Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko
24 czerwca 2015
Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie dynamicznego zacisku in vitro w neuronach korowych przy użyciu ogólnodostępnego zestawu narzędzi programowych LCG. Osiąga się to poprzez przygotowanie wycinków kory somatosensorycznej szczurów do nagrań z komórek parametalicznych. W drugim kroku do zarejestrowanej komórki stosuje się szereg zautomatyzowanych protokołów elektrofizjologicznych, które zapewniają standardową charakterystykę komórki, która będzie przydatna w późniejszych analizach i porównaniach między typami komórek.
Następnie symuluje się wstrzykiwanie pobudzających i hamujących zdarzeń synaptycznych. Aby odtworzyć stan wysokiego przewodnictwa doświadczany przez neurony kory nowej in vivo, wyniki pokazują, w jaki sposób wstrzyknięcie synaptyczne w tle moduluje wzmocnienie komórek korowych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest możliwość osadzania nagrań eksperymentalnych w bardziej skomplikowanych przepływach pracy poprzez wykorzystanie, na przykład, wyniku jednego protokołu eksperymentalnego jako danych wejściowych do innego protokołu.
Metoda ta może pomóc w standaryzacji protokołów elektrofizjologicznych, przyspieszyć analizę danych i utorować drogę do udostępniania danych między laboratoriami. Chociaż metoda ta została pierwotnie opracowana dla hurtowych nagrań CLA z plastrami in vitro, może być również wygodnie stosowana do innych eksperymentalnych preparatów i protokołów, takich jak łatki in vivo, nagrania CLA lub nagrania akceleratora z mikro do matryc wyścigu. Po wyjęciu mózgu szczura wyrzuć móżdżek i oddziel dwie półkule wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela, usuń nadmiar płynu z jednej z półkul i przyklej go na pochyłej platformie za pomocą kropli super kleju.
Następnie szybko dodaj kilka kropli płynu mózgowo-rdzeniowego na mózg i przenieś go do komory Vibram. Usuń pierwsze 2,5 do trzech milimetrów tkanki mózgowej za pomocą ostrza. Następnie dostosuj prędkość i częstotliwość krojenia, aby ograniczyć uszkodzenia powierzchni plastru.
Następnie ustaw grubość na 300 mikrometrów i rozpocznij krojenie. Gdy ostrze przejdzie przez korę, użyj żyletki lub wygiętej igły, aby wykonać cięcie nad hipokampem i na krawędziach interesującego obszaru kory. Następnie przenieś plastry do wielodołkowej komory inkubacyjnej w temperaturze 36 stopni Celsjusza.
W tej procedurze umieść plasterek w komorze nagrywającej z soczewką o powiększeniu 40 razy. Szukaj zdrowych komórek w warstwie piątej i od 600 do 1000 mikrometrów. Poniżej powierzchni mózgu komórki te mają zwykle niższy kontrast, gładki wygląd i nie są spuchnięte.
Po znalezieniu zdrowej komórki załaduj jedną trzecią mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść go w stopniu głównym we wstępnie skonfigurowanym systemie operacyjnym Linux. Uruchom polecenie.
Shell dodaje swój monit. Wpisz to polecenie, aby upewnić się, że karta akwizycji danych nie steruje wzmacniaczem. Następnie należy zastosować nadciśnienie o wartości od 30 do 50 milibarów, naciskając tłok strzykawki, który jest podłączony do uchwytu na pipety.
Następnie umieść pipetę około 100 mikrometrów nad plasterkiem i przesuń pipetę w kierunku komórki docelowej, korzystając z trybu podejścia manipulatora mikrom. Następnie wyreguluj przesunięcie pipety na wzmacniaczu elektrofizjologicznym i wyprowadź impuls testowy o napięciu 10 miliwoltów w trybie cęgów napięciowych. Za pomocą polecenia LCG SEAL test monitoruj opór pipety, a następnie zmniejsz ciśnienie do 10 do 30 milibarów, wycofując tłok strzykawki.
