Name: Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj mikroskopię sił sondy Kelvina do badania potencjału powierzchniowego bakterii. Ta metoda umożliwia analizę ładunku błon komórkowych mikroorganizmów na różnych podłożach z nanometryczną rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy serdecznie dziękują Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych, Ministerstwu Badań i Innowacji Ontario oraz Kanadyjskiej Fundacji Innowacji za sfinansowanie tego badania.

1. Przygotowanie wyrobów szklanych i kultur
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do tego eksperymentu przygotuj 5% płytki z agarem z krwią owczą (SBA) do uprawy MRSA. Inkubować płytki SBA przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Po tym czasie powinny być obecne pojedyncze, dobrze odizolowane kolonie, które można wykorzystać do kolejnych inokulacji w płynnych pożywkach. Płytki SBA z pojedynczymi koloniami należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 - 2 miesiące. 
	UWAGA: Płytki agarowe z krwią owczą są dostarczane w gotowych opakowaniach zawierających od 20 do 25 płytek w zależności od producenta i zazwyczaj składają się z tryptycznej bazy agaru sojowego z dodatkiem 5% w/v krwi owczej.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) uzupełnionego 1% glukozy i 0,1% NaCl. Następnie zbierz i wyczyść 2 szklane probówki. Jeśli pokrywki do sterylizacji w autoklawie nie są dostępne dla probówek, użyj folii aluminiowej jako nakrętki. Autoklaw TSB i probówki wraz z pudełkiem końcówek do pipet o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego lub w pobliżu palnika Bunsena odpipetować 5 ml wcześniej autoklawizowanego TSB do autoklawowanych probówek. Należy uważać, aby upewnić się, że dano wystarczająco dużo czasu, aby TSB i probówki ostygły do temperatury pokojowej. Z wcześniej prążkowanej 5% płytki SBA zaszczepij pojedynczą kolonię w 6 ml bulionu TSB. Jedna będzie zawierała MRSA, a druga probówka będzie używana jako kontrola ujemna w celu zapewnienia sterylności.</li>
	<li>Pobrać zaszczepione probówki TSB i umieścić je w inkubatorze tłokowym na 24 godziny w temperaturze 37 °C i przy 200 obr./min. Po tym czasie wzrost drobnoustrojów powinien być widoczny w probówce MRSA, podczas gdy w probówce kontrolnej nie powinien być żaden wzrost.</li>
	<li>Pobrać 1 ml z 24-godzinnej hodowli i odpipetować do 6 ml świeżego TSB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin przy 200 obr./min.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml 6-godzinnej subkultury do 1,5 ml probówki do mikrofuge. Wirować przez 3 minuty przy 850 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml dejonizowanegoH2O. Odwirować, powtórzyć i ponownie zawiesić.</li>
</ol>
2. Czyszczenie i zaszczepianie podłoży ze stali nierdzewnej i złota
<ol>
	<li>Pobrać krążki z próbkami AFM ze stali nierdzewnej i złota (odpowiednio o średnicy 20 mm i 10 mm) i oczyścić każdą stronę 5 ml dejonizowanegoH2O. Trzymać krążki z próbkami w ręce dominującej za pomocą kleszczy i używać ręki subdominującej do pipetowania 5 ml z każdej strony krążka próbki. Po umyciu obu stron umieścić krążki z próbkami w zlewce zawierającej 20 ml dejonizowanegoH2O, a następnie przeprowadzić sonikację na 1 minutę.</li>
	<li>Po sonikacji użyj kleszczyków, aby usunąć krążki z próbką ze zlewki. Umieść krążki tak, aby opierały się pod kątem 60° o krawędź otwartej płytki Petriego na ręczniku papierowym. Użyj pokrywki płytki Petriego, aby przykryć krążki suszące. Poczekaj, aż dyski całkowicie wyschną przed kontynuowaniem. Czas schnięcia może wynosić od 4 do 8 godzin.</li>
	<li>Po wyschnięciu użyj kleszczyków, aby umieścić krążki próbek na płytce Petriego.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie funkcjonalizować powierzchnie krążków próbek dowolnym materiałem (np. kolagenem, hialuronanem, nanocząstkami srebra itp.).</li>
		<li>W tym eksperymencie użyj poli-L-lizyny do pokrycia powierzchni podłoża. W celu funkcjonalizacji poli-L-lizyny należy pobrać pipetą 200 - 400 μl 0,1% poli-L-lizyny (w H2O) na krążki z próbką i pozostawić do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na szalce Petriego.</li>
		<li>Po upływie 1 godziny przytrzymać krążek z próbką za pomocą kleszczyków i przemyć 1 ml dejonizowanegoH2O. Pozostaw do wyschnięcia na ręcznikach papierowych zgodnie z opisem w kroku 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać 2x umyte ponownie zawieszone komórki i płytkę 200 - 400 μl na krążkach z próbkami wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Jeżeli krążki próbki są pokryte poli-L-lizyną, inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji komórek na krążkach z próbkami, delikatnie przemyć krążki z próbkami 1 ml dejonizowanegoH2O. Pozostaw dyski do wyschnięcia na noc przed obrazowaniem.</li>
</ol>
3. Obrazowanie KPFM
UWAGA: Do tego eksperymentu użyj Agilent 5500 series ILM-AFM.
<ol>
	<li>Aby uruchomić AFM, włącz jednostkę komputerową wraz z kontrolerem HEB i MAC III AFM. Otwórz oprogramowanie do obrazowania AFM (np. PicoView firmy Agilent). Upewnij się, że początkowo wybrałeś ACAFM lub inne prawidłowe oznaczenie na AFM do obrazowania w trybie przerywanego kontaktu.</li>
	<li>Używając kleszczyków AFM w dominującej ręce i przytrzymując sprężynowy uchwyt klipsa otwartą ręką subdominującą, umieść wspornik KPFM w głowicy. Należy zachować ostrożność podczas obsługi i przenoszenia głowicy AFM do AFM, ponieważ ta jednostka (przynajmniej w modelu 5500 ILM-AFM) zawiera delikatną jednostkę kryształu piezoelektrycznego, która kontroluje kierunki skanowania X, Y i Z. 
	UWAGA: Wsporniki KPFM użyte w tym przypadku były wspornikami przewodzącymi DPE (niskoszumowymi) firmy Mikromasch o średnich częstotliwościach rezonansowych 80 kHz i stałych sprężystości 2,7 N/m. Wsporniki o tych częstotliwościach rezonansowych i stałych sprężystości zostały wybrane ze względu na ich łatwość obsługi. Wsporniki o większych stałych sprężystości i wyższych częstotliwościach rezonansowych mogą być również używane do obrazowania.</li>
	<li>Ostrożnie załaduj głowicę do AFM i podłącz odpowiednie przewody (w tym przypadku należy podłączyć dwa przewody: światło laserowe i silnik podnośnika stage).</li>
	<li>Ustaw laser na końcówce wspornika. Niektóre jednostki są wyposażone w funkcję kamery, która pozwala na łatwiejsze wyrównanie. Jeśli funkcja kamery nie jest dostępna w AFM, wyrównaj na końcówce wspornika zgodnie z poniższym opisem:
	<ol>
		<li>Obróć pokrętło od przodu do tyłu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć laser nad chipem wspornikowym. Gdy laser dotrze do chipa, zostanie zablokowany i nie będzie już widoczny. Przekręć pokrętło tylko kilka razy.</li>
		<li>Obracaj pokrętło od przodu do tyłu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż plamka lasera pojawi się ponownie. Laser znajduje się teraz na krawędzi chipa.</li>
		<li>Obróć pokrętło od lewej do prawej, aby ustawić laser na wsporniku. Gdy laser przechodzi przez wspornik, znika i pojawia się ponownie w krótkich odstępach czasu. Plamka lasera powinna być widoczna w osłonie z matowego szkła, w której później znajdzie się jednostka fotodiody.</li>
		<li>Przekręć pokrętło od przodu do tyłu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby przesunąć miejsce w dół wspornika w kierunku końcówki, aż miejsce na matowym szkle zniknie.</li>
		<li>Przekręć pokrętło od przodu do tyłu tylko nieznacznie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ustawić laser tak, aby znajdował się na końcówce wspornika. Plamka lasera pojawi się ponownie na matowym szkle. 
		UWAGA: Jest to metoda pozycjonowania laserowego wsporników desek do nurkowania. W przypadku trójkątnych wsporników proces wyrównywania różni się nieznacznie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyrównaniu lasera przytrzymaj silnik podnośnika stolika w pozycji "otwartej" przez 10 sekund, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń między wspornikiem a próbką podczas mocowania próbki do AFM.</li>
	<li>Umieść próbkę na stoliku próbki KPFM. Zmielić próbkę za pomocą drutu miedzianego. Podłącz odpowiednie przewody z AFM do sample stage. Podłącz stolik do AFM. W większości przypadków stolik jest utrzymywany na miejscu za pomocą magnesów.</li>
	<li>W oprogramowaniu AFM dostrój wspornik, a następnie rozpocznij zbliżanie się końcówki wspornika do próbki. Upewnij się, że czas stabilizacji jest ustawiony na nie więcej niż 10 ms, a prędkości zbliżania się nie przekraczają 2.0 μm/s, aby uniknąć uszkodzenia końcówki.</li>
	<li>Gdy końcówka wspornika znajdzie się na powierzchni próbki, wybierz rozmiar okna obrazowania i idealny obszar obrazowania. Zoptymalizuj wzmocnienia I i P wraz z nastawą wspornika, aby zoptymalizować obrazowanie topograficzne.
	<ol>
		<li>Po zoptymalizowaniu obrazowania topograficznego włącz moduł KPFM (tryb FM lub AM; tutaj użyj trybu FM). Należy zauważyć, że obrazowanie KPFM jest bardzo trudne poza oknem obrazowania 5 μm x 5 μm. Ponadto, aby uzyskać optymalne obrazowanie KPFM, użyj rozdzielczości 512 x 512 z niskimi prędkościami skanowania (0,02 - 0,05 linii/s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku ustawień FM-KPFM (nie ustawień ACAFM) ustaw procent napędu w zakresie od 5 do 10%. Ustawić częstotliwość wspornikową w zakresie od 1 do 5 kHz przy szerokości pasma 2 kHz. Ustaw wzmocnienia I i P dla ustawień FM-KPFM na 0.3%.
	<ol>
		<li>Zmieniaj szerokość pasma sygnału oraz wzmocnienia I i P między powierzchniami próbki. Aby zoptymalizować obrazowanie SP, należy dodatkowo dostosować szerokość pasma sygnału oraz wzmocnienia I i P, aby uzyskać optymalne obrazy. Zalecany zakres zysków I i P wynosi od 0,22 do 0,35%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj i analizuj zebrane obrazy KPFM za pomocą oprogramowania do przetwarzania po obrazie w celu zbierania danych SP.</li>
</ol>

<ol><li>Seth, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modeling+of+biofilm-infected+wounds%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review.</a> J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).</li>
<li>Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+and+chronic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Biofilms and chronic infections.</a> JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).</li>
<li>Hoiby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+impact+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Micro.+Infect%22%5BJournal%5D)">The clinical impact of bacterial biofilms.</a> Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).</li>
<li>Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+hematite+nanoparticle+exposure+on+biomechanical%2C+adhesive%2C+and+surface+electrical+properties+of+E.+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).</li>
<li>Lorite, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+physicochemical+properties+at+the+micro+and+nano+length+scales%3A+role+on+bacterial+adhesion+and+Xylella+fastidiosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li>
<li>Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+surface+potential+microscopy+of+spore+adhesion+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Surf.+Biointer%22%5BJournal%5D)">Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces.</a> Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).</li>
<li>Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+plasma+membrane+surface+potential+of+PC12+cells+as+measured+by+Kelvin+probe+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+the+positively+charged+bacterium+Strenotrophomonas+%28Xanthomonas%29+maltophilia+70401+to+glass+and+Teflon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon.</a> J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).</li>
<li>Soon, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+surface+charge+of+colistin-susceptible+and+-resistant+Acinetobacter+baumannii+cells+measured+with+zeta+potential+as+a+function+of+growth+phase+and+colistin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anti.+Chemo%22%5BJournal%5D)">Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment.</a> J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).</li>
<li>Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Link+between+culture+zeta+potential+homogeneity+and+Ebp+in+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).</li>
<li>Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeta+potential+as+a+measure+of+the+surface+charge+of+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells.</a> Ann Microbiol. , (2013).</li>
<li>Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed.+Nanobiotech%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy of biological samples.</a> Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).</li>
<li>Lindsay, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+tunneling+microscopy+and+atomic+force+microscopy+studies+of+biomaterials+at+a+liquid-solid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface.</a> J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).</li>
<li>Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kelvin+probe+force+microscopy+in+application+to+biomolecular+films%3A+frequency+modulation%2C+amplitude+modulation%2C+and+lift+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode.</a> Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).</li>
<li>Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probe+force+microscopy+and+its+application%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Reports%22%5BJournal%5D)">probe force microscopy and its application.</a> Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).</li>
<li>Loppacher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+demodulated+Kelvin+probe+force+microscopy+for+surface+photovoltage+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking.</a> Nanotechnology. 16 (3), (2005).</li>
<li>Domanski, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kelvin+probe+force+microscopy+in+nonpolar+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids.</a> Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).</li>
<li>Collins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+harmonic+Kelvin+probe+force+microscopy+at+the+graphene-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Letters%22%5BJournal%5D)">Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface.</a> Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103(2014).</li>
<li>Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+potential+measurements+in+liquid+by+frequency+modulation+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instru%22%5BJournal%5D)">Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instru. 81, (2010).</li>
<li>Collins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+charge+screening+dynamics+and+electrochemical+processes+at+the+solid-liquid+interface+with+electrochemical+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy.</a> Nature Comm. 5, 2871(2014).</li>
<li>Pastar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+methicillin+resistant+Staphylococcus+aureus+USA300+and+Pseudomonas+aeruginosa+in+polymicrobial+wound+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection.</a> PLoS One. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brien, D. J., Gould, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+vancomycin+have+a+future+in+the+treatment+of+skin+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Opin.+Infec.+Diseas%22%5BJournal%5D)">Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections.</a> Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).</li>
<li>Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+surface+potential%3A+dual+effects+upon+ion+uptake+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and.</a> 155 (2), 808-820 (2011).</li>
<li>Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+teichoic+acid+net+charge+in+Staphylococcus+aureus+colonization+of+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces.</a> Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).</li>
<li>Sinensky, A. M., Belcher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+high-resolution+protein%2FDNA+nanoarray+analysis+using+Kelvin+probe+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+recognition+of+biomolecular+interaction+via+kelvin+probe+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy.</a> ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

KPFM został wykorzystany jako nowatorska technika uzyskiwania danych elektrycznych powierzchni. Jest powszechnie stosowana jako metoda badania rozkładu ładunków w chemii i dopiero niedawno zaczęła być stosowana do badania układów biologicznych w skali mikro i nano. Na podstawie zebranych danych stwierdziliśmy, że drobnoustroje nie wydają się łatwo przyczepiać do czystych powierzchni ze stali nierdzewnej i złota, nawet po 3 godzinach inkubacji statycznej. Powierzchnie funkcjonalizowane poli-L-lizyną wykazywały szybkie prz...

Biofilmy wytwarzane na powierzchniach sprzętu i w ranach skórnych stanowią problem dla przemysłu medycznego, ponieważ biofilmy są oporne na usuwanie i mogą prowadzić do zwiększonego tempa przenoszenia chorób i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przyczepienie jest pierwszym krokiem w tworzeniu biofilmu i jest najbardziej krytycznym krokiem ze względu na jego odwracalność1-3. Charakterystyka powierzchni podłoża odgrywa kluczową rolę w przyczepianiu się drobnoustrojów. Wykazano, że czynniki takie jak twardość powierzchni, porowatość, chropowatość i hydrofobowość wpływają na przyczepianie się drobnoustrojów; jednak przeprowadzono niewiele badań oceniających rolę potencjału powierzchniowego podłoża (SP) na adhezję mikrobiologiczną4,5. Ujemnie naładowane powierzchnie zapobiegają przyczepianiu się zarodników Bacillus thuringiensis do miki, krzemu i złota6. Zmiany potencjału błony komórkowej wskazują na zmiany w przyczepieniu i ruchliwości komórek5,7. Zaobserwowano, że powierzchnie jednorodne elektrycznie łatwiej sprzyjają adhezji mikrobiologicznej5. Scharakteryzowanie potencjału powierzchniowego bakterii w nanoskali może zapewnić nowy sposób zrozumienia kinetyki adhezji bakterii do różnych powierzchni, a tym samym może pomóc w opracowaniu strategii przeciwdziałania biofoulingowi. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do charakteryzowania elektrokinetyki bakterii, takich jak elektroforetyczne rozpraszanie światła, potencjał zeta i wyznaczanie punktów izoelektrycznych, mikroskopia sił sondy Kelvina (KPFM) pozwala na badanie pojedynczych komórek, a nie całych kultur8-11. Jest to korzystne, gdy chce się porównać charakterystyki elektryczne komórka-komórka lub biofilm z dużą dokładnością i precyzją.
KPFM jest modułem mikroskopii sił atomowych (AFM). AFM został opracowany bezpośrednio w wyniku zastosowania skaningowego mikroskopu tunelowego (STM)12. Pierwsze opublikowane zdjęcia za pomocą STM zostały wykonane przez Gerda Binniga i Heinricha Rorhrera w 1982roku12. Ich wynalazek był w stanie rozdzielić struktury atomowe poprzez skanowanie rastrowe ostrej końcówki przewodzącej nad przewodzącą powierzchnią w powietrzu. Implikacje uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości podekscytowały biologów, którzy szybko podjęli próbę wykorzystania STM do obrazowania wysuszonych próbek DNA, białek iwirusów12. STM można również wykonać w cieczach za pomocą specjalistycznych końcówek sondy13. Zostało to wykazane przez Lindsay i wsp., którzy użyli STM i AFM do obrazowania cząsteczek DNA w 10 mM HClO4 i w wodzie, na złotych elektrodach13. KPFM wykazano w określaniu potencjałów powierzchniowych analizy DNA i białek25 oraz interakcji biomolekuł z ligandami26.
KPFM działa poprzez pomiar różnicy potencjałów stykowych (CPD) między przewodzącą końcówką wspornikową AFM a idealnie przewodzącą próbką (Rysunek 1, i)14,15. Próbki niekoniecznie muszą być przewodzące (tj. próbki biologiczne). Obrazowanie można przeprowadzić na powierzchniach mikowych, szklanych i silikonowych (nieprzewodzących), o ile powierzchnia nieprzewodząca jest cienka i znajduje się pod nią materiał przewodzący6,7. CPD jest równoważne napięciu potencjału powierzchniowego i można je opisać jako różnicę funkcji pracy między końcówką (końcówką φ) a próbką (φpróbką), podzieloną przez ujemny ładunek elektronów (-e). Gdy przewodząca końcówka AFM zbliży się do powierzchni próbki (oddzielonej odległością d), generowana jest siła elektrostatyczna (Fes) wynikająca z różnicy energii Fermiego (rysunek 1, ii, a)15. W tym momencie energie próżni końcówki i próbki (Ev) są w równowadze i wyrównane. Po zbliżeniu końcówki do powierzchni próbki, końcówka i powierzchnia próbki stykają się elektrycznie i działają jak równoległe kondensatory płytkowe (rysunek 1, ii, b)14,15. W tym punkcie energie Fermiego końcówki i powierzchni próbki wyrównują się, osiągając równowagę w stanie ustalonym (rys. 1, ii, b). Końcówka i powierzchnia próbki zostaną naładowane, a z powodu różnicy w Ev, v i funkcjach roboczych utworzy się VCPD. A Fes działa na obszar styku elektrycznego ze względu na utworzony VCPD. Siła ta jest następnie niwelowana poprzez przyłożenie zewnętrznego VDC do końcówki, która ma taką samą wielkość jak utworzona VCPD (rysunek 1, ii, c). To przyłożone napięcie prądu stałego eliminuje ładunek powierzchniowy w obszarze kontaktu elektrycznego, a ilość VDC niezbędna do wyeliminowania Fes VCPD jest równa różnicy w funkcjach roboczych między powierzchnią próbki a końcówką15. Należy zauważyć, że funkcja pracy końcówki jest znana i jest dostarczana przez producentów. We wszystkich metodach KPFM do końcówki przykładane jest również napięcie prądu przemiennego (VAC, około 100 - 500 mV) w celu wytworzenia oscylujących sił elektrycznych między końcówką a próbką14. Zapewnia to lepszą rozdzielczość podczas pomiaru zmian w V, CPD i/lub Fes. W związku z tym zmiany częstotliwości lub amplitudy oscylacji elektrycznych mogą być korygowane przez VDC i można generować mapy potencjału powierzchniowego. Dane z określonych obszarów tych map mogą być dalej analizowane w celu dostarczenia informacji elektrycznych o określonych obiektach topograficznych.
KPFM może być obsługiwany w trzech trybach: (1) tryb podnoszenia, (2) tryb modulacji amplitudy (AM) i (3) tryb modulacji częstotliwości (FM)14,16. Tryb Lift był początkowym wcieleniem KPFM. Tryb podnoszenia opiera się na metodzie dwuprzebiegowej, w której oscylowana końcówka jest przeciągana po powierzchni w celu uzyskania obrazu topograficznego. W drugim przejściu końcówka jest unoszona o ustaloną odległość nad próbką (10 - 100 nm) i skanowana z powrotem w tym samym obszarze. Ze względu na tę dwuprzebiegową metodę tryb lift, w porównaniu do AM i FM-KPFM, zajmuje najwięcej czasu na akwizycję obrazu. Odsunięcie końcówki od powierzchni zapewnia, że mierzone są tylko wartości dalekiego zasięgu. Ponadto przesłuch między topografią a pomiarami potencjału powierzchniowego jest rozprzężony kosztem zwiększonej rozdzielczości bocznej i czułości.
AM-KPFM poprawia rozdzielczość poprzeczną i czułość, wykorzystując podwójne częstotliwości do jednoczesnego pomiaru topografii próbki i potencjału powierzchni (skanowanie jednoprzebiegowe)14. W trybie AM wspornik jest oscylowany mechanicznie, zwykle 5% poniżej swojej pierwszej częstotliwości rezonansowej (f0) i oscylowany elektrycznie (przez VAC) przy drugiej częstotliwości rezonansowej (f1). Zmiany amplitudy f0 prowadzą do generowania danych topograficznych, podczas gdy zmiany amplitudy f1, spowodowane zmianami Fes i VCPD, dają dane pomiarowe potencjału powierzchniowego. F0 i f1 wspornika są oddzielone znacznymi częstotliwościami i energiami, które sygnalizują, że przesłuchy są zminimalizowane14. Skrzynka elektroniki głowicy (HEB) AFM oddziela te dwa sygnały, aby jednocześnie dostarczyć zarówno dane topograficzne, jak i dane o potencjale powierzchniowym w jednym skanie. FM-KPFM zwiększa rozdzielczość jeszcze bardziej niż AM-KPFM na powierzchniach biologicznych14. FM-KPFM działa inaczej niż AM-KPFM, ponieważ mierzy zmiany gradientów siły elektrostatycznej, a nie siły elektrostatycznej (Fes)15. Podobnie jak tryb AM, tryb FM wykorzystuje podwójne częstotliwości i jednoprzebiegowy mechanizm skanowania w celu jednoczesnego uzyskania danych topograficznych i potencjału powierzchniowego14. W trybie FM wspornik jest oscylowany mechanicznie przy f0 i oscylowany elektrycznie przy niskiej zmodyfikowanej częstotliwości (fmod, zwykle 1 - 5 kHz). Po oddziaływaniach elektrostatycznych f0 i fmod mieszają się, tworząc pasma boczne f0 ± fmod. Te wstęgi boczne są bardzo wrażliwe na zmiany siły elektrostatycznej i można je oddzielić od f0 za pomocą HEB AFM. Ponieważ FM-KPFM mierzy zmiany gradientów sił elektrostatycznych, kształt wierzchołka końcówki i jego konserwacja/integralność odgrywają kluczową rolę w ogólnej rozdzielczości potencjału powierzchni14, 15. Rozdzielczość potencjału powierzchniowego w trybach AM i FM mieści się w zakresie 1 nm bocznie14-16. Należy zauważyć, że obrazowanie KPFM można wykonać w cieczach niepolarnych, a ostatnio wykazano, że wykonuje się je w cieczach polarnych o niskiej jonowości (<10 mM) (w trybach KPFM w pętli otwartej, które nie wymagają sprzężenia zwrotnego polaryzacji, co eliminuje zastosowanie polaryzacji prądu stałego), takich jak woda MilliQ; jednak obrazowanie KPFM nie zostało jeszcze wykonane na żywych komórkach w roztworach polarnych17-20. Dodatkowym wyzwaniem związanym z obrazowaniem SP w cieczy jest to, że roztwory powszechnie stosowane do utrzymywania komórek (tj. sól fizjologiczna buforowana fosforanami) mają wysokie stężenia ruchomych jonów, co prowadziłoby do reakcji Farada, dynamiki ładunku wywołanej odchyleniem oraz dyfuzji/redystrybucji jonów20. Tak więc w tym eksperymencie pomiary wykonano z wysuszonych i martwych komórek MRSA na powierzchniach ze stali nierdzewnej i złota funkcjonalizowanych poli-L-lizyną w warunkach otoczenia. Obrazowanie można przeprowadzić w warunkach powietrza lub próżni na próbkach biologicznych, które zostały wcześniej wysuszone lub unieruchomione na powierzchniach20. Wykazano również, że warunki wilgotne wpływają na obrazowanie powierzchni z użyciem KPFM6.
W tym badaniu użyliśmy FM-KPFM i AFM do zbadania roli SP w przyczepianiu opornego na metycylinę Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) do funkcjonalizowanej poli-L-lizyną powierzchni ze stali nierdzewnej i złota. MRSA zyskał ostatnio status "superbakterii" wielolekoopornej (MDR) ze względu na naturalnie wyselekcjonowaną oporność na wiele antybiotyków β-laktamowych i cefalosporyn21. Zakażenia MRSA są obecnie trudniejsze, trudniejsze i groźniejsze do leczenia, co prowadzi do stosowania ostrzejszych środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak wankomycyna lub oksazolidynony, które mają wyższy poziom toksyczności u ludzi, a zatem nie mogą być stosowane jako leczenie długoterminowe22. Stal nierdzewna została wybrana ze względu na jej znaczenie medyczne i powszechne zastosowanie jako materiał w igłach podskórnych, basenach, klamkach, zlewach itp. Złoto było używane jako metal porównawczy. FM-KPFM wykorzystano do zbadania, czy SP błony mikrobiologicznej zmienia się po przyczepieniu do substratów.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop sił atomowych 5500ILM</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>Metalowe dyski do próbek AFM/STM</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16219</td><td>Tarcze do pobierania próbek ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>DPE (Low-Noise) Przewodzące sondy SPM</td><td>Mikromasch</td><td>#HQ:DPE-XSC11</td><td>W każdym chipie znajdują się 4 wsporniki pokryte Pt. Do eksperymentów wykorzystaliśmy wspornik B.</td></tr><tr><td>Metalowe dyski do próbek AFM/STM pokryte złotem PELCO</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>Złote dyski z próbkami</td></tr><tr><td>Oprogramowanie PicoView</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797B</td><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopu sił atomowych 5500ILM</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania obrazu Pico (Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM Mikroskop sił atomowych oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 Mikrowirówka o dużej prędkości</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>Wirówka stosowana na etapach mycia komórek w celu oddzielenia komórek (osadów) od podłoża</td></tr><tr><td>Tryptykaza Agar sojowy z 5% krwią owczą</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>Gotowe talerze</td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>BD</td><td>#257107</td><td>Występuje w postaci suchego proszku. Instrukcja, jak zrobić na pojemniku.</td></tr></tbody></table>

pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy kelvina

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Potencjał powierzchniowy jest często pomijaną cechą fizyczną, która odgrywa dominującą rolę w przyleganiu mikroorganizmów do powierzchni podłoża. Mikroskopia siły sondy Kelvina (KPFM) to moduł mikroskopii sił atomowych (AFM), który mierzy różnicę potencjałów kontaktowych między powierzchniami w nanoskali. Połączenie KPFM z AFM pozwala na jednoczesne generowanie potencjału powierzchniowego i map topograficznych próbek biologicznych, takich jak komórki bakteryjne. W tym przypadku wykorzystujemy KPFM do zbadania wpływu potencjału powierzchniowego na adhezję mikrobiologiczną do powierzchni istotnych z medycznego punktu widzenia, takich jak stal nierdzewna i złoto. Mapy potencjału powierzchniowego ujawniły różnice w potencjale powierzchniowym membran mikrobiologicznych na różnych podłożach materiałowych. Wygenerowano wykres wysokości kroku, aby pokazać różnicę w potencjale powierzchniowym w obszarze granicznym między powierzchnią podłoża a mikroorganizmami. Zmiany potencjału powierzchniowego błony komórkowej zostały powiązane ze zmianami w metabolizmie i ruchliwości komórek. Dlatego KPFM stanowi potężne narzędzie, które można wykorzystać do badania zmian potencjału powierzchni błony mikrobiologicznej po przyczepieniu do różnych powierzchni podłoża. W tym badaniu demonstrujemy procedurę charakteryzowania potencjału powierzchniowego poszczególnych komórek Staphylococcus aureus USA100 opornych na metycylinę na stali nierdzewnej i złocie przy użyciu KPFM.

Zdolność do pomiaru SP za pomocą KPFM opiera się na zasadzie, że zarówno powierzchnia próbki, jak i końcówka wspornika są w pewnym stopniu przewodzące. Stal nierdzewna i złoto posłużyły jako powierzchnie przewodzące, do których przytwierdzono MRSA. Obrazy KPFM wykonano dla 15 komórek MRSA na obu powierzchniach z rozdzielczością 512 x 512, przy obszarach skanowania od 5 x 5 µm do 10 x 10 µm. Skanowanie przeprowadzano z prędkościami linii w zakresie od 0,02 linii/sek do 0,05 linii/sek. Zatem przy 512 punktach danych zbiera...

Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający użycie mikroskopii siły sondy Kelvina jako narzędzia do generowania wysokiej rozdzielczości nanoskalowych map potencjału powierzchniowego. Narzędzie to zastosowano do oceny wpływu potencjału powierzchniowego na zdolność wiązania mikroorganizmów z powierzchniami podłoża.

Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja zmian ładunku błony komórkowej po przyleganiu do różnych podłoży materiałowych. Osiąga się to poprzez hodowlę mikroorganizmów w bogatym w składniki odżywcze medium w celu zwiększenia ich liczby. Następnie powierzchnie materiałów, do których przylegać będą mikroorganizmy, są oczyszczane i funkcjonalizowane w celu zapewnienia optymalnych wskaźników przywierania drobnoustrojów.Następnie mikroorganizmy są wysiewane na różne podłoża materiałowe w celu przeprowadzenia obrazowania za pomocą siłowej mikroskopii sondy Kelvina (KPFM). Wyniki wykazują, że rodzaj podłoża materiałowego oraz jego ładunek własny wpływają na aktywność komórek, co objawia się zmianami ładunku błony komórkowej oraz adhezji komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroforeza, rozpraszanie światła i wyznaczanie punktu izoelektrycznego, jest fakt, że KPFM umożliwia badanie ładunku pojedynczych komórek i biofilmów zamiast całych kultur lub kolonii.Jest to korzystne w przypadku chęci porównania charakterystyk elektrycznych poszczególnych komórek oraz biofilmu z wysoką dokładnością i precyzją. Aby rozpocząć, przygotuj płytki z 5% agaru z krwią owczą, wysej na przygotowanych płytkach bakterie MRSA i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, aby uzyskać pojedyncze, dobrze odizolowane kolonie. Przygotuj 500 mL bulionu sojowego triptic, uzupełnionego o 1% glukozy i 0,1% chlorku sodu, a następnie wysterylizuj w autoklawie wraz z dwiema czystymi szklanymi probówkami i jednym opakowaniem końcówek do pipety 1 mL.Po wystudzeniu pożywki i probówek w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub w pobliżu palnika Bunsena, odpipetuj 6 mL TSB do każdej probówki. Korzystając z jednej z wcześniej przygotowanych płytek z agarem z krwią owczą, zaszczep pojedynczą kolonię MRSA do jednej z probówek. Drugą probówkę wykorzystaj jako kontrolę negatywną w celu zapewnienia sterylności. Inkubuj probówki w inkubatorze obrotowym przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przy 200 RPM.W probówce z MRSA powinien być widoczny wzrost lub w probówce kontrolnej nie powinien nastąpić żaden wzrost. Następnie należy przygotować subkulturę, wykorzystując 1 mL 24-godzinnej hodowli do zaszczepienia 6 mL świeżego bulionu sojowego z tryptonem, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 RPM przez kolejne sześć godzin. Następnie należy pipetować 1 mL hodowli do probówki typu conical i wirować z prędkością 850 ×g przez trzy minuty.Odlej nadsącz i używając pęsety w dominującej dłoni, dwukrotnie przemyj osad wodą dejonizowaną. Chwyć 20 milimetrową stalową próbkę dysku FM i użyj pięciu mililitrów wody dejonizowanej, aby oczyścić każdą stronę. Umieść czyste dyski w zlewce z wodą dejonizowaną i poddaj sonikacji przez jedną minutę.Za pomocą pincety wyjmij krążki z próbką z zlewki i oprzyj je pod kątem około 60 stopni o krawędź otwartej szalki Petriego wyłożonej ręcznikiem papierowym. Aby całkowicie je osuszyć, przykryj schnące krążki pokrywką szalki. Po wyschnięciu przenieś krążek do szalki Petriego w celu funkcjonalizacji powierzchni krążka. W komorze z laminarnym przepływem powietrza nanieś pipetą od 200 do 400 µL 0,1% poli-L-lizyny na krążki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, podtrzymując krążki za pomocą pincety.Użyj wody dejonizowanej, aby je wypłukać, zgodnie z wcześniejszą demonstracją w tym filmie. Następnie nanieś od 200 do 400 µL zawiesiny komórek, które zostały dwukrotnie wypłukane, na pokryte krążki do próbek. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut delikatnie wypłucz krążki, używając 1 mL wody dejonizowanej.Pozostaw krążki do wyschnięcia na noc przed obrazowaniem, aby przeprowadzić pomiary za pomocą mikroskopii siłowej z sondą Kelvina. Włącz komputer wraz z mikroskopem sił atomowych (AFM), HEB oraz kontrolerem MAC three. Otwórz oprogramowanie do obrazowania AFM, takie jak Ulence P ovu overview.Wybierz A-C-A-F-M lub odpowiednie oznaczenie dla obrazowania w trybie przerywanego kontaktu. Używając pincety FM w dominującej dłoni i trzymając otwarty sprężynowy uchwyt klipsa w drugiej dłoni, ostrożnie umieść wspornik A-K-P-F-M w głowicy. Ostrożnie zamontuj głowicę w A FM i podłącz przewody wiązki lasera oraz silnika podnośnika stolika.Następnie skieruj wiązkę lasera na czubek dźwigni. Aby ustawić laser na czubku dźwigni, obróć pokrętło przód-tył kilkukrotnie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć laser nad chip z dźwignią.Gdy laser dotrze do chipa, zostanie zablokowany i przestanie być widoczny. Następnie obracaj pokrętło przesunięcia przód-tył przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aż plamka lasera pojawi się ponownie. Laser znajduje się teraz na krawędzi chipa.Obracaj pokrętłem lewo-prawo, aby ustawić laser na belce dwuwarstwowej. Gdy laser przechodzi nad belką, będzie on szybko znikać i pojawiać się. Plamka lasera powinna być widoczna na matowej szklanej osłonie, w miejscu, gdzie później zostanie umieszczona jednostka fotodiody.Obracaj pokrętło przód-tył przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby przesunąć plamkę w dół wspornika w stronę końcówki, aż plamka na matowym szkle zniknie. Następnie obróć pokrętło przód-tył lekko zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ustawić laser tak, by znajdował się dokładnie na końcówce wspornika; plamka lasera ponownie pojawi się na matowym szkle. Po wyrównaniu lasera przytrzymaj silnik podnoszący stolik w pozycji otwartej przez 10 sekund, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń między wspornikiem a próbką.Podczas mocowania próbki do A FM, umieść próbkę na stoliku KPFM. Użyj miedzianego drutu, aby uziemić próbkę, a następnie podłącz odpowiednie przewody z A FM do stolika z próbką. Następnie połącz stolik z A FM w oprogramowaniu A FM.Należy upewnić się, że czas ustalania nie przekracza 10 ms, a prędkości zbliżania nie przekraczają 2 µm/s. Aby uniknąć uszkodzenia końcówki, należy nastroić dźwignię i rozpocząć przesuwanie jej końcówki w stronę próbki. Gdy końcówka dźwigni dotrze do powierzchni próbki, należy wybrać rozmiar okna obrazowania i optymalny obszar obrazowania, a następnie zoptymalizować wzmocnienia pętli i P oraz punkt nastawy dźwigni w celu optymalizacji obrazowania topograficznego.Po zoptymalizowaniu obrazowania topograficznego należy włączyć moduł KPFM w trybie FM. Ustaw okno obrazowania na pięć mikronów na pięć mikronów z rozdzielczością 12 na 12 lub wolną prędkością skanowania. W ustawieniach FM KPFM ustaw wartość drive w zakresie od 5 do 10%. Częstotliwość drive ustaw w zakresie od 1 do 5 kHz z szerokością pasma 2 kHz.Ustaw przyrosty nanocząsteczek żelaza dla F-M-K-P-F-M na 0.3%. Po pozyskaniu obrazów KPFM, użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu ich analizy i zebrania danych SP, korzystając z ustawień przedstawionych w tej demonstracji wideo. Obrazy KPFM wykonano dla 15 komórek MRSA zarówno na powierzchniach ze stali nierdzewnej, jak i ze złota. Przedstawiono tutaj rodzaje zgromadzonych obrazów.Ponieważ metoda KPFM wykorzystuje podwójne częstotliwości, jednocześnie gromadzono obrazy topograficzne oraz dane elektryczne powierzchni komórki. Do map potencjału powierzchni zastosowano filtry termiczne, aby łatwiej dostrzec niewielkie zmiany potencjału powierzchni. Na tym wykresie przeanalizowano obrazy w celu określenia potencjału powierzchni błony mikrobiologicznej, a następnie wykorzystano je do porównania wzrostu na różnych podłożach.Skanowanie potencjału powierzchni gołych podłoży ze stali nierdzewnej i złota wykazało ogólnie ujemne potencjały powierzchniowe. Krążki ze stali nierdzewnej i złota powlekane poliolizyną wykazały przesunięcie w stronę dodatnich potencjałów powierzchniowych. Potencjały błon komórkowych MRSA różniły się w zależności od powierzchni stali nierdzewnej i złota.Stal nierdzewna wykazała znacznie wyższy dodatni potencjał powierzchniowy błony komórkowej w porównaniu do komórek MRSA na podłożu ze złota, które wykazywały ujemne potencjały powierzchniowe. Aby zaprezentować pełne możliwości KPFM, tutaj przedstawiono przykład wykresu wysokości stopnia dla MRSA na stali nierdzewnej. Ilustruje on różnicę w potencjale powierzchniowym między powierzchnią podłoża a błoną mikrobiologiczną.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania siłowej spektroskopii sondy Kelvina do badania wpływu ładunku elektrycznego na przyleganie i aktywność komórek drobnoustrojów na powierzchniach różnych podłoży materiałowych.

surface-potential-measurement-bacteria-using-kelvin-probe-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pomiar potencjału powierzchni bakterii za pomocą mikroskopii sił sond Kelvina

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Źródło: Wen, J., Pasman, et al., Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii oświetlenia strukturalnego do uzyskania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych, które ujawniają organizację białek kiełkujących w zarodnikach bakterii.

Wizualizacja białek kiełkujących w błonie wewnętrznej zarodników bakterii

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Ten artykuł pokazuje oryginalną metodologię opartą na zdalnym uruchamianiu cząstek magnetycznych osadzonych w biofilmie bakteryjnym oraz rozwoju dedykowanych pęset magnetycznych do pomiaru in situ lokalnych właściwości mechanicznych złożonego żywego materiału zbudowanego przez mikroorganizmy na granicy faz.

Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Prosta metoda pomiaru i charakteryzowania przyczepności bakterii do roślin, szczególnie korzeni i pędów, jest opisana w tym artykule.

Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.

Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Mikroskopia siły sondy Kelvina (KPFM) mierzy topografię powierzchni i różnice w potencjale powierzchni, podczas gdy skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i związane z nią spektroskopie mogą wyjaśnić morfologię powierzchni, skład, krystaliczność i orientację krystalograficzną. W związku z tym kolokalizacja SEM z KPFM może zapewnić wgląd w wpływ składu i struktury powierzchni w nanoskali na korozję.

Koloktuacja mikroskopii sił sondy Kelvina z innymi mikroskopami i spektroskopiami: wybrane zastosowania w charakterystyce korozji stopów

Poznaj mikroskopię sił sondy Kelvina do badania potencjału powierzchniowego bakterii. Ta metoda umożliwia analizę ładunku błon komórkowych mikroorganizmów na różnych podłożach z nanometryczną rozdzielczością.

Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Przeglądaj więcej filmów