Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans
8 stycznia 2015
Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.
Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest zbadanie rozprzestrzeniania się i złożonej toksyczności białek podobnych do PreOn przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C elegancji. Osiąga się to poprzez monitorowanie transportu wewnątrz- i wewnątrzkomórkowego pęcherzyków zawierających białko podobne do PreOn, za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie specyficzne dla tkanek czujniki fałdowania i wszechobecny wyrażany stres.
Reportery służą do oceny autonomicznego i nieautonomicznego wpływu komórek na sprawność komórkową. Następnie przeprowadza się badanie przesiewowe RNAi całego genomu w celu zidentyfikowania nowych modyfikatorów toksyczności indukowanej przez PreOn. Przesiewanie wykonuje się w hodowli płynnej przy użyciu młócenia jako odczytu toksyczności.
Wreszcie, worm tracker, wtyczka do obrazu J służy do ilościowego określania ruchu elegancji C w połączeniu. Metody te pozwalają na wyodrębnienie szlaków genetycznych zaangażowanych w ruch międzykomórkowy białek takich jak PreOn i ich nieautonomicznej toksyczności komórkowej. Po przygotowaniu zsynchronizowanych linii transgenicznych do kontroli morskiej elegancji i domeny PreOn oraz 10% podkładek agros, zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, należy odpipetować trzy mikrolitry 100 nanogramów kulek polistyrenowych i trzy mikrolitry czterech milimolowych limassoli do podkładki agros
.Za pomocą kilofa z drutu platynowego przenieś robaki w pożądanym wieku z płytki do roztworu i użyj szkiełka nakrywkowego do przykrycia, aby zobrazować robaki na poziomie subkomórkowym. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka mikroskopowego mikroskopu konfokalnego i użyj obiektywu olejowego 63 x lub 100 x 1,4 NA. Następnie otwórz METAMORPH i wybierz akwizycję wielowymiarową.
A pod główną zakładką zaznacz pola poklatkowe i uruchom dzienniki. Na karcie zapisywania wybierz lub utwórz folder katalogu do zapisywania plików i przypisz nazwę do pliku Na karcie długości fali użyj poczwórnego czerwonego podświetlenia Yoko lub równoważnego oświetlenia obrazowania MRFP i dostosuj ekspozycję do zakresu od 100 do 300 milisekund, a wzmocnienie aparatu do zakresu od 100 do 300. Następnie na karcie upływ czasu ustaw interwał czasu na jedną sekundę, czas trwania na pięć minut, a liczbę punktów czasowych na 301.
W zakładce dzienniki. Dla dziennika wybierz zestaw A FC, wstrzymanie Z i powrót FC do wstrzymania Z dla typu wybierz specjalny dwa razy, a dla punktu początkowego wybierz początek punktu czasu i koniec punktu czasu. Po zakończeniu konfiguracji naciśnij przycisk acquire Zgodnie z tą procedurą, w celu pomiaru właściwości dynamicznych dysku można zastosować inne metody, takie jak aplikacje do śledzenia cząstek.
Po zsynchronizowaniu domeny prionowej transgenicznej i podczas typowania nicieni oraz skopiowaniu płytek biblioteki inger RNAI zgodnie z protokołem tekstowym, inkubuj zduplikowane płytki RNAi w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min, aby użyć HT jednej 15 bakterii E coli zawierających pusty wektor L 4 4 4 0 jako kontrolę. Hoduj go oddzielnie w probówce hodowlanej, a następnie użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 65 mikrolitrów kultury do jednej czwartej studzienek o pojemności 2 96. Płytki studzienne ze zautomatyzowaną stacją roboczą zawierającą dozowaną głowicę wielokanałową.
10 mikrolitrów po pięć milimolowych rozcieńczonych IPTG do każdej studzienki bakterii RNAi i płytek kontrolnych. Zamknij je ponownie przed inkubacją przez trzy godziny, podczas gdy bakterie wysiadują. Wymieszaj zsynchronizowaną kontrolę typu dzikiego i transgeniczną L jedną larwę i M dziewięć baseniny i pipetuj od pięciu do 10 mikrolitrów na szklany mikroskop.
Slajd policz robaki i oblicz liczbę robaków na mikrolitr. Po trzygodzinnej inkubacji bakteryjnej wyjmij płytki z inkubatora i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową, aby uniknąć stresu cieplnego robaków. Następnie uzupełnij bufor M nine cholesterolem IPTG i antybiotykami zgodnie z protokołem tekstowym.
