Name: Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Poznaj metody badania rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych w organizmie modelowym C. elegans. Wykorzystaj mikroskopię fluorescencyjną, sensory zwijania białek oraz ekranowanie RNAi do identyfikacji nowych modyfikatorów toksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Cindy Voisine i Yoko Shibata za pomocną dyskusję i krytyczne komentarze na temat rękopisu. Dziękujemy za udzieloną pomoc: Laboratorium Analiz Wysokoprzepustowych (HTAL) oraz Zakładowi Obrazowania Biologicznego (BIF) na Uniwersytecie Northwestern. Praca ta została sfinansowana z grantów z National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), Ellison Medical Foundation oraz Fundacji Daniela F. i Ady L. Rice (dla R.I.M.). C.I.N.-K. została wsparta przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Monitorowanie transkomórkowego rozprzestrzeniania się białek prionopodobnych za pomocą obrazowania in vivo w czasie
UWAGA: Hoduj linie dzikiego typu (WT) (N2) oraz linie transgeniczne C. elegans zgodnie ze standardowymi metodami i ściśle kontroluj temperaturę hodowli47.
<ol>
	<li>Wygeneruj linie transgeniczne C. elegans wykazujące ekspresję białka prionopodobnego, oznakowanego monomerycznym czerwonym białkiem fluorescencyjnym (mRFP). Obejrzyj ten film, który demonstruje sposób stosowania mikroiniekcji48. Aby uzyskać więcej szczegółów i metod opisujących sposób integracji tych linii ekstrachromosomalnych, zapoznaj się z49.</li>
	<li>Przygotuj zsynchronizowane populacje poprzez składanie jaj lub wybielanie zgodnie ze standardowymi metodami50.
	<ol>
		<li>Synchronizacja poprzez składanie jaj
		<ol>
			<li>Przenieś 10 - 20 dorosłych osobników zapłodnionych na płytkę i pozwól im składać jaja przez 1 - 2 h. Usuń dorosłe osobniki z płytki i pozwól potomstwu rosnąć do pożądanego wieku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Synchronizacja poprzez wybielanie
		<ol>
			<li>Zbierz niezsynchronizowaną populację dorosłych osobników zapłodnionych i wybiel je za pomocą alkalicznego roztworu podchlorynu (250 mM NaOH i rozcieńczenie komercyjnego wybielacza w H2O w stosunku 1:4 (v/v)). Przemyj jaja dwukrotnie (218 x g przez 1 min) buforem M947 (21 mMNa2HPO4·7H2O, 22 mMKH2PO4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO4·7H2O, dodać dH2O do objętości 1 L).</li>
			<li>Pozostaw je do wyklucia w buforze M9 przy łagodnym mieszaniu przez noc (O/N) w temperaturze 20 °C. Rozwój nicieni zostanie zatrzymany w stadium L1 wobec braku źródła pożywienia, co pozwoli uzyskać zsynchronizowaną populację. Przenieś stadiy L1 na świeże płytki z pożywką dla nicieni (NGM) zaszczepione bakteriami E. coli OP50 i pozwól potomstwu rozwijać się do pożądanego wieku47.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 2% podkładki agarowe (w H2O) na szkiełku przedmiotowym zgodnie z opisem50.
	<ol>
		<li>Przygotuj dwa szkiełka przedmiotowe z naklejonymi taśmami etykietami na całej ich długości, które będą służyć jako dystansery. Umieść trzecie szkiełko przedmiotowe pomiędzy nimi.</li>
		<li>Rozpuść 2% agarozy w H2O i nanieś jedną kroplę na czyste szkiełko.</li>
		<li>Umieść czwarte szkiełko prostopadle do trzech pozostałych szkiełek na kropli agaru. Delikatnie dociśnij je, aby spłaszczyć podkładkę do tej samej grubości co taśma etykietująca.</li>
		<li>Pozostaw do wyschnięcia na 1 min przed usunięciem dystanserów i delikatnym rozdzieleniem szkiełek. Podkładka agarowa przylgnie do jednego z nich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieś pipetą ~10 µl środka anestetycznego (2 mM lewamisolu w buforze M9) na podkładkę i przenieś ~10 osobników za pomocą igły platynowej. Przykryj szkiełkiem nakrywką (~22 x 22 mm) i wykonaj zdjęcia w ciągu 1 h.</li>
	<li>Alternatywnie, aby uzyskać filmy z dłuższego okresu czasu lub dodatkowo zminimalizować możliwość ruchu zwierząt, zastosuj kombinację anestetyka i unieruchomienia za pomocą kulek51.
