Name: Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj metodę przygotowania i charakteryzacji nanocząstek SDF-1α z siarczanem dekstranu i chitozanem. Technika obejmuje pomiar wielkości, potencjała zeta oraz aktywności białka, co umożliwia zastosowanie w terapii komórkami macierzystymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH: HL671795, HL048743 i HL108630.

1. Przygotowanie nanocząstek glikanu SDF-1α
Ze względu na cel dostarczania in vivo, wysterylizuj wszystkie pojemniki, pipety i końcówki użyte do przygotowania.
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory podstawowe w wodzie ultraczystej: 1% siarczan dekstranu; 1 M NaOH (sterylny przefiltrowany membraną PES); 0,1% chitozan w 0,2% lodowatym kwasie octowym (przefiltrować kolejno przez filtry 0,8 i 0,22 μm, a następnie dostosować pH do 5,5 za pomocą NaOH); 0,1 MZnSO4; 15% mannitolu; i 0,92 mg/ml SDF-1α (przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze 80 °C, i przechowywać w temperaturze 4 °C po rozmrożeniu).</li>
	<li>Sterylizuj roztwory podstawowe przez membrany filtracyjne 0,22 μm. Ocenić poziom endotoksyn w przygotowanym roztworze za pomocą testu zakrzepów w żelu lizatu amebocytów limulusa (LAL). Upewnij się, że poziomy wynoszą <0,06 EU/ml.</li>
	<li>Dodać 0,18 ml wody UltraPure do szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml zawierającej mieszadło magnetyczne. Ustaw prędkość mieszania na 800 obr./min. Dodać 0,1 ml 1% siarczanu dekstranu i mieszać przez 2 min. Dodać 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml 0,92 mg/ml roztworu SDF-1α) i mieszać przez 20 min.</li>
	<li>Dodać kroplami 0,33 ml 0,1% chitozanu i mieszać przez 5 minut. Zmienić prędkość mieszania na maksymalną i powoli dodawać 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 za pomocą strzykawki o pojemności 0,1 ml (przez 1 min).</li>
	<li>Zwiększ prędkość mieszania do 800 obr./min i mieszaj przez 30 min. Dodać 0,4 ml 15% mannitolu i mieszać przez 5 minut. Przenieść mieszaninę reakcyjną do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. 
	Uwaga: Obecność mannitolu ułatwia ponowne zawieszenie cząstek po odwirowaniu. W zależności od zwartości granulatu stężenie mannitolu można zmieniać od 0% do 5%. Całkowite ponowne zawieszenie cząstek po każdym odwirowaniu ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zagregowań w końcowej zawiesinie.</li>
	<li>Odessać supernatant i za pomocą pipety powoli usunąć ostatnią kroplę płynu. Dodać 0,2 ml 5% mannitolu. Zawiesić osad za pomocą strzykawki igłowej o pojemności 0,5 ml i 29 G. Dodać 1 ml 5% mannitolu. Wirować przy 16 000 x g przez 15 min.</li>
	<li>Powtórz krok 1.6.</li>
	<li>Odessać supernatant. Zawiesić osad w 0,2 ml 5% mannitolu. Zawiesinę cząstek należy przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Zawiesina cząstek może być również przechowywana w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C lub liofilizowana. Włączenie 5% mannitolu do zawiesiny jest niezbędne, aby zapobiec agregacji cząstek po zamrożeniu i rozmrożeniu lub po liofilizacji i ponownym uwodnieniu. Mannitol można usunąć przez odwirowanie zawiesiny po przechowywaniu.</li>
</ol>
2. Pomiar wielkości cząstek i potencjału Zeta
Wielkość cząstek i potencjał zeta są analizowane odpowiednio przez dynamiczne rozpraszanie światła i elektroforetyczne rozpraszanie światła za pomocą analizatora cząstek wskazanego na Liście Materiałów.
<ol>