I dodaj odpowiednią objętość roztworu robaka transgenicznego w domenie PreOn do końcowego stężenia 15 robaków na mikrolitr mieszanki, aby równomiernie rozprowadzić. Następnie dozować 50 mikrolitrów do każdej studzienki płytek RNAi i dołków jednej z pustych płytek kontrolnych wektorowych. Dozować roztwór robaka typu dzikiego do drugiej płytki kontrolnej.
Następnie pozostaw wszystkie płytki otwarte, aby umożliwić napowietrzenie i zapobiec parowaniu płynnej kultury, układając cztery do pięciu płytek razem, owijając je wilgotnym ręcznikiem papierowym, a następnie folią aluminiową. Inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez cztery dni. Do płyt użyj kamery Falcon four M 60 podłączonej do komputera z monitorem, aby wizualnie przesiewać zwiększone młócenie w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami transgenicznymi w domenie PreOn.
Główną zaletą korzystania ze zautomatyzowanej stacji roboczej do obsługi cieczy do dozowania robaków do płytek R RNAi jest to, że znacznie zmniejsza to zmienność i liczbę robaków w studzience. Aby przeprowadzić test ruchliwości na płytkach stałych i zwalidować kandydujące klony RNAi, należy wyhodować bakterie RNAi w ciągu nocy, zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie użyj jednego milimolowego IPTG, aby indukować ekspresję DS RNA przez trzy godziny.
Użyj 150 mikrolitrów każdego klonu bakteryjnego RNAi, aby wysiać wcześniej przygotowane płytki NGM, rozprowadzając je cienką warstwą. Pozostaw bakterie do wyschnięcia na dwa dni w temperaturze pokojowej w ciemności pod mikroskopem stereoskopowym. Określ ilość zsynchronizowanych robaków i zawiesiny, jak opisano wcześniej, i dodaj od 25 do 30 l jednej larwy do każdej płytki doświadczalnej.
Wysiaduj nicienie w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez cztery dni, aż robaki dotrą. Drugi dzień dorosłości, aby określić ilościowo ruchliwość robaków, włącz aparat i proste oprogramowanie do obrazowania PCI. Kliknij ikonę aparatu, aby włączyć regulację warunków obrazowania.
Następnie skonfiguruj warunki obrazowania w następujący sposób. Ustaw wzmocnienie na zero, tryb światła, indeks wysokiej prędkości na jeden i binning na dwa. Następnie kliknij na żywo i automatycznie naświetlaj i dostosuj warunki oświetleniowe, przesuwając lustra mikroskopu oraz pokrętła jasności i kontrastu.
Kliknij czas, zeskanuj i wpisz folder i nazwę pliku, ustaw opóźnienie pola na 20 milisekund i zatrzymaj się na czasie na 30 sekund. Naciśnij podgląd na żywo, aby wybrać obszar płyty do nagrywania. Następnie stuknij w płytkę trzy lub cztery razy na stole montażowym.
Szybko potwierdź jego pozycję w polu view i naciśnij start po zakończeniu nagrywania filmu, kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz eksport sekwencji montażu, aby wyeksportować film z formatu CXD do pliku A VI. Aby przeanalizować filmy z ruchliwością, otwórz obraz J, wybierz zakładkę wtyczek, a następnie wybierz śledzenie robaków i wybierz partię Worm Tracker, a następnie wybierz katalog zawierający wszystkie pliki do analizy w głównym oknie wejściowym wsadu Worm Tracker, załaduj wartości wejściowe zgodnie z opisem tutaj. Wyjaśnienie każdego z parametrów można znaleźć w instrukcji, która jest dołączona do wtyczki.
Kliknij przycisk OK i zezwól na uruchomienie analizy ruchu. Na koniec, aby wyselekcjonować wyniki, upewnij się, że wszystkie wykryte ślady pochodzą z rzeczywistej morskiej elegancji i wyeliminuj artefakty. Otwórz pliki TXT utworzone dla każdego filmu i skopiuj informacje do pliku oprogramowania do analizy danych.
Otwórz utworzone pliki zip etykiet i uruchom wynikowe etykiety TIFF, aby ręcznie sprawdzić i wyeliminować fałszywe ślady robaków. Yesper Peterson, były doktor habilitowany w laboratorium, jako pierwszy wpadł na pomysł urządzenia do śledzenia robaków jako substytutu naszej ręcznej oceny motilu CL Elegance, która jest odczytem toksyczności. Narzędzie do śledzenia robaków pozwala nam przeprowadzać te eksperymenty w sposób zautomatyzowany, bez uprzedzeń użytkownika, jednocześnie oceniając więcej warunków w krótszym czasie za pomocą obrazowania poklatkowego.
