Name: Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj zaawansowane metody przygotowania próbek drewna do analizy anatomicznej w dendroekologii. Protokół obejmuje sekcjonowanie mikrotomem, podwójne barwienie komórek i automatyczną analizę obrazów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Sandro Lucchinettiemu (Schenkung Dapples, Zürich) za skonstruowanie urządzeń niezbędnych do zagwarantowania postępu w przygotowaniu próbek.

1. Techniki pobierania próbek
<ol>
	<li>Próbkowanie rdzenia
	<ol>
		<li>Aby pobrać próbki pni drzewa, należy wydobyć co najmniej dwa rdzenie za pomocą rdzenia przyrostowego z każdej łodygi, aby przeanalizować jej rozwój wzrostu. Zmieniaj położenie pobierania próbek w zadaniu badawczym, np. w przypadku typowych rekonstrukcji klimatycznych należy ułożyć rdzenie równolegle do zbocza. Podczas pracy z gatunkami tropikalnymi weź co najmniej trzy lub więcej rdzeni.</li>
		<li>Użyj zaostrzonego rdzenia przyrostowego (o średnicy 5, 10 lub 12 mm) i umieść rdzeń prostopadle do rosnącej osi łodygi. 
		UWAGA: Aby mieć kontrolowaną i stabilną pozycję rdzenia, użyj popychacza, aby uniknąć ruchów rdzenia innych niż jego obrót podczas wiercenia go w drzewie. Wwiercić się w łodygę aż do rdzenia i przez niego. Do rdzeniowania bardzo gęstego drewna (tj. gatunków tropikalnych) należy używać specjalnych, przekonfigurowanych korpusów pił łańcuchowych z adapterem rdzeni przyrostowych, które pozwalają na rdzeniowanie nawet gęstego drewna jako Diospyrus ebenum (Heban).</li>
		<li>Użyj ekstraktora i usuń powstały rdzeń z drzewa. Wykręć rdzeń i usuń go z łodygi.</li>
		<li>Dodaj określony identyfikator do wyodrębnionego rdzenia za pomocą miękkiego ołówka, pisząc na taśmie, która jest następnie umieszczana bezpośrednio na rdzeniu. Powtórz procedurę po przeciwnej stronie łodygi.</li>
		<li>Przechowuj dwie próbki drzewa w plastikowych lub papierowych tubach lub specjalnych pudełkach, aby zapobiec uszkodzeniom. 
		UWAGA: Słomki papierowe są korzystne szczególnie w środowiskach tropikalnych, ponieważ zapobiegają pleśnieniu rdzeni.</li>
		<li>Na koniec zamontuj rdzenie (w kierunku włókien pionowo) na drewnianych belkach nośnych. Użyj kleju do drewna odpornego na zimną wodę i pozwól im wyschnąć. 
		UWAGA: Nigdy nie montuj rdzeni na drewnianych wspornikach, jeśli celem badania jest dalsza analiza chemiczna, izotopowa lub gęstości. W tym celu należy zamocować rdzenie w otwartych kanałach kablowych lub jednolicowej tekturze falistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbkowanie mikrordzeniowe
	<ol>
		<li>Użyj specjalnego urządzenia do wykrawania lub igły z otworem 2 mm. W zależności od grubości kory użyj dłuta, aby usunąć niezbędną część kory.</li>
		<li>Umieść urządzenie prostopadle do osi wzrostu na łodydze, jak opisano powyżej, i za pomocą młotka wbij się w ksylem łodygi na głębokość około 2 cm.</li>
		<li>Obróć igłę, aby złamać powstały mikrordzeń wewnątrz narzędzia i usuń go z trzpienia. Przechowuj mikrordzenie w fiolkach do mikrowirówek i oznacz je.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek z płyty
	<ol>
		<li>W szczególnych przypadkach (a zwłaszcza w tropikach), np. podczas pobierania próbek z pni i powalonych drzew lub w miarę możliwości, należy pobrać tarcze (przekroje prostopadłe do osi wzrostu) za pomocą piły łańcuchowej. Po prostu oznacz płyty i przechowuj je do dalszej analizy. 
		UWAGA: Ta procedura pobierania próbek jest najczęściej stosowana w przypadku wszystkich suchych martwych, historycznych, archeologicznych i subfopalnych materiałów, a także bardzo gęstego drewna liściastego, które nie pozwala na użycie rdzeni przyrostowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Tarcze szlifierskie
	<ol>
		<li>Umieść tarcze na szlifierce i przeszlifuj powierzchnię za pomocą sekwencji coraz drobniejszych materiałów ściernych, zaczynając od papieru ściernego o ziarnistości 80, a następnie o ziarnistości 120, 220, 300. Końcowe polerowanie papierem o ziarnistości 400 jest wystarczające dla większości drzew iglastych. W przypadku drewna liściastego, a zwłaszcza gatunków tropikalnych, należy użyć grysu ściernego o grubości do 1 200 mm, aby odróżnić granice słojów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcie płaskich powierzchni na rdzeniach
	<ol>
		<li>Zamocuj rdzenie inkrementacyjne w uchwycie rdzenia nowo opracowanego mikrotomu rdzeniowego, umożliwiając cięcie płaskich powierzchni rdzeni na całej ich długości. 
		UWAGA: Skoryguj orientację rdzenia w uchwycie, aby kierunek włókien próbki był pionowy, czyli pod kątem prostym do noża mikrotomu.</li>
		<li>Podnieś rdzeń, aż lekko dotknie ostrza. Pociągnij ostrze, które jest zamocowane na prowadnicy na łożysku kulkowym, po długości rdzenia, aby odciąć pierwszą część góry.</li>
		<li>Wepchnąć nóż za gilzę, podnieść uchwyt próbki z rdzeniem o około 10 μm i powtórzyć procedurę cięcia. Rób to, aż około jedna trzecia średnicy rdzenia zostanie odcięta, co spowoduje powstanie ciągłej płaskiej powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mikro przekrojów poprzez dodanie roztworu skrobi kukurydzianej.
	<ol>
		<li>W celu szczegółowej analizy obrazu struktury anatomicznej należy utrwalić rdzenie lub inne próbki oddzielone od krążków w uchwycie mikrotomu. Umieść ostrze mikrotomu, prowadzone przez łożysko kulkowe nowo opracowanego mikrotomu saneczkowego, na górnej krawędzi próbki i pociągnij nad nim.</li>
		<li>Popchnij ostrze, aby podnieść próbkę o około 20 do 30 μm i ponownie przeciągnij ostrze nad próbką. Powtarzaj tę procedurę, aż zostanie utworzona ciągła powierzchnia na wierzchu próbki.</li>
		<li>Przykryj powstałą powierzchnię roztworem skrobi kukurydzianej (10 g skrobi kukurydzianej, 8 ml wody i 7 g 100% glicerolu) za pomocą zwykłej szczotki. 
		UWAGA: Ziarna skrobi wypełniają otwarte komórki próbki, aby ustabilizować strukturę przed późniejszym cięciem cienkich odcinków.</li>
		<li>Podnieś próbkę o 15 μm, umieść szczotkę na powierzchni próbki i powoli pociągnij ostrze w kierunku próbki, zaczynając odcinać cienki odcinek (poniżej szczotki). Podczas cięcia powstała sekcja ślizga się po ostrzu prowadzonym przez szczotkę.</li>
		<li>Po przecięciu całej sekcji usuń mikrosekcję z ostrza za pomocą szczotki i wody (w celu zmniejszenia tarcia) i umieść sekcję na szklanym szkiełku w celu dalszego przygotowania. Aby zapobiec ich wysuszeniu, przykryj je niewielką ilością glicerolu (33% = jedna część 100% glicerolu i dwie części wody).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikropreparatów
<ol>
	<li>W celu późniejszego przygotowania preparatów stałych należy najpierw zmyć glicerol z mikrosekcji za pomocą pipety i wody.</li>
	<li>Przykryj mokry odcinek kilkoma kroplami Safraniny (1 g proszku Safraniny + 100 ml wody) i Astrablue (0,5 g niebieskiego proszku Astra + 2 ml 100% kwasu octowego + 100 ml wody), aby odróżnić struktury zdrewniałe od niezdrewniałych, ale także zwiększyć kontrast do późniejszej analizy obrazu.</li>
	<li>Pozostaw sekcję na 5 minut przykrytą barwnikiem, a następnie ponownie zmyj ją pipetą i wodą.</li>
	<li>Jak tylko nadmiar barwnika zostanie usunięty, odwodnić sekcję pipetami, myjąc je sekwencją 75% rozcieńczonego, 96% i na koniec 100% etanolu.</li>
	<li>Zamiast umieszczać próbki w kąpieli w kąpieli, należy używać pipet do płukania próbek na szkiełku podstawowym, aby skrócić czas przetwarzania do około dwóch do 3 minut w całym procesie odwadniania. 
	UWAGA: Odwodnienie etanolem zapobiega pękaniu delikatnych próbek.</li>
	<li>Następnie spłucz skrawek 100% ksylolem. 
	UWAGA: Ksylen jest rakotwórczy i podczas jego stosowania w laboratorium obowiązkowa jest wentylacja. Istnieją inne produkty zastępujące ksylol, ale jeśli istnieje zamiar przechowywania próbek przez dłuższe okresy czasu (lata, dekady) w celu potencjalnej ponownej analizy, balsam kanadyjski (krok 3.5.2) jest jedynym podłożem do zatapiania, które pozostaje przezroczyste bez zmiany koloru w czasie. Niestety balsam kanadyjski musi być stosowany w połączeniu z ksylolem.</li>
	<li>Dopóki ksylol zmieni kolor na mleczny (białawy), powtórz proces odwadniania, ponieważ nie jest wystarczająco odwodniony.</li>
	<li>Gdy tylko ksylol pozostanie czysty, przykryj sekcję kroplą 100% balsamu kanadyjskiego i przykryj ją szkłem nakrywkowym o rozmiarze co najmniej równym rozmiarowi sekcji. 
	UWAGA: Należy pamiętać o usuwaniu pęcherzyków powietrza poprzez delikatne dociśnięcie szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść powstałą mikroszkiełko między dwoma paskami żaroodpornych tworzyw sztucznych i umieść je na metalowej płycie. Umieść ciężarek (np. magnes) na górze szkiełka, aby go docisnąć, aby sekcja była płaska podczas następnego procesu suszenia.</li>
	<li>Umieść szkiełka w piekarniku nagrzanym do 60 °C na około 12 godzin. Po 12 godzinach wyjmij szkiełka z piekarnika i umieść je na półce, aby ostygły do temperatury RT (około 20 °C). Po ostygnięciu usuń ciężarek i plastikowy pasek i wyczyść szkiełko za pomocą żyletek, aby usunąć nadmiar balsamu kanadyjskiego.</li>
</ol>
4. Wizualizacja zawartości komórek
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór Nawashin25.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór (A) z 5 g kwasu chromowego, 50 ml 96% kwasu octowego i 320 ml wody dejonizowanej. Przygotować inny roztwór (B) z 200 ml formaliny ze 175 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Wymieszaj roztwór A i roztwór B w stosunku 1:1, aby uzyskać roztwór Nawashin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uwidocznić zawartość komórki, utrwal próbkę roztworem Nawashin przez 10 minut, aby zatrzymać wszystkie procesy degradacji w komórce. 
	UWAGA: Utrwalenie zachowuje jądra komórkowe, pozwalając na oszacowanie długowieczności komórki (długowieczność komórki = jądra obecne / jądra nieobecne; obecność lub brak jądra wskazuje, czy komórka jest żywa, czy martwa).</li>
	<li>Po utrwaleniu należy przemyć skrawki wodą, aby całkowicie usunąć roztwór Nawashin, a następnie zabarwić je błękitem Safranin-Astra, a przed dodatkowym zabarwieniem błękitem pikrynowo-anilinowym (1 część nasyconego rozpuszczalnego w wodzie błękitu anilinowego + 4 części 10% kwasu pikrynowego).</li>
	<li>Ostrożnie podgrzać próbkę do temperatury około 80 °C (w każdym przypadku poniżej temperatury wrzenia), aby przyspieszyć proces barwienia. W przypadku dehydratacji i zatapiania próbek należy postępować zgodnie z krokami protokołu 3.4 do 3.8.</li>
</ol>
5. Przygotowanie cyfrowych obrazów cech anatomicznych
<ol>
	<li>Twórz cyfrowe obrazy powierzchni rdzeni do analizy zbiorników.
	<ol>
		<li>Wytnij płaszczyznę powierzchni rdzenia za pomocą mikrotomu rdzeniowego i zabarwij powstałą powierzchnię na czarno za pomocą markera filcowego.</li>
		<li>Jak tylko barwnik wyschnie, przetrzyj powierzchnię rdzenia białą kredą. Dociśnij kredę w komórkach, po prostu pocierając kredę po powierzchni palcem. W ten sposób usuń również nadmiar kredy. 
		UWAGA: W rezultacie ściany komórkowe są czarne, a części świetlne naczyń są białe. Ten kontrast jest warunkiem wstępnym automatycznej analizy obrazu.</li>
		<li>Przygotowany rdzeń należy umieścić pod mikroskopem dwuokularowym wyposażonym w kamerę cyfrową. Wykonaj sekwencję lekko nakładających się na siebie (ok. 10%) obrazów, zaczynając od jednej strony rdzenia, aż do uchwycenia całej powierzchni. Złącz pojedyncze obrazy, aby utworzyć pełny obraz powierzchni rdzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie obrazów cyfrowych z mikroslajdów
	<ol>
		<li>Umieść oczyszczone mikropreparaty pod mikroskopem i wykonuj nakładające się obrazy z całego przekroju.</li>
		<li>Zdefiniuj konkretne powiększenie w zależności od struktur, które mają być analizowane, w zakresie od 40X do 1,000X.</li>
		<li>Złącz pojedyncze obrazy, aby utworzyć jeden kompletny obraz sekcji. Aby uniknąć ewentualnych zniekształceń podczas procesu szycia, należy używać soczewek obiektywowych typu "plan" z mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja cech anatomicznych
<ol>
	<li>Aby wykryć komórki i granice pierścieni za pomocą narzędzia do analizy obrazu ROXAS18 lub podobnego oprogramowania, należy załadować pełny obraz mikroprzekroju i związaną z nim kalibrację przestrzenną, aby uzyskać wyniki ilościowe w jednostkach metrycznych. Obliczyć kalibrację przestrzenną, mierząc liczbę pikseli między skalami obrazów ze stolika mikrometrycznego wykonanych w tym samym powiększeniu i dzieląc uzyskaną wartość przez odstępy między podziałkami w jednostkach metrycznych (np. 1 000 μm).</li>
	<li>Z podanej listy (dołączonej do oprogramowania) należy wybrać odpowiednią konfigurację przed rozpoczęciem automatycznej części analizy. 
	UWAGA: Konfiguracja to wcześniej zoptymalizowany zestaw ustawień programu, który na przykład uwzględnia kolor barwienia próbki oraz zakres rozmiaru i kształtu komórek, które mają być wykryte. Dostosowane konfiguracje pozwalają zatem na uzyskanie optymalnych wyników rozpoznawania dla różnych gatunków i jakości obrazu.
	<ol>
		<li>Wybierz dalsze opcje, takie jak użycie obszarów na obrazie, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone, aby uniknąć np. pustych marginesów obrazu lub pęknięć w próbce, jeśli jest to wymagane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij analizę, naciskając przycisk Analizuj. Jeśli ta opcja jest wybrana, zdefiniuj obszary obrazu, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone, za pomocą narzędzia wielokąta, prostokąta lub koła. Poniższa analiza automatyczna wykorzystuje elastyczne algorytmy do korygowania niektórych wad obrazu (np. słabego kontrastu) i poprawy kontrastu w zależności od jakości obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Schweingruber, F. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchweingruber%2C+FH+%22Tree+Rings+and+Environment%3A+Dendroecology%22">Tree Rings and Environment: Dendroecology</a>. , Haupt. Bern. (1996).</li>
<li>Sheppard, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendroclimatology%3A+extracting+climate+from+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">Dendroclimatology: extracting climate from trees.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 1, 343-352 (2010).</li>
<li>Wagenführ, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagenf%C3%BChr%2C+R+%22Anatomie+des+Holzes%3A+Strukturanalytik+-+Identifizierung+-+Nomenklatur+-+Mikrotechnologie%22">Anatomie des Holzes: Strukturanalytik - Identifizierung - Nomenklatur - Mikrotechnologie</a>. , DRW-Verlag Weinbrenner. (1999).</li>
<li>Tennessen, D., Blanchette, R. A., Windes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+Aspen+and+Cottonwood+in+Prehistoric+Wood+from+Chacoan+Great+House+Ruins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+Science%22%5BJournal%5D)">Differentiating Aspen and Cottonwood in Prehistoric Wood from Chacoan Great House Ruins.</a> Journal of Archaeological Science. 29, 521-527 (2002).</li>
<li>Rowell, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRowell%2C+RM+%22Handbook+of+Wood+Chemistry+and+Wood+Composites%22">Handbook of Wood Chemistry and Wood Composites</a>. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2005).</li>
<li>Kaennel, M., Schweingruber, F. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaennel%2C+M+%22Multilingual+Glossary+of+Dendrochronology.+Terms+and+definitions+in+English%2C+German%2C+French%2C+Spanish%2C+Italian%2C+Portuguese+and+Russian%22">Multilingual Glossary of Dendrochronology. Terms and definitions in English, German, French, Spanish, Italian, Portuguese and Russian</a>. , Haupt. Berne. (1995).</li>
<li>Esper, J., Frank, D. C., Luterbacher, J., et al. A changing world: challenges for landscape research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEsper%2C+J+%22On+selected+issues+and+challenges+in+dendroclimatology%22">On selected issues and challenges in dendroclimatology</a>. Kienast, F. , Springer. Dordrecht. 113-132 (2007).</li>
<li>Esper, J., Frank, D. C., Wilson, R. J. S., Büntgen, U., Treydte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+growth+trends+among+central+Asian+low+and+high+elevation+juniper+tree+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Trees%22%5BJournal%5D)">Uniform growth trends among central Asian low and high elevation juniper tree sites.</a> Trees. 21 (2), 141-150 (2007).</li>
<li>Frank, D. C., Nievergelt, D., Esper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summer+temperature+variations+in+the+European+Alps%2C+AD+755-2004%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Climate%22%5BJournal%5D)">Summer temperature variations in the European Alps, AD 755-2004.</a> Journal of Climate. 19 (2), 5606-5623 (2006).</li>
<li>Treydte, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millennium-long+precipitation+record+from+tree-ring+oxygen+isotopes+in+northern+Pakistan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Millennium-long precipitation record from tree-ring oxygen isotopes in northern Pakistan.</a> Nature. 440, 1179-1182 (2006).</li>
<li>Heinrich, I. Dendrogeomorphology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeinrich%2C+I+%22The+Encyclopedia+of+Quaternary+Science%22">The Encyclopedia of Quaternary Science</a>. Elias, S. A. 2, Amsterdam, Elsevier. 91-103 (2013).</li>
<li>Verheyden, A., De Ridder, F., Schmitz, N., Beeckman, H., Koedam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+time+series+of+vessel+density+in+Kenyan+mangrove+trees+reveal+a+link+with+climate%29%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">High-resolution time series of vessel density in Kenyan mangrove trees reveal a link with climate).</a> New Phytologist. 167, 425-435 (2005).</li>
<li>Abrantes, J., Campelo, F., García-González, I., Nabais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+vessel+traits+in+Quercus+ilex+under+Mediterranean+climate%3A+relating+xylem+anatomy+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trees%22%5BJournal%5D)">Environmental control of vessel traits in Quercus ilex under Mediterranean climate: relating xylem anatomy to function.</a> Trees. 27, 655-662 (2013).</li>
<li>Fengel, D., Wegener, G. W. ood Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , Kessel Verlag, Remagen. (2003).</li>
<li>Heinrich, I., Gärtner, H., Monbaron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+wood+formed+in+Fagus+sylvatica+and+Alnus+glutinosa+after+simulated+mass+movement+events%5BTitle%5D)+AND+%22IAWA-Journal%22%5BJournal%5D)">Tension wood formed in Fagus sylvatica and Alnus glutinosa after simulated mass movement events.</a> IAWA-Journal. 28 (1), 39-48 (2007).</li>
<li>Climate Change 2013: The Physical Science Basis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Contribution+of+Working+Group+I+to+the+Fifth+Assessment+Report+of+the+Intergovernmental+Panel+on+Climate+Change%22">Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change</a>. Stocker, T. F., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom and New York, NY. (2013).</li>
<li>Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+for+wood+anatomical+analysis+in+Dendrosciences%3A+The+GSL1-microtome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dendrochronologia%22%5BJournal%5D)">New perspectives for wood anatomical analysis in Dendrosciences: The GSL1-microtome).</a> Dendrochronologia. 32 (1), 47-51 (2014).</li>
<li>Arx, G., Carrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROXAS+-+a+new+tool+to+build+centuries-long+tracheid-lumen+chronologies+in+conifers%5BTitle%5D)+AND+%22Dendrochronologia%22%5BJournal%5D)">ROXAS - a new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers.</a> Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).</li>
<li>Schweingruber, F. H. Microscopic Preparation Techniques for Plant Stem Analysis. , Verlag Dr Kessel, Remagen. (2013).</li>
<li>Hoadley, R. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoadley%2C+RB+%22Identifying+wood%3A+Accurate+results+with+simple+tools%22">Identifying wood: Accurate results with simple tools</a>. , The Taunton Press. Newtown, CT. (1990).</li>
<li>Nievergelt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core-microtome.+A+new+tool+for+surface+preparation+on+cores+and+time+series+analysis+of+varying+cell+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Dendrochronologia%22%5BJournal%5D)">The core-microtome. A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters.</a> Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).</li>
<li>Von Schnakenburg, P., Bräuning, A., Helle, G. Detecting annual growth rhythms from high-frequency densitometry and carbon isotopes in tropical mountain rain forest trees in southern Ecuador. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVon+Schnakenburg%2C+P+%22Tree+Rings+in+Archaeology%2C+Climatology+and+Ecology%22">Tree Rings in Archaeology, Climatology and Ecology</a>. Elferts, D., Brumelis, G., Gärtner, H., Helle, G., Schleser, G. 6, GFZ Potsdam. Potsdam. 96-99 (2008).</li>
<li>Garcia Gonzalez, I., Fonti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+a+representative+sample+of+earlywood+vessels+for+dendroecological+studies%3A+an+example+from+two+ring-porous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Trees%22%5BJournal%5D)">Ensuring a representative sample of earlywood vessels for dendroecological studies: an example from two ring-porous species.</a> Trees. 22 (2), 237-244 (2008).</li>
<li>Fonti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+global+change+through+plastic+responses+of+xylem+anatomy+in+tree+rings%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Studying global change through plastic responses of xylem anatomy in tree rings.</a> New Phytologist. 185 (1), 42-53 (2010).</li>
<li>Purvis, M. J., Collier, D. C., Walls, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurvis%2C+MJ+%22Laboratory+techniques+in+Botany%22">Laboratory techniques in Botany</a>. , Butterworth, London. (1966).</li>
<li>Schneider, L., Gärtner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantage+of+using+non-Newtonian+fluids+to+prepare+micro+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Dendrochronologia%22%5BJournal%5D)">The advantage of using non-Newtonian fluids to prepare micro sections.</a> Dendrochronologia. 31 (3), 175-178 (2013).</li>
<li>De Ridder, M., Vanden Bulcke, J., Van Ackera, J., Beeckman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tree-ring+analysis+of+an+African+long-lived+pioneer+species+as+a+tool+for+sustainable+forest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Ecology+and+Management%22%5BJournal%5D)">Tree-ring analysis of an African long-lived pioneer species as a tool for sustainable forest management.</a> Forest Ecology and Management. 304, 417-426 (2013).</li>
<li>De Ridder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tree-ring+based+comparison+of+Terminalia+superba+climate%E2%80%93growth+relationships+in+West+and+Central%5BTitle%5D)+AND+%22Trees%22%5BJournal%5D)">A tree-ring based comparison of Terminalia superba climate–growth relationships in West and Central.</a> Trees. 27 (5), 1225-1238 (2013).</li>
<li>Redband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij">http://imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wyzwania związane z udaną i zrównoważoną integracją anatomii drewna z badaniami dendroekologicznymi, oprócz wielorakich problemów analitycznych, wynikają głównie z aspektów technicznych. Wyzwania te obejmują zarówno podstawowe podejścia do pobierania próbek, jak i tworzenie wysokiej jakości mikroprzekrojów i ich późniejszą analizę19.
Na pierwszy rzut oka próbkowanie rdzeni, a nawet dysków to prosta procedura znana już od wielu lat. Jest wiele rzeczy, które można zrobić źle, a niewielka niedokładność w pobieraniu próbek może spowodować poważne problemy podczas kolejnych faz przygotowania i analizy. Drobne niedokładności, takie jak rdzeniowanie, które nie jest dokładnie prostopadłe do osi trzpienia lub użycie nieidealnie naostrzonego rdzenia, nie stanowią problemu, jeśli cel badania ogranicza się do pomiarów szerokości pierścienia. Jednak w przypadku dążenia do analizy mikroskopowej próbek, nieprawidłowy kierunek pobierania próbek może skutkować zniekształceniami optycznymi ścian komórkowych, podczas gdy użycie rdzeni powoduje mikropęknięcia w rdzeniu. W rezultacie, przy próbie cięcia mikro odcinków tych rdzeni, cienkie sekcje po prostu się rozpadają i nie jest już gwarantowane skuteczne przygotowanie. To samo dotyczy próbkowania mikrordzeniowego. końcówka spowoduje wysokie ciśnienie, gdy dziurkacz zostanie wbity w drewno łodygi. W konsekwencji warstwa kambium zostanie ściśnięta. Komórki kambium (ryc. 5) są w konsekwencji ściskane i nie można ich analizować.
Pobieranie próbek z dysku jest rzeczywiście najlepszą strategią podczas analizy zmian wzrostu w celu powiązania ich ze zmianami środowiskowymi. Niestety, po prostu niemożliwe jest pobranie krążków ze wszystkich drzew przeznaczonych do pobrania próbek do dalszych analiz. Niemniej jednak, szczególnie w przypadku dendrochronologii tropikalnej, potrzebna jest pewna ilość krążków macierzystych w połączeniu z rdzeniami przyrostowymi. Dyski są używane jako podstawa do definiowania granic pierścienia i w tym celu do obsługi granic zdefiniowanych na podstawie analizy rdzeni przyrostowych12,27,28.
Często omawiane są zalety i wady szlifowania w porównaniu z cięciem1,11,21. Jak wspomniano powyżej, najlepsza procedura zawsze zależy od pytania badawczego i parametrów, które mają być analizowane (makroskopowe lub mikroskopowe). Jeżeli analizy izotopowe lub chemiczne są projektowane w dalszym etapie roboczym, niezwykle ważne jest, aby pył ścierny powstały podczas szlifowania, który może wypełnić luminę komórki na całej próbce, został starannie usunięty przez odkurzanie lub sprężone powietrze.
Wycinanie mikroskrawków jest dla wszystkich analiz mikroskopowych najwłaściwszym sposobem przygotowania próbek do dalszych analiz. W pierwszej kolejności odcinana jest próbka, którą następnie można zachować bez żadnych zanieczyszczeń do ewentualnych dalszych analiz. Po drugie, sekcje te pozwalają na pomiary parametrów pojedynczej komórki w wysokiej rozdzielczości. Co więcej, unikanie czasochłonnej techniki zatapiania poprzez użycie roztworu skrobi kukurydzianej26 do stabilizacji komórek jest dużą zaletą w mikrosekcjach.
Wadą mikroprzekroju jest nadal ograniczona wielkość próbki, co skutkuje długim czasem przygotowania. W przypadku analiz szeregów w czasie rzeczywistym sięgających w czasie na przestrzeni wieków, a nawet tysiącleci, istnieje potrzeba dalszego rozwoju istniejących urządzeń tnących17,19, ale także przetwarzania i analizy obrazu18. Pierwszym krokiem w tym kierunku jest opracowanie mikrotomurdzeniowego 21, początkowo produkowanego do cięcia płaskich powierzchni rdzeni (ilustracja 1). Ostatnie testy wykazały możliwość wycinania mikrosekcji całych rdzeni za pomocą tego urządzenia (ilustracja 1).
Wysokiej jakości mikrosekcje stanowią podstawową zasadę skutecznej analizy obrazu. Wykonywanie zdjęć pod mikroskopem jest powszechną procedurą19 , ale ich skuteczna analiza jest nadal zadaniem, które wymaga dalszego rozwoju17 . Wszystkie istniejące systemy analizy obrazu są półautomatyczne, tzn . muszą być mniej lub bardziej intensywnie kontrolowane przez technika. W wielu przypadkach obrazy muszą zostać skorygowane, a nawet konieczne jest wykonanie nowych obrazów w celu zwiększenia kontrastu w celu lepszej rejestracji struktur przez oprogramowanie bez zmiany grubości ściany komórkowej w obrazie.
Specjalistyczne narzędzia do analizy obrazu, takie jak ROXAS18, WinCell lub specjalne skrypty dla ImageJ29, są w stanie dostarczyć podstawowych danych anatomicznych, takich jak liczba komórek, wymiary komórek, grubość ściany komórkowej i położenie komórki w pierścieniu rocznym. Na podstawie tych podstawowych pomiarów można obliczyć wiele dodatkowych wskaźników anatomicznych, które są istotne w kontekście dendroekologicznym, takich jak rozmiar największych przewodów, rozkład rozmiarów przewodów, rozmiar wczesnego drewna lub pierwszego rzędu przewodów, gęstość drewna (optycznego), śródroczne profile wielkości przewodu i grubości ścianki komórkowej oraz wzorce grupowania przewodów (pojedyncze, wielokrotności itp.).
Korzystając z oprogramowania ROXAS18, kontury luminy przewodu (tj. ogniwa przewodzącego wodę) i obramowania pierścienia rocznego są automatycznie rozpoznawane i wizualnie przedstawiane jako nakładki na oryginalny obraz. Algorytmy wykrywania przewodów są oparte na informacjach o kolorze, rozmiarze i kształcie, a algorytmy wykrywania granic pierścieniowych na lokalnym kontekście każdego kanału. Przybornik pozwala nam ręcznie poprawić te wyniki poprzez bezpośrednią edycję elementów nakładki, tj. usuwanie, dodawanie i modyfikowanie obramowań pierścieni i konturów przewodów. Po edycji końcowe dane wyjściowe, w tym grubość ścianki komórki (drzewa iglaste), są automatycznie generowane i zapisywane w arkuszu kalkulacyjnym. W pełni zautomatyzowane systemy nie są obecnie dostępne, nawet dla drzew iglastych o stosunkowo prostej budowie, ale jest to cel na przyszłe rozwój. Zdecydowanie przemawiałoby to za pełną integracją parametrów anatomicznych drewna w analizach szeregów czasowych.