	<li>Ustaw następujące parametry pomiaru wielkości cząstek: Czasy akumulacji: 70; Czasy powtórzeń: 4; Temperatura: 25 °C; Rozcieńczalnik: woda; Regulacja intensywności: automatyczna.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę SDF-1α-DS-CS wodą (10-krotne rozcieńczenie). Załaduj 100 μl próbki do jednorazowej kuwety UV, takiej jak kuweta Eppendorf. Włóż kuwetę do uchwytu kuwety. Poczekaj, aż regulacja intensywności osiągnie "Optymalny" (~10 000 cps). Rozpocznij pobieranie danych.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru należy zapisać wyniki kumulantów średnicy (nm) i wskaźnika polidyspersyjności. Uśrednić wyniki uzyskane z każdego z 4 powtórzonych odczytów i obliczyć odchylenie standardowe.</li>
	<li>Załadować 500 μl 10-krotnie rozcieńczonej próbki cząstek do celi przepływowej w celu pomiaru potencjału zeta. Ustaw następujące parametry pomiaru: Czasy akumulacji: 10; Czasy powtórzeń: 5; Temperatura: 25 °C; Rozcieńczalnik: woda; Regulacja intensywności: automatyczna. Zapisz wyniki potencjału zeta (mV). Uśrednij wynik uzyskany z każdego z 5 powtórzonych odczytów i oblicz odchylenie standardowe.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja SDF-1α w cząstkach
<ol>
	<li>Rozcieńczyć wolną formę SDF-1α do stężeń 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 i 0,05 mg/ml w 1,3x buforze do próbek Laemmli. Rozcieńczyć 6 μl próbek SDF-1α-DS-CS w 40 μl 1,3x bufor do próbek Laemmli. (Przygotować 4x bufor podstawowy Laemmli zawierający 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glicerolu, 0,05 mg/ml błękitu bromofenolowego i 8% 2-merkaptoetanolu. Podzielić roztwór podstawowy na małe porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C do jednorazowego użytku)</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Dwukrotnie wirować próbki (każdy przez 10 sekund z maksymalną prędkością) podczas 10-minutowego czasu nagrzewania w celu całkowitej dysocjacji cząstek. Schłodzić próbki do temperatury suchej temperatury przez 2 minuty. Wirować przy 10 000 x g przez 0,5–1 minutę, aby obniżyć kondensat wodny. Ponownie zwirować, aby dobrze wymieszać. 
	Uwaga: W tym momencie roztwór próbki powinien być klarowny i nie ma widocznego osadu.</li>
	<li>Załadować 10 μl próbki/studzienki do 4–20% żelu SDS. Uruchomić elektroforezę przy napięciu 200 V przez 20 minut. Zabarwić żel niebieską plamą białkową Coomassie.</li>
	<li>Zbadaj gęstość pasm białkowych SDF-1α za pomocą obrazowania molekularnego i oprogramowania do analizy densytometrycznej. Oblicz ilość SDF-1α w cząstkach w stosunku do krzywej standardowej zbudowanej z wolnych wzorców SDF-1α.</li>
</ol>
4. Test uwalniania in vitro
<ol>
	<li>Zmieszać cząstki glikanu SDF-1α z solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco bez wapnia i magnezu (D-PBS) w stosunku 1:1 (v/v).</li>
	<li>Podzielić zawiesinę cząstek na podwielokrotności o objętości 0,05 ml w probówkach o pojemności 1,5 ml. Załaduj próbki na dno probówek. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza lub naruszania powierzchni płynu. Uszczelnij górną część tub za pomocą Parafilm. 
	UWAGA: W ten sposób płyn pozostanie na dnie podczas późniejszego obrotu od góry do dołu na mikserze rurowym.</li>
	<li>Obrócić probówki w temperaturze 37 °C na obracającym się mieszadle mikroprobówkowym. Usunąć podwielokrotności z probówek w wyznaczonych momentach i natychmiast odwirować próbki o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oddzielić sklaranty i osady, a następnie rozpuścić osad w 0,05 ml D-PBS. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. Po pobraniu wszystkich próbek należy zbadać supernatanty i granulki na żelu SDS, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
5. Test migracji
Ten test mierzy aktywność chemotaktyczną SDF-1α. Interakcja SDF-1α z jego receptorem (CXCR4) na powierzchni komórki powoduje migrację komórki w kierunku gradientu SDF-1α. W tym teście komórki są ładowane do górnej studzienki (oddzielonej półprzepuszczalną membraną od dolnej studzienki), a roztwór SDF-1α do dolnej studzienki.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć SDF-1α (forma wolna lub związana z cząstkami) buforem migracyjnym (pożywka RPMI-1640 zawierająca 0,5% albuminy surowicy bydlęcej) w 3-krotnym seryjnym rozcieńczeniu do końcowych stężeń 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 i 0,05 ng/ml.</li>
