Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna
5 marca 2015
Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak pobierać próbki z drewnianych próbek w celu ogólnej oceny ich struktur wzrostu. Opisano makro- i mikroskopowe techniki preparacji i wizualizacji niezbędne do wygenerowania dobrze odwzorowanych i wysoce rozdzielczych zbiorów danych anatomicznych i dendroekologicznych drewna.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie dobrze odwzorowanego drewna o wysokiej rozdzielczości. Zestawy danych anatomicznych do badania wpływu czasu i czynników środowiskowych na wzrost drzew i krzewów. Osiąga się to dzięki zastosowaniu płynu nienewtonowskiego do stabilizacji komórek roślinnych podczas cięcia mikrotomowego, co pozwala na szczegółową analizę mikroskopową próbek w drugim etapie.
Mikroskrawki są podwójnie barwione, aby ułatwić różnicowanie zdrewniałych i niezdrewniałych komórek, a następnie wykonywane są cyfrowe obrazy próbek. Ostatecznie można przeprowadzić zautomatyzowane analizy wzrostu roślin oparte na komórkach i powiązane analizy szeregów czasowych, aby umożliwić ocenę parametrów anatomicznych drewna będących przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wysyłanie wyniku próbki, jest to, że dzięki naszym technikom komórki nie są wypełnione trocinami, co skutkuje bardzo wyraźnymi próbkami wysokiej jakości do analizy obrazu.
Co więcej, dodanie płynu innego niż newtonon do komórek podczas cięcia pozwala uniknąć czasochłonnej techniki zatapiania próbki w parafinie. Nowe mikrotomy, które zobaczymy na filmie, zostały opracowane w naszym laboratorium, w którym zainstalowano centralne Lu Netti z Shang Dubs i Zurychu. Wyróżniają się wysoką stabilnością prowadzenia, co pozwala na cięcie dużych i gęstych próbek.
Do pobierania próbek rdzeniowych pni drzew. Zacznij od umieszczenia zaostrzonego rdzenia przyrostowego prostopadle do osi wzrostu pnia drzewa. Następnie obróć rdzeń i użyj ekstraktora, aby usunąć powstałą próbkę rdzenia z drzewa.
Oznacz rdzeń specjalnym identyfikatorem oznaczonym miękkim ołówkiem na powierzchni rdzenia i powtórz procedurę po przeciwnej stronie trzpienia, gdy wszystkie próbki zostaną zebrane. Oznaczone tuleje przechowuj w odpowiednim pojemniku, aby zabezpieczyć je przed uszkodzeniem podczas transportu. Następnie, po powrocie do laboratorium, zamontuj próbki rdzenia w kierunku włókien, pionowo na drewnianych belkach nośnych za pomocą wodoodpornego kleju do drewna i pozwól im wyschnąć w celu pobrania próbek mikrordzenia.
Najpierw użyj dłuta, aby w razie potrzeby usunąć część kory. Następnie umieść specjalne urządzenie do wykrawania prostopadle do osi wzrostu na łodydze, którą właśnie zademonstrowano, i użyj młotka, aby przebić ksylem łodygi na głębokość około dwóch centymetrów. Obróć urządzenie wykrawające, aby złamać powstały mikrordzeń wewnątrz narzędzia.
Następnie usuń rdzeń z łodygi i przechowuj go w oznakowanej mikroprobówce wirówkowej. Aby wyciąć płaską powierzchnię na próbce rdzenia, należy rozpocząć od zamocowania interesującego nas rdzenia przyrostowego w uchwycie rdzenia nowo opracowanego mikrotomu rdzeniowego do cięcia płaskich powierzchni rdzeni na całej ich długości. Następnie podnieś rdzeń, aż lekko dotknie ostrza, które jest zamocowane na łożysku kulkowym prowadzącym nad długością rdzenia, i pociągnij ostrze, aby przeciąć pierwszą część górnej części rdzenia.
Następnie wepchnij nóż za rdzeń. Podnieś uchwyt próbki na około 10 mikronów i powtórz procedurę cięcia do około jednej trzeciej rdzenia. Średnica jest zmniejszana, w wyniku czego uzyskuje się ciągłą płaską powierzchnię.