Delikatnie podejdź do komórki i sprawdź, czy nie powstał wgłębienie, obserwując obraz na monitorze kamery wideo. W tym samym czasie monitoruj wzrost rezystancji wywołanej impulsem testowym, obserwując aktualny przebieg wyświetlany na monitorze. W przypadku wzrostu oporu pipety i powstania wgłębienia w komórce, należy natychmiast zwolnić ciśnienie i delikatnie podciśnienie przyłożyć pipetę, aby pomóc w tworzeniu uszczelnienia.
W międzyczasie stopniowo zmniejszaj potencjał utrzymywania do minus 70 miliwoltów. Zastosuj delikatne ssanie, aby rozerwać błonę komórkową i ustalić całą konfigurację komórek. Następnie scharakteryzuj ogniwo pod względem jego właściwości elektrycznych.
Za pomocą kodu polecenia LCGE. Oto średni potencjał czynnościowy neuronu parametalicznego z łataną warstwą piątą o progu ujemnym 50,5 miliwolta. Rysunek ten przedstawia pomiar pasywnych odpowiedzi na prądy hiperpolaryzacyjne.
Identyfikacja podstawowych właściwości aktywnych komórki ujawnia, że komórka jest regularnym neuronem impulsowym i istnieje minimalna adaptacja do wstrzykiwania symulowanych pobudzających, postsynaptycznych zmian potencjałów do katalogu, w którym następny eksperyment zostanie zapisany poprzez wpisanie tego polecenia w wierszu poleceń powłoki. Zamiast działać na konwencjonalne sterowanie sprzętowe wzmacniacza. Aby zastosować równoważenie mostka i kompensację pojemności, oszacuj jądro elektrody potrzebne do wykonania aktywnej kompensacji elektrody, wydając to polecenie.
Pełne jądro jest sumą dwóch składników, szybkiego jądra elektrody i wolniejszego jądra błonowego, które powoduje powstanie wykładniczego ogona obserwowanego w pełnym jądrze. Pierwszy z nich stanowi nieparametryczny model pipety Po wstrzyknięciu prądu w celu oddzielenia jądra membrany i elektrody, polecenie jądra LCG zapyta użytkownika o liczbę punktów, które składają się na jądro elektrody szybkiej. Następnie wybierz liczbę, aby jądro elektrody zakrywało koniec ogona rozpadu wykładniczego.
Następnie wykonaj eksperyment z zaciskiem dynamicznym za pomocą tego polecenia. Na koniec zwizualizuj wyniki. Oto odtworzenie aktywności podobnej do in vivo przy użyciu dynamicznego zacisku.
Czerwone i niebieskie ślady reprezentują symulację odpowiednio synaps pobudzających i hamujących. A oto ślady napięcia zarejestrowane z neuronu parametalicznego L 5, który został poddany bombardowaniu pobudzającymi lub hamującymi prądami postsynaptycznymi. Odpowiedni prąd pobudzający, hamujący i całkowity wstrzykiwany do ogniwa pokazano na wykresie.
Wykres rastrowy impulsów wygenerowanych w 20 próbach pokazuje, że neuron może być niezwykle niezawodny i precyzyjny w odpowiedzi na te same dane wejściowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty z lampami dynamicznymi za pomocą ogólnodostępnego zestawu narzędzi programowych. LCG. Procedura ta może zostać rozszerzona na inne protokoły zamkniętej pętli w celu zbadania szerokiej gamy tematów, od pobudliwości neuronalnej po złożone interakcje sieciowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia metodę przeprowadzania in vitro dynamicznego zacisku w korowych neuronach przy użyciu zestawu narzędzi oprogramowania LCG. Podejście to umożliwia zastosowanie zautomatyzowanych protokołów elektrofizjologicznych do efektywnego charakteryzowania korowych neuronów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauki
- Dynamika neuronów korowych
Tło
- Protokoły zamkniętej pętli są coraz częściej stosowane w elektrofizjologii.
- Techniki dynamicznego zacisku pozwalają na symulację zdarzeń synaptycznych.
- Charakteryzacja korowych neuronów jest niezbędna do zrozumienia ich funkcji.