	<li>Dodać 0,6 ml rozcieńczonego roztworu SDF-1α lub samego buforu migracyjnego (kontrola ujemna) do studzienki na płytce 24-dołkowej. Dodać 0,57 ml buforu migracyjnego do studzienki (kontrola komórki wejściowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Umieść przepuszczalną wkładkę do hodowli komórkowej, taką jak Transwell (wielkość porów 5 μm, średnica 6,5 mm) na górze dolnej studzienki. Załaduj 0,1 ml komórek Jurkat (5 × 105) do wkładki Transwell. Załaduj komórki o pojemności 0,03 ml bezpośrednio do studzienki kontrolnej komórki wejściowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 .</li>
	<li>Wyjmij wkładki Transwell. Przenieś komórki, które migrowały do dolnych studzienek, do probówki polistyrenowej o pojemności 4 ml. Policz migrowane komórki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Oblicz migrację jako procent liczby komórek wejściowych (numer komórki w studzience kontrolnej komórki wejściowej x 100/30) po odjęciu liczb w kontrolach ujemnych (komórki migrowane do studzienek zawierających tylko bufor migracyjny).</li>
</ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).</li>
<li>Yue, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+affects+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+chitosan-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).</li>
<li>Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+as+a+therapeutic+stem+cell+homing+factor+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction.</a> Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).</li>
<li>Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-derived+factor-1%2FCXCR4+signaling%3A+indispensable+role+in+homing+and+engraftment+of+hematopoietic+stem+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).</li>
<li>Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha-heparin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).</li>
<li>Amara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1alpha+associates+with+heparan+sulfates+through+the+first+beta-strand+of+the+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).</li>
<li>Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate%2Fheparin+oligosaccharides+protect+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29%2FCXCL12+against+proteolysis+induced+by+CD26%2Fdipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV.</a> J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).</li>
<li>Yin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+in+glycan+nanoparticles+exhibits+full+activity+and+reduces+pulmonary+hypertension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).</li>
<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
<li>McCall, R. L., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA+nanoparticles+formed+by+single-+or+double-emulsion+with+vitamin+E-TPGS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS.</a> J Vis Exp. (82), 51015(2013).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jak wspomniano powyżej, nanocząstki DS-CS powstają w wyniku neutralizacji ładunku między cząsteczkami polianionu (DS) i polikacji (CS). Ponieważ oddziaływanie ładunku zachodzi łatwo podczas zderzenia molekularnego, stężenie roztworów polimerowych i prędkość mieszania podczas mieszania mają kluczowe znaczenie dla wielkości powstałych cząstek. Ogólna tendencja jest taka, że bardziej rozcieńczone roztwory DS i CS 15 i wyższa prędkość mieszania skutkują mniejszymi cząstkami.
Formuła nan...

Siarczan dekstranu (DS) i chitozan (CS) to polisacharydy z wieloma podstawionymi ujemnie naładowanymi grupami siarczanowymi (w DS) lub dodatnio naładowanymi grupami aminowymi (deacetylowany CS). Po zmieszaniu w roztworze wodnym dwa polisacharydy tworzą kompleksy polielektrolitowe w wyniku oddziaływań elektrostatycznych. Powstałe kompleksy mogą tworzyć duże agregaty, które zostaną oddzielone fazowo od roztworu wodnego (wytrącają się) lub małe cząstki, które dyspergowalnie w wodzie (koloidy). Konkretne warunki, które przyczyniają się do tych wyników, zostały szeroko zbadane i szczegółowo podsumowane i zilustrowane w niedawnym przeglądzie 1. Wśród tych warunków dwa podstawowe wymagania dotyczące wytwarzania cząstek dyspergowalnych w wodzie to: przeciwnie naładowane polimery muszą: 1) mieć znacznie różną masę molową; oraz 2) mieszać w stosunku niestechiometrycznym. Warunki te pozwolą neutralnym pod względem ładunku skompleksowanym segmentom polimerowym wygenerowanym przez neutralizację ładunku na segregację i utworzenie rdzenia cząstki, a nadmiar polimeru na utworzenie powłoki zewnętrznej 1. Cząstki glikanu opisane w tym protokole są przeznaczone do dostarczania do płuc i są zaprojektowane tak, aby były naładowane netto i miały wymiary nanometrowe. Ujemny ładunek powierzchniowy zmniejsza prawdopodobieństwo komórkowego wychwytu cząstek 2,3. Cząstki o wymiarach nanometrowych ułatwiają przejście przez dystalne drogi oddechowe. Aby osiągnąć ten cel, ilość DS użyta w tym preparacie przekracza CS (stosunek wagowy 3:1); oraz DS o wysokiej masie cząsteczkowej (średnia wagowa MW 500 000) i CS o niskiej masie cząsteczkowej (zakres MW 50–190 kDa, 75–85% deacetylowany).
SDF-1α to czynnik naprowadzający komórki macierzyste, który pełni funkcję naprowadzania poprzez swoją aktywność chemotaktyczną. SDF-1α odgrywa ważną rolę w naprowadzaniu i utrzymaniu hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym oraz w rekrutacji komórek progenitorowych do tkanki obwodowej w celu naprawy uszkodzeń 4,5. SDF-1α ma w swojej sekwencji białkowej miejsce wiążące heparynę, co pozwala białku wiązać się z heparyną / siarczanem heparanu, tworzyć dimery, być chronionym przed inaktywacją proteazy (CD26 / DPPIV) i wchodzić w interakcje z komórkami docelowymi za pośrednictwem receptorów na powierzchni komórki 6-8. DS ma podobne właściwości strukturalne jak heparyna/siarczan heparanu; w związku z tym wiązanie SDF-1α z DS byłoby podobne do wiązania jego naturalnych ligandów polimerowych.
W poniższym protokole opisujemy przygotowanie nanocząstek SDF-1α-DS-CS. Procedury te stanowią jedną z preparatów, które były wcześniej badane 9. Protokół został pierwotnie zaadaptowany z badania nanocząstek VEGF-DS-CS 10. Opisano preparat na małą skalę, który można łatwo zwiększyć przy użyciu tych samych roztworów podstawowych i warunków przygotowania. Po przygotowaniu cząstki są charakteryzowane poprzez zbadanie ich wielkości, potencjału zeta, zakresu inkorporacji SDF-1α, czasu uwalniania in vitro i aktywności włączonego SDF-1α.

<table><tbody><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitozan, niskocząsteczkowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure woda&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alfa;</td><td>Przygotowano zgodnie z odniesieniem 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, membrana PES 0,22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne mikromieszadła (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; mm)</td><td>Rybak&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw szklanych fiolek; SUN-SRi</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Analizator cząstek Delsa Nano C&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Niebieski bezpieczny barwnik białkowy</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Obrazownik molekularny VersaDoc MP 4000 System</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalne podpory Corning Transwell</td><td>Cytometr przepływowy Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus zestaw</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu sdf-1α-chitozan-dekstranu

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitozan (CS) i siarczan dekstranu (DS) są naładowanymi polisacharydami (glikanami), które tworzą nanocząstki na bazie kompleksu polielektrolitu po zmieszaniu w odpowiednich warunkach. Nanocząstki glikanu są użytecznymi nośnikami czynników białkowych, które ułatwiają dostarczanie białek in vivo i utrzymują ich retencję w tkance docelowej. Kompleksy glikanowych polielektrolitów są również idealne do dostarczania białek, ponieważ włączenie odbywa się w roztworze wodnym, co zmniejsza prawdopodobieństwo inaktywacji białek. Białka z miejscem wiązania heparyny łatwo przylegają do siarczanu dekstranu i są z kolei stabilizowane przez wiązanie. Cząsteczki te są również mniej zapalne i toksyczne, gdy są dostarczane in vivo. W opisanym poniżej protokole SDF-1α (czynnik pochodzenia komórek zrębu-1α), czynnik naprowadzający komórki macierzyste, jest najpierw mieszany i inkubowany z siarczanem dekstranu. Do mieszaniny dodaje się chitozan w celu utworzenia kompleksów polielektrolitowych, a następnie siarczan w celu stabilizacji kompleksów za pomocą mostków cynkowych. Powstałe cząstki SDF-1α-DS-CS są mierzone pod kątem wielkości (średnicy) i ładunku powierzchniowego (potencjału zeta). Określa się ilość wbudowanego SDF-1α, a następnie dokonuje się pomiarów jego szybkości uwalniania in vitro i jego aktywności chemotaktycznej w postaci związanej z cząstkami.

Rozmiar i potencjał zeta przygotowanych cząsteczek SDF-1α-DS-CS wyznaczono za pomocą analizatora cząstek. Rysunek 1 przedstawia analizę pomiaru rozmiaru. Na podstawie wyników kumanatów uzyskanych z czterech powtórnych pomiarów, średnica hydrodynamiczna cząsteczek SDF-1α-DS-CS wynosi 661 ± 8.2 (nm), a polidyspersyjność 0.23 ± 0.02. Wynik pomiaru potencjału zeta przedstawiono na Rysunku 2. Z pięciu powtórnych pomiarów wynika, że potencjał zeta cząsteczek SDF-1α-DS-CS wynosi -24.8 ± 0.5 mV....

Celem tego protokołu jest włączenie SDF-1α, czynnika naprowadzającego komórki macierzyste, do nanocząsteczek siarczanu dekstranu i chitozanu. Powstałe cząstki są mierzone pod kątem ich wielkości i potencjału zeta, a także zawartości, aktywności i szybkości uwalniania in vitro SDF-1α z nanocząstek.

Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przygotowanie i charakterystyka nanocząsteczek SD F1 Alpha Chias oraz siarczanu dekstranu. Przygotowanie nanocząsteczek polega najpierw na zmieszaniu czynnika homingu komórek macierzystych, stromal cell derived factor one alpha (SDF-1α), z siarczanem dekstranu, aby umożliwić wiązanie z ujemnie naładowanym glikanem. W drugim kroku do mieszaniny dodaje się ozan, dodatnio naładowany glikan, tworząc kompleks polielektrolitowy z siarczanem dekstranu.Następnie dodaje się siarczan cynku w celu stabilizacji kompleksów za pomocą mostków cynkowych. Powstała cząstka posiada gęsty rdzeń otoczony ujemnie naładowaną otoczką. Następnie mierzy się rozmiar i potencjał zeta cząstek, a także zawartość i aktywność SDF-1α w nanopartykulach. Główną zaletą glikanowych nanopartykul SDF-1α jest to, że włączone SDF-1α pozostaje w pełni aktywne bez konieczności uwalniania z cząstek.W związku z tym cząstki te mogłyby być użyteczne jako stacjonarny sygnał hermine w terapii komórkami macierzystymi. Na początek przygotować roztwory zapasowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wysterylizować je, przepuszczając przez membrany filtracyjne o porach 0,22 µm. Poziom endotoksyn w przygotowanym roztworze ocenić za pomocą testu LAL (limulus amoebocyte lysate) metodą żelowania.Upewnij się, że poziomy endotoksyn wynoszą poniżej 0,06 jednostek endotoksyn na mililitr. Następnie dodaj 0,18 ml wody ultrapurej do szklanej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pasek magnetyczny. Ustaw prędkość mieszania na 800 RPM, następnie dodaj 0,1 ml 1% siarczanu dekstranu i mieszaj przez dwie minuty.Dodać 0,08 milligrams SD F1 alpha i mieszać przez 20 minut. Kroplami dodać 0,33 milliliters 0,1% tizen i mieszać przez pięć minut. Zmienić prędkość mieszania na maksymalną i powoli dodać 0,1 milliliters siarczanu cynku za pomocą strzykawki szczelnej dla gazów.Ustaw prędkość mieszania ponownie na 800 RPM i mieszaj przez 30 minut. Następnie dodaj 0,4 ml 15% mannitolu i mieszaj przez pięć minut. Przenieś mieszaninę reakcyjną do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 16 000 G i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Po wirowaniu odessać supernatant i za pomocą pipety usunąć ostatnią kroplę cieczy. Powoli dodać 0,2 ml 5% mannitolu i zawiesić osad, używając strzykawki z igłą 29G o pojemności 0,5 ml. Następnie dodać kolejny 1 ml 5% mannitolu przed ponownym wirowaniem.Ponownie przy 16 000 g przez 15 minut. Po powtórzeniu procesu wirowania zawiesiny Resus odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 0,2 mililitra 5% mannitolu. Wielkość cząstek oraz potencjał zeta analizuje się odpowiednio za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i elektroforetycznego rozpraszania światła.Na początek należy wybrać procedurę operacyjną z listy SOP, która zawiera parametry pomiaru wielkości cząstek metodą dynamicznego rozpraszania światła. Zgodnie z protokołem tekstowym należy rozcieńczyć próbkę cząstek SD F1 alpha wodą. Następnie do jednorazowej kuwety UV Q Vet, takiej jak Einor Q Vet, należy wprowadzić 100 µL próbki.Włóż kuwetę Q do uchwytu na próbki i poczekaj, aż regulacja natężenia osiągnie wartość optymalną przed rozpoczęciem akwizycji danych. Po zakończeniu pomiaru zapisz skumulowane wyniki średnicy oraz indeksu polidyspersyjności. Oblicz średnią z wyników uzyskanych z każdego z czterech powtórzeń oraz odchylenie standardowe dla pomiaru potencjału zeta metodą rozpraszania światła elektroforetycznego.Napełnij komórkę przepływową 500 µL dziesięciokrotnie rozcieńczonej próbki cząstek. Wybierz procedurę operacyjną z listy SOP dla potencjału zeta, która zawiera parametry pomiaru wymienione w protokole tekstowym. Zapisz wyniki potencjału zeta.Następnie wyciągnij średnią z wyników uzyskanych z każdego z pięciu powtórzonych odczytów i oblicz odchylenie standardowe. Podgrzewaj rozcieńczone próbki wolnej i związanej z cząsteczkami SD F1 alpha w buforze do próbek Laemmli w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Podczas 10-minutowego ogrzewania dwukrotnie wymieszaj próbki w wirówce typu vortex, aby całkowicie rozfrakcjonować cząsteczki. Po schłodzeniu próbek do temperatury pokojowej przez dwie minuty, odwiruj je przy 10 000 G przez 0,5 do 1 minuty, aby osadzić kondensat wodny, a następnie ponownie wymieszaj w wirówce typu vortex.Na tym etapie roztwór próbki powinien być klarowny, bez widocznego osadu. Następnie należy nałożyć 10 µL próbki na każdą studzienkę żelu SDS-PAGE (lub żelu z siarczanem sodu ESAL) o stężeniu od 4 do 20%. Elektroforezę należy prowadzić przy napięciu 200 V przez 20 minut, a następnie zabarwić żel barwnikiem białek Coomassie Blue.Zbadaj gęstość prążka białkowego SDF-1 alpha za pomocą obrazowacza molekularnego i oprogramowania do analizy densytometrycznej. Oblicz ilość SDF-1 alpha w cząsteczkach, korzystając z krzywej wzorcowej opracowanej z wolnych standardów SDF-1 alpha, aby przeprowadzić test uwalniania in vitro; zmieszaj cząsteczki glikanu SDF-1 alpha z buforem fosforanowym z docosolą bez wapnia i magnezu lub DPBS w stosunku 1:1. Podziel zawiesinę cząsteczek na alikwoty o objętości 0,05 ml w probówkach o pojemności 1,5 ml.Nanieś próbki na dno probówek. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza oraz naruszania powierzchni cieczy. Zamknij górną część probówek parafilmem.Następnie rotuj probówki w temperaturze 37 °C na rotacyjnym mieszalniku do mikroprobówek. Pobieraj alikwoty z probówek w wyznaczonych odstępach czasu i natychmiast wirować próbki z prędkością 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza; po wirowaniu oddziel nadnadkład od osadu.Następnie zresuspender pellet w 0,05 ml DPBS. Po zebraniu wszystkich próbek poddać analizie nadnad płyny oraz pellety na żelu SDS. Podobnie jak wcześniej, badanie to pozwala na pomiar aktywności chemotaktycznej S df.Interakcja SDF-1α z jego receptorem powoduje migrację komórki w kierunku gradientu SDF-1α. W celu rozpoczęcia procedury, należy rozcieńczyć wolną lub związaną z cząsteczkami formę SDF-1α w buforze do migracji, wykonując trzykrotne rozcieńczenia seryjne do końcowych stężeń wymienionych w protokole tekstowym. Do dołka w płytce 24-dołkowej przeznaczonej dla kontroli negatywnej należy dodać 0,6 ml rozcieńczonego roztworu SDF-1α.Postąp analogicznie w przypadku samego buforu do migracji, a następnie dodaj 0,57 ml buforu do migracji do studni służącej jako kontrola komórek wejściowych. Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie umieść na górze dolnej studni przepuszczalny wkład do hodowli komórkowych, taki jak transwell, i wprowadź 0,1 ml komórek jerk hat do wkładu transwell.Następnie nanieś 0,03 ml komórek bezpośrednio do kontroli wejściowej komórek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez dwie godziny w inkubatorze z 5% CO2. Po zakończeniu inkubacji usuń wkłady do hodowli komórkowej.Przenieś komórki, które migrowały do dolnych studni, do polistyrenowej probówki o pojemności czterech mililitrów. Policz migrowane komórki za pomocą cytometru przepływowego. Na koniec oblicz migrację jako procent liczby komórek wejściowych po odjęciu wartości uzyskanych w kontrolach negatywnych.Przedstawiono tutaj analizę pomiaru wielkości cząsteczek SD F1 alpha dextran sulfate ozan. Wynik CUMUL wskazuje, że średnica hydrodynamiczna cząsteczki wynosi 671 nanometrów, a polidyspersyjność wynosi 0,24. Ten zrzut ekranu przedstawia jeden z pięciu powtórzonych pomiarów potencjału zeta cząsteczek SD F1 alpha DExT strand sulfate ozan.Potencjał zeta wynosi -24,7 mV. Ilość S df one alpha w cząsteczkach S df one alpha dextran sulfate ozan jest szacowana za pomocą elektroforezy w żelu SDS. Przedstawiono tutaj barwiony kumazą żel SDS z naniesionymi standardami SD F1 alpha, kontrolnymi nanocząsteczkami dextran sulfate kaizan oraz próbkami nanocząsteczek SD F1 alpha dextran sulfate kaizan.Krzywa wzorcowa została opracowana na podstawie analizy gęstości prążków standardu SDF-1α. Obliczenia z krzywej wzorcowej wskazują, że stężenie SDF-1α w próbce nanopartykuł SDF-1α wynosi 0,03 mg/mL. Aby określić szybkość uwalniania SDF-1α z nanopartykuł in vitro, ilość uwolnionego SDF-1α w supernatancie oraz ilość SDF-1α związanego z cząsteczkami w osadzie określono poprzez barwienie żelu SDS Coomassie, a następnie analizę cytometryczną. Aktywność SDF-1α związanego z cząsteczkami zmierzono za pomocą testu migracji i porównano ją z aktywnością wolnego SDF-1α, jak pokazano tutaj.Cząstki z wiązanym SDF-1α indukowali migrację w takim samym stopniu, jak wolny SDF-1α przy wszystkich mierzonych stężeniach. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że skład cząstek białkowo-glikanowych może być modyfikowany. W zależności od konkretnego zastosowania można włączyć inne białka oraz zastosować różne formulacje w celu zmiany wielkości cząstek.Mamy nadzieję, że niniejszy film zaprezentował podstawowe techniki przygotowania do gromadzenia nanocząsteczek, a następnie analizę funkcjonalną wbudowanego SDF-1α.

preparation-characterization-sdf-1-chitosan-dextran-sulfate

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przygotowanie i Charakteryzacja Nanocząstek SDF-1α-Chitosan-Dekstran Siarczan

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Elektroforeza kapilarna bez roztworu jest szybką, tanią i solidną metodą analityczną, która umożliwia ilościowe monitorowanie reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym. Jego przydatność do szybkiej, wygodnej i precyzyjnej analizy została tutaj zademonstrowana poprzez analizę szczepienia peptydów kowalencyjnych na foliach chitozanu w celu poprawy adhezji komórek.

Elektroforeza kapilarna do monitorowania szczepienia peptydów na warstwach chitozanu w czasie rzeczywistym

Prosta homogenizacja została wykorzystana do przygotowania nowatorskich, wysokiej gęstości, naśladujących lipoproteiny nanocząsteczek do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów. W artykule opisano wyzwania, szczegółowe protokoły przygotowania nanocząstek, charakterystyki in vitro oraz badań in vivo.

Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Tutaj prezentujemy protokół syntezy łożyskowych nanocząstek lipidowo-polimerowych skojarzonych z peptydem wiążącym siarczan chondroityny A (plCSA-BP) za pomocą jednoetapowej techniki sonikacji i biokoniugatu. Cząstki te stanowią nowatorskie narzędzie do ukierunkowanego dostarczania leków do większości ludzkich nowotworów i trofoblastów łożyska w leczeniu nowotworów i zaburzeń łożyska.

Synteza i charakterystyka nanocząstek lipidowo-polimerowych siarczanu chondroityny A (plCSA) ukierunkowanych na łożysko

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Metoda zamrażania i rozmrażania jest stosowana do produkcji hydrożeli chitozanowo-poli(alkohol winylowy) bez środków sieciujących. W przypadku tej metody ważne jest, aby wziąć pod uwagę warunki zamrażania (temperatura, liczba cykli) i stosunek polimeru, które mogą wpływać na właściwości i zastosowania otrzymanych hydrożeli.

Metoda zamrażania i rozmrażania do przygotowania hydrożeli chitozanowo-poli(alkohol winylowy) bez środków sieciujących i badań uwalniania diflunisalnego

To badanie opisuje metodę przekształcania chityny w piankę za pomocą technik chemicznych, które nie wymagają specjalistycznego sprzętu.

Otrzymywanie ekspandowanych pianek chitynowych i ich zastosowanie w usuwaniu wodnych roztworów miedzi

Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej

Poznaj metodę przygotowania i charakteryzacji nanocząstek SDF-1α z siarczanem dekstranu i chitozanem. Technika obejmuje pomiar wielkości, potencjała zeta oraz aktywności białka, co umożliwia zastosowanie w terapii komórkami macierzystymi.

Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Przeglądaj więcej filmów