Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przygotowanie i scharakteryzowanie nanocząstek SD F1, Alpha Chias i siarczanu dekstranu. Przygotowanie nanocząstek uzyskuje się poprzez najpierw zmieszanie czynnika naprowadzającego komórek macierzystych, czynnika pochodzącego z komórek zrębu, czynnika pierwszego alfa lub S, df, jednej alfa z siarczanem dekstranu, aby umożliwić wiązanie z ujemnie naładowanym glikanem. W drugim etapie ozan do mieszaniny dodaje się dodatnio naładowany glikan, tworząc kompleks polielektrolitowy z siarczanem dekstranu.

Następnie dodaje się siarczan w celu ustabilizowania kompleksów mostkami cynkowymi. Powstała cząstka ma gęste jądro otoczone ujemnie naładowaną powłoką. Cząstki są następnie mierzone pod kątem ich wielkości i potencjału zeta, a także zawartości i aktywności S df one alfa w nanocząstkach Główną zaletą nanocząstek alfa glikanu SDF one jest to, że wbudowana SDF one alfa jest w pełni aktywna bez uwalniania się z cząstek.

W związku z tym cząsteczki mogą być użyteczne jako stacjonarny sygnał herminowy w terapii komórkami macierzystymi. Na początek przygotuj roztwory podstawowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wysterylizuj je przez membrany filtracyjne o średnicy 0,22 mikrona. Oceń poziom endotoksyn w przygotowanym roztworze za pomocą testu zakrzepów w żelu z lizatu cytów ulu ameba.

Upewnij się, że poziomy są mniejsze niż 0,06 jednostki endotoksyny na mililitr. Następnie w 0,18 mililitra ultraczystej wody do szklanej fiolki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej mieszadło magnetyczne. Ustaw prędkość mieszania na 800 obr./min, a następnie dodaj 0,1 mililitra 1% siarczanu dekstranu i zamieszaj po dwóch minutach.

Dodaj 0,08 miligrama SD F1 alpha i mieszaj przez 20 minut. Kroplami dodaj 0,33 mililitra 0,1% tizen i mieszaj przez pięć minut. Zmień prędkość mieszania na maksymalną i powoli dodaj 0,1 mililitra siarczanu za pomocą gazoszczelnej strzykawki.

Przywróć prędkość mieszania do 800 obr./min i mieszaj przez 30 minut. Następnie dodaj 0,4 mililitra 15% mannitolu i wymieszaj po pięciu minutach. Przenieś mieszaninę reakcyjną do 1,5-mililitrowej probówki fuge i odwiruj w temperaturze 16 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Po odwirowaniu odessać supernatant i za pomocą pipety usunąć ostatnią kroplę płynu. Powoli dodaj 0,2 mililitra 5% mannitolu i zawiesij granulkę za pomocą strzykawki z igłą o średnicy 0,5 mililitra i rozmiarze 29. Następnie dodaj dodatkowy mililitr 5% manitolu przed odwirowaniem.

Drugi raz o 16 000 GS przez 15 minut. Po powtórzeniu procesu wirowania zawiesiny Resus należy odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 0,2 mililitra 5% mannitolu. Wielkość cząstek i potencjał zeta są analizowane odpowiednio przez dynamiczne rozpraszanie światła i elektroforetyczne rozpraszanie światła.

Aby rozpocząć, wybierz procedurę operacyjną z listy SOP, która zawiera parametry pomiaru wielkości cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Zgodnie z podaniem w protokole tekstowym rozcieńczyć próbkę cząstek alfa SD F1 wodą. Następnie załaduj 100 mikrolitrów próbki do jednorazowego weterynarza UV Q, takiego jak Einor Q Vet.

Włóż Q vet do uchwytu kuwety i poczekaj, aż regulacja intensywności osiągnie optimum przed rozpoczęciem zbierania danych. Po zakończeniu pomiaru zapisz wyniki kumulacji średnicy i wskaźnika dyspersyjności poli. Uśrednić wyniki uzyskane z każdego z czterech powtórzonych odczytów i obliczyć odchylenie standardowe dla pomiaru potencjału zeta poprzez elektroforetyczne rozpraszanie światła.

Załadować 500 mikrolitrów dziesięciokrotnie rozcieńczonej próbki cząstek do celi przepływowej. Wybierz procedurę operacyjną z listy SOP potencjału Zeta, która zawiera parametry pomiaru wymienione w protokole tekstowym. Zapisz wyniki potencjału zeta.

Następnie uśrednij wyniki uzyskane z każdego z pięciu powtórzonych odczytów i oblicz odchylenie standardowe. Podgrzewać rozcieńczone próbki wolnego i związanego z cząstkami SD F1 alfa w buforze do próbek laly w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dwukrotnie wirować próbki podczas 10-minutowego ogrzewania w celu całkowitej dysocjacji cząstek po schłodzeniu próbek do temperatury pokojowej przez dwie minuty, wirówka miała 10 000 G przez 0,5 do jednej minuty, aby ponownie obniżyć wir kondensatu wodnego, aby dobrze wymieszać.

W tym momencie roztwór próbki powinien być klarowny i nie ma widocznego osadu. Następnie załaduj 10 mikrolitrów próbki na studzienkę do 4 do 20% siarczanu ESAL sodu lub żelu SDS. Uruchom elektroforezę przy napięciu 200 woltów przez 20 minut przed zabarwieniem żelu niebieskim barwnikiem białkowym kumasi.

Zbadaj gęstość prążków białkowych SD F1 alfa za pomocą obrazowania molekularnego i oprogramowania do analizy densytometrycznej. Obliczyć ilość S, DF, jednej alfa w cząstkach w stosunku do krzywej wzorcowej skonstruowanej z wolnych wzorców SDF jeden alfa, aby przeprowadzić test uwalniania in vitro, wymieszać cząstki alfa glikanu SD F1 z roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym docos, roztworem soli fizjologicznej bez wapnia i magnezu lub DPBS w stosunku jeden do jednego. Podziel zawiesinę cząstek na podwielokrotności o pojemności 0,05 mililitra w probówkach o pojemności 1,5 mililitra.

Załaduj próbki na dno probówek. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza lub naruszania powierzchni płynu. Uszczelnij górną część rurek za pomocą paraformu.

Następnie obróć rurki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na obracającym się mikserze mikrorurkowym. Wyjąć podwielokrotności z probówek w wyznaczonych momentach i natychmiast odwirować próbki w temperaturze 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po odwirowaniu. Oddzielić supernatanty i osadki.

Następnie rozpuść osad w 0,05 mililitra DPBS. Po pobraniu wszystkich próbek należy zbadać supernatanty i granulki na żelu SDS. Tak jak poprzednio, ten test mierzy aktywność chemotaktyczną S df.

Jedna interakcja alfa S df one alfa z jego receptorem powoduje migrację komórki w kierunku gradientu alfa SD F1. Na początek rozcieńczony wolny od cząstek lub związany cząstkami z SD F1 alfa z buforem migracyjnym w trzykrotnym seryjnym rozcieńczeniu do końcowych stężeń wymienionych w protokole tekstowym. Dodać 0,6 mililitra rozcieńczonego roztworu SD F1 alfa do studzienki w płytce 24-dołkowej w celu kontroli ujemnej.

Zrób to samo dla bufora migracji, tylko wtedy, gdy dodaj 0,57 mililitra bufora migracji do studzienki w celu kontroli komórki wejściowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie umieść przepuszczalną wkładkę do hodowli komórkowej, taką jak transwell, na dolnej studzience załaduj 0,1 mililitra komórek kapelusza szarpnięcia do wkładki transwell.

Następnie załaduj 0,03 mililitra komórek bezpośrednio do kontrolki komórki wejściowej. Dobrze inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji usunąć wkładki z kultur komórkowych.

Przenieś komórki, które migrowały do dolnych studzienek, do czteromililitrowej rurki polistyrenowej. Policz migrowane komórki za pomocą cytometru przepływowego. Na koniec oblicz migrację jako procent liczby komórek wejściowych po odjęciu liczb w kontrolach ujemnych.

Pokazano tutaj analizę pomiaru wielkości cząstek siarczanu alfa dekstranu SD F1. Wynik CUMUL pokazuje, że średnica hydrodynamiczna cząstki wynosi 671 nanometrów, a polidyspersyjność 0,24. Ten zrzut ekranu pokazuje jeden z pięciu powtarzających się pomiarów potencjału zeta cząstek siarczanu nici SD F1 alfa DExT.

Potencjał zeta wynosi minus 24,7 miliwolta. Ilość S df one alfa w cząstkach siarczanu alfa dekstranu S df one określa się za pomocą elektroforezy żelowej SDS. Pokazano tutaj wybarwiony kumaši żel SDS z załadowanymi próbkami nanocząstek chlorku dekstranu siarczanu kaizan SD F1 alfa i siarczanu alfa dekstranu kaizan SD F1

Krzywa standardowa jest konstruowana na podstawie analizy gęstości pasm SD F1 Alpha Standard, obliczenie na podstawie krzywej standardowej wskazuje, że stężenie S DF one alfa w próbce nanocząstek SDF one alpha wynosi 0,03 miligrama na mililitr. Aby określić szybkość uwalniania in vitro S DF jednej alfa z nanocząstek, ilość uwolnionego S DF jednego alfa w supernacie oraz ilość cząstki związane sdf one alfa w granulkach określono przez barwienie kumasi żelu SDS, a następnie analizę cytometryczną. Aktywność związanego z cząstkami S DF jednego alfa mierzy się za pomocą testu migracji i porównuje się z nim wolny SDF jeden alfa, jak pokazano tutaj.

Związany z cząstkami SDF jeden alfa indukował taki sam zakres migracji, jak swobodny s DF jeden alfa we wszystkich mierzonych stężeniach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że formuła cząstek białka glikanowego może ulec zmianie. W zależności od konkretnego zastosowania, można włączyć inne białka i zastosować różne preparaty w celu zmiany wielkości cząstek.

Mamy nadzieję, że ten film zademonstruje podstawowe techniki przygotowania do zbierania nanocząstek, a następnie analizy funkcjonalnej wbudowanego SDF one alpha.