W celu szczegółowej analizy obrazu struktury anatomicznej próbek, mikroskrawki muszą być przygotowane z innym typem mikrotomu. Najpierw umocuj badaną próbkę rdzeniową w uchwycie mikrotomu mikrotomu. Następnie ustaw ostrze mikrotomu prowadzone przez prowadnicę łożyska kulkowego i przeciągnij ostrze po rdzeniu.
Popchnij ostrze do tyłu, aby podnieść próbkę o 20 do 30 mikronów. Następnie przeciągnij ostrze po próbce. Ponownie, powtarzając ten proces, aż na wierzchu próbki zostanie utworzona ciągła powierzchnia.
Teraz za pomocą pędzla przykryj powstałą powierzchnię roztworem skrobi kukurydzianej. Następnie podnieś próbkę o 15 mikronów i umieść szczoteczkę na powierzchni próbki. Powoli pociągnij ostrza w kierunku próbki, rozpoczynając cienkie cięcie poniżej szczotki i używając szczotki do prowadzenia sekcji na powierzchni ostrza, gdy cała sekcja została przecięta.
Użyj innej szczotki i wody, aby usunąć tkankę z ostrza i umieść ją na szklanym szkiełku, aby umożliwić rozróżnienie między zdrewniałymi i niezdrewniałymi strukturami. Zmyj glicerol wodą za pomocą pipety. Następnie przykryj mokrą część kilkoma kroplami mieszanki szafranu i astro blue.
Po pięciu minutach zmyj barwniki wodą, a następnie natychmiast odwodnij sekcję za pomocą kolejnych zabiegów z etanolem. Po zabiegu odwodnionym etanolem kilkakrotnie przepłukać sekcję w 100% xol. Jak tylko xol pozostanie czysty.
Przykryj chusteczkę kroplą balsamu 100%Canada i szklanką nakrywkową, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Następnie umieść powstałą mikroprowadnicę między dwoma paskami żaroodpornego tworzywa sztucznego i umieść ją na metalowej płycie. Umieść obciążnik na szkiełku, aby sekcja była płaska, a następnie umieść szkiełko w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Po 12 godzinach pozwól szkiełku ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie usuń ciężarek i plastikowy pasek. Na koniec wyczyść szkiełko za pomocą żyletek, aby usunąć nadmiar balsamu, postępując zgodnie z procedurami cięcia i barwienia przedstawionymi przed przygotowaniem wszelkiego rodzaju próbek o różnych rozmiarach i kształtach, a także za pomocą specjalnych uchwytów do tworzenia cyfrowych obrazów powierzchni rdzenia do analizy naczyń. Najpierw przetnij płaszczyznę powierzchni rdzenia za pomocą mikrotomu rdzeniowego, jak pokazano, i użyj filcowego markera, aby zabarwić powstałą powierzchnię na czarno.
Jak tylko barwnik wyschnie, przetrzyj powierzchnię rdzenia białą kredą, a następnie wciśnij kredę w komórki palcem. Usuń nadmiar kredy, a następnie umieść rdzeń na stoliku mikroskopu dwuokularowego wyposażonego w kamerę cyfrową, zaczynając po jednej stronie rdzenia. Teraz uzyskaj sekwencję lekko nakładających się obrazów, aż cała powierzchnia zostanie uchwycona.
Następnie zszyj pojedyncze obrazy razem, aby stworzyć pełny obraz powierzchni rdzenia, aby utworzyć obrazy cyfrowe z mikroszkiełek. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz odpowiednie powiększenie dla analizowanych struktur. Na koniec uzyskaj nakładające się obrazy sekcji zamontowanych na oczyszczonych mikroszkiełkach, jak właśnie pokazano dla próbki powierzchni rdzenia, i zszyj obrazy razem, aby utworzyć jeden kompletny obraz przekroju.
Zdolność do posiadania otwartych komórek jest pierwszym ważnym krokiem w kierunku adaptacji anatomicznych struktur ekologicznych dendro do analizy szeregów czasowych. Do bardziej szczegółowej analizy wczesnego drewna lub późnych trach drewna w drzewach iglastych potrzebne są wysokiej jakości mikroprzekroje. Należy unikać potencjalnych artefaktów, takich jak uszkodzone ściany komórkowe.
