Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja zmian ładunku błony komórkowej po przyleganiu do różnych podłoży materiałowych. Osiąga się to poprzez hodowlę mikroorganizmów w bogatym w składniki odżywcze medium w celu zwiększenia ich liczby. Następnie powierzchnie materiałów, do których przylegać będą mikroorganizmy, są oczyszczane i funkcjonalizowane w celu zapewnienia optymalnych wskaźników przywierania drobnoustrojów.

Następnie mikroorganizmy są wysiewane na różne podłoża materiałowe w celu przeprowadzenia obrazowania za pomocą siłowej mikroskopii sondy Kelvina (KPFM). Wyniki wykazują, że rodzaj podłoża materiałowego oraz jego ładunek własny wpływają na aktywność komórek, co objawia się zmianami ładunku błony komórkowej oraz adhezji komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroforeza, rozpraszanie światła i wyznaczanie punktu izoelektrycznego, jest fakt, że KPFM umożliwia badanie ładunku pojedynczych komórek i biofilmów zamiast całych kultur lub kolonii.

Jest to korzystne w przypadku chęci porównania charakterystyk elektrycznych poszczególnych komórek oraz biofilmu z wysoką dokładnością i precyzją. Aby rozpocząć, przygotuj płytki z 5% agaru z krwią owczą, wysej na przygotowanych płytkach bakterie MRSA i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, aby uzyskać pojedyncze, dobrze odizolowane kolonie. Przygotuj 500 mL bulionu sojowego triptic, uzupełnionego o 1% glukozy i 0,1% chlorku sodu, a następnie wysterylizuj w autoklawie wraz z dwiema czystymi szklanymi probówkami i jednym opakowaniem końcówek do pipety 1 mL.

Po wystudzeniu pożywki i probówek w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub w pobliżu palnika Bunsena, odpipetuj 6 mL TSB do każdej probówki. Korzystając z jednej z wcześniej przygotowanych płytek z agarem z krwią owczą, zaszczep pojedynczą kolonię MRSA do jednej z probówek. Drugą probówkę wykorzystaj jako kontrolę negatywną w celu zapewnienia sterylności. Inkubuj probówki w inkubatorze obrotowym przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przy 200 RPM.

W probówce z MRSA powinien być widoczny wzrost lub w probówce kontrolnej nie powinien nastąpić żaden wzrost. Następnie należy przygotować subkulturę, wykorzystując 1 mL 24-godzinnej hodowli do zaszczepienia 6 mL świeżego bulionu sojowego z tryptonem, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 RPM przez kolejne sześć godzin. Następnie należy pipetować 1 mL hodowli do probówki typu conical i wirować z prędkością 850 ×g przez trzy minuty.

Odlej nadsącz i używając pęsety w dominującej dłoni, dwukrotnie przemyj osad wodą dejonizowaną. Chwyć 20 milimetrową stalową próbkę dysku FM i użyj pięciu mililitrów wody dejonizowanej, aby oczyścić każdą stronę. Umieść czyste dyski w zlewce z wodą dejonizowaną i poddaj sonikacji przez jedną minutę.

Za pomocą pincety wyjmij krążki z próbką z zlewki i oprzyj je pod kątem około 60 stopni o krawędź otwartej szalki Petriego wyłożonej ręcznikiem papierowym. Aby całkowicie je osuszyć, przykryj schnące krążki pokrywką szalki. Po wyschnięciu przenieś krążek do szalki Petriego w celu funkcjonalizacji powierzchni krążka. W komorze z laminarnym przepływem powietrza nanieś pipetą od 200 do 400 µL 0,1% poli-L-lizyny na krążki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, podtrzymując krążki za pomocą pincety.

Użyj wody dejonizowanej, aby je wypłukać, zgodnie z wcześniejszą demonstracją w tym filmie. Następnie nanieś od 200 do 400 µL zawiesiny komórek, które zostały dwukrotnie wypłukane, na pokryte krążki do próbek. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut delikatnie wypłucz krążki, używając 1 mL wody dejonizowanej.

Pozostaw krążki do wyschnięcia na noc przed obrazowaniem, aby przeprowadzić pomiary za pomocą mikroskopii siłowej z sondą Kelvina. Włącz komputer wraz z mikroskopem sił atomowych (AFM), HEB oraz kontrolerem MAC three. Otwórz oprogramowanie do obrazowania AFM, takie jak Ulence P ovu overview.

Wybierz A-C-A-F-M lub odpowiednie oznaczenie dla obrazowania w trybie przerywanego kontaktu. Używając pincety FM w dominującej dłoni i trzymając otwarty sprężynowy uchwyt klipsa w drugiej dłoni, ostrożnie umieść wspornik A-K-P-F-M w głowicy. Ostrożnie zamontuj głowicę w A FM i podłącz przewody wiązki lasera oraz silnika podnośnika stolika.

Następnie skieruj wiązkę lasera na czubek dźwigni. Aby ustawić laser na czubku dźwigni, obróć pokrętło przód-tył kilkukrotnie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć laser nad chip z dźwignią.

Gdy laser dotrze do chipa, zostanie zablokowany i przestanie być widoczny. Następnie obracaj pokrętło przesunięcia przód-tył przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aż plamka lasera pojawi się ponownie. Laser znajduje się teraz na krawędzi chipa.

Obracaj pokrętłem lewo-prawo, aby ustawić laser na belce dwuwarstwowej. Gdy laser przechodzi nad belką, będzie on szybko znikać i pojawiać się. Plamka lasera powinna być widoczna na matowej szklanej osłonie, w miejscu, gdzie później zostanie umieszczona jednostka fotodiody.

Obracaj pokrętło przód-tył przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby przesunąć plamkę w dół wspornika w stronę końcówki, aż plamka na matowym szkle zniknie. Następnie obróć pokrętło przód-tył lekko zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ustawić laser tak, by znajdował się dokładnie na końcówce wspornika; plamka lasera ponownie pojawi się na matowym szkle. Po wyrównaniu lasera przytrzymaj silnik podnoszący stolik w pozycji otwartej przez 10 sekund, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń między wspornikiem a próbką.

Podczas mocowania próbki do A FM, umieść próbkę na stoliku KPFM. Użyj miedzianego drutu, aby uziemić próbkę, a następnie podłącz odpowiednie przewody z A FM do stolika z próbką. Następnie połącz stolik z A FM w oprogramowaniu A FM.

Należy upewnić się, że czas ustalania nie przekracza 10 ms, a prędkości zbliżania nie przekraczają 2 µm/s. Aby uniknąć uszkodzenia końcówki, należy nastroić dźwignię i rozpocząć przesuwanie jej końcówki w stronę próbki. Gdy końcówka dźwigni dotrze do powierzchni próbki, należy wybrać rozmiar okna obrazowania i optymalny obszar obrazowania, a następnie zoptymalizować wzmocnienia pętli i P oraz punkt nastawy dźwigni w celu optymalizacji obrazowania topograficznego.

Po zoptymalizowaniu obrazowania topograficznego należy włączyć moduł KPFM w trybie FM. Ustaw okno obrazowania na pięć mikronów na pięć mikronów z rozdzielczością 12 na 12 lub wolną prędkością skanowania. W ustawieniach FM KPFM ustaw wartość drive w zakresie od 5 do 10%. Częstotliwość drive ustaw w zakresie od 1 do 5 kHz z szerokością pasma 2 kHz.

Ustaw przyrosty nanocząsteczek żelaza dla F-M-K-P-F-M na 0.3%. Po pozyskaniu obrazów KPFM, użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu ich analizy i zebrania danych SP, korzystając z ustawień przedstawionych w tej demonstracji wideo. Obrazy KPFM wykonano dla 15 komórek MRSA zarówno na powierzchniach ze stali nierdzewnej, jak i ze złota. Przedstawiono tutaj rodzaje zgromadzonych obrazów.

Ponieważ metoda KPFM wykorzystuje podwójne częstotliwości, jednocześnie gromadzono obrazy topograficzne oraz dane elektryczne powierzchni komórki. Do map potencjału powierzchni zastosowano filtry termiczne, aby łatwiej dostrzec niewielkie zmiany potencjału powierzchni. Na tym wykresie przeanalizowano obrazy w celu określenia potencjału powierzchni błony mikrobiologicznej, a następnie wykorzystano je do porównania wzrostu na różnych podłożach.

Skanowanie potencjału powierzchni gołych podłoży ze stali nierdzewnej i złota wykazało ogólnie ujemne potencjały powierzchniowe. Krążki ze stali nierdzewnej i złota powlekane poliolizyną wykazały przesunięcie w stronę dodatnich potencjałów powierzchniowych. Potencjały błon komórkowych MRSA różniły się w zależności od powierzchni stali nierdzewnej i złota.

Stal nierdzewna wykazała znacznie wyższy dodatni potencjał powierzchniowy błony komórkowej w porównaniu do komórek MRSA na podłożu ze złota, które wykazywały ujemne potencjały powierzchniowe. Aby zaprezentować pełne możliwości KPFM, tutaj przedstawiono przykład wykresu wysokości stopnia dla MRSA na stali nierdzewnej. Ilustruje on różnicę w potencjale powierzchniowym między powierzchnią podłoża a błoną mikrobiologiczną.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania siłowej spektroskopii sondy Kelvina do badania wpływu ładunku elektrycznego na przyleganie i aktywność komórek drobnoustrojów na powierzchniach różnych podłoży materiałowych.