Drzewa, jak również krzewy, krzewy karłowate, a nawet zioła, wykazują różnorodne wzorce reakcji związanych ze zmianami w ich otoczeniu. Wzory te są przedmiotem botaniki i fizjologii roślin od połowy XIXwieku. W tamtych czasach badania nad roślinami drzewiastymi koncentrowały się głównie na drzewach i opisowej analizie struktury i zmienności słojów rocznych w kontekście ekologicznym1. Kiedy Andrew Ellicott Douglass wynalazł technikę datowania krzyżowego do badań słojów drzew2, ten kontekst ekologiczny został mniej lub bardziej stłumiony przez nową możliwość dokładnego datowania drewnianych znalezisk w archeologii. Datowanie krzyżowe po raz pierwszy umożliwiło dokładne datowanie słojów drzew do roku kalendarzowego i do chwili obecnej jest uważane za podstawę badań słojów drzew we wszystkich dziedzinach ich zastosowania1.
Równolegle, od końca XIX wieku, anatomia drewna przekształciła się w ważną dyscyplinę badawczą związaną z wieloma innymi dziedzinami nauk przyrodniczych i stosowanych3. Wyodrębniono dwie główne dziedziny: systematyczną anatomię drewna, która jest podstawą identyfikacji drewna w archeologii4, oraz stosowaną anatomię drewna, związaną z technologią, fizjologią, patologią i ekologiądrewna 3,5.
W badaniach słojów drzew, dendroekologia jest obecnie definiowana jako temat obejmujący badania związane z słojami drzew, koncentrując się na badaniach środowiskowych, takich jak procesy geomorficzne (dendrogeomorfologia), rekonstrukcje temperatury i opadów (dendroklimatologia), zmiany poziomu wody (dendrohydrologia) czy nawet fluktuacje lodowców (dendroglaciologia)6. Jak wskazuje ta definicja, analiza słojów drzew staje się coraz ważniejsza w dziedzinie datowania i rekonstrukcji procesów środowiskowych, takich jak (i) przeszłe warunki klimatyczne poprzez analizę rocznych zmian szerokości słojów7,8, gęstości drewna9 lub izotopów10 lub (ii) interwały nawrotów procesów geomorficznych11. Te bardzo szczegółowe badania dotyczące zmian szerokości pierścieni i ich zawartości izotopowej wskazują na potrzebę bardziej szczegółowej analizy pierścieni, tj. zbadania budowy anatomicznej pierścieni. Szczegółowe badania cech anatomicznych drewna w obrębie słojów rocznych związanych ze zmianami środowiskowymi są jednak rzadkie12,13. Chociaż te mikroskopijne cechy sąznane14, rzadko stosowano je na poziomie mikroskopowym do badań dendroekologicznych. Co więcej, dokładny czas tych reakcji wzrostu u naturalnie rosnących drzew, niezbędny do dokładnego datowania, rzadko został ostatnioudokumentowany15.
Jeśli chodzi o skutki globalnego ocieplenia16, konieczne jest ulepszenie istniejących i opracowanie nowych technik rejestrowania i ilościowego określania przeszłych i trwających procesów środowiskowych, szczególnie w zakresie badań nad wpływem klimatu11. Rozszerzając tradycyjne badania anatomiczne drewna na anatomię drewna opartą na ekologii17, naukowcy zajmujący się dendro mogą analizować nowe parametry i opracowywać nowe metodologie, aby zrozumieć krótko- i długoterminowy wpływ określonych czynników środowiskowych na anatomię roślin drzewiastych18. Szczegółowa wiedza na temat zmian różnych parametrów komórkowych w obrębie poszczególnych słojów związanych z określonymi czynnikami (np. siłami mechanicznymi, zmianami klimatu) jest podstawowym wymogiem zrozumienia zmienności powstawania słojów drzew. W porównaniu ze zwykłymi pomiarami szerokości pierścienia, identyfikacja różnic anatomicznych drewna wymaga bardziej złożonych i ekspansywnych technik przygotowania, które wymagają dużo pracy i czasu. Szczegółowe procedury cięcia, barwienia i zatapiania próbek są wielorakie i zawsze zależą od celu badania19.
Do makroskopowej analizy szerokości pierścieni w drzewach iglastych lub nawet struktur pod kątem liczby, rozmiaru lub rozmieszczenia naczyń w twardym drewnie, powierzchnia próbki jest zwykle polerowana za pomocą drobnego papieru ściernego lub specjalnych szlifierek20. Wadą tej procedury jest wypełnienie poszczególnych komórek pyłem, który uniemożliwia dalszą półautomatyczną analizę mikroskopową21. Najlepsze wyniki w makroskopowym przygotowaniu próbki uzyskuje się, gdy powierzchnia próbki jest cięta za pomocą żyletki lub innego ostrego noża.
Podczas gdy dla małych próbek, żyletki są doskonałym narzędziem; większe próbki jako rdzenie wymagają cięcia płaskich powierzchni na całej długości rdzeni. W przeciwieństwie do szlifowania, komórki nie są wypełniane pyłem, co umożliwia późniejsze przygotowanie do kolejnej analizy obrazu. Ponadto światło otwartej komórki, prawidłowo przecięte ściany komórkowe i płaska powierzchnia całej próbki umożliwiają zastosowanie densytometrii wysokiej częstotliwości22 na całej długości rdzenia. W przypadku analiz obrazowych powierzchnię próbek (ściany komórkowe) można zabarwić ciemnym tuszem, a światło otwartej komórki można następnie wypełnić białą kredą w celu zwiększenia kontrastu między ścianą komórkową a obszarem światła19,23. Ta dość prosta technika umożliwia podstawową makroskopową ocenę większych struktur komórkowych w celu pomiaru wielkości naczyń.
Te techniki cięcia płaskich powierzchni są wystarczające do analiz makroskopowych. W celu przeprowadzenia szczegółowej analizy anatomicznej drewna (tj. mikroskopowej) mikroskopia w świetle przechodzącym jest najczęstszą metodą stosowaną w naukach o dendro. Komórki ksylemu różnicują się w złożonych procesach obejmujących określanie typu komórki, podział komórek, różnicowanie komórek i programowaną śmierć komórki24. Ponieważ czas i szybkość, z jaką zachodzą te procesy, determinują charakterystykę anatomiczną komórki, warunki środowiskowe wpływające na te procesy mogą generować odchylenia anatomiczne w strukturze pierścienia. Ważnym warunkiem wstępnym tych analiz jest przygotowanie mikroskrawków za pomocą mikrotomu19. Podczas przygotowywania próbek do przekroju kluczowe znaczenie ma widoczność kierunku tchawicy lub włókien. Do wycinania mikroprzekrojów zaleca się stosowanie mikrotomów przesuwnych z napędem ręcznym, ponieważ technika ta ułatwia tworzenie wysokiej jakości przekrojów w zależności od potrzeb do analiz obrazowych19. W zależności od konkretnego celu danego badania, mikroprzekroje są cięte prostopadle lub równolegle do podłużnej rozciągłości komórek. Skrawki te są następnie fotografowane pod mikroskopem, a wymiary komórek mierzone za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazu.
Do niedawna możliwość przygotowania mikrosekcji była ograniczona tylko do małych rozmiarów próbek (około 1 cm x 1 cm). Jest to dopuszczalne do analizowania pojedynczych zdarzeń jako zakłóceń w określonych latach, ale technika ta nie pozwala na rozszerzoną analizę szeregów czasowych potrzebną do rekonstrukcji środowiska. Wysiłek ten można zrealizować jedynie poprzez opracowanie nowych, wydajnych i ekonomicznych procedur przygotowawczych i technik analitycznych. W ostatnich latach członkowie laboratorium słojów drzew w Szwajcarskim Federalnym Instytucie Badawczym WSL w Szwajcarii rozpoczęli intensywne prace nad tym tematem. W rezultacie opracowano nowe urządzenia i techniki analizy, które wspierają ideę integracji cech anatomicznych drewna z szerokim zakresem tematów badań środowiskowych.

<table><tbody><tr><td>Przyrost rdzenia</td><td></td><td></td><td>http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article & id=57& Itemid=88& lang=pl</td></tr><tr><td>Core-Microtome</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>Laboratory Mikrotom</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>Trephor mikrordzeń</td><td></td><td></td><td>http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp</td></tr><tr><td>roztworem</td><td></td><td></td> Nawashin <td>Dziesięć części 1% kwas chromowy, cztery części 4% formaldehyd i jedna część kwasu octowego</td></tr><tr>Błękit <td></td><td></td><td>anilinowy Pikry-Jedna</td><td>część nasyconego błękitu anilinowego i cztery części Trinitrofenolu rozpuszczone w 95% etanolu</td></tr><tr><td>Safranina</td><td></td><td></td><td>Wzór empiryczny (notacja Hilla) C20H19ClN4&nbsp;</td></tr><tr><td>Astra-blue</td><td></td><td></td><td>Wzór empiryczny (notacja Hilla) C47H52CuN14O6S3&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>Wzór liniowy CH3CH2OH&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksylol (ksylen)</td><td></td><td></td><td>Wzór liniowy C6H4(CH3)2&nbsp;</td></tr><tr><td>Canada Balsam</td><td></td><td></td><td>Embedding solution do mikroskopii</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Roxas <td>http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> ImageJ <td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>WinCell</td><td></td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