Zastosowanie płynu nienewtonowskiego do próbki, takiego jak roztwór skrobi kukurydzianej, jak właśnie wykazano, wspiera stabilność struktury komórkowej. Mikrosekcje umożliwiają pewniejsze wyznaczanie rang rocznych. Jest to szczególnie ważne w przypadku drzew iglastych rosnących na swoich naturalnych granicach.
Jak widać tutaj, ekstremalnie wąskie pierścienie są częste, ale trudne do wykrycia makroskopowo. W skrajnych przypadkach pierścienie składają się z jednego lub dwóch rzędów komórek, które mogą być widoczne tylko przy użyciu mikrosekcji. Podczas analizowania obrazów przy dużych powiększeniach widoczne są pojedyncze komórki.
Oprogramowanie do analizy półautomatycznej umożliwia określenie zmian pojedynczych parametrów, takich jak grubość ścianki komórkowej, dla wszystkich pierścieni widocznych na obrazie, co wskazuje na potrzebę rozszerzonej analizy szeregów czasowych. Podwójne barwienie mikroskrawków pozwala na wizualizację różnych etapów zdrewnienia. Informacje te można następnie odnieść do danych środowiskowych dotyczących danego okresu wegetacji, aby określić bardziej szczegółową zależność wzrostu klimatu po jego rozwoju.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się ekologią DRO do zbadania różnych parametrów anatomicznych drzew i krzewów. Zastosowanie tej metody drastycznie skraca czas potrzebny na wyprodukowanie dużych, wysokiej jakości przekrojów. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem i noszenie rękawiczek.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować dobrze zreplikowane i wysoce rozdzielcze, aby umieścić zestawy danych anatomicznych w celu obsługi analizy szeregów czasowych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pobierania próbek drewna w celu oceny ich struktur wzrostu. Szczegółowo opisano techniki preparacji makro- i mikroskopowej niezbędne do generowania wysokorozdzielczych zbiorów danych anatomicznych drewna.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Dendroekologia
- Anatomia drewna
- Analiza wzrostu roślin
Wstęp
- Badanie koncentruje się na wpływie czasu i czynników środowiskowych na wzrost drzew i krzewów.
- Płyn nienewtonowski jest wykorzystywany do stabilizacji komórek roślinnych podczas cięcia mikrotomem.
- Techniki podwójnego barwienia są stosowane w celu odróżnienia komórek zdrewniałych od niezdrewniałych.
- Zautomatyzowane analizy komórkowe są przeprowadzane w celu oceny parametrów anatomicznych drewna.
Cel badania
- W celu uzyskania dobrze powtarzalnych i wysokorozdzielczych zbiorów danych z anatomii drewna.
- W celu ułatwienia szczegółowej analizy mikroskopowej próbek drewna.
- W celu poprawy jakości próbek do analizy obrazu w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek rdzeniowych z pni drzew przy użyciu zaostrzonego świdra przeciwpróbkującego.
- Przygotowywanie skrawków z próbek rdzeniowych za pomocą mikrotomu do szczegółowych badań anatomicznych.
- Techniki barwienia i obrazowania w celu wizualizacji struktur drewna.
- Cyfrowa akwizycja i analiza obrazów do badania naczyń.
Główne wyniki
- Uzyskano wysokiej jakości próbki bez zanieczyszczeń trocinami.
- Nowe konstrukcje mikrotomów umożliwiły stabilne cięcie dużych preparatów.
- Skuteczne rozróżnienie typów komórek dzięki technikom barwienia.
- Zautomatyzowane analizy dostarczyły informacji na temat parametrów anatomicznych drewna.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa jakość i rozdzielczość badań anatomicznych drewna.
- Wykorzystanie płynów nienewtonowskich upraszcza proces przygotowania próbek.