Zapytania ofertowe oznaczone jako R dwa E dwa, które gromadzą się w pęcherzykach rurkowych, zaobserwowano, że są transportowane wewnątrz i między komórkami przez coex wyrażający czujnik składania lub reporter stresu. Wraz z komórką białkową podobną do PreOn można ocenić autonomiczne i nieautonomiczne efekty komórkowe. Ekspresja R dwa E dwa w komórkach mięśniowych prowadzi do wcześniejszego początku agregacji Q 44 w jelicie, ujawniając, że R dwa E dwa ma nieautonomiczny wpływ na proteostazę koekspresja R dwa E dwa Z SOD trzy PGFP Reporter transkrypcyjnego stresu oksydacyjnego prowadzi do regulacji w górę reportera w różnych tkankach, wykazując, że domena PreOn indukuje odpowiedź na stres oksydacyjny autonomicznie w komórkach podążających za badaniem przesiewowym całego genomu.
Ten film pokazuje, że obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i wizualizacja na ekranie komputera umożliwiają jednoczesne wyświetlanie jednej czwartej płytki Po opanowaniu, te protokoły przesiewowe można wykonać w 12 rundach po 25 płyt na sesję. Jeśli wykonywane są dwie sesje w tygodniu, cała biblioteka RNAi może zostać poddana badaniom przesiewowym w ciągu sześciu tygodni. Narzędzie do śledzenia robaków zostało użyte do ilościowego określenia ruchliwości elegancji C, jak widać tutaj.
Worm Tracker konwertuje oryginalny film na format binarny, a każdy robak ma przypisaną ścieżkę. Przetworzone filmy można oglądać z nałożonymi ścieżkami w celu ręcznego wyeliminowania wszelkich artefaktów. Parametr długości ciała na sekundę normalizuje się pod kątem potencjalnych różnic rozmiarów. Nicienie.
W ramach tej metody zidentyfikowano 35 supresorów toksyczności indukowanej przez PreOn, które zwiększały fenotyp ruchliwości do co najmniej 133% i do 256% w porównaniu z kontrolnymi robakami poddanymi działaniu środka zapobiegawczego. Wynajmując lokalizator robaków, należy pamiętać o ręcznej weryfikacji uzyskanych śladów robaków. Oprogramowanie świetnie radzi sobie z identyfikacją robaków, ale czasami tło może być błędnie zidentyfikowane jako zwierzę.
Dlatego pamiętaj, aby sprawdzić swoje filmy po uruchomieniu na nich narzędzia do śledzenia robaków. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak to, czy określone białko związane z chorobą jest w stanie rozprzestrzeniać się z komórki na komórkę, podobnie jak w przypadku choroby lub czy istnieje związek między transmisją międzykomórkową a złożoną toksycznością tych białek. Dzieci.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje prionopodobną propagację agregatów białkowych z wykorzystaniem nicieni C. elegans jako systemu modelowego. Badania koncentrują się na monitorowaniu rozprzestrzeniania się białek oraz ocenie toksyczności związanej z białkami typu PreOn.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Choroby neurodegeneracyjne
- Agregacja białek
- Organizmy modelowe
Wstęp
- Rozprzestrzenianie się białek w sposób prionopodobny jest zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne.
- C. elegans służy jako skuteczny model do badania dynamiki białek.
- Zrozumienie rozprzestrzeniania się białek może dostarczyć wiedzy na temat toksyczności komórkowej.
- Monitorowanie transportu pęcherzykowego jest kluczowe dla oceny zachowania białek.
Cel badania
- Zbadanie rozprzestrzeniania się białek typu PreOn.
- Zbadanie toksyczności związanej z tymi białkami.
- Identyfikacja modyfikatorów toksyczności indukowanej przez PreOn za pomocą przesiewu RNAi.
Zastosowane metody
- Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse do monitorowania transportu pęcherzyków.
- Tkankowo specyficzne sensory fałdowania do oceny fałdowania białek.
- Ubikwitynie ekspresjonowane reportery stresu do oceny kondycji komórkowej.
- Genomowy skrining RNAi w celu identyfikacji nowych modyfikatorów toksyczności.
Główne wyniki
- Skuteczne monitorowanie transportu białek wewnątrzkomórkowego i międzykomórkowego.
- Identyfikacja efektów autonomicznych i nieautonomicznych komórkowo wpływających na kondycję organizmu.
- Odkryto nowe modyfikatory toksyczności indukowanej przez PreOn.
- Odczyt fenotypu Thrasher w hodowli płynnej dostarczył informacji na temat poziomu toksyczności.
Wnioski
- Badanie to pogłębia zrozumienie agregacji białek w procesach neurodegeneracji.
- C. elegans stanowi wartościowy model do badania zjawisk prionopodobnych.
- Wyniki mogą doprowadzić do opracowania nowych celów terapeutycznych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsze badanie ustanawia model metazoiczny u C. elegans w celu zbadania rozprzestrzeniania się białek prionopodobnych i związanej z tym toksyczności, wypełniając tym samym istotną lukę w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Poprzez umożliwienie bezpośredniego monitorowania domen prionowych znakowanych fluorescencyjnie u żywych zwierząt oraz ułatwienie przesiewów genetycznych, podejście to wspiera walidację celów i redukcję ryzyka mechanistycznego w rozwoju terapeutyków. Model ten dostarcza istotnego z punktu widzenia patogenezy układu do oceny transmisji międzykomórkowej oraz zaburzeń proteostazy, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania wczesnych decyzji w procesie odkrywania leków na zaburzenia agregacji białek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących rozprzestrzeniania się białek prionopodobnych oraz mechanizmów toksyczności komórkowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację transportu międzykomórkowego i wewnątrzkomórkowego agregatów białkowych w żywym systemie.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia identyfikację modyfikatorów genetycznych wpływających na toksyczność, co pomaga w zwiększeniu pewności co do wyboru celu terapeutycznego oraz w selekcji projektów w portfolio dla wskazań neurodegeneracyjnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zwalidowany system biologiczny do przygotowania ustandaryzowanych testów w celu monitorowania transportu pęcherzyków i odpowiedzi na stres.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowy screening RNAi w kulturze płynnej, w której miotanie się (thrashing) służy jako ilościowy i powtarzalny odczyt toksyczności.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy do screeningu dużych bibliotek genetycznych, z udowodnioną zdolnością do przeselekcjonowania całych bibliotek RNAi w ciągu sześciu tygodni przy użyciu zautomatyzowanych przepływów pracy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje związek z patogenezą choroby poprzez powiązanie ekspresji białek prionopodobnych z odpowiedziami na stres oksydacyjny i zaburzeniami proteostazy w różnych tkankach.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z fazy wstępnej z walidacją przedkliniczną za pomocą mierzalnych fenotypów, takich jak defekty motoryczne i kinetyka agregacji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację modyfikatorów hamujących toksyczność, co zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu terapeutycznego.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z ciągiem procesów badawczych, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, wspierając testowanie hipotez oraz wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych w programach badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących międzykomórkowego przemieszczania się białek prionopodobnych oraz ich nieautonomicznych efektów komórkowych w odniesieniu do kondycji komórkowej.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość analizy dzięki fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej oraz kwantyfikacji motywności w oparciu o system śledzenia nicieni, co gwarantuje powtarzalne wyniki ilościowe.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty, w tym dynamikę transportu pęcherzyków, zachowanie thrashing oraz aktywację reporterów stresu w celu porównawczej analizy warunków.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez obserwowane nieautonomiczne efekty komórkowe w zakresie proteostazy i stresu oksydacyjnego, istotne dla modelowania chorób.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną zdolność do przesiewania genetycznego i farmakologicznego, redukując zmienność dzięki zautomatyzowanej obsłudze cieczy i zestandaryzowanym protokołom obrazowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez wyjaśnienie mechanizmów rozprzestrzeniania się białek prionopodobnych i związanej z nimi toksyczności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zsynchronizowanemu przygotowaniu nicieni, kontrolowanym warunkom środowiskowym oraz zautomatyzowanemu śledzeniu motywności.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową, umożliwiając szybkie przesiewanie modyfikatorów genetycznych i redukując biologiczne ryzyko na późnych etapach dzięki wczesnemu zrozumieniu mechanizmów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację supresorów toksyczności, które przywracają fenotypy motywności, co dostarcza danych do decyzji o dalszym rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z C. elegans, mikroskopii fluorescencyjnej oraz metodologii przesiewowej RNAi.
- Zależne od dostępu do mikroskopii konfokalnej z odpowiednimi obiektywami (63x lub 100x, 1.4 NA oil) oraz oprogramowania do obrazowania (METAMORPH, wtyczka Worm Tracker).
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie synchronizacji preparowania nicieni, warunków hodowli w cieczy oraz przeprowadzania testów motywności.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne przy przenoszeniu wyników z C. elegans na systemy ssacze, w szczególności w odniesieniu do konserwacji mechanizmów prionopodobnych.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność ręcznej weryfikacji wyników z programu Worm Tracker w celu wyeliminowania fałszywych ścieżek powstałych w wyniku artefaktów tła.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Monitoring Transcellular Spreading of Prion-like Proteins by In Vivo Time-lapse Imaging
3:31
Genome-wide Screen for Suppression of Prion-induced Toxicity in C. elegans
6:22
Confirmation of Preliminary Screen Hits
9:57
Results: Analyzing the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins
12:29
Conclusion
