Name: Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji chemiczno-genetycznych interakcji u Saccharomyces cerevisiae. Technika pozwala wykrywać mutacje nadwrażliwe na substancje chemiczne i analizować genetyczne podstawy tolerancji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania w laboratorium CJN są wspierane przez granty operacyjne z NSERC, Instytutu Badawczego Kanadyjskiego Towarzystwa Onkologicznego (CCSRI) i Kanadyjskiej Fundacji Raka Piersi (BC-Yukon Branch).

UWAGA: Ogólny przebieg tej procedury jest opisany na rysunku 2.
1. Określenie dawki hamującej wzrost
<ol>
	<li>Przygotowanie drożdży na noc 
	UWAGA: Pożywka wzrostowa z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YEPD) stosowana w tym protokole jest standardową recepturą13.
	<ol>
		<li>Usunąć komórki BY4741 (MATahis3, Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) na płytce agarowej YEPD i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 30 °C lub do momentu powstania widocznych kolonii.</li>
		<li>Przygotować nocne posiewy, zaszczepiając 5 ml płynnej pożywki YEPD w sterylnym naczyniu hodowlanym z pojedynczą kolonią. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z ciągłym obracaniem lub wytrząsaniem. Kultura zazwyczaj osiąga nasycenie rano (~2 × 108 komórek/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat ze stałego podłoża agarowego zawierającego różne dawki substancji chemicznych
	<ol>
		<li>Przygotuj kilka zapasów substancji chemicznej do badania przy 100-krotnym pożądanym stężeniu końcowym w odpowiednim rozpuszczalniku. 
		UWAGA: Skuteczne stężenia będą zależeć od substancji chemicznej i muszą być określone empirycznie. Dlatego zaleca się wstępne przetestowanie szerokiego zakresu stężeń końcowych; tj. od niskiego μM do wysokiego mM.</li>
		<li>Dla każdego stężenia substancji chemicznej, która ma być badana, porcjować 3 ml stopionego agaru YEPD do kilku sterylnych probówek hodowlanych. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aby nie zastygła.</li>
		<li>Dla każdego stężenia badanej substancji chemicznej dodać 30 μl 100x związku do stopionego podłoża, wirować 2-3 sekundy w celu wymieszania i odpipetować 1 ml do każdej pary zduplikowanych studzienek na 12-dołkowej płytce. Pamiętaj, aby dołączyć tylko kontrolkę pojazdu. Pozostaw talerze na noc do zastygnięcia w temperaturze pokojowej. Wyrzuć wszystkie dodatkowe nośniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozproszone komórki galwaniczne
	<ol>
		<li>Zaszczepić 10 ml płynnej pożywki YEPD 2 μl nasyconej kultury drożdży, hodowanej przez noc, jak w kroku 1.1.2.</li>
		<li>Umieść na płytce 25 μl rozcieńczonej kultury drożdży na studzienkę, równomiernie rozprowadź za pomocą sterylnych szklanych kulek lub pręta i pozostaw płytkę do wyschnięcia pod płomieniem. Inkubować płytkę w temperaturze 30°C przez 48 godzin.</li>
		<li>Oceń wzrost drożdży (zarówno całkowitą liczbę, jak i wielkość kolonii) na płytkach. Wybierz subletalne stężenie związku, które nie hamuje wzrostu o więcej niż 10%-15%, aby przeprowadzić badanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Systematyczne chemiczne badanie genetyczne
<ol>
	<li>Utrzymanie tablicy mutantów delecyjnych (DMA) i przygotowanie płytki źródłowej
	<ol>
		<li>Szczegółowy opis konstruowania zmutowanych macierzy delecyjnych z zapasów glicerolu znajduje się w Baryshnikova et al.14. Po ułożeniu mutantów delecyjnych w układzie o gęstości 384 kolonii na płytkę, DMA może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C. Powtórzyć na agarze YEPD zawierającym 200 μg/ml G418, jeśli jest to konieczne, aby zapobiec zrastaniu się kolonii ze sobą. 
		UWAGA: Należy unikać wielokrotnych replikacji seryjnych, aby zapobiec utracie wolno rosnących szczepów i zminimalizować pojawienie się mutantów supresorowych. Jest to szczególnie istotne w przypadku utrzymywania kolekcji jako haploidów.</li>
		<li>Wykonaj wszystkie etapy posiewu repliki za pomocą zrobotyzowanego systemu układania mikrobiologicznego. Alternatywnie, manipuluj koloniami w szyku za pomocą ręcznych narzędzi do przypinania. 
		UWAGA: Kolekcja delecji drożdży jest dostępna w postaci haploidów i diploidów z kilku źródeł komercyjnych i jest zwykle wysyłana jako zapasy glicerolu na 96-dołkowych płytkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kondensacja tablicy mutantów usuwania
	<ol>
		<li>Przygotować 250 ml pożywki agarowej YEPD zawierającej 200 μg/ml G418. Skuteczne stężenie G418 może się różnić, a każda partia powinna być przetestowana empirycznie.</li>
		<li>Przygotować pięć płytek agarowych YEPD, wlewając 50 ml agaru YEPD zawierającego 200 μg/ml G418 na płytkę. Zrób to jeden dzień przed kondensacją matrycy i pozwól płytkom ostygnąć w temperaturze pokojowej przez noc na płaskiej, równej powierzchni. 
		UWAGA: Do zbioru wymagane będą cztery płytki o gęstości 1,536 szczepów, piąta płytka jest nalewana jako dodatek.</li>
		<li>Usunąć 16 szalek Petriego zawierających zbiór delecji mutantów o gęstości 384 kolonii na płytkę i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (~1 godzina).</li>
		<li>Wytrzyj kondensację, która utworzyła się na pokrywie każdej płytki, za pomocą delikatnej ściereczki roboczej. Niezastosowanie się do tego może spowodować osadzanie się kropelek wody na matrycy i zanieczyszczenie krzyżowe zmutowanych w układzie.</li>
		<li>Za pomocą robota do przypinania macierzy mikrobiologicznej należy skondensować DMA z gęstości 384 kolonii na płytkę (16 szalek Petriego) do 1 536 kolonii na płytkę (4 szalki Petriego). Wykonaj to tak, aby 1st colony od tablicy 1 kołki do wiersza 1 kolumna 1 skondensowanej tablicy, 1st kolonia płytki 2 do wiersza 1 kolumna 2, 1st kolonia płytki 3 do wiersza 2 i kolumny 1 oraz 1st kolonia płytki 4 do wiersza 2 kolumna 2.</li>
		<li>Inkubować skonsolidowaną matrycę w temperaturze 30°C przez noc.</li>
		<li>Zbadaj matrycę, aby zapewnić równomierny transfer kolonii z płytek źródłowych. Pojawi się kilka pustych pozycji, celowo włączonych do tablicy, które służą jako wskazówka zapewniająca prawidłowe zagęszczenie DMA (Rysunek 4A). 
		UWAGA: Będą to płytki źródłowe do replikowania posiewu na pożywce zawierającej badany związek. Pojedyncza płytka źródłowa może być używana do wielu przypinów. Ponadto wiele robotów będzie miało funkcję kompensacji, która zapewni, że za każdym razem przenoszona będzie podobna liczba drożdży.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tablica mutantów do usuwania tablicy repliki
	<ol>
		<li>Przygotować 700 ml pożywki kontrolnej (sam nośnik) i 700 ml pożywki doświadczalnej (zawierającej substancje chemiczne). To wystarczy do wykonania testu w trzech egzemplarzach (12 płytek na warunek plus dwie dodatkowe).</li>
		<li>Na płytkę wlać 50 ml agaru YEPD zawierającego badaną substancję chemiczną lub kontrolną. Pozostaw talerze do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez noc na płaskiej, równej powierzchni.</li>
		<li>Używając robota do replikacji płytki, zaszczepij DMA na trzech zestawach płytek zawierających chemikalia w eksperymentalnie określonym stężeniu, a także na trzech zestawach płytek zawierających sterowanie pojazdem. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 24-48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Płyty obrazowe i analiza danych
<ol>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora i pozostawić je do osiągnięcia temperatury pokojowej (~1 godz.) przed obrazowaniem. Zapobiegnie to tworzeniu się kondensatu podczas obrazowania płyt.</li>
	<li>Płyty obrazowe po 24 i 48 godzinach, zdejmując pokrywę i umieszczając ją stroną zadrukowaną do dołu na skanerze z płaskim stołem. Rób obrazy w rozdzielczości co najmniej 300 dpi. Alternatywnie użyj aparatu cyfrowego do robienia zdjęć. Jeśli to zrobisz, umieść talerze stroną zadrukowaną do góry na ciemnym tle i zdejmij pokrywki, aby image. 
	UWAGA: Format pliku i położenie płytek będą zależeć od użytego programu do oceny ilościowej.</li>
	<li>Przeprowadź kwantyfikację i porównanie rozmiarów kolonii tablic za pomocą jednego z kilku programów typu open source, w tym Balony 15, SGAtools 16 i ScreenMill 17.</li>
</ol>
4. Walidacja ekranu
UWAGA: Na tym etapie kilka mutantów delecji drożdży zostanie ocenionych jako nadwrażliwe na substancję chemiczną, która ich interesuje. Te interakcje chemiczno-genetyczne muszą być następnie zweryfikowane na dwa sposoby. Po pierwsze, tożsamość wrażliwych szczepów powinna zostać potwierdzona za pomocą PCR. Po drugie, wrażliwość chemiczna musi być oceniana niezależnie. Poniżej przedstawiono krótki protokół wykonywania testów plamienia w celu walidacji nadwrażliwości szczepu, techniki powszechnej w biologii drożdży.
<ol>
	<li>Usunąć pożądane (nadwrażliwe) mutanty z kolekcji delecji drożdży na agarze YEPD zawierającym 200 μg/ml G418. Inkubować w temperaturze 30 °C aż do powstania kolonii. Zweryfikuj genotyp szczepu za pomocą diagnostycznej PCR ze starterami zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml płynu YEPD dla każdego szczepu i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z rotacją lub wytrząsaniem.</li>
	<li>Zmierzyć OD600 i rozcieńczyć każdy szczep do OD600 = 1 w sterylnym dH2O. Są to teraz znormalizowane kultury drożdży.</li>
	<li>Dozować 100 μl znormalizowanej kultury drożdży typu dzikiego (BY4741) do dołka A1 na 96-dołkowej płytce. Dozować 100 μl maksymalnie siedmiu dodatkowych szczepów do studzienek B1-H1.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 90 μl sterylnego dH2O do studzienek od A2-H2 do A6-H6. Na koniec przygotuj serię rozcieńczeń 1:10 znormalizowanych kultur drożdży. Rozpocząć od seryjnego pipetowania 10 μl z kolumny 1 do kolumny 2 za pomocą pipetora wielokanałowego i kontynuować na płytce 96-dołkowej, aż do uzyskania sześciu rozcieńczeń (tj. 100 do 10-5).</li>
	<li>Przenieść 2-5 μl rozcieńczonych kultur drożdży do siatki za pomocą pipety wielokanałowej na pożywkę stałą YEPD zawierającą kontrolę chemiczną i nośnikową. Inkubować płytki w odpowiedniej temperaturze przez 24-48 godzin.</li>
	<li>Sprawdź płytki i porównaj wrażliwość wybranych mutantów na chemikalia (w stosunku do kontroli BY4741). Płyty pamięciowe po 24 i 48 godzinach, jak w kroku 3.2. 
	UWAGA: Podczas gdy identyfikacja kilku nadwrażliwych szczepów z pokrewnymi ontologiami lub funkcjami genów daje pewność co do ważności badania przesiewowego, transformacja nadwrażliwego szczepu delecji z plazmidem zawierającym dziką kopię genu jest wymagana do formalnego ustalenia, że delecja genu będąca przedmiotem zainteresowania (a nie ukryte mutacje w drugim miejscu) powoduje wrażliwość na lek.</li>
</ol>

<ol><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30(2010).</li>
<li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li>
<li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+In+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+%28SGA%29+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li>
<li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balony%3A+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354(2013).</li>
<li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SGAtools%3A+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li>
<li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScreenMill%3A+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement%2C+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353(2010).</li>
<li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil%3A+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li>
<li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth%3A+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li>
<li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunSpec%3A+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35(2002).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li>
<li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology+annotations+at+SGD%3A+new+data+sources+and+annotation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li>
<li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008(2006).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleosome+function%3A+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Poniżej przedstawiono podejście do generowania profili interakcji chemiczno-genetycznych. Metoda jest prosta: porównując rozmiary kolonii każdego szczepu w kompleksowych kolekcjach delecji genów w obecności i pod nieobecność substancji chemicznej, identyfikowane są wszystkie geny potrzebne do tolerowania zniewagi chemicznej. Analiza wzbogacania adnotacji uzyskanej listy wrażliwych szczepów może być następnie wykorzystana do uzyskania wglądu w sposób działania chemikaliów. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod k...

Narzędzia genetyczne i zasoby dostępne w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae umożliwiły prowadzenie na dużą skalę badań genomiki funkcjonalnej, które łącznie dostarczają nowego wglądu w to, jak geny funkcjonują jako sieci spełniające wymagania systemów biologicznych. Kamieniem węgielnym tych narzędzi było wspólne stworzenie kompletnego zestawu nieistotnych delecji genów we wszystkich otwartych ramkach odczytu u drożdży1,2. Uderzającą obserwacją było to, że tylko ~20% genów drożdży jest wymaganych do żywotności, gdy są hodowane jako haploidy w standardowych warunkach laboratoryjnych. Podkreśla to zdolność komórki do buforowania przed zaburzeniami genomu poprzez wykorzystanie alternatywnych szlaków biologicznych. Mutanty genetyczne, które są zdolne do życia indywidualnie, ale śmiertelne w połączeniu, sygnalizują połączone lub zbieżne równoległe szlaki biologiczne i tworzą sieci interakcji genetycznych, które opisują funkcję biologiczną. Wraz z rozwojem warunkowych, wrażliwych na temperaturę i hipomorficznych alleli niezbędnych genów, technologia nie została ograniczona do badania genów innych niż niezbędne3,4. Koncepcja ta została zastosowana w skali genomowej, tworząc bezstronną mapę interakcji genetycznych ilustrującą, w jaki sposób geny zaangażowane w podobne procesy komórkowe grupują się ze sobą5.
Chemiczne zakłócenia sieci genetycznych naśladują delecje genów (Rysunek 1)6. Badanie związków hamujących wzrost w stosunku do macierzy szczepów delecyjnych o dużej gęstości pod kątem nadwrażliwości identyfikuje profil interakcji chemiczno-genetycznej, tj. listę genów, które są wymagane do tolerowania stresu chemicznego. Podobnie jak w przypadku interakcji genetycznych, wielkoskalowe badania przesiewowe bibliotek chemicznych wykazały, że związki o podobnym sposobie działania grupują się razem7. W związku z tym, ustalając profil interakcji chemiczno-genetycznej związku, można wywnioskować sposób działania, porównując go z wielkoskalowymi zestawami danych dotyczących syntetycznych interakcji genetycznych i chemicznych interakcji genetycznych8,9.
Duże badania chemiczno-genetyczne, gdzie badane są dziesiątki związków, zostały przeprowadzone za pomocą testów konkurencji kodów kreskowych. W tym podejściu zbiorcza kolekcja szczepów delecyjnych jest hodowana masowo przez kilka pokoleń w niewielkiej objętości pożywki zawierającej substancję chemiczną. Ponieważ każdy mutant delecji zawiera unikalny genetyczny kod kreskowy, żywotność/wzrost poszczególnych mutantów w puli szczepów delecyjnych jest śledzony za pomocą mikromacierzy lub sekwencjonowania o wysokiej przepustowości10.
Wnioskowanie o dopasowaniu poprzez monitorowanie wielkości kolonii fizycznie ułożonych mutantów hodowanych na stałym agarze zawierającym związek bioaktywny jest również skuteczną metodą identyfikacji interakcji chemiczno-genetycznych11,12. Podejście to stanowi opłacalną alternatywę dla badań przesiewowych opartych na konkurencji i doskonale nadaje się do oznaczania małych bibliotek substancji chemicznych. Przedstawiono tutaj prostą metodologię tworzenia listy interakcji chemiczno-genetycznych u S. cerevisiae, która nie opiera się na manipulacjach biologii molekularnej ani infrastrukturze. Wymaga jedynie pobrania próbek do usuwania drożdży, zrobotyzowanego lub ręcznego aparatu do przypinania oraz ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu.

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Do pożywek płynnych / stałych YEPD dodać do 1% stężenia końcowego (w/v)</td></tr> <tr><td>Tyrpton w proszku</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>Do pożywki płynnej / stałej YEPD dodać do 2% stężenia końcowego (w / v)</td></tr> <tr><td>Anachemia</td> <td>dekstrozy</td><td>31096-380</td><td>W przypadku pożywek płynnych/stałych YEPD dodać do 2% stężenia końcowego (w/v) &#8212; Nie sterylizować w autoklawie. Przygotować 20% roztwór podstawowy, przefiltrować, wysterylizować i dodać do podłoża po autoklawowaniu.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>Do pożywek stałych YEPD dodać do 2% stężenia końcowego (w/v)</td></tr><tr><td>G418</td><td>AG Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Przygotuj 1,000x zapas po 200&nbsp; mg/ml w dH2O i sterylizować filtrem.&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki hodowlane</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>wysokowydajny robot do kołkowania macierzy mikrobiologicznej</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy; Szalka Petriego</td><td>Instrumenty Śpiewaka&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Pudełko 200 naczyń</td></tr><tr><td>384 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Pudełko 1 000 padów</td></tr><tr><td>1536 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Pudełko z 1,000 padów</td></tr><tr><td colspan="4">Alternatywne narzędzia do przypinania:</td></tr><tr><td>W pełni zautomatyzowane systemy robtic S</td><td>& P robotyka</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Dostępnych jest kilka zautomatyzowanych systemów do obsługi kolonii, systemów roboczych i wyobrażeniowych.</td></tr><tr><td>Ręczne narzędzia do przypinania V</td><td>& P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Ręczne narzędzia i akcesoria do replikacji.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Określenie sposobu działania bioaktywnych substancji chemicznych jest interesujące dla szerokiego grona naukowców akademickich, farmaceutycznych i przemysłowych. Saccharomyces cerevisiae, czyli drożdże pączkujące, to modelowe eukarionty, dla których na rynku dