Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie dynamicznego zacisku in vitro w neuronach korowych przy użyciu ogólnodostępnego zestawu narzędzi programistycznych LCG. Osiąga się to poprzez przygotowanie skrawków kory somatosensorycznej szczura do rejestracji metodą patch clamp z komórek parametalnych. W drugim kroku do rejestrowanej komórki stosuje się serię zautomatyzowanych protokołów elektrofizjologicznych, co zapewnia standardową charakterystykę komórki, która będzie przydatna w późniejszych analizach i porównaniach między typami komórek.

Następnie symulowana jest injekcja pobudzających i hamujących zdarzeń synaptycznych. Aby odtworzyć stan wysokiej przewodności występujący w neuronach neocortexu in vivo, wyniki pokazują, w jaki sposób tła synaptyczna injekcja moduluje wzmocnienie komórek korowych. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami jest możliwość włączania rejestracji eksperymentalnych w bardziej złożone przepływy pracy poprzez wykorzystanie, na przykład, wyniku jednego protokołu eksperymentalnego jako danych wejściowych do innego protokołu.

Ta metoda może pomóc w standaryzacji protokołów elektrofizjologicznych, przyspieszyć analizę danych i utorować drogę do wymiany danych pomiędzy laboratoriami. Chociaż metoda ta została pierwotnie opracowana dla rejestracji CLA w technice whole-cell patch clamp in vitro, może być ona również wygodnie stosowana w innych preparatach i protokołach doświadczalnych, takich jak rejestracje patch CLA in vivo lub rejestracje z wykorzystaniem mikroelektrod wielokanałowych. Po wyjęciu mózgu szczura należy usunąć móżdżek i oddzielić obie półkule wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela, usunąć nadmiar płynu z jednej z półkul i przykleić ją do nachylonej platformy za pomocą kropli superglue.

Następnie szybko dodaj kilka kropli CSF na mózg i przenieś go do komory Vibram. Usuń pierwsze 2,5 do trzech milimetrów tkanki mózgowej za pomocą ostrza. Następnie dostosuj prędkość i częstotliwość cięcia, aby ograniczyć uszkodzenia powierzchni skrawka.

Następnie ustaw grubość na 300 µm i rozpocznij krojenie. Gdy ostrze przejdzie poza korę, użyj żyletki lub zgiętej igły, aby wykonać nacięcie nad hipokampem oraz na krawędziach interesującego obszaru kory. Po tym etapie przenieś skrawki do wielodobojowej komory inkubacyjnej w temperaturze 36 °C.

W tej procedurze należy umieścić przekrój w komorze rejestracyjnej z obiektywem o powiększeniu 40x. Należy wyszukać zdrowe komórki w warstwie piątej, na głębokości od 600 do 1000 mikrometrów poniżej powierzchni mózgu; komórki te zazwyczaj charakteryzują się niższym kontrastem, gładkim wyglądem i nie są obrzękłe.

Po znalezieniu zdrowej komórki, napełnij jedną trzecią mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść ją w głowicy w tak skonfigurowanym systemie operacyjnym Linux. Uruchom polecenie.

Poczekaj na pojawienie się znaku zachęty powłoki. Wpisz tę komendę, aby upewnić się, że karta akwizycji danych nie steruje wzmacniaczem. Następnie przyłóż od 30 do 50 milibarów nadciśnienia, naciskając tłok strzykawki podłączonej do uchwytu pipety.

Następnie umieść pipetę około 100 µm nad skrawkiem i przesuń ją w stronę komórki docelowej, korzystając z trybu zbliżania (approach mode) mikromanipulatora. Po tym ustaw odpowiednie przesunięcie pipety (offset) w wzmacniaczu elektrofizjologicznym i podaj impuls testowy o wartości 10 mV w trybie clamp napięciowy (voltage clamp). Użyj polecenia LCG SEAL do monitorowania rezystancji pipety, a następnie zmniejsz ciśnienie do 10–30 mbar, wycofując tłok strzykawki.

Powoli zbliżyć pipetę do komórki i sprawdzić, czy utworzył się wgłobienie, obserwując obraz na monitorze kamery wideo. Jednocześnie monitorować wzrost oporu wywołany impulsem próbnym, obserwując przebieg prądu wyświetlany na monitorze. W momencie wzrostu oporu pipety i powstania wgłobienia w komórce, natychmiast zwolnić nacisk i przyłożyć do pipety delikatne podciśnienie, aby wspomóc utworzenie uszczelnienia.

W międzyczasie stopniowo zmniejszaj potencjał trzymający do wartości -70 mV. Zastosuj delikatne ssanie, aby przerwać błonę komórkową i uzyskać konfigurację whole-cell. Następnie określ charakterystykę elektryczną komórki.

Korzystając z kodu LCGE. Przedstawiono tutaj średni potencjał czynnościowy neuronu parametal warstwy piątej z założonym potencjałem zablokowanym (patched) i progiem wynoszącym -50,5 mV. Rysunek ten pokazuje pomiar odpowiedzi pasywnych na prądy hiperpolaryzujące.

Identyfikacja podstawowych właściwości aktywnych komórki wykazuje, że komórka jest neuronem o regularnej częstotliwości wyładowań i wykazuje minimalną adaptację na wstrzyknięte symulowane pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne; zmień katalog, w którym zostanie zapisany następny eksperyment, wpisując to polecenie w wierszu poleceń powłoki. Zamiast korzystać z konwencjonalnych sterowników sprzętowych wzmacniacza, aby przeprowadzić balansowanie mostka i kompensację pojemności, oszacuj jądro elektrody niezbędne do wykonania aktywnej kompensacji elektrody, wydając to polecenie.

Pełny kernel jest sumą dwóch komponentów: szybkiego kernela elektrody oraz wolniejszego kernela błony, który odpowiada za wykładniczy ogon obserwowany w pełnym kernelu. Ten pierwszy stanowi model nieparametryczny pipety. Aby oddzielić kernele błony i elektrody podczas wstrzykiwania prądu, polecenie LCG kernel poprosi użytkownika o podanie liczby punktów składających się na szybki kernel elektrody. Następnie należy wybrać taką liczbę, aby kernel elektrody obejmował koniec wykładniczego ogona zaniku.

Następnie przeprowadź eksperyment dynamic clamp, korzystając z tej komendy. Na koniec zwizualizuj wyniki. Oto odtworzenie aktywności typu in vivo z wykorzystaniem metody dynamic clamp.

Ślady czerwone i niebieskie reprezentują odpowiednio symulację synaps pobudzających i hamujących. Poniżej przedstawiono przebiegi napięcia zarejestrowane z neuronu L5 z obszaru parametalnego, który został poddany bombardowaniu pobudzającymi lub hamującymi prądami postsynaptycznymi. Na wykresie pokazano odpowiadające im pobudzający, hamujący oraz całkowity prąd wstrzyknięty do komórki.

Wykres rastrowy impulsów wygenerowanych w ciągu 20 prób pokazuje, że neuron może być niezwykle niezawodny i precyzyjny w odpowiedzi na ten sam sygnał wejściowy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów z dynamicznym oświetleniem przy użyciu bezpłatnego zestawu narzędzi programistycznych LCG. Procedurę tę można rozszerzyć na inne protokoły pętli zamkniętej w celu zbadania szerokiego zakresu zagadnień, od pobudliwości neuronalnej po złożone oddziaływania sieciowe.