	<ol>
		<li>Przygotuj 10% podkładki agarowe (w buforze M9) zgodnie z opisem51 i dodaj nicienie do 3 µl roztworu standardów wielkości nanosfer (kule polistyrenowe, 100 nm) oraz 3 µl środka anestetycznego (4 mM lewamisolu w buforze M9). Delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywką. Aby uniknąć wysychania, uszczelnij szkiełko nakrywką VALAPem (mieszaniną równych ilości wazeliny, lanoliny i wosku parafiniowego).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie unieruchomionych nicieni za pomocą mikroskopu konfokalnego. 
	UWAGA: Wyniki uzyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu dyskowego (Spinning Disc AF) wyposażonego w kamerę EM-CCD oraz oprogramowanie do automatyzacji mikroskopii i analizy obrazu, takie jak MetaMorph; poniżej opisano szczegóły, jednak można również użyć innych porównywalnych systemów obrazowania konfokalnego.
	<ol>
		<li>Użyj obiektywu olejowego 63X lub 100X/1.4NA i umieść szkiełko przedmiotowe z nicieniami w uchwycie na szkiełko.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie. Dostosuj moc lasera i filtry do obrazowania mRFP. Użyj lasera 561 nm przy mocy 10% i filtra emisyjnego &gt;600 nm.</li>
		<li>Otwórz funkcję „MultiDimensional Acquisition”. W zakładce „Main” zaznacz pola „Timelapse” i „Run Journals” (Hardware Auto Focus: wyłączony).</li>
		<li>W zakładce „Saving” wybierz lub utwórz folder katalogu, w którym mają zostać zapisane pliki. Przypisz nazwę do pliku.</li>
		<li>W zakładce „Wave Length” wybierz odpowiednie oświetlenie i dostosuj czas ekspozycji oraz wzmocnienie (gain). Użyj ustawienia „YokoQuad Red” (lub równoważnego ustawienia oświetlenia dla obrazowania mRFP) z czasem ekspozycji od 100 do 300 msec i wzmocnieniem kamery od 100 do 300, w zależności od poszczególnych próbek (oceniając na podstawie obrazu na żywo).</li>
		<li>W zakładce „Timelapse” wybierz „Number of time points” = 301, „Duration” = 5 min oraz „Time/Interval” = 1 sec.</li>
		<li>W zakładce „Journals” wybierz Journal: „AFC SET Z HOLD” i „AFC Return to Z HOLD”, Type: „Special” (dwukrotnie), Initial Point: „Start of time point” oraz „End of time point”. Ta opcja autofokusa jest istotna dla obrazowania tego samego przekroju przez dłuższy czas.</li>
		<li>Po zakończeniu konfiguracji naciśnij „Acquire”. Film timelapse zostanie zapisany jako oddzielne pliki TIFF.</li>
		<li>Otwórz wszystkie pliki .tiff danej serii czasowej w programie ImageJ. Przejdź do „Image” → „Stacks” → „Images to Stacks”. Opcjonalnie dostosuj jasność i kontrast, dodaj pasek skali itp. Eksportuj film przez „File” → „Save as” → „AVI…” (przykład znajduje się w Video 1 i 2 odpowiadających Rysunkowi 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykorzystanie czujników fałdowania i reporterów stresu do badania autonomicznych komórkowych i nieautonomicznych komórkowych wpływów na proteostazę i toksyczność
<ol>
	<li>Wytworzyć linie transgeniczne współwyrażające sensor fałdowania lub reporter stresu wraz z białkiem prionopodobnym. Metody przeprowadzania krzyżówek lub wytwarzania linii transgenicznych opisano w źródłach48,49,52. Listę szczepów C. elegans, które można wykorzystać, przedstawiono w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotować zsynchronizowane populacje zwierząt transgenicznych i hodować je do pożądanego wieku zgodnie z powyższym opisem (sekcja 1.2)50.</li>
	<li>Za pomocą stereomikroskopu zbadać odpowiedni fenotyp sensora fałdowania lub reportera stresu.
	<ol>
		<li>W przypadku sensora fałdowania określić liczbę zwierząt z agregatami w każdym dniu po synchronizacji (przykład przedstawiono na Ryc. 2E i F).</li>
		<li>W przypadku reportera stresu sprawdzić, czy współwyrażanie białka prionopodobnego prowadzi do zwiększenia fluorescencji reportera (przykład przedstawiono na Ryc. 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przesiew genomowy w celu zidentyfikowania supresji toksyczności indukowanej prionami u C. elegans
<img alt="Proces eksperymentu RNAi, etapy inkubacji, nicienie w stadium L1, metoda: przesiewanie genów, schemat." src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Schematyczna reprezentacja protokołu przesiewowego RNAi. Szczegółowy opis poszczególnych kroków znajduje się w sekcji 3 protokołu.
<ol>
	<li>Synchronizacja nicieni C. elegans i powielenie biblioteki RNAi
	<ol>
		<li>Do przesiewu RNAi należy użyć biblioteki RNAi Ahringera (lub biblioteki RNAi Vidala)53,54. Przenieść bibliotekę RNAi z oryginalnego formatu 384-dołkowego do płytek 96-dołkowych, wypełniając płytki 100 µl pożywki LB-amp (50 μg/ml ampicyliny w LB) uzupełnionej o 10% glicerolu, a następnie zaszczepić je za pomocą replikatora 96-pinowego. Hodować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem i przechowywać w -80 °C.</li>
		<li>Utrzymywać linie WT oraz linie transgeniczne C. elegans w temperaturze 20 °C na płytkach NGM z wysianymi bakteriami E. coli OP50 zgodnie ze standardowymi metodami47.</li>
		<li>Zsynchronizować nicienie transgeniczne z domeną prionową oraz nicienie WT (kontrolne) poprzez wybielanie (patrz sekcja 1.2).</li>
		<li>W tym samym dniu, w którym przeprowadzane jest wybielanie nicieni, przygotować pożywkę LB uzupełnioną o 50 μg/ml ampicyliny. Używając automatycznego dozownika odczynników, rozdzielić (lub pipetować ręcznie) 65 μl pożywki LB-amp do każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Wyjąć płytki z 96-dołkową biblioteką RNAi Ahringera z -80 °C i przenieść je do sterylnego dygestorium wyłożonego ręcznikami papierowymi. Natychmiast usunąć taśmę uszczelniającą, trzymając płytkę dnem do góry, gdy płytki są jeszcze zamrożone, uważając, aby uniknąć kontaminacji lodem z zewnętrznej strony płytek. Odwrócić płytki i pozostawić do rozmrożenia przez około 30 min.</li>
		<li>Zanurzyć sterylny replikator 96-pinowy w jednej płytce biblioteki RNAi, a następnie w jednej świeżej płytce z LB-amp. Do każdej płytki należy używać świeżego, sterylnego replikatora. Wszystkie płytki uszczelnić folią klejącą i zwrócić płytki biblioteki do -80 °C. Replikatory można moczyć w wybielaczu, płukać i autoklawować w celu ponownego użycia.</li>
		<li>Pozostawić powielone płytki RNAi do wzrostu przez noc w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 300 rpm. Aby użyć bakterii E. coli HT115 zawierających pusty wektor (L4440) jako kontrolę, hodować je oddzielnie w probówce, a następnie pipetować 65 μl hodowli za pomocą pipety wielokanałowej do jednej czwartej dwóch płytek 96-dołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja produkcji bakteryjnego dsRNA i dodanie nicieni
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć izopropyl-β-D-thiogalaktopiranozyd (IPTG) do stężenia 5 mM w ddH2O. Używając automatycznej stacji roboczej z głowicą wielokanałową, rozdzielić (lub pipetować ręcznie) 10 μl rozcieńczonego IPTG do każdego dołka z bakteriami RNAi oraz do płytek kontrolnych. Ponownie uszczelnić i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze. Inkubować przy wytrząsaniu przez 3 h w 37 °C.</li>
		<li>Podczas wytrząsania bakterii, przygotować nicienie. Dokładnie wymieszać zawiesinę M9/nicienie i pipetować małą próbkę (~5 - 10 µl) na szklane szkiełko mikroskopowe. Policzyć liczbę nicieni pod stereomikroskopem i obliczyć liczbę nicieni na 1 μl.</li>
		<li>Stosując technikę sterylną, przygotować roztwór uzupełnionego M9 (M9+) o następujących stężeniach końcowych: 0,20 mg/ml IPTG, 8,0 μg/ml cholesterolu, 50 μg/ml ampicyliny, 9,6 μg/ml tetracykliny, 0,0835 μg/ml Fungizone oraz 15 nicieni na 50 μl.