- Opracowane metody mogą być stosowane do różnych próbek drewna w celach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczą analizę anatomiczną drewna na potrzeby badań nad odpowiedzią na stres środowiskowy, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów podczas odkrywania bioaktywnych związków pochodzenia roślinnego. Dzięki generowaniu dobrze powtórzonych zbiorów danych gotowych do analizy szeregów czasowych, zwiększa on pewność predykcyjną w wiązaniu interwencji genetycznych lub farmakologicznych z efektami fenotypowymi w modelach roślin drzewiastych. Podejście to wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po ocenę przedkliniczną, dostarczając mierzalnych, rozdzielonych anatomicznie biomarkerów wzrostu i adaptacji do stresu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez szczegółowe fenotypowanie anatomiczne modeli roślin zdrewniałych pod wpływem kontrolowanych stresorów środowiskowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez dostarczanie wysokiej jakości, powtarzalnych danych strukturalnych na temat lignifikacji i modyfikacji ścian komórkowych jako funkcjonalnych odczytów bioaktywności.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez korelację zmian mikroanatomicznych z efektami zależności dawka-odpowiedź lub perturbacjami genetycznymi, co zwiększa pewność co do celu terapeutycznego na wczesnym etapie odkrywania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki z barwionych mikroprzekrojów, co umożliwia wiarygodny screening związków wpływających na procesy tworzenia drewna lub szlaki odporności na stres.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność analizy poprzez stabilizowane krojenie z wykorzystaniem płynów nienewtonowskich, co minimalizuje występowanie artefaktów i zwiększa dokładność analizy obrazu w zastosowaniach wysokoprzepustowych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Generuje cyfrowo archiwizowalne obrazy rdzeni i przekrojów, które nadają się do monitorowania podłużnego oraz porównań międzybadawczych w procesach odkrywczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy procesy odkrywcze z protokołami przedklinicznymi, dostarczając istotnych dla przebiegu choroby, anatomicznie rozdzielczych biomarkerów, które odzwierciedlają skumulowane efekty ekspozycji na czynniki środowiskowe lub związki chemiczne.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez umożliwienie analizy szeregów czasowych parametrów anatomicznych, co zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach badań wynikających z nieprzewidzianej zmienności biologicznej w systemach roślinnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia relacje struktura-funkcja w szlakach wzrostu wtórnego, pomagając w walidacji celów modulujących biosyntezę ligniny lub aktywność kambium.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków — od wczesnej walidacji celu po optymalizację związku wiodącego — dostarczając anatomicznie rozdzielonych danych fenotypowych, które wspierają zrozumienie mechanizmów oraz modelowanie predykcyjne w systemach roślinnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie precyzyjnej kwantyfikacji grubości ścian komórkowych, wzorców lignifikacji oraz architektury naczyniowej jako biomarkerów funkcjonalnych.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych mikroprzekrojów gotowych do analizy o podwyższonej jakości obrazu, co ułatwia wiarygodną ocenę związków w testach formowania drewna lub odpowiedzi na stres.
- Analityka: Generuje dane szeregów czasowych z półautomatycznej analizy obrazu, umożliwiając porównanie parametrów anatomicznych w różnych warunkach i punktach czasowych w celu oceny dynamicznych odpowiedzi biologicznych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczenie mierzalnych, anatomicznie rozdzielczych punktów końcowych, które odzwierciedlają trwałą aktywność biologiczną lub toksyczność w modelach roślin zdrewniałych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy do badań podłużnych, zapewniając spójność danych między projektami i ograniczając redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki wysokorozdzielczemu fenotypowaniu anatomicznemu.
- Wartość operacyjna: Zwiększa standaryzację i skalowalność dzięki stabilizacji procesów sekcjonowania oraz cyfrowego obrazowania, co poprawia odtwarzalność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w odniesieniu do celów w systemach roślinnych, zmniejszając zależność od modeli o niższej wartości predykcyjnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie danych opartych na anatomii, które informują decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o biomarkery strukturalne i funkcjonalne.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu anatomii drewna, technik cięcia mikrotomem oraz barwienia histologicznego w celu zapewnienia dokładnego przygotowania i interpretacji próbek.
- Metoda zależy od dostępu do specjalistycznych mikrotomów z prowadnicami kulkowymi oraz możliwości obsługi cieczy nienewtonowskich, co zapewnia stabilne cięcie gęstych preparatów.
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych protokołów barwienia i obrazowania w obrębie zespołów badawczych, aby zapewnić porównywalność zestawów obrazów cyfrowych w analizach szeregów czasowych.
- Wymagane jest uwzględnienie adaptacji protokołu przy zastosowaniu go do różnych gatunków drzewiastych o zróżnicowanej gęstości, zawartości żywicy lub złożoności anatomicznej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują dostępność próbek, sezonową zmienność tempa wzrostu oraz konieczność zapewnienia kontrolowanych warunków środowiskowych w celu wyizolowania wpływu konkretnych czynników.