Badania dendroekologiczne wykorzystują informacje przechowywane w słojach drzew, aby zrozumieć, jak pojedyncze drzewa, a nawet całe ekosystemy leśne reagowały na zmiany środowiskowe i ostatecznie zrekonstruować takie zmiany. Odbywa się to poprzez analizę zmian wzrostu w czasie i korelację różnych parametrów specyficznych dla rośliny z (na przykład) zapisami temperatury. Włączenie parametrów anatomicznych drewna do tych analiz wzmocniłoby rekonstrukcje, nawet w ujęciu śródrocznym. W związku z tym przedstawiamy protokół dotyczący pobierania próbek, przygotowania i analizy próbki drewnianej do typowych analiz makroskopowych, ale także do późniejszych analiz mikroskopowych. Ponadto wprowadzamy potencjalne rozwiązanie do analizy obrazów cyfrowych generowanych z popularnych małych i dużych próbek w celu wsparcia analiz szeregów czasowych. W protokole przedstawiono podstawowe kroki, jakie obecnie można z nich korzystać. Poza tym istnieje ciągła potrzeba doskonalenia istniejących technik i opracowywania nowych technik w celu rejestrowania i ilościowego określania przeszłych i bieżących procesów środowiskowych. Tradycyjne badania anatomiczne drewna muszą zostać rozszerzone o informacje ekologiczne w tej dziedzinie badań. Wspierałoby to dendronaukowców, którzy zamierzają analizować nowe parametry i opracowywać nowe metodologie, aby zrozumieć krótko- i długoterminowy wpływ określonych czynników środowiskowych na anatomię roślin drzewiastych.