		<ol>
			<li>Przygotować oddzielne roztwory dla nicieni transgenicznych z domeną prionową oraz nicieni WT. Końcowa objętość roztworu nicieni w M9+ będzie zależeć od liczby powielonych płytek RNAi (patrz poniżej), plus około 30 ml objętości martwej, która pozostanie w zbiorniku, jeśli używany jest automatyczny dozownik.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po 3-godzinnej indukcji produkcji bakteryjnego dsRNA wyjąć płytki z inkubatora i pozwolić im ostygnąć do temperatury pokojowej (RT, ~30 min), aby uniknąć szoku termicznego zwierząt.</li>
		<li>Rozdzielić 50 μl roztworu transgenicznych nicieni z domeną prionową w M9+ do każdego dołka płytek RNAi oraz do jednej z kontrolnych płytek z pustym wektorem. Należy mieszać roztwór nicieni przed każdym krokiem, ponieważ zwierzęta mają tendencję do sedymentacji na dno zbiornika.</li>
		<li>Rozdzielić nicienie WT do drugiej płytki kontrolnej. Pozostawić płytki nieuszczelnione, aby umożliwić napowietrzanie. Aby zapobiec odparowaniu hodowli ciekłej, ułożyć 4-5 płytek jedna na drugiej i owinąć wilgotnym ręcznikiem papierowym oraz folią aluminiową. Inkubować przy 200 rpm w 20 °C przez 4 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena 
	UWAGA: Po 4 dniach w inkubatorze nicienie będą w drugim dniu dorosłości i będą gotowe do przesiewu. Przed rozpoczęciem analizy pozwolić zwierzętom przystosować się do warunków bez wytrząsania przez 30 min, aby zapewnić niezakłócone ruchy typu thrashing.
	<ol>
		<li>Używając kamery Falcon 4M60 podłączonej do komputera z monitorem, przeprowadzić wizualny przesiew w kierunku zwiększonej intensywności ruchów thrashing w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami transgenicznymi z domeną prionową.</li>
		<li>Sporządzić listę wstępnych wyników pozytywnych w celu potwierdzenia ich za pomocą wrMTrck (patrz następna sekcja).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Potwierdzenie wyników wstępnego przesiewu
<ol>
	<li>Analiza motylości na płytkach stałych
	<ol>
		<li>Przygotować płytki z NGM uzupełnionym o 100 µg/ml ampicyliny, 12,5 µg/ml tetracykliny oraz 1 mM IPTG, zgodnie ze standardowymi metodami47. Jeśli to możliwe, należy użyć maszyny do wylewania płytek, aby zapewnić taką samą wysokość podłoża na wszystkich płytkach, co pozwoli na usprawnienie procesu akwizycji wideo.</li>
		<li>Wyhodować poszczególne klony RNAi w ~1 ml LB + 50 µg/ml ampicyliny, przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C przy 250 rpm.</li>
		<li>Następnego dnia indukowany ekspresję dsRNA za pomocą 1 mM IPTG przez 3 h. Zasiać płytki 150 µl każdego bakteryjnego klonu RNAi, rozprowadzając je cienką warstwą. Pozostawić bakterie do wyschnięcia przez 2 dni w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności. Przygotować 3 płytki na każdy klon RNAi.</li>
		<li>Zsynchronizować populację nicieni metodą wybielania (bleaching) zgodnie ze standardowymi metodami50 (patrz sekcja 1.2) i pozwolić jajom wykluć się przez noc w medium M9.</li>
		<li>Pobrać próbkę zawiesiny nicieni i oznaczyć liczbę nematod na 1 µl pod stereomikroskopem. Następnie pipetować odpowiednią objętość M9 z nicieniami na każdą płytkę eksperymentalną tak, aby zawierała 25 - 30 nicieni w stadium L1. Hodować nematody w temperaturze 20 °C przez 4 dni, aż nicienie osiągną 2. dzień dorosłości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowa analiza motylości nicieni za pomocą wtyczki wrMTrck dla programu ImageJ 
	UWAGA: Filmy zostały zarejestrowane przy użyciu stereomikroskopu z powiększeniem 10X, cyfrowej kamery Hamamatsu Orca-R2 C10600-10B oraz oprogramowania obrazującego Hamamatsu Simple PCI.