- Istniejące metody nie mają elastyczności dla złożonych przepływów eksperymentalnych.
Cel badania
- Przedstawić uniwersalną metodę dynamicznego zacisku w korowych neuronach.
- Zautomatyzować protokoły elektrofizjologiczne do standardowej charakteryzacji.
- Symulować zdarzenia synaptyczne wzbudzające i hamujące in vitro.
Stosowane metody
- Przygotowanie skorup skorupy somatosensorycznej szczura.
- Rejestracji z zaciskowego patcha z komórek parametal.
- Zastosowanie zautomatyzowanych protokołów elektrofizjologicznych.
- Wstrzyknięcie symulowanych zdarzeń synaptycznych do modulacji wzmocnienia neuronów.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na osadzanie rejestracji eksperymentalnych w złożonych przepływach pracy.
- Tłowe wstrzyknięcie synaptyczne skutecznie moduluje wzmocnienie komórek korowych.
- Standardowa charakterystyka pomaga w porównaniu różnych typów komórek.
- Podejście to jest proste, wszechstronne i opłacalne.
Wnioski
- Ta technika poprawia badanie dynamiki korowych neuronów.
- Zapewnia ramy dla integracji różnych protokołów elektrofizjologicznych.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia zachowania neuronów in vitro.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Closed-loop electrophysiology enables precise interrogation of neuronal dynamics by linking stimulus delivery to real-time cellular responses, supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by simulating physiological synaptic bombardment and assessing neuronal reliability under controlled conditions. The LCG software toolbox facilitates workflow integration and reproducibility, positioning the method as a reusable capability for early discovery and assay development in neuroscience-focused drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal excitability and synaptic integration to validate functional targets in cortical circuits.
- Operational Value: Supports standardized characterization of electrophysiological properties across cell types for consistent target assessment.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts of spike reliability and gain modulation to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible voltage and current traces in response to simulated synaptic inputs for assay standardization.
- Operational Value: Enables automation of trial repetitions and protocol execution via command-line interface for high-throughput screening readiness.
- Assay Readiness: Produces quantifiable outputs such as action potential thresholds and spike raster plots for compound effect evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Mimics in vivo-like synaptic bombardment to improve relevance of preclinical neuronal models.
- Mechanistic De-risking: Allows testing of how background synaptic activity modulates neuronal gain, informing dose-response predictability.
- Preclinical Alignment: Supports cross-laboratory data sharing and protocol reproducibility for consistent target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports a discovery continuum from target validation through lead identification by enabling standardized neuronal phenotyping and dynamic pathway interrogation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of ion channel and receptor function through dynamic clamp-mediated synaptic simulation.
- Screening: Delivers reproducible electrophysiological profiles to support assay consistency and compound screening readiness.
- Analytics: Provides spike timing reliability, action potential morphology, and gain modulation metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Enhances preclinical validity by recreating in vivo synaptic conditions in vitro.
- Enterprise Reuse: LCG’s modular design allows adaptation across neuronal models and experimental paradigms for sustained utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal target validation through reliable, quantifiable electrophysiological phenotyping.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via automated protocols and software-driven execution.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on consistent neuronal response profiles across experimental conditions.
Implementation Considerations
- Expertise in patch clamp electrophysiology and dynamic clamp principles is required for successful implementation.
- Instrumentation includes a compatible data acquisition board, electrophysiology amplifier, and micromanipulator for precise electrode positioning.
- Analytical infrastructure must support LCG software execution, including a Linux-based system and sufficient storage for trial-based data acquisition.
- Cross-team standardization requires shared configuration files and protocol documentation to ensure reproducibility across laboratories.
- Adaptation to other neuronal types or in vivo preparations may require adjustments to slice health, intracellular solution, and stimulation parameters.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Brain Slice Preparation
2:49
Patch-clamp Recordings from Layer 5 Pyramidal Neurons
5:35
Injection of Conductance Through Simulated Synapses and Simulation of In Vivo-like Background Activity
6:47
Results: Recreation of In Vivo-like Activity Using Dynamic Clamp
7:34
Conclusion
