Name: Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj metodę przygotowania i charakteryzacji nanocząstek SDF-1α z siarczanem dekstranu i chitozanem. Technika obejmuje pomiar wielkości, potencjała zeta oraz aktywności białka, co umożliwia zastosowanie w terapii komórkami macierzystymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH: HL671795, HL048743 i HL108630.

1. Przygotowanie nanocząstek glikanu SDF-1α
Ze względu na cel dostarczania in vivo, wysterylizuj wszystkie pojemniki, pipety i końcówki użyte do przygotowania.
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory podstawowe w wodzie ultraczystej: 1% siarczan dekstranu; 1 M NaOH (sterylny przefiltrowany membraną PES); 0,1% chitozan w 0,2% lodowatym kwasie octowym (przefiltrować kolejno przez filtry 0,8 i 0,22 μm, a następnie dostosować pH do 5,5 za pomocą NaOH); 0,1 MZnSO4; 15% mannitolu; i 0,92 mg/ml SDF-1α (przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze 80 °C, i przechowywać w temperaturze 4 °C po rozmrożeniu).</li>
	<li>Sterylizuj roztwory podstawowe przez membrany filtracyjne 0,22 μm. Ocenić poziom endotoksyn w przygotowanym roztworze za pomocą testu zakrzepów w żelu lizatu amebocytów limulusa (LAL). Upewnij się, że poziomy wynoszą <0,06 EU/ml.</li>
	<li>Dodać 0,18 ml wody UltraPure do szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml zawierającej mieszadło magnetyczne. Ustaw prędkość mieszania na 800 obr./min. Dodać 0,1 ml 1% siarczanu dekstranu i mieszać przez 2 min. Dodać 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml 0,92 mg/ml roztworu SDF-1α) i mieszać przez 20 min.</li>
	<li>Dodać kroplami 0,33 ml 0,1% chitozanu i mieszać przez 5 minut. Zmienić prędkość mieszania na maksymalną i powoli dodawać 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 za pomocą strzykawki o pojemności 0,1 ml (przez 1 min).</li>
	<li>Zwiększ prędkość mieszania do 800 obr./min i mieszaj przez 30 min. Dodać 0,4 ml 15% mannitolu i mieszać przez 5 minut. Przenieść mieszaninę reakcyjną do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. 
	Uwaga: Obecność mannitolu ułatwia ponowne zawieszenie cząstek po odwirowaniu. W zależności od zwartości granulatu stężenie mannitolu można zmieniać od 0% do 5%. Całkowite ponowne zawieszenie cząstek po każdym odwirowaniu ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zagregowań w końcowej zawiesinie.</li>
	<li>Odessać supernatant i za pomocą pipety powoli usunąć ostatnią kroplę płynu. Dodać 0,2 ml 5% mannitolu. Zawiesić osad za pomocą strzykawki igłowej o pojemności 0,5 ml i 29 G. Dodać 1 ml 5% mannitolu. Wirować przy 16 000 x g przez 15 min.</li>
	<li>Powtórz krok 1.6.</li>
	<li>Odessać supernatant. Zawiesić osad w 0,2 ml 5% mannitolu. Zawiesinę cząstek należy przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Zawiesina cząstek może być również przechowywana w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C lub liofilizowana. Włączenie 5% mannitolu do zawiesiny jest niezbędne, aby zapobiec agregacji cząstek po zamrożeniu i rozmrożeniu lub po liofilizacji i ponownym uwodnieniu. Mannitol można usunąć przez odwirowanie zawiesiny po przechowywaniu.</li>
</ol>
2. Pomiar wielkości cząstek i potencjału Zeta
Wielkość cząstek i potencjał zeta są analizowane odpowiednio przez dynamiczne rozpraszanie światła i elektroforetyczne rozpraszanie światła za pomocą analizatora cząstek wskazanego na Liście Materiałów.
<ol>
	<li>Ustaw następujące parametry pomiaru wielkości cząstek: Czasy akumulacji: 70; Czasy powtórzeń: 4; Temperatura: 25 °C; Rozcieńczalnik: woda; Regulacja intensywności: automatyczna.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę SDF-1α-DS-CS wodą (10-krotne rozcieńczenie). Załaduj 100 μl próbki do jednorazowej kuwety UV, takiej jak kuweta Eppendorf. Włóż kuwetę do uchwytu kuwety. Poczekaj, aż regulacja intensywności osiągnie "Optymalny" (~10 000 cps). Rozpocznij pobieranie danych.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru należy zapisać wyniki kumulantów średnicy (nm) i wskaźnika polidyspersyjności. Uśrednić wyniki uzyskane z każdego z 4 powtórzonych odczytów i obliczyć odchylenie standardowe.</li>
	<li>Załadować 500 μl 10-krotnie rozcieńczonej próbki cząstek do celi przepływowej w celu pomiaru potencjału zeta. Ustaw następujące parametry pomiaru: Czasy akumulacji: 10; Czasy powtórzeń: 5; Temperatura: 25 °C; Rozcieńczalnik: woda; Regulacja intensywności: automatyczna. Zapisz wyniki potencjału zeta (mV). Uśrednij wynik uzyskany z każdego z 5 powtórzonych odczytów i oblicz odchylenie standardowe.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja SDF-1α w cząstkach
<ol>
	<li>Rozcieńczyć wolną formę SDF-1α do stężeń 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 i 0,05 mg/ml w 1,3x buforze do próbek Laemmli. Rozcieńczyć 6 μl próbek SDF-1α-DS-CS w 40 μl 1,3x bufor do próbek Laemmli. (Przygotować 4x bufor podstawowy Laemmli zawierający 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glicerolu, 0,05 mg/ml błękitu bromofenolowego i 8% 2-merkaptoetanolu. Podzielić roztwór podstawowy na małe porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C do jednorazowego użytku)</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Dwukrotnie wirować próbki (każdy przez 10 sekund z maksymalną prędkością) podczas 10-minutowego czasu nagrzewania w celu całkowitej dysocjacji cząstek. Schłodzić próbki do temperatury suchej temperatury przez 2 minuty. Wirować przy 10 000 x g przez 0,5–1 minutę, aby obniżyć kondensat wodny. Ponownie zwirować, aby dobrze wymieszać. 
	Uwaga: W tym momencie roztwór próbki powinien być klarowny i nie ma widocznego osadu.</li>
	<li>Załadować 10 μl próbki/studzienki do 4–20% żelu SDS. Uruchomić elektroforezę przy napięciu 200 V przez 20 minut. Zabarwić żel niebieską plamą białkową Coomassie.</li>
	<li>Zbadaj gęstość pasm białkowych SDF-1α za pomocą obrazowania molekularnego i oprogramowania do analizy densytometrycznej. Oblicz ilość SDF-1α w cząstkach w stosunku do krzywej standardowej zbudowanej z wolnych wzorców SDF-1α.</li>
</ol>
4. Test uwalniania in vitro
<ol>
	<li>Zmieszać cząstki glikanu SDF-1α z solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco bez wapnia i magnezu (D-PBS) w stosunku 1:1 (v/v).</li>
	<li>Podzielić zawiesinę cząstek na podwielokrotności o objętości 0,05 ml w probówkach o pojemności 1,5 ml. Załaduj próbki na dno probówek. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza lub naruszania powierzchni płynu. Uszczelnij górną część tub za pomocą Parafilm. 
	UWAGA: W ten sposób płyn pozostanie na dnie podczas późniejszego obrotu od góry do dołu na mikserze rurowym.</li>
	<li>Obrócić probówki w temperaturze 37 °C na obracającym się mieszadle mikroprobówkowym. Usunąć podwielokrotności z probówek w wyznaczonych momentach i natychmiast odwirować próbki o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oddzielić sklaranty i osady, a następnie rozpuścić osad w 0,05 ml D-PBS. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. Po pobraniu wszystkich próbek należy zbadać supernatanty i granulki na żelu SDS, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
5. Test migracji
Ten test mierzy aktywność chemotaktyczną SDF-1α. Interakcja SDF-1α z jego receptorem (CXCR4) na powierzchni komórki powoduje migrację komórki w kierunku gradientu SDF-1α. W tym teście komórki są ładowane do górnej studzienki (oddzielonej półprzepuszczalną membraną od dolnej studzienki), a roztwór SDF-1α do dolnej studzienki.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć SDF-1α (forma wolna lub związana z cząstkami) buforem migracyjnym (pożywka RPMI-1640 zawierająca 0,5% albuminy surowicy bydlęcej) w 3-krotnym seryjnym rozcieńczeniu do końcowych stężeń 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 i 0,05 ng/ml.</li>
	<li>Dodać 0,6 ml rozcieńczonego roztworu SDF-1α lub samego buforu migracyjnego (kontrola ujemna) do studzienki na płytce 24-dołkowej. Dodać 0,57 ml buforu migracyjnego do studzienki (kontrola komórki wejściowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Umieść przepuszczalną wkładkę do hodowli komórkowej, taką jak Transwell (wielkość porów 5 μm, średnica 6,5 mm) na górze dolnej studzienki. Załaduj 0,1 ml komórek Jurkat (5 × 105) do wkładki Transwell. Załaduj komórki o pojemności 0,03 ml bezpośrednio do studzienki kontrolnej komórki wejściowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 .</li>
	<li>Wyjmij wkładki Transwell. Przenieś komórki, które migrowały do dolnych studzienek, do probówki polistyrenowej o pojemności 4 ml. Policz migrowane komórki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Oblicz migrację jako procent liczby komórek wejściowych (numer komórki w studzience kontrolnej komórki wejściowej x 100/30) po odjęciu liczb w kontrolach ujemnych (komórki migrowane do studzienek zawierających tylko bufor migracyjny).</li>
</ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).</li>
<li>Yue, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+affects+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+chitosan-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).</li>
<li>Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+as+a+therapeutic+stem+cell+homing+factor+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction.</a> Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).</li>
<li>Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-derived+factor-1%2FCXCR4+signaling%3A+indispensable+role+in+homing+and+engraftment+of+hematopoietic+stem+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).</li>
<li>Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha-heparin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).</li>
<li>Amara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1alpha+associates+with+heparan+sulfates+through+the+first+beta-strand+of+the+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).</li>
<li>Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate%2Fheparin+oligosaccharides+protect+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29%2FCXCL12+against+proteolysis+induced+by+CD26%2Fdipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV.</a> J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).</li>
<li>Yin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+in+glycan+nanoparticles+exhibits+full+activity+and+reduces+pulmonary+hypertension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).</li>
<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
<li>McCall, R. L., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA+nanoparticles+formed+by+single-+or+double-emulsion+with+vitamin+E-TPGS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS.</a> J Vis Exp. (82), 51015(2013).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jak wspomniano powyżej, nanocząstki DS-CS powstają w wyniku neutralizacji ładunku między cząsteczkami polianionu (DS) i polikacji (CS). Ponieważ oddziaływanie ładunku zachodzi łatwo podczas zderzenia molekularnego, stężenie roztworów polimerowych i prędkość mieszania podczas mieszania mają kluczowe znaczenie dla wielkości powstałych cząstek. Ogólna tendencja jest taka, że bardziej rozcieńczone roztwory DS i CS 15 i wyższa prędkość mieszania skutkują mniejszymi cząstkami.
Formuła nan...

Siarczan dekstranu (DS) i chitozan (CS) to polisacharydy z wieloma podstawionymi ujemnie naładowanymi grupami siarczanowymi (w DS) lub dodatnio naładowanymi grupami aminowymi (deacetylowany CS). Po zmieszaniu w roztworze wodnym dwa polisacharydy tworzą kompleksy polielektrolitowe w wyniku oddziaływań elektrostatycznych. Powstałe kompleksy mogą tworzyć duże agregaty, które zostaną oddzielone fazowo od roztworu wodnego (wytrącają się) lub małe cząstki, które dyspergowalnie w wodzie (koloidy). Konkretne warunki, które przyczyniają się do tych wyników, zostały szeroko zbadane i szczegółowo podsumowane i zilustrowane w niedawnym przeglądzie 1. Wśród tych warunków dwa podstawowe wymagania dotyczące wytwarzania cząstek dyspergowalnych w wodzie to: przeciwnie naładowane polimery muszą: 1) mieć znacznie różną masę molową; oraz 2) mieszać w stosunku niestechiometrycznym. Warunki te pozwolą neutralnym pod względem ładunku skompleksowanym segmentom polimerowym wygenerowanym przez neutralizację ładunku na segregację i utworzenie rdzenia cząstki, a nadmiar polimeru na utworzenie powłoki zewnętrznej 1. Cząstki glikanu opisane w tym protokole są przeznaczone do dostarczania do płuc i są zaprojektowane tak, aby były naładowane netto i miały wymiary nanometrowe. Ujemny ładunek powierzchniowy zmniejsza prawdopodobieństwo komórkowego wychwytu cząstek 2,3. Cząstki o wymiarach nanometrowych ułatwiają przejście przez dystalne drogi oddechowe. Aby osiągnąć ten cel, ilość DS użyta w tym preparacie przekracza CS (stosunek wagowy 3:1); oraz DS o wysokiej masie cząsteczkowej (średnia wagowa MW 500 000) i CS o niskiej masie cząsteczkowej (zakres MW 50–190 kDa, 75–85% deacetylowany).
SDF-1α to czynnik naprowadzający komórki macierzyste, który pełni funkcję naprowadzania poprzez swoją aktywność chemotaktyczną. SDF-1α odgrywa ważną rolę w naprowadzaniu i utrzymaniu hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym oraz w rekrutacji komórek progenitorowych do tkanki obwodowej w celu naprawy uszkodzeń 4,5. SDF-1α ma w swojej sekwencji białkowej miejsce wiążące heparynę, co pozwala białku wiązać się z heparyną / siarczanem heparanu, tworzyć dimery, być chronionym przed inaktywacją proteazy (CD26 / DPPIV) i wchodzić w interakcje z komórkami docelowymi za pośrednictwem receptorów na powierzchni komórki 6-8. DS ma podobne właściwości strukturalne jak heparyna/siarczan heparanu; w związku z tym wiązanie SDF-1α z DS byłoby podobne do wiązania jego naturalnych ligandów polimerowych.
W poniższym protokole opisujemy przygotowanie nanocząstek SDF-1α-DS-CS. Procedury te stanowią jedną z preparatów, które były wcześniej badane 9. Protokół został pierwotnie zaadaptowany z badania nanocząstek VEGF-DS-CS 10. Opisano preparat na małą skalę, który można łatwo zwiększyć przy użyciu tych samych roztworów podstawowych i warunków przygotowania. Po przygotowaniu cząstki są charakteryzowane poprzez zbadanie ich wielkości, potencjału zeta, zakresu inkorporacji SDF-1α, czasu uwalniania in vitro i aktywności włączonego SDF-1α.

<table><tbody><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitozan, niskocząsteczkowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure woda&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alfa;</td><td>Przygotowano zgodnie z odniesieniem 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, membrana PES 0,22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne mikromieszadła (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; mm)</td><td>Rybak&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw szklanych fiolek; SUN-SRi</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Analizator cząstek Delsa Nano C&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Niebieski bezpieczny barwnik białkowy</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Obrazownik molekularny VersaDoc MP 4000 System</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalne podpory Corning Transwell</td><td>Cytometr przepływowy Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus zestaw</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu sdf-1α-chitozan-dekstranu

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitozan (CS) i siarczan dekstranu (DS) są naładowanymi polisacharydami (glikanami), które tworzą nanocząstki na bazie kompleksu polielektrolitu po zmieszaniu w odpowiednich warunkach. Nanocząstki glikanu są użytecznymi nośnikami czynników białkowych, które ułatwiają dostarczanie białek in vivo i utrzymują ich retencję w tkance docelowej. Kompleksy glikanowych polielektrolitów są również idealne do dostarczania białek, ponieważ włączenie odbywa się w roztworze wodnym, co zmniejsza prawdopodobieństwo inaktywacji białek. Białka z miejscem wiązania heparyny łatwo przylegają do siarczanu dekstranu i są z kolei stabilizowane przez wiązanie. Cząsteczki te są również mniej zapalne i toksyczne, gdy są dostarczane in vivo. W opisanym poniżej protokole SDF-1α (czynnik pochodzenia komórek zrębu-1α), czynnik naprowadzający komórki macierzyste, jest najpierw mieszany i inkubowany z siarczanem dekstranu. Do mieszaniny dodaje się chitozan w celu utworzenia kompleksów polielektrolitowych, a następnie siarczan w celu stabilizacji kompleksów za pomocą mostków cynkowych. Powstałe cząstki SDF-1α-DS-CS są mierzone pod kątem wielkości (średnicy) i ładunku powierzchniowego (potencjału zeta). Określa się ilość wbudowanego SDF-1α, a następnie dokonuje się pomiarów jego szybkości uwalniania in vitro i jego aktywności chemotaktycznej w postaci związanej z cząstkami.

Rozmiar i potencjał zeta przygotowanych cząsteczek SDF-1α-DS-CS wyznaczono za pomocą analizatora cząstek. Rysunek 1 przedstawia analizę pomiaru rozmiaru. Na podstawie wyników kumanatów uzyskanych z czterech powtórnych pomiarów, średnica hydrodynamiczna cząsteczek SDF-1α-DS-CS wynosi 661 ± 8.2 (nm), a polidyspersyjność 0.23 ± 0.02. Wynik pomiaru potencjału zeta przedstawiono na Rysunku 2. Z pięciu powtórnych pomiarów wynika, że potencjał zeta cząsteczek SDF-1α-DS-CS wynosi -24.8 ± 0.5 mV....

Celem tego protokołu jest włączenie SDF-1α, czynnika naprowadzającego komórki macierzyste, do nanocząsteczek siarczanu dekstranu i chitozanu. Powstałe cząstki są mierzone pod kątem ich wielkości i potencjału zeta, a także zawartości, aktywności i szybkości uwalniania in vitro SDF-1α z nanocząstek.

Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przygotowanie i charakterystyka nanocząsteczek SD F1 Alpha Chias oraz siarczanu dekstranu. Przygotowanie nanocząsteczek polega najpierw na zmieszaniu czynnika homingu komórek macierzystych, stromal cell derived factor one alpha (SDF-1α), z siarczanem dekstranu, aby umożliwić wiązanie z ujemnie naładowanym glikanem. W drugim kroku do mieszaniny dodaje się ozan, dodatnio naładowany glikan, tworząc kompleks polielektrolitowy z siarczanem dekstranu.Następnie dodaje się siarczan cynku w celu stabilizacji kompleksów za pomocą mostków cynkowych. Powstała cząstka posiada gęsty rdzeń otoczony ujemnie naładowaną otoczką. Następnie mierzy się rozmiar i potencjał zeta cząstek, a także zawartość i aktywność SDF-1α w nanopartykulach. Główną zaletą glikanowych nanopartykul SDF-1α jest to, że włączone SDF-1α pozostaje w pełni aktywne bez konieczności uwalniania z cząstek.W związku z tym cząstki te mogłyby być użyteczne jako stacjonarny sygnał hermine w terapii komórkami macierzystymi. Na początek przygotować roztwory zapasowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wysterylizować je, przepuszczając przez membrany filtracyjne o porach 0,22 µm. Poziom endo

preparation-characterization-sdf-1-chitosan-dextran-sulfate

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przygotowanie i Charakteryzacja Nanocząstek SDF-1α-Chitosan-Dekstran Siarczan

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Elektroforeza kapilarna bez roztworu jest szybką, tanią i solidną metodą analityczną, która umożliwia ilościowe monitorowanie reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym. Jego przydatność do szybkiej, wygodnej i precyzyjnej analizy została tutaj zademonstrowana poprzez analizę szczepienia peptydów kowalencyjnych na foliach chitozanu w celu poprawy adhezji komórek.

Elektroforeza kapilarna do monitorowania szczepienia peptydów na warstwach chitozanu w czasie rzeczywistym

Prosta homogenizacja została wykorzystana do przygotowania nowatorskich, wysokiej gęstości, naśladujących lipoproteiny nanocząsteczek do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów. W artykule opisano wyzwania, szczegółowe protokoły przygotowania nanocząstek, charakterystyki in vitro oraz badań in vivo.

Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Tutaj prezentujemy protokół syntezy łożyskowych nanocząstek lipidowo-polimerowych skojarzonych z peptydem wiążącym siarczan chondroityny A (plCSA-BP) za pomocą jednoetapowej techniki sonikacji i biokoniugatu. Cząstki te stanowią nowatorskie narzędzie do ukierunkowanego dostarczania leków do większości ludzkich nowotworów i trofoblastów łożyska w leczeniu nowotworów i zaburzeń łożyska.

Synteza i charakterystyka nanocząstek lipidowo-polimerowych siarczanu chondroityny A (plCSA) ukierunkowanych na łożysko

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Metoda zamrażania i rozmrażania jest stosowana do produkcji hydrożeli chitozanowo-poli(alkohol winylowy) bez środków sieciujących. W przypadku tej metody ważne jest, aby wziąć pod uwagę warunki zamrażania (temperatura, liczba cykli) i stosunek polimeru, które mogą wpływać na właściwości i zastosowania otrzymanych hydrożeli.

Metoda zamrażania i rozmrażania do przygotowania hydrożeli chitozanowo-poli(alkohol winylowy) bez środków sieciujących i badań uwalniania diflunisalnego

To badanie opisuje metodę przekształcania chityny w piankę za pomocą technik chemicznych, które nie wymagają specjalistycznego sprzętu.

Otrzymywanie ekspandowanych pianek chitynowych i ich zastosowanie w usuwaniu wodnych roztworów miedzi

Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej

Poznaj metodę przygotowania i charakteryzacji nanocząstek SDF-1α z siarczanem dekstranu i chitozanem. Technika obejmuje pomiar wielkości, potencjała zeta oraz aktywności białka, co umożliwia zastosowanie w terapii komórkami macierzystymi.

Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Przeglądaj więcej filmów