	<ol>
		<li>Włączyć kamerę i oprogramowanie obrazujące Simple PCI. Kliknąć „Live”, aby umożliwić dostrojenie warunków obrazowania.</li>
		<li>Ustawić parametry wideo w następujący sposób: Gain = 0; Light Mode = High; Speed Index = 1; Binning = 2. Kliknąć „Auto Expose”, a następnie dostosować warunki oświetlenia, przesuwając lustra mikroskopu oraz pokrętła jasności i kontrastu. 
		UWAGA: Wideo musi mieć wysoki kontrast bez prześwietleń, tak aby zwierzęta jawiły się jako czarne kształty na jasnym tle.</li>
		<li>Kliknąć „Time Scan” i wybrać folder oraz nazwę pliku. Ustawić „Field Delay” na 20 msec oraz „Stop at Time” na 30 sec. Nacisnąć „Live Review”, aby wybrać obszar płytki do nagrania (tam, gdzie znajduje się najwięcej nicieni). Stukać w płytkę 3 lub 4 razy na stoliku, szybko potwierdzić jej pozycję w polu widzenia i nacisnąć „Start”.</li>
		<li>Po zakończeniu nagrywania filmu kliknąć prawym przyciskiem myszy na obraz i wybrać „Export Montage Sequence”, aby wyeksportować film z formatu .cxd do .avi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza filmów z motylością
	<ol>
		<li>Otworzyć oprogramowanie ImageJ, przejść do karty „Plugins”, następnie „wrmtrck” i wybrać „wrMTrck Batch”. Wybrać katalog zawierający wszystkie pliki do analizy.</li>
		<li>W głównym oknie wejściowym wrMTrck_Batch wprowadzić wartości zgodnie ze szczegółami na Rysunku 5C. Wyjaśnienie każdego z parametrów znajduje się w instrukcjach dołączonych do wtyczki. Kliknąć „OK” i uruchomić analizę ruchu.</li>
		<li>Aby zweryfikować wyniki i potwierdzić, że wszystkie wykryte ścieżki pochodzą od rzeczywistych osobników C. elegans oraz usunąć artefakty, należy otworzyć każdy z plików .txt utworzonych dla każdego filmu i skopiować informacje do pliku oprogramowania do analizy danych. Otworzyć utworzone pliki „*_labels.zip” i uruchomić wynikowe pliki „*_labels.tif”, aby ręcznie sprawdzić i usunąć błędne ścieżki nicieni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisane tutaj metody pomagają zilustrować rozprzestrzenianie się oraz złożoną, autonomiczną i nieautonomiczną toksyczność komórkową białek prionopodobnych. Niedawno odkryliśmy, że podatna na agregację cytozolowa domena prionowa jest pobierana do pęcherzyków związanych z błoną w procesie związanym z autofagią. Specyficzny podzbiór tych pęcherzyków transportuje domenę prionową w obrębie i między komórkami i tkankami40. Kluczem do monitorowania ich ruchu u żywego zwierzęcia jest to, że białko musi być oznaczone m...

Wiele chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i pasażowalne encefalopatie gąbczaste (TSE), są związane z białkami podatnymi na agregację i dlatego są zbiorczo znane jako zaburzenia nieprawidłowego fałdowania białek (PMD). TSE lub choroby prionowe stanowią wyjątkową klasę PMD, ponieważ mogą być zakaźne zarówno dla ludzi, jak i zwierząt1. Na poziomie molekularnym priony replikują się poprzez rekrutację i przekształcanie monomerycznego, bogatego w α-helisę komórkowego PrP kodowanego przez gospodarza (PrPC) w patologiczną konformację PrPSc bogatą w β arkusze2,3. Samorozmnażające się agregaty białkowe zidentyfikowano również u grzybów, które mają ważne cechy wspólne z prionamissaków 4,5. Dodatkowo priony ssaków są zdolne do przemieszczania się z komórki do komórki i infekowania komórek naiwnych6,7.