Wszystkie analizy dendroekologiczne zależą od dokładności pobranych próbek, niezależnie od tego, czy są to przekroje, rdzenie czy mikro-rdzenie. W tym celu urządzenia muszą być w idealnym stanie (precyzyjnie naostrzone), aby uniknąć powstawania mikropęknięć w próbce drewna. Przy przygotowywaniu powierzchni rdzeni przyrostowych niezbędne jest użycie mikrotonu do rdzeni. Możliwość uzyskania otwartych komórek, które mogą być następnie poddane obróbce w celu zwiększenia kontrastu dla analiz obrazu i pomiarów wielkości naczyń (Rycina 1), jest pierwszym istotnym krokiem w kierunku adaptacji struktur anatomicznych do analiz serii czasowych. Czasami gęstość próbki drewna liściastego uniemożliwia zastosowanie mikrotonu. W takim przypadku najlepszą opcją jest odpowiednie polerowanie i późniejsze usunięcie nadmiaru trocin z naczyń za pomocą kompresora lub odkurzacza.
Do bardziej szczegółowych analiz mniejszych struktur komórkowych, takich jak cewki wczesnego i późnego drewna u iglaków, wymagane są wysokiej jakości mikrosekcje. Należy przy tym unikać potencjalnych artefaktów, takich jak oddzielanie się wtórnych ścian komórkowych od ściany pierwotnej (Rycina 2). Jeśli artefakty te pojawią się na obrazach cyfrowych, zautomatyzowana analiza wymiarów komórek staje się niemożliwa. Artefakty te muszą być wówczas korygowane ręcznie, co jest czasochłonne i w większości przypadków prowadzi do błędnych pomiarów wymiarów komórek. Proste zastosowanie cieczy nienewtonowskiej, t. j., roztworu skrobi kukurydzianej, na górną część próbki wspomaga stabilność struktury, minimalizując jednocześnie powstawanie artefaktów (Rycina 2)26Zastosowanie skrobi kukurydzianej, odpowiedniej dla wszystkich próbek drewna, w tym gatunków tropikalnych, sprawia, że przeprowadzenie procedury zatapiania próbek przed cięciem staje się zbędne.
Przekroje mikroskopowe umożliwiają bardziej pewne wyznaczenie słojów rocznych. Dotyczy to szczególnie drzew iglastych rosnących na swoich naturalnych granicach, i.e., na granicy lasu w wysokich obszarach alpejskich. Często występują słoje niezwykle wąskie, które są trudne do wykrycia makroskopowo (Rycina 3). W skrajnych przypadkach słoje składają się z jednego lub dwóch rzędów komórek drewna wczesnego i jednego rzędu spłaszczonych komórek drewna późnego, które nie posiadają (w przeciwieństwie do typowych komórek drewna późnego) pogrubionych ścian komórkowych. Z tego powodu są one lepiej widoczne, a czasem widoczne tylko przy zastosowaniu przekrojów mikroskopowych. Ponadto można wyraźniej odróżnić wahania gęstości od granic słojów, co upraszcza wykrywanie słojów rocznych, zwłaszcza w basenie Morza Śródziemnego i w tropikach (Rycina 3).
Podczas analizy obrazów przy powiększeniu 40X lub większym, pojedyncze komórki są widoczne, a możliwe jest również wykrycie grubości ich ścian komórkowych. Oprogramowanie do analizy półautomatycznej umożliwia pomiar określonych parametrów wzdłuż zdefiniowanych ścieżek, zgodnie z kierunkiem ich rozwoju czasowego i przestrzennego (Rysunek 4). Dzięki temu można określić zmiany pojedynczych parametrów, takich jak światło komórki lub grubość ściany komórkowej, na całym obszarze słoja rocznego (Rysunek 4). Można to przeprowadzić dla wszystkich słojów widocznych na obrazie, co w pełni wspiera potrzebę przeprowadzenia rozszerzonej analizy szeregów czasowych.
Analizy obrazów mogą być również wykorzystywane do określania faz rozwojowych słojów rocznych w obrębie okresu wegetacyjnego (Ryc. 5). Podczas analizy obrazu przekroju barwionego safraniną i astra-błękitem w świetle spolaryzowanym widoczne stają się nawet różne etapy lignifikacji, zaczynając od zewnętrznych narożników ścian komórkowych, aż po pełne zdrewnienie wtórnej ściany komórkowej. Dzieje się tak, ponieważ zdrewniałe (dojrzałe) ściany komórkowe świecą w świetle spolaryzowanym (Ryc. 5). Szczegółowe informacje można powiązać z danymi środowiskowymi udokumentowanymi dla danego okresu wegetacyjnego, aby określić na przykład bardziej szczegółową zależność między klimatem a wzrostem.
<img alt="Analiza słojów drzewa, wykres i przekrój poprzeczny drewna, badanie dendrochronologiczne, porównanie wzorców wzrostu." src="/files/ftp_upload/52337/52337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przykłady mikroprzekroju oraz przygotowanej płaszczyzny dębu, obejmujące pomiary szerokości słojów i wielkości naczyń. Po lewej: zewnętrzna część rdzenia przyrostowego dębu. Rdzeń o średnicy 5 mm został wycięty za pomocą mikrotomu do rdzeni. Powierzchnię zabarwiono następnie na czarno markerem filcowym, a po wyschnięciu barwnika komórki wypełniono białą kredą. Po prawej: wykres przedstawiający pomiary szerokości słojów i wielkości naczyń wykonane na powierzchni rdzenia pokazanego po lewej stronie. Do wykonania tych pomiarów nie były potrzebne mikroprzekroje dzięki gładkiej powierzchni uzyskanej za pomocą mikrotomu do rdzeni (zmodyfikowano na podstawie21). Na dole: Mikroprzekrój wycięty z rdzenia przyrostowego, zabarwiony, odwodniony i utrwalony w balsamie kanadyjskim. Grubość: 20 µm, długość: 25 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Struktura tkanki roślinnej, obraz mikroskopowy, układ komórek ksylemu i floemu, analiza przekroju poprzecznego." src="/files/ftp_upload/52337/52337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Obrazy mikroprzekrojów wykonanych bez stabilizacji w porównaniu do przekroju wykonanego przy użyciu roztworu skrobi kukurydzianej. Lewo: Mikroprzekrój wykazujący artefakty cięcia w tracheidach drewna wczesnego iglaka. Próbka została przecięta bez zatopienia, w wyniku czego dość cienkie ściany wtórne komórek drewna wczesnego oddzieliły się od ściany pierwotnej (niebieskie strzałki). Prawo: Mikroprzekrój bez artefaktów w tracheidach drewna wczesnego iglaka. Przekrój ten (ta sama próbka, co po lewej stronie) został wykonany po naniesieniu pędzlem roztworu skrobi kukurydzianej na powierzchnię próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy struktury drewna ukazujący organizację komórkową, paski skali wskazują powiększenie." src="/files/ftp_upload/52337/52337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykłady słabo wykrywalnych granic słoje rocznych. Lewo: Przekrój mikroskopowy rdzenia przyrostowego (tutaj: Larix decidua) ukazujący granicę słoja (czarna strzałka) wskazaną przez pojedynczy rząd spłaszczonych komórek drewna późnego bez żadnego pogrubienia ścian komórkowych. Słój ten nie byłby widoczny makroskopowo. Prawo: Wewnątrzroczne wahania gęstości (biała strzałka) są powszechne u gatunków śródziemnomorskich (przekrój mikroskopowy: Quercus ilex). Stopniowa zmiana struktury komórkowej w stronę drewna późnego i powrót do struktury drewna wczesnego (biała strzałka) pozwala na odróżnienie wahań gęstości od rzeczywistych granic słojów (czarna strzałka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig3large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy i wykres pola światła oraz grubości ścianek cewników w badaniu tkanek roślinnych." src="/files/ftp_upload/52337/52337fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ilustracja pomiarów pola światła i grubości ścianek w obrębie przyrostu rocznego drzewa iglastego. Góra: Wycinek obrazu przedstawiający przykładowe wyniki analizy ROXAS w przyroście rocznym Pinus sylvestris (sosny zwyczajnej). Granice przyrostu zaznaczono kolorem żółtym, a obrysy światła cewników kolorem cyjanowym. Dla jednego rzędu radialnego (światła cewników w kolorze niebieskim) zmierzone grubości ścian komórkowych przedstawiono czerwonymi okręgami. Czarny pasek skali = 100 µm. Dół: Wewnątrzroczne zmiany pola światła i grubości ścian komórkowych cewników dla całego przyrostu rocznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Microscopic plant tissue diagram; cambial zone, xylem, phloem, cell development phases labeled." src="/files/ftp_upload/52337/52337fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Rycina 5. Przykład tworzącego się słownika rocznego. Obraz został wykonany za pomocą mikroskopu świetlnego ze światłem spolaryzowanym z mikroprzekroju barwionego safraniną i Astra-blue, uzyskanego z mikrojądra pobranego 7 lipca.th, 2007 z Larix decidua rosnące w dolinie Lötschental na wysokości 1300 m n.p.m. Na tym mikroprzekroju rozpoznawalne są komórki kambium, komórki w fazie powiększenia, komórki w fazie pogrubiania ścian oraz komórki dojrzałe. Szerokość styczna obrazu obejmuje ~1 mm przekroju poprzecznego ksylemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, należy kliknąć tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak pobierać próbki z drewnianych próbek w celu ogólnej oceny ich struktur wzrostu. Opisano makro- i mikroskopowe techniki preparacji i wizualizacji niezbędne do wygenerowania dobrze odwzorowanych i wysoce rozdzielczych zbiorów danych anatomicznych i dendroekologicznych drewna.

Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie dobrze zreplikowanych i wysokorozdzielczych przekrojów drewna. Powstałe zestawy danych anatomicznych służą do badania wpływu czasu i czynników środowiskowych na wzrost drzew i krzewów. Cel ten osiąga się poprzez zastosowanie cieczy nienewtonowskiej do stabilizacji komórek roślinnych podczas krojenia mikrotomem, co w drugim etapie umożliwia szczegółową analizę mikroskopową próbek.Mikrosekcje są barwione podwójnie, aby ułatwić rozróżnienie komórek zdrewniałych i niezdrewniałych, a następnie pobierane są cyfrowe obrazy próbek. Ostatecznie można przeprowadzić zautomatyzowane analizy oparte na komórkach w celu oceny wzrostu roślin oraz powiązane analizy szeregów czasowych, co pozwala na ewaluację interesujących parametrów anatomicznych drewna. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że komórki nie są wypełnione trocinami, co skutkuje uzyskaniem próbek o znacznie wyższej jakości i przejrzystości do analizy obrazu.Ponadto dodanie płynu nienewtonowskiego do komórek podczas sekcjonowania pozwala uniknąć czasochłonnej techniki zatapiania próbki w parafinie. Nowe mikrotomy, które zobaczymy w filmie, zostały opracowane w naszym laboratorium we współpracy z centralnym Lu Netti z Shang Dubs i Zurich. Wyróżniają się one wysoką stabilnością prowadnicy, co umożliwia cięcie dużych i gęstych preparatów.Do pobierania próbek rdzeniowych z pni drzew. Należy rozpocząć od prostopadłego umieszczenia zaostrzonego świdra do pobierania rdzeni względem osi wzrostu pnia drzewa. Następnie należy wkręcić świder i za pomocą ekstraktora wyjąć pobrany rdzeń z drzewa.Oznacz rdzeń konkretnym identyfikatorem, zapisując go miękkim ołówkiem na powierzchni rdzenia, a następnie powtórz tę procedurę po przeciwnej stronie łodygi, gdy wszystkie próbki zostaną pobrane. Przechowuj oznakowane rdzenie w odpowiednim pojemniku, aby chronić je przed uszkodzeniem podczas transportu. Po powrocie do laboratorium zamocuj próbki rdzenia pionowo, zgodnie z kierunkiem włókien, na drewnianych belkach wspierających, używając wodoodpornego kleju do drewna, i pozostaw je do wyschnięcia przed pobraniem mikropróbek z rdzenia.Najpierw za pomocą dłuta usuń niezbędną część kory. Następnie umieść specjalne urządzenie do pobierania próbek prostopadle do osi wzrostu łodygi, tak jak pokazano przed chwilą, i użyj młotka, aby przebić ksylem łodygi na głębokość około dwóch centymetrów. Obróć urządzenie, aby przełamać powstały mikro rdzeń wewnątrz narzędzia.Następnie wyjmij rdzeń z łodygi i przechowuj go w opisanej probówce do mikrowirówki. Aby uzyskać płaską powierzchnię na próbce rdzenia, należy zacząć od zamocowania wybranego rdzenia przyrostowego w uchwycie nowego mikrotomu do rdzeni, opracowanego do wycinania płaskich powierzchni na całej długości rdzenia. Następnie podnieś rdzeń, aż lekko dotknie ostrza, które jest zamocowane na prowadnicy z łożysk kulkowych wzdłuż długości rdzenia, i pociągnij ostrze, aby odciąć pierwszą część górnej strony rdzenia.Następnie przesuń nóż za rdzeń. Podnieś uchwyt próbki o około 10 mikronów i powtarzaj procedurę cięcia, aż zostanie odcięta w przybliżeniu jedna trzecia średnicy rdzenia, co pozwoli na uzyskanie ciągłej, płaskiej powierzchni.W celu szczegółowej analizy obrazowej struktury anatomicznej próbek należy przygotować mikrosekcje przy użyciu innego rodzaju mikrotomu. Najpierw przymocuj badaną próbkę rdzeniową w uchwycie mikrotomu. Następnie ustaw nóż mikrotomu, kierując się prowadnicą kulkową, i przeciągnij nóż przez próbkę.Przesuń ostrze w tył, aby podnieść próbkę o 20 do 30 mikronów. Następnie przeciągnij ostrze nad próbką. Powtarzaj ten proces, aż na górnej powierzchni próbki powstanie ciągła warstwa.Następnie za pomocą pędzla pokryj powstałą powierzchnię roztworem skrobi kukurydzianej. Następnie podnieś próbkę o 15 µm i przyłóż pędzel do jej powierzchni. Powoli przesuwaj ostrza w stronę próbki, rozpoczynając cienkie cięcie pod pędzlem, a gdy cały przekrój zostanie odcięty, użyj pędzla, aby poprowadzić go na powierzchnię ostrza.Użyj innego pędzla i wody, aby usunąć tkankę z ostrza, a następnie umieść ją na szkiełku podstawowym, aby umożliwić rozróżnienie struktur zdrewniałych i niezdrewniałych. Wypłucz glicerol wodą za pomocą pipety. Następnie pokryj wilgotny przekrój kilkoma kroplami mieszaniny szafranu i astro blue.Po pięciu minutach wypłukać barwniki wodą, a następnie niezwłocznie odwodnić preparat poprzez kolejne traktowanie etanolem. Po zakończeniu odwadniania w etanolu wielokrotnie przepłukać preparat w 100% ksylenie. Kontynuować do momentu, aż ksylen pozostanie przejrzysty.Przykryj tkankę kroplą 100% kanadyjskiego balsamu i szkiełkiem podstawowym, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie umieść tak przygotowany preparat mikroskopowy pomiędzy dwoma paskami tworzywa sztucznego odpornego na wysoką temperaturę i połóż go na metalowej płytce. Na szkiełko połóż obciążnik, aby utrzymać przekrój w pozycji płaskiej, a następnie umieść preparat w piekarniku nagrzanym do 60 °C.Po 12 godzinach należy pozwolić preparatowi ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie zdjąć obciążnik i pasek plastikowy. Na koniec oczyścić preparat za pomocą żyletek, aby usunąć nadmiar balsamu. Po przeprowadzeniu procedur sekcjonowania i barwienia, przedstawionych wcześniej, można przygotować wszelkie rodzaje próbek o różnych rozmiarach i kształtach, stosując również specjalne uchwyty do rdzeni w celu stworzenia obrazów cyfrowych powierzchni rdzenia do analizy naczyń. Najpierw należy przyciąć płaszczyznę powierzchni rdzenia za pomocą mikrotomu do rdzeni, tak jak właśnie zaprezentowano, a następnie za pomocą pisaka filcowego zabarwić powstałą powierzchnię na czarno.Gdy tylko barwnik wyschnie, przetrzyj powierzchnię rdzenia białą kredą, a następnie wciśnij kredę w komórki palcem. Usuń nadmiar kredy, a następnie umieść rdzeń na stoliku mikroskopu binokularnego wyposażonego w kamerę cyfrową, zaczynając od jednej strony rdzenia. Następnie wykonaj sekwencję lekko nachodzących na siebie obrazów, aż do uchwycenia całej powierzchni.Następnie zszyj pojedyncze obrazy, aby stworzyć kompletny obraz powierzchni rdzenia i uzyskać obrazy cyfrowe z preparatów mikroskopowych. Umieść preparat na stoliku mikroskopu i wybierz odpowiednie powiększenie dla analizowanych struktur. Na koniec wykonaj nakładające się obrazy przekrojów osadzonych na oczyszczonych preparatach, tak jak zaprezentowano to przed chwilą dla próbki powierzchni rdzenia, a następnie zszyj obrazy, aby stworzyć jeden kompletny obraz przekroju.Możliwość uzyskania otwartych komórek jest pierwszym ważnym krokiem w kierunku adaptacji anatomicznych dendroekologicznych struktur do analizy szeregów czasowych. Do bardziej szczegółowej analizy naczyń drewna wczesnego lub późnego u drzew iglastych niezbędne są wysokiej jakości mikrosekcje. Należy unikać potencjalnych artefaktów, takich jak pęknięte ściany komórkowe.Zastosowanie cieczy nienewtonowskiej do próbki, takiej jak zaprezentowany przed chwilą roztwór skrobi kukurydzianej, wspomaga stabilność struktury komórkowej. Mikroprzekroje umożliwiają dokładniejsze określenie przyrostów rocznych. Ma to szczególne znaczenie w przypadku drzew iglastych rosnących na granicach swojego naturalnego zasięgu.Jak widać tutaj, niezwykle wąskie pierścienie występują często, lecz są trudne do wykrycia makroskopowo. W skrajnych przypadkach pierścienie składają się z jednego lub dwóch rzędów komórek, które mogą być widoczne jedynie w mikroprzekrojach. Przy analizie obrazów przy dużych powiększeniach widoczne są pojedyncze komórki.Oprogramowanie do półautomatycznej analizy umożliwia określenie zmian w pojedynczych parametrach, takich jak grubość ściany komórkowej, dla wszystkich pierścieni widocznych na obrazie, co wskazuje na potrzebę przeprowadzenia rozszerzonej analizy szeregów czasowych. Podwójne barwienie mikrosekcji pozwala na wizualizację różnych etapów lignifikacji. Informacje te mogą następnie zostać powiązane z danymi środowiskowymi z odpowiedniego okresu wegetacyjnego, aby po opracowaniu metody określić bardziej szczegółową zależność między klimatem a wzrostem.Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu ekologii DRO do analizy różnych parametrów anatomicznych drzew i krzewów. Zastosowanie tej metody drastycznie skraca czas potrzebny na przygotowanie dużych, wysokiej jakości przekrojów. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca pod dygestorium oraz noszenie rękawiczek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować dobrze powtórzone i wysokorozdzielcze zestawy danych anatomicznych w celu wsparcia analizy szeregów czasowych.

a-technical-perspective-modern-tree-ring-research-how-to-overcome

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Perspektywa techniczna w nowoczesnych badaniach pierścieni drzewnych - Jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

Charakteryzacja erozji na podstawie dendrogeomorfologii zazwyczaj skupiała się na dokładnym znalezieniu początkowego czasu ekspozycji korzeni, poprzez badanie makroskopowych lub zmian na poziomie komórki spowodowanych ekspozycją. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis różnych nowatorskich technik uzyskiwania bardziej precyzyjnych wskaźników erozji na podstawie bardzo dokładnych danych mikrotopograficznych.

Laboratoryjny i terenowy protokół do szacowania szybkości erozji arkuszy na podstawie dendrogeomorfologii

Tutaj prezentujemy protokół, jak uniknąć mikro pęknięć w rdzeniach przyrostowych poprzez zastosowanie wiertarki akumulatorowej z mnożnikiem momentu obrotowego, aby zminimalizować problemy podczas rdzeniowania drzew, a także jego wpływ na przygotowanie długich mikrosekcji. Protokół ten obejmuje również procedurę ostrzenia rdzeni w terenie.

Zaawansowany przepływ pracy do pobierania wysokiej jakości rdzeni przyrostowych - nowe techniki i urządzenia

Tutaj pokazujemy, jak przetwarzać rdzenie drzew za pomocą łańcucha narzędzi do tomografii komputerowej rentgenowskiej. Z wyjątkiem ekstrakcji chemicznej do niektórych celów, nie jest wymagana dalsza fizyczna obróbka laboratoryjna. Łańcuch narzędzi może być używany do szacowania biomasy, do uzyskiwania danych MXD/szerokości słojów drzew, a także do uzyskiwania ilościowych danych dotyczących anatomii drewna.

Analiza rdzenia drzewa za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej

Przedstawiamy protokół do używania drukowanych w 3D uchwytów do mocowania rdzeni przyrostowych w terenie, bez konieczności rozpakowywania i przyklejania ich do drewnianych mocowań. Nowy uchwyt GSC umożliwia umieszczenie rdzeni w mikrotomie rdzeniowym w celu przecięcia ich powierzchni i bezpośredniego przeniesienia ich do cyfrowego przechwytywania obrazu.

Nowy przepływ pracy dla próbkowania i digitalizacji rdzeni przyrostowych

Ten artykuł opisuje projekt, budowę i funkcję obiektu o powierzchni 1 000m2 zawierającego 24 indywidualne działki polowe o powierzchni 33,6m2 wyposażone do pomiaru całkowitej objętości spływu z czasem i pobierania podpróbek spływu w wybranych odstępach czasu w celu ilościowego określenia składników chemicznych w wodzie spływającej z symulowanych trawników domowych.

Projekt i budowa Zakładu Badań Spływów Miejskich

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Aby ułatwić poszukiwanie bardziej ekonomicznych i przyjaznych dla środowiska formuł naturalnych klejów do drewna na bazie produktów, ta praca demonstruje przygotowanie i testowanie klejów do drewna na bazie nasion roślinnych. Protokół ten pozwala ocenić produkty rolne na bazie nasion roślin jako odpowiednich kandydatów do zastąpienia syntetycznych klejów do drewna.

Przygotowanie i testowanie klejów do drewna na bazie mączki z nasion roślin

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Białka są często używane do oznaczania stawonogów do badań nad rozprzestrzenianiem się. Przedstawiono metody podawania wewnętrznych i zewnętrznych znaczników białkowych na stawonogach. Przedstawiono również techniki wykrywania znaczników białkowych, zarówno za pomocą pośrednich lub kanapkowych testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją

Preferencje zachowań żywieniowych u zwierząt gospodarskich mogą być modyfikowane, aby wdrożyć plan zarządzania wypasem w uprawach drzewiastych. W tym miejscu przedstawiamy protokół pokazujący dawkę chlorku litu po zjedzeniu nowej rośliny, która wywołuje uwarunkowaną awersję do smaku.

Jak stworzyć kondycjonowaną awersję smakową do wypasu roślin okrywowych w uprawach drzewiastych z małymi przeżuwaczami?

Poznaj zaawansowane metody przygotowania próbek drewna do analizy anatomicznej w dendroekologii. Protokół obejmuje sekcjonowanie mikrotomem, podwójne barwienie komórek i automatyczną analizę obrazów.

Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

Przeglądaj więcej filmów