Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie neuronów dopaminowych z wycinków tkanek na szkiełkach. Osiąga się to poprzez pierwsze przecięcie zamrożonej brzusznej tkanki śródmózgowia na stylizowane szkiełka lub szkiełka błony pióra. Następnie neurony dopaminowe są znakowane szybką immunohistochemią fluorescencyjną.

Następnie tkanka jest odwadniana i ładowana do laserowego mikroskopu przechwytującego. Następnie znakowane neurony dopaminowe są przyłączane do czapeczki LCM za pomocą lasera na podczerwień i izoluje się RNA lub cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania. Wyniki pokazują, że RNA o wystarczającej ilości i jakości można uzyskać do ilościowych pomiarów PCR przy użyciu laserowej mikroskopii wychwytowej.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak gruba sekcja lub mikrostemple, jest to, że poszczególne populacje komórek mogą być izolowane lub bardzo dyskretne obszary mózgu. Aby przygotować się do zanurzenia w izolacji RNA, szkiełka do przygotowywania seline lub szkiełka z metanolanu etylenu lub szkła membranowego do wstrzykiwacza zanurzyć w roztworze odkażającym i użyć wody wolnej od RNA, aby przemyć je trzykrotnie za pomocą stopniowanej serii etanolu wolnego od RNA, odwodnić szkiełka i wysuszyć próżniowo przez 30 minut za pomocą kriostatu, wyciąć skrawki tkanki o grubości 10 mikronów i zamontować na przygotowanych RNA. Wolne szkiełka utrzymują próbki zamrożone podczas cięcia, aby zachować jakość RNA.

Następnie należy przeprowadzić immunohistochemię. Użyj pisaka hydrofobowego, aby obrysować tkankę i pozwól jej wyschnąć, a następnie w roztworze metanolu acetonowego jeden do jednego. Utrwal tkankę w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza przez 10 minut Po wyjęciu tkanki z zamrażarki przykryj skrawki 100 do 200 mikrolitrami przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozynowej NPBS i 1% trittonowi przez 10 minut.

Następnie użyj PBS z 1% tryttonem do przepłukania szkiełek przed pokryciem skrawków 100 do 200 mikrolitrami koziej anty króliczej IgG, oznaczonej Alexa Fluor 4 88, inkubuj przez pięć minut, a następnie użyj PBS do dwukrotnego przepłukania szkiełek. Następnie odwadniaj próbki zintegrowanymi seriami etanolu wolnego od RNA przez 30 sekund każda, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Inkubować w ksylenie przez minutę i sekundę, myć przez pięć minut.

Wyjmij szkiełka bezpośrednio przed użyciem LCM i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu. Po załadowaniu nasadek LCM i prowadnic oraz skonfigurowaniu systemu LCM zgodnie z protokołem tekstowym, wyreguluj i wyceluj przechwytywanie lasera IR pod kątem siły. Umieść nasadkę w obszarze szkiełka z dala od tkanki na pasku narzędzi lasera przechwytywania.

Wybierz włącz, dostosuj impuls mocy i liczbę uderzeń lasera. Uruchom laser na podczerwień, gdy nasadka znajdzie się nad częścią szkiełka bez tkanki i sprawdź, czy laser wystarczająco topi membranę nasadki LCM. Po dostosowaniu intensywności lasera IR, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz laser przechwytujący, aby skierować laser w celu wykonania LCM na poszczególnych neuronach dopaminowych poza szkiełkami przygotowawczymi.

Zacznij od przejścia do obszaru zainteresowania, aby przechwycić komórki, aby przechwycić poszczególne komórki po stronie przygotowania klinów. Na pasku narzędzi mikrodysekcji wybierz zakładkę LCM, a następnie ikonę pojedynczego punktu. Następnie na pasku narzędzi mikroskopu użyj zakładki migawki, aby przełączać się między zakładkami fluorescencji i jasnego pola z filtrami fluorescencyjnymi, aby wybrać odpowiednie filtry i użyj zakładek obiektywów, aby zmienić powiększenie.

Gdy interesujące komórki będą widoczne w oknie wideo na żywo, dostosuj rozmiar plamki używanej do oznaczania interesujących komórek do przybliżonego rozmiaru komórek. Zaznacz interesujące Cię komórki, wybierając ikonę pojedynczego punktu, a następnie klikając komórki. Po zaznaczeniu komórek na pasku narzędzi mikrodysekcji wybierz zakładkę go cut and capture, a laser IR automatycznie wystrzeli we wszystkie zaznaczone komórki.

Odsuń nasadkę od sekcji i na otwarty obszar szkiełka, aby sprawdzić, czy komórki są przechwycone na nasadce LCM. Po zakończeniu pobierania tkanki przesuń nasadkę, klikając nasadkę prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję przenieś do, a następnie rozładuj zgodnie z opisem w protokole tekstowym, użyj szkiełka przetworzonego do celów immunohistochemicznych jako przewodnika, aby wybrać obszar zainteresowania z tkanki na błonie pióra. Na pasku narzędzi mikroanalizy wybierz zakładkę "wytnij i uchwyć", a następnie wybierz zakładkę "linia cięcia" i korzystając ze slajdu oznaczonego jako przewodnika z etykietą immunohistochemiczną, nakreśl obszar zainteresowania pod obiektywem 10 x.

Przetestuj, odpal i wyceluj lasery IR i UV, jak pokazano wcześniej. W tym filmie na pasku narzędzi mikrodysekcji wybierz kartę przechwytywania i wycinania go. Następnie odsuń nasadkę LCM od tkanki, aby określić, czy tkanka została usunięta z sekcji i przymocuj do nasadki.

Po zakończeniu zbierania tkanki w celu usunięcia nasadki, kliknij prawym przyciskiem myszy nasadkę i wybierz przenieś, aby następnie rozładować mikrofotografie na tych rysunkach pokazują, że LCM jest w stanie wyizolować poszczególne immunoreaktywne neurony dopaminowe hydroksylazy tyrozyny za pomocą lasera IR lub laserów IR i UV, ponieważ najczęstszym zastosowaniem komórek w tkankach izolowanych za pomocą LCM jest analiza RNA. Przedstawione procedury zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania integralności RNA, co widać po względnym zmniejszeniu wysokości piku RRNA 28 S w porównaniu z pikiem 18 S, jakość RNA uległa obniżeniu w próbkach LCM o niższej integralności po immunohistochemii, a następnie utrwaleniu acetonu w porównaniu z RNA całego mózgu. Aby zmierzyć ilość RNA uzyskanego z neuronów uzyskanych za pośrednictwem L-C-M-R-N-A z neuronów dopaminowych z brzusznego obszaru turkusowego z preparatu soli fizjologicznej, izolowano szkiełka na podstawie wygenerowanej krzywej standardowej, w sumie 17,3, 24,8 i 50,9 pikogramów na mikrolitr wyizolowano odpowiednio z 5, 100 i 200 neuronów dopaminowych.

E za pomocą QPCR do pomiaru jakości RNA, zakres stężeń RNA całego mózgu i RNA z neuronów dopaminowych został odwrócony, transkrybowany i na podstawie tych pomiarów zmierzono stężenie trzech punktów 55, 6, 0,82 i 20 punktów 58 pikogramów na mikrolitr obliczono odpowiednio z 5, 100 i 200 neuronów dopaminowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikroskopu laserowego do izolowania pojedynczych neuronów dopaminowych lub izolowania regionów neuronów dopaminowych.