Chociaż PMD inne niż TSE nie są zakaźne, mają wspólną zasadę chorobotwórczości z chorobami prionowymi8,9. Chociaż białka połączone z każdym z PMD nie są powiązane pod względem struktury ani funkcji, wszystkie tworzą agregaty w procesie podobnym do krystalizacji zwanym polimeryzacją jądrzastą lub zarodkową; Ponadto nasiona białkowe rosną poprzez rekrutację ich rozpuszczalnych izoform2,10,11. Zdolność do samorozmnażania się różni się in vivo, w zależności od wewnętrznych właściwości białka, które wraz z dodatkowymi czynnikami komórkowymi, takimi jak molekularne białka opiekuńcze, ostatecznie determinują tempo zarodkowania agregatów, wysiewu, fragmentacji i rozprzestrzenianiasię 12-15. W związku z tym musi istnieć delikatna równowaga między tymi czynnikami, która umożliwia efektywną propagację białek. Może to również wyjaśniać, dlaczego tylko niektóre agregaty amyloidogenne mają cechy prionu, a zatem nie wszystkie PMD są zakaźne. Wydaje się, że priony reprezentują "najlepsze wyniki" w szerokim spektrum samoreplikujących się agregatów białkowych, co czyni je potężnym narzędziem do badania PMD8,13.
Intrygujące, toksyczność związana z agregatami związanymi z chorobą często ma nieautonomiczny komponent komórkowy16,17. Oznacza to, że wpływają one na sąsiednie komórki, które nie wyrażają odpowiedniego genu, w przeciwieństwie do efektu ściśle autonomicznego komórki, który oznacza, że tylko komórki wyrażające gen wykazują określony fenotyp. Zostało to przekonująco wykazane przez specyficzną tkankowo ekspresję lub knock odpowiednich białek w licznych modelach chorób neurodegeneracyjnych18-26. Jako podstawę tej nieautonomicznej dla komórek toksyczności w PMD zasugerowano różne mechanizmy, w tym zmniejszone dostarczanie składników odżywczych, brak równowagi w sygnalizacji neuronalnej, ekscytotoksyczność glutaminianu i zapalenie nerwów16,27,28. Ponadto podobny do prionów ruch agregatów związanych z chorobą między komórkami może przyczyniać się do tego aspektu29,30. Coraz więcej dowodów sugeruje, że inkluzje białek inne niż priony mogą przenosić się z komórki do komórki, co może wyjaśniać charakterystyczne rozprzestrzenianie się patologii obserwowane w wielu PMD30-36. Jednak nie ustalono jeszcze, czy istnieje wyraźny związek przyczynowy między międzykomórkowym przemieszczaniem się białek chorobowych a toksycznym wpływem na sąsiednie komórki. W związku z tym lepsze zrozumienie szlaków komórkowych, które leżą u podstaw transmisji międzykomórkowej i nieautonomicznej toksyczności komórkowej, jest konieczne i niezbędne do opracowania nowych środków terapeutycznych. Jednak wiele aspektów rozprzestrzeniania się podobnych do prionów i czynników komórkowych, które wpływają na przekazywanie z komórki do komórki nieprawidłowo sfałdowanych białek w metazoanach, nie jest dobrze poznanych, w szczególności na poziomie organizmu.
Nicień Caenorhabditis elegans ma kilka zalet, które dają potencjał do odkrycia nowych aspektów rozprzestrzeniania się prionów w metazoanach17. Jest przezroczysty, co pozwala na śledzenie in vivo fluorescencyjnie znakowanych białek w żywym organizmie. Co więcej, wiele procesów komórkowych i fizjologicznych dotkniętych chorobą jest zachowanych od robaków do człowieka, a C. elegans jest również podatny na szeroką gamę manipulacji genetycznych oraz analiz molekularnych i biochemicznych37-39. Dokładnie 959 komórek somatycznych składa się na dorosłego hermafrodytę o prostym planie ciała, który nadal ma kilka różnych typów tkanek, w tym mięśnie, neurony i jelita.
