Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie komórek drożdży do znalezienia procesów biologicznych, na które ukierunkowuje się substancja chemiczna będąca przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez określenie najpierw profilu odpowiedzi na dawkę substancji chemicznej dla drożdży. Drugim krokiem jest wyhodowanie pełnej kolekcji szczepów drożdży z nokautem genów na subletalnej dawce substancji chemicznej i na płytce kontrolnej.

Następnie identyfikowane są mutanty drożdży, które są nadwrażliwe na tę substancję chemiczną. Ta lista jest analizowana bioinformatycznie, aby ujawnić wszystkie geny potrzebne do tolerowania tej substancji chemicznej. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie biologicznej repliki eksperymentu przy niskiej przepustowości.

Potwierdza to wszelkie znalezione interakcje chemiczne genów. Ostatecznie ta wysokoprzepustowa metoda chemicznych badań przesiewowych w genetyce jest wykorzystywana do pokazania, które produkty genowe i szlaki biologiczne są wykorzystywane do tolerowania interesującej nas substancji chemicznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak konkurencyjny wzrost mutantów z kodami kreskowymi w hodowli płynnej, jest to, że nie są wymagane żadne techniki biologii molekularnej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii chemicznej, takie jak to, w jaki sposób nowa mała cząsteczka może hamować wzrost komórek eukariotycznych. Na początek przygotuj nocną kulturę drożdży, rozsiewając komórki BY 4 7 4 1 na płytce A-Y-E-P-D i inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza lub do momentu, gdy utworzą się widoczne kolonie. Kiedy kolonie są gotowe.

Przygotuj płynne kultury na noc, wybierając pojedynczą kolonię i zaszczepiając pięć mililitrów płynnej pożywki YEPD w sterylnym naczyniu. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z ciągłym obracaniem lub wstrząsaniem. Następnie należy przygotować stałe podłoże agarowe zawierające różne dawki badanej substancji chemicznej.

Aby to zrobić. Najpierw należy przygotować kilka roztworów podstawowych substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania o stężeniu 100-krotnym od końcowego stężenia w odpowiednim rozpuszczalniku. Następnie, dla każdego badanego stężenia, należy podać trzy mililitry stopionego agaru YEPD do kilku sterylnych probówek hodowlanych.

Umieść probówki zawierające agar w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza, aby zapobiec zestaleniu się agaru. Teraz, dla każdego stężenia substancji chemicznej, która ma być badana w temperaturze 13, białe uwolnienie 100 x związku do podwielokrotności stopionego agaru tex, probówka przez dwie do trzech sekund do wymieszania, a następnie pipetowanie jednego mililitra z każdej probówki do zduplikowanych studzienek na 12-światowej płytce, pozwól płytce zastygnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia zaszczepić 10 mililitrów płynnej pożywki YEPD dwoma mikrolitrami nasyconej przez noc kultury drożdży.

Następnie odpipetować 25 mikrolitrów tej kultury na agar zawierający substancję chemiczną w dołkach płytki z 12 wielorybami i równomiernie rozprowadzić za pomocą sterylnych szklanych kulek lub sterylnego pręta. Pozostaw płytkę do wyschnięcia pod płomieniem, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po upływie czasu inkubacji należy ocenić całkowitą liczbę i wielkość kolonii w studzienkach.

Zidentyfikuj subletalne stężenie związku, które nie hamuje wzrostu o więcej niż 10 do 15% do użycia na ekranie. Utrzymać szybkość delecji mutantów przy gęstości 384 kolonii na płytkę, replikując na 16 płytkach agarowych YEPD, zawierających 200 mikrolitrów na mililitr G four 18. Korzystanie z systemu robotycznego do układania mikrobiologicznego lub ręcznych narzędzi do przypinania co trzy miesiące.

Przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Następnie przygotuj 250 mililitrów pożywki agarowej YEPD o tym samym stężeniu G, czterech 18 lub pięciu płytek agarowych i pozostaw je do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej na płaskiej, równej powierzchni. Wyjąć płytki zawierające zbiór mutantów usuwających z miejsca przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odczekać, aż płytki osiągną temperaturę pokojową.

Użyj delikatnej chusteczki do usuwania kondensacji, która utworzyła się na pokrywie każdej płytki, aby zapobiec osadzaniu się kropelek wody na matrycy i zanieczyszczeniu krzyżowemu mutantów macierzy. Niech robot do przypinania macierzy mikrobiologicznej skondensuje macierz mutantów delecyjnych z gęstości 384 kolonii na płytkę na 16 szalkach Petriego do 1 536 kolonii na płytkę na czterech szalkach Petriego. Po inkubacji macierzy w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc, należy ją zbadać, aby zapewnić równomierny transfer kolonii z płytek źródłowych.

W tablicy będzie kilka pustych pozycji, które służą jako wskazówka, że tablica mutantów usuwania została poprawnie skondensowana. Będą to płytki źródłowe używane do replikacji na podłożach zawierających interesujący Cię związek. Pojedyncza płytka źródłowa może być używana do wielu przypinów.

Ponadto wiele robotów posiada funkcje offsetowe, które pozwolą na to, co zapewni podobną liczbę przenoszonych drożdży za każdym razem. Aby skonfigurować naprawę macierzy mutantów do usuwania płytki repliki, 700 mililitrów tylko pojazdu kontrolnego i eksperymentalnego agaru YEPD zawierającego interesującą substancję chemiczną. To wystarczy do wykonania testu w trzech egzemplarzach.

Wlać płytki za pomocą agaru kontrolnego i doświadczalnego. Dodanie 50 mililitrów do każdej płytki. Pozwól talerzom ostygnąć w temperaturze pokojowej przez noc na płaskiej, równej powierzchni, używając robota do odchylenia talerza.

Inokulować podwójnie zmutowaną matrycę na trzech zestawach płytek zawierających substancje chemiczne w eksperymentalnie określonym stężeniu, jak również resetować płytki zawierające kontrolę nośnika. Inkubuj płytki na blacie stołu w temperaturze pokojowej, aby uzyskać obraz trwający łącznie od 24 do 48 godzin. Płytki są inkubowane przez 24 i 48 godzin poprzez zdjęcie pokrywy i umieszczenie ekranem do dołu na skanerze płaskim.

Rób obrazy w rozdzielczości co najmniej 300 DPI. Alternatywnie użyj aparatu cyfrowego do robienia zdjęć. Jeśli to zrobisz, umieść talerze stroną zadrukowaną do góry na ciemnym tle i zdejmij pokrywki, aby zrobić zdjęcie.

Następnie przeprowadź kwantyfikację i porównanie rozmiarów kolonii tablicowych za pomocą jednego z kilku programów open source, w tym narzędzi kulowych SGA i młyna sitowego. Na tym etapie kilka mutantów delecji drożdży uzyska wynik jako nadwrażliwy na substancję chemiczną będącą przedmiotem zainteresowania, usuwając pożądane nadwrażliwe mutanty z kolekcji delecji drożdży na YEPD. Ager zawierający 200 mikrogramów na mikrolitr G cztery 18 inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż utworzą się kolonie.

Po zweryfikowaniu genotypu szczepu za pomocą diagnostycznego PCR i elektroforezy Agel, należy zaszczepić pięć mililitrów płynu YPD każdym szczepem i inkubować przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z rotacją lub wstrząsaniem. Zmierz OD 600 każdej kultury i rozcieńczyć każdy szczep do OD 600 jednego w sterylnej wodzie destylowanej. Są to teraz znormalizowane kultury drożdży.

Następnie dozuj 100 mikrolitrów znormalizowanego dzikiego typu przez 4 7 4 1 kulturę drożdży do dołka A jednej z 96-dołkowej płytki, dozuj 100 mikrolitrów do siedmiu dodatkowych szczepów do studzienek, B jeden do H jeden. Następnie wlej 90 mikrolitrów sterylnej wody do studni, od dwóch do H od dwóch do dwóch przez sześć do sześciu do sześciu godzin. Na koniec przygotuj serię od jednego do 10 rozcieńczeń znormalizowanych rzeźb G.

Zacznij od seryjnego pipetowania 10 mikrolitrów z kolumny pierwszej do drugiej za pomocą pipety wielokanałowej i kontynuuj na płytce 96-dołkowej, aż do uzyskania sześciokrotnego rozcieńczenia. Następnie użyj pipety wielokanałowej do dwóch do pięciu mikrolitrów rozcieńczonych kultur drożdży w siatce na YEP D, stałych pożywkach zawierających substancje chemiczne i kontrolę nośnika. Inkubować płytki w odpowiedniej temperaturze przez 24 do 48 godzin po inkubacji.

Sprawdź płytki i porównaj wrażliwość wybranych mutantów na substancje chemiczne w stosunku do kontrolnych płytek obrazowych BY 47 41 po 24 i 48 godzinach. Tak jak poprzednio, poniższe obrazy pokazują wyniki procedury mającej na celu określenie stężenia inhibitora subiny substancji chemicznej. Pierwszy obraz pokazuje wzrost nasyconej kultury BY 4 7 4 1 rozcieńczonej od 1 do 5 000 i posianej na rosnących stężeniach pięciu fluorouracylu.

Stężenie 10 mikromolowe wybiera się jako pod-in-hamującą dawkę. Ten obraz przedstawia krzywą wzrostu komórek BY 4, 7, 41 w płynnych pożywkach zawierających pięć fluroucylu. Około cztery razy 10 do czterech komórek zdeponowano w trzech egzemplarzach i mierzono rosnące stężenia pięciu fluorouracylu i gęstości optyczne co 10 minut przez 22 godziny.

Ponownie, można zauważyć, że dawka 10 mikromolowa jest dawką hamującą subinę. Następne zdjęcia pokazują wyniki badań genetyki chemicznej na zielono z pięcioma fluorouracylami. Tutaj pokazano zmutowaną macierz delecji S sachar visier replikowaną na agarze YPD zawierającą 10 mikromolowych pięciu Fluor uracylu po prawej stronie i kontrolę DMSO po lewej stronie.

Ten wykres pokazuje wyniki genetyki chemicznej na zielono, względny wzrost mutantów na 10 mikromolach. Pięć Fluor uracylu w porównaniu z kontrolą DMSO jest tutaj uporządkowanych według pozycji promienia. Względny wzrost mutantów na 10 mikromolowych, pięciu flora uracylu w porównaniu z kontrolą DMSO jest uporządkowany według stosunku wielkości kolonii.

Na obu wykresach wskazany jest próg współczynnika mniejszy niż 0,8. Ten ostatni obraz przedstawia wyniki trzech testów walidacyjnych. Seryjne rozcieńczenia kilku izolowanych zmutowanych szczepów hodowano na kontroli DMSO po lewej stronie, 10 mikromolowych, pięć fluoro-UIL w środku i 0,015% sulfonianu metylosu po prawej.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że pracujesz z wiarygodną kopią macierzy mutantów delecyjnych, a także w celu walidacji wszelkich wyników przy użyciu niezależnej metodologii, takiej jak testy plam drożdżowych lub rozwarstwienie tetrady drożdży. Technika ta stanowi skuteczny środek dla naukowców zajmujących się badaniami nad małymi cząsteczkami do zbadania sposobu działania związku przy użyciu podejść na poziomie systemowym w pączkujących drożdżach.