejestracje z wykorzystaniem mikroelektrod wielokanałowych. Po wyjęciu mózgu szczura należy usunąć móżdżek i oddzielić obie półkule wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela, usunąć nadmiar płynu z jednej z półkul i przykleić ją do nachylonej platformy za pomocą kropli superglue.Następnie szybko dodaj kilka kropli CSF na mózg i przenieś go do komory Vibram. Usuń pierwsze 2,5 do trzech milimetrów tkanki mózgowej za pomocą ostrza. Następnie dostosuj prędkość i częstotliwość cięcia, aby ograniczyć uszkodzenia powierzchni skrawka.Następnie ustaw grubość na 300 µm i rozpocznij krojenie. Gdy ostrze przejdzie poza korę, użyj żyletki lub zgiętej igły, aby wykonać nacięcie nad hipokampem oraz na krawędziach interesującego obszaru kory. Po tym etapie przenieś skrawki do wielodobojowej komory inkubacyjnej w temperaturze 36 °C.W tej procedurze należy umieścić przekrój w komorze rejestracyjnej z obiektywem o powiększeniu 40x. Należy wyszukać zdrowe komórki w warstwie piątej, na głębokości od 600 do 1000 mikrometrów poniżej powierzchni mózgu; komórki te zazwyczaj charakteryzują się niższym kontrastem, gładkim wyglądem i nie są obrzękłe.Po znalezieniu zdrowej komórki, napełnij jedną trzecią mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść ją w głowicy w tak skonfigurowanym systemie operacyjnym Linux. Uruchom polecenie.Poczekaj na pojawienie się znaku zachęty powłoki. Wpisz tę komendę, aby upewnić się, że karta akwizycji danych nie steruje wzmacniaczem. Następnie przyłóż od 30 do 50 milibarów nadciśnienia, naciskając tłok strzykawki podłączonej do uchwytu pipety.Następnie umieść pipetę około 100 µm nad skrawkiem i przesuń ją w stronę komórki docelowej, korzystając z trybu zbliżania (approach mode) mikromanipulatora. Po tym ustaw odpowiednie przesunięcie pipety (offset) w wzmacniaczu elektrofizjologicznym i podaj impuls testowy o wartości 10 mV w trybie clamp napięciowy (voltage clamp). Użyj polecenia LCG SEAL do monitorowania rezystancji pipety, a następnie zmniejsz ciśnienie do 10–30 mbar, wycofując tłok strzykawki.Powoli zbliżyć pipetę do komórki i sprawdzić, czy utworzył się wgłobienie, obserwując obraz na monitorze kamery wideo. Jednocześnie monitorować wzrost oporu wywołany impulsem próbnym, obserwując przebieg prądu wyświetlany na monitorze. W momencie wzrostu oporu pipety i powstania wgłobienia w komórce, natychmiast zwolnić nacisk i przyłożyć do pipety delikatne podciśnienie, aby wspomóc utworzenie uszczelnienia.W międzyczasie stopniowo zmniejszaj potencjał trzymający do wartości -70 mV. Zastosuj delikatne ssanie, aby przerwać błonę komórkową i uzyskać konfigurację whole-cell. Następnie określ charakterystykę elektryczną komórki.Korzystając z kodu LCGE. Przedstawiono tutaj średni potencjał czynnościowy neuronu parametal warstwy piątej z założonym potencjałem zablokowanym (patched) i progiem wynoszącym -50,5 mV. Rysunek ten pokazuje pomiar odpowiedzi pasywnych na prądy hiperpolaryzujące.Identyfikacja podstawowych właściwości aktywnych komórki wykazuje, że komórka jest neuronem o regularnej częstotliwości wyładowań i wykazuje minimalną adaptację na wstrzyknięte symulowane pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne; zmień katalog, w którym zostanie zapisany następny eksperyment, wpisując to polecenie w wierszu poleceń powłoki. Zamiast korzystać z konwencjonalnych sterowników sprzętowych wzmacniacza, aby przeprowadzić balansowanie mostka i kompensację pojemności, oszacuj jądro elektrody niezbędne do wykonania aktywnej kompensacji elektrody, wydając to polecenie.Pełny kernel jest sumą dwóch komponentów: szybkiego kernela elektrody oraz wolniejszego kernela błony, który odpowiada za wykładniczy ogon obserwowany w pełnym kernelu. Ten pierwszy stanowi model nieparametryczny pipety. Aby oddzielić kernele błony i elektrody podczas wstrzykiwania prądu, polecenie LCG kernel poprosi użytkownika o podanie liczby punktów składających się na szybki kernel elektrody. Następnie należy wybrać taką liczbę, aby kernel elektrody obejmował koniec wykładniczego ogona zaniku.Następnie przeprowadź eksperyment dynamic clamp, korzystając z tej komendy. Na koniec zwizualizuj wyniki. Oto odtworzenie aktywności typu in vivo z wykorzystaniem metody dynamic clamp.Ślady czerwone i niebieskie reprezentują odpowiednio symulację synaps pobudzających i hamujących. Poniżej przedstawiono przebiegi napięcia zarejestrowane z neuronu L5 z obszaru parametalnego, który został poddany bombardowaniu pobudzającymi lub hamującymi prądami postsynaptycznymi. Na wykresie pokazano odpowiadające im pobudzający, hamujący oraz całkowity prąd wstrzyknięty do komórki.Wykres rastrowy impulsów wygenerowanych w ciągu 20 prób pokazuje, że neuron może być niezwykle niezawodny i precyzyjny w odpowiedzi na ten sam sygnał wejściowy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów z dynamicznym oświetleniem przy użyciu bezpłatnego zestawu narzędzi programistycznych LCG. Procedurę tę można rozszerzyć na inne protokoły pętli zamkniętej w celu zbadania szerokiego zakresu zagadnień, od pobudliwości neuronalnej po złożone oddziaływania sieciowe.

real-time-electrophysiology-using-closed-loop-protocols-to-probe

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie zamkniętych protokołów do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

W tym artykule przedstawiono eksperymentalny framework do przeprowadzania eksperymentów w pętli zamkniętej, w którym przetwarzanie informacji (tj. kodowanie i dekodowanie) oraz uczenie się zespołów neuronalnych są badane podczas ciągłej interakcji z ciałem robota.

Eksperymenty neurorobotyczne w pętli zamkniętej w celu przetestowania właściwości obliczeniowych sieci neuronowych

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

W tym badaniu przedstawiono metodologię wykonywania wielomiejscowych zapisów elektrofizjologicznych in vivo ze szlaku hiperbezpośredniego w znieczuleniu uretanowym.

Ostre zapisy elektrofizjologiczne in vivo lokalnych potencjałów pola i aktywności wielocząsteczkowej ze szlaku hiperbezpośredniego u znieczulonych szczurów

Ten protokół pokazuje, jak używać systemu elektrofizjologicznego do stymulacji w pętli zamkniętej wywołanej wzorcami aktywności neuronalnej. Dostępny jest również przykładowy kod Matlab, który można łatwo modyfikować dla różnych urządzeń stymulacyjnych.

Wykorzystanie aktywności neuronów do wyzwalania bodźców w pętli zamkniętej w eksperymentach neurofizjologicznych

Opisujemy protokół oceny krzywych dawka-odpowiedź dla stymulacji pozaczaszkowej pod względem pomiarów pola elektrycznego mózgu i odpowiedniego biomarkera przepływu krwi w mózgu. Ponieważ protokół ten obejmuje inwazyjne umieszczenie elektrod w mózgu, potrzebne jest znieczulenie ogólne, w którym preferowane jest spontaniczne oddychanie, a nie kontrolowane oddychanie.

Umieszczenie zewnątrzczaszkowych elektrod stymulujących i pomiar przepływu krwi w mózgu i wewnątrzczaszkowych pól elektrycznych u znieczulonych myszy

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Poznaj dynamiczny clamp in vitro w neuronach kory mózgowej szczura przy użyciu oprogramowania LCG. Ta metoda umożliwia automatyzację protokołów elektrofizjologicznych i symulację zdarzeń synaptycznych w czasie rzeczywistym.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Przeglądaj więcej filmów