Aby stworzyć nowy model prionów u C. elegans, zdecydowaliśmy się na egzogenną ekspresję dobrze scharakteryzowanej domeny prionowej NM bogatej w glutaminę/asparaginę (Q/N) cytozolowego białka prionowego Sup35, ponieważ nie ma znanych endogennych białek prionowych u robaków4,40. Priony drożdży okazały się nieocenione w wyjaśnianiu podstawowych mechanizmów replikacji prionów41-44. Co więcej, NM jest pierwszym cytozolowym białkiem podobnym do prionów, które, jak wykazano, podsumowuje pełny cykl życia prionu w hodowli komórkowej ssaków45,46. Podobnie, gdy ulegała ekspresji u C. elegans, domena prionowa Sup35 wyjątkowo dobrze dostosowała się do różnych wymagań dotyczących rozmnażania w komórkach metazoan w porównaniu z komórkami drożdży i wykazywała kluczowe cechy biologii prionów40. Agregacja NM wiązała się z głębokim fenotypem toksycznym, w tym z zaburzeniem integralności mitochondriów i pojawieniem się różnych pęcherzyków związanych z autofagią na poziomie komórkowym, a także zatrzymaniem zarodków i larw, opóźnieniem rozwoju i rozległym zaburzeniem środowiska fałdowania białek na poziomie organizmu. Uderzające jest to, że domena prionowa wykazuje autonomiczną i nieautonomiczną toksyczność komórkową, wpływając na sąsiednie tkanki, w których transgen nie uległ ekspresji. Ponadto transport pęcherzykowy domeny prionowej w obrębie komórek i między komórkami jest monitorowany w czasie rzeczywistym in vivo40.
Tutaj opisujemy, jak badać rozprzestrzenianie się prionów u C. elegans. Wyjaśnimy, jak monitorować transport wewnątrz- i międzykomórkowy pęcherzyków zawierających domenę prionową za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Położymy nacisk na wykorzystanie specyficznych dla tkanek czujników składania i wszechobecnie wyrażanych reporterów stresu do oceny autonomicznego i nieautonomicznego wpływu komórek na sprawność komórkową. Na koniec opiszemy procedurę niedawno przeprowadzonego badania przesiewowego interferencji RNA całego genomu (RNAi) w celu zidentyfikowania nowych modyfikatorów toksyczności indukowanej prionami. W połączeniu metody te mogą pomóc w wyodrębnieniu szlaków genetycznych zaangażowanych w międzykomórkowy ruch białek i ich nieautonomiczną toksyczność komórkową.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzorce wielkości nanosfery 100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka Ahringer RNAi</td><td>Źródło: BioSciences&nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/produkty-klonowe/niessaki/c-elegans/biblioteka-elegans-rnai/</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem Sorvall Legend XTR, 120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>96-pinowy replikator&nbsp;</td><td>Scionomix&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr> <tr><td>Wytrząsarka inkubacyjna HiGro o dużej pojemności&nbsp;</td>Dozownik odczynników <td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Multidrop Combi&nbsp;</td><td>Zautomatyzowana stacja robocza Titertrek</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td></tr><tr><td>Biomek FX AP96&nbsp;</td><td>Wytrząsarka Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Innova44</td><td>Nowy Brunszwik</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& action=produkty& contentid=1& catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr> <tr><td>ORCA-R2 C10600-10BDygwarny aparat CCD</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Spinning Disc AF&nbsp;</td><td>Aparat Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr> <tr><td>Falcon 4M60&nbsp;</td><td>Teledyne Dalsa&nbsp;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopy Automation & Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td></td>Urządzenia <td></td><td>molekularne</td> http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</tr><tr><td>Hamamatsu Oprogramowanie do analizy obrazu SimplePCI</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wtyczka NIH</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>wrMTrck dla ImageJ</td><td></td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>C. elegans szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>Laboratorium <td></td><td>Morimoto</td><td>dostępne w naszym laboratorium&nbsp;</td></tr><tr><td>W tabeli 1 przedstawiono źródło naprężeń czujnika składanego i reportera</td><td></td><td></td><td></td> naprężeń</tr></tbody></table>

badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego c. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Priony to niekonwencjonalne, samorozprzestrzeniające się cząstki białkowe, pozbawione jakiegokolwiek kodującego kwasu nukleinowego. Te białkowe nasiona służą jako matryce do konwersji i replikacji ich łagodnej izoformy komórkowej. Coraz więcej dowodów sugeruje, że wiele agregatów białkowych może działać jako samorozprzestrzeniające się matryce i zakłócać fałdowanie pokrewnych białek. Chociaż agregaty mogą być funkcjonalne w pewnych okolicznościach, proces ten często prowadzi do zakłócenia homeostazy białek komórkowych (proteostazy), co ostatecznie prowadzi do wyniszczających chorób, takich jak choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) lub pasażowalne encefalopatie gąbczaste (TSE). Dokładne mechanizmy propagacji prionów i rozprzestrzeniania się agregatów białkowych z komórki między komórkami są nadal przedmiotem intensywnych badań. Aby pogłębić tę wiedzę, niedawno ustalono nowy model metazoanu w Caenorhabditis elegans, dla ekspresji domeny prionowej cytozolowego białka prionowego drożdży Sup35. Ten model prionowy ma kilka zalet, ponieważ umożliwia bezpośrednie monitorowanie fluorescencyjnie znakowanej domeny prionowej u żywych zwierząt i ułatwia podejście genetyczne. Opisano tutaj metody badania podobnego do prionów zachowania agregatów białkowych i identyfikacji modyfikatorów toksyczności indukowanej prionami przy użyciu C. elegans.

Monitorowanie międzykomórkowego rozprzestrzeniania się białek prionopodobnych za pomocą in vivo obrazowanie poklatkowe
Linie transgeniczne C. elegans wykazujące ekspresję domeny prionowej są szczególnie odpowiednie do analizy niektórych aspektów białek prionopodobnych, np. transmisji międzykomórkowej i toksyczności nieautonomicznej komórkowo. Przezroczystość tych organizmów umożliwia śledzenie białek znakowanych fluo...

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest zbadanie rozprzestrzeniania się i złożonej toksyczności białek podobnych do PreOn przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C elegancji. Osiąga się to poprzez monitorowanie transportu wewnątrz- i wewnątrzkomórkowego pęcherzyków zawierających białko podobne do PreOn, za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie specyficzne dla tkanek czujniki fałdowania i wszechobecny wyrażany stres.Reportery służą do oceny autonomicznego i nieautonomicznego wpływu komórek na sprawność komórkową. Następnie przeprowadza się badanie przesiewowe RNAi całego genomu w celu zidentyfikowania nowych modyfikatorów toksyczności indukowanej przez PreOn. Przesiewanie wykonuje się w hodowli płynnej przy użyciu młócenia jako odczytu toksyczności.Wreszcie, worm tracker, wtyczka do obrazu J służy do ilościowego określania ruchu elegancji C w połączeniu. Metody te pozwalają na wyodrębnienie szlaków genetycznych zaangażowanych w ruch międzykomórkowy białek takich jak PreOn i ich nieautonomicznej toksyczności komórkowej. Po przygotowaniu zsynchronizowanych linii transgenicznych do kontroli morskiej elegancji i domeny PreOn oraz 10% podkładek agros, zgo

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek przypominających priony przy użyciu organizmu modelowego Metazoon C. elegans

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Ten film demonstruje procedurę obrazowania in vivo C. elegans wyrażającego białka podobne do prionów oznaczone białkiem czerwonej fluorescencji. Protokół polega na unieruchomieniu nicieni na podkładce agarozowej w celu poklatkowej mikroskopii konfokalnej, ujawniając agregację i transport białek w obrębie komórek i między nimi. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla badania agregacji białek związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi.

Obrazowanie poklatkowe w celu monitorowania transkomórkowego rozprzestrzeniania się białek podobnych do prionów u nicień transgenicznych

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Poznaj metody badania rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych w organizmie modelowym C. elegans. Wykorzystaj mikroskopię fluorescencyjną, sensory zwijania białek oraz ekranowanie RNAi do identyfikacji nowych modyfikatorów toksyczności.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Przeglądaj więcej filmów