Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zaobserwowanie zmian w ładunku błony komórkowej po przyleganiu do różnych substratów materiałowych. Osiąga się to poprzez hodowlę mikroorganizmów w pożywce bogatej w składniki odżywcze w celu zwiększenia ich liczby. Następnie powierzchnie materiałów, do których będą przylegać mikroorganizmy, są czyszczone i funkcjonalizowane w celu uzyskania optymalnych wskaźników przyczepiania się mikroorganizmów.

Następnie mikroorganizmy są platerowane na różnych podłożach materiałowych, aby umożliwić mikroskopię siły sondy Kelvina lub obrazowanie KPFM. Wyniki pokazują, że rodzaj substratu materiałowego i jego nieodłączny ładunek mają wpływ na aktywność komórki, co widać po zmianach w ładunku błony komórkowej i przyleganiu komórki. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak elektroforetyka, rozpraszanie światła i izoelektryczne wyznaczanie punktów, jest to, że KPFM pozwala na badanie ładunku pojedynczych komórek i biofilmów, a nie całych kultur lub kolonii.

Jest to korzystne, gdy chce się porównać charakterystykę elektryczną komórki do komórki, a także biofilmu z dużą dokładnością i precyzją. Na początek przygotuj 5% płytki agarowe z krwią owczą, rozprowadź bakterie MRSA na przygotowanych płytkach i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wytworzyć pojedyncze, dobrze izolowane kolonie. Przygotuj 500 mililitrów tryptyku bulionu sojowego, uzupełnionego autoklawem 1% glukozy i 0,1% chlorku sodu, a także dwiema czystymi szklanymi probówkami i jednym pudełkiem z mililitrowymi łykami pipety.

Po pozostawieniu pożywki i probówek do ostygnięcia pod szafką bezpieczeństwa biologicznego lub w pobliżu bułek i palnika, należy odpipetować sześć mililitrów TSB do każdej probówki. Za pomocą jednej z wcześniej przygotowanych płytek agarowych z krwią owczą należy zaszczepić pojedynczą kolonię MRSA w jednej z probówek. Użyj drugiej probówki jako kontroli ujemnej, aby zapewnić sterylność, inkubuj probówki w inkubatorze wzajemnym przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.

Probówka MRSA powinna wykazywać wzrost lub nic nie powinno wyrosnąć w probówce kontrolnej. Następnie utwórz subkulturę, używając jednego mililitra z 24-godzinnej kultury do zaszczepienia sześciu mililitrów świeżego bulionu sojowego tryptycznego i inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez kolejne sześć godzin. Następnie odpipetować jeden mililitr kultury do probówki afus i odwirować w temperaturze 850 razy G przez trzy minuty.

Usuń supinat i użyj wody dejonizowanej, aby dwukrotnie umyć granulkę kleszczami w dominującej ręce. Trzymaj 20-milimetrowy dysk z próbką FM ze stali nierdzewnej i użyj pięciu mililitrów wody dejonizowanej do oczyszczenia z każdej strony. Umieść czyste krążki w zlewce z wodą dejonizowaną i poddaj sonizacji przez jedną minutę po sonikacji.

Za pomocą kleszczyków wyjmij krążki próbek ze zlewki i oprzyj je pod kątem około 60 stopni do krawędzi otwartej szalki Petriego na ręczniku papierowym Aby całkowicie wyschnąć, użyj pokrywki naczynia do przykrycia krążków do suszenia. Po wyschnięciu przenieś krążek na szalkę Petriego, aby funkcjonalizować powierzchnię dysku. Odpipetować od 200 do 400 mikrolitrów 0,1% poliolilizyny na krążki w komorze bezpieczeństwa biologicznego i inkubowanej temperaturze pokojowej przez jedną godzinę za pomocą kleszczy do przytrzymywania krążków.

Użyj wody dejonizowanej do ich umycia, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Następna płytka, od 200 do 400 mikrolitrów zawieszonych komórek, które zostały dwukrotnie przemyte na powlekane krążki próbki. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie użyj jednego mililitra wody dejonizowanej do umycia krążków.

Pozostaw dyski do wyschnięcia na noc przed obrazowaniem w celu przeprowadzenia obrazowania pod mikroskopem Kelvin Probe Force. Włącz komputer wraz z mikroskopem sił atomowych lub AFM, kontrolerem HEB i MAC three. Otwórz oprogramowanie do obrazowania A FM, takie jak Ulence P ovu overview.

Wybierz A-C-A-F-M lub prawidłowe oznaczenie do obrazowania w trybie przerywanego kontaktu. Używając kleszczyków FM w dominującej dłoni i trzymając w drugiej ręce otwarty sprężynowy uchwyt klipsa, ostrożnie umieść wspornik A-K-P-F-M w nakryciu głowy. Ostrożnie załaduj głowicę do A FM i podłącz światło laserowe i stage przewody silnika podnośnika.

Następnie ustaw laser na końcówce wspornika. Aby wyrównać laser na końcówce wspornika. Obróć kilka razy pokrętło od przodu do tyłu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć laser na wiór wspornika.

Gdy laser dotrze do chipa, zostanie zablokowany i nie będzie już widoczny. Następnie obracaj pokrętło od przodu do tyłu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż plamka lasera pojawi się ponownie. Laser znajduje się teraz na krawędzi chipa.

Obróć pokrętło od lewej do prawej, aby ustawić laser na wsporniku. Gdy laser przechodzi przez wspornik, znika i pojawia się ponownie w krótkich odstępach czasu. Plamka lasera powinna być widoczna w osłonie z matowego szkła, w której później znajdzie się zespół fotodiody.

Przekręć pokrętło od przodu do tyłu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby przesunąć miejsce w dół kantyla w kierunku końcówki, aż miejsce na matowym szkle zniknie. Teraz tylko nieznacznie przekręć pokrętło od przodu do tyłu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ustawić laser tak, aby znajdował się tuż na końcówce wspornika, plamka lasera pojawi się ponownie na matowym szkle. Po wyrównaniu lasera przytrzymaj silnik podnośnika stolika w pozycji otwartej przez 10 sekund, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń między wspornikiem a próbką.

Podłączając próbkę do A FM, teraz umieść próbkę na stoliku KPFM. Użyj drutu miedzianego do uziemienia próbki i podłącz odpowiednie przewody od A FM do sample stage. Następnie podłącz stage do A FM w oprogramowaniu A FM.

Upewnij się, że czas wiązania nie przekracza 10 milisekund i aby prędkości zbliżania nie przekraczały dwóch mikronów na sekundę. Aby uniknąć uszkodzenia końcówki, należy dostroić wspornik i rozpocząć przesuwanie końcówki wspornika w kierunku próbki. Gdy końcówka wspornika dotrze do powierzchni próbki, wybierz rozmiar okna obrazowania i idealny obszar obrazowania, zoptymalizuj wzmocnienie oka i P wraz z nastawą wspornika, aby zoptymalizować obrazowanie topograficzne.

Gdy obrazowanie topograficzne jest zoptymalizowane, włącz moduł KPFM w trybie FM. Ustaw okno obrazowania na pięć mikronów na pięć mikronów z rozdzielczością pięciu 12 na pięć 12 lub niska prędkość skanowania. W przypadku ustawień FM KPFM ustaw napęd w zakresie od pięciu do 10%Ustaw częstotliwość sterowania w zakresie od jednego do pięciu kiloherców z szerokością pasma dwóch kiloherców.

Ustaw zyski NP żelaza dla F-M-K-P-F-M na 0.3%Po uzyskaniu obrazów KPFM użyj oprogramowania do przetwarzania po obrazowaniu, aby przeanalizować obrazy i zebrać dane SP przy użyciu ustawień opisanych w tej demonstracji wideo. Zdjęcia KPFM wykonano na 15 komórkach MRSA, zarówno na powierzchniach ze stali nierdzewnej, jak i złota. Poniżej przedstawiono typy zbieranych obrazów.

Ponieważ KPFM działa w oparciu o dwie częstotliwości, obrazy topograficzne i dane elektryczne powierzchni komórki były zbierane jednocześnie. Filtry termiczne zostały zastosowane do map potencjału powierzchniowego, aby łatwiej dostrzec niewielkie zmiany potencjału powierzchniowego. Na tym wykresie obrazy zostały przeanalizowane w celu określenia potencjału powierzchni błony drobnoustrojów, a następnie wykorzystane do porównania wzrostu na różnych podłożach.

Skany potencjału powierzchniowego gołych podłoży ze stali nierdzewnej i gołego złota wykazały ogólne ujemne potencjały powierzchniowe. Zarówno pokryte poliolem lizyną, stal nierdzewna, jak i złote krążki wykazywały przesunięcie w kierunku dodatnich potencjałów powierzchniowych. Potencjały błony komórkowej MRSA różniły się między powierzchniami ze stali nierdzewnej i złota.

Ponieważ stal nierdzewna wykazuje znacznie większy dodatni potencjał powierzchni błony dla komórek w porównaniu z komórkami MRSA na złotym podłożu, które wykazywały ujemne potencjały powierzchniowe. Aby zademonstrować pełne możliwości KPFM, przykład wykresu wysokości stopnia MRSA na stali nierdzewnej znajduje się tutaj. Pokazuje to różnicę w potencjale powierzchniowym między powierzchnią podłoża a błoną mikrobiologiczną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikroskopii siły sondy Kelvina do badania wpływu ładunku elektrycznego na przyczepienie komórek drobnoustrojów i aktywność na różnych powierzchniach podłoża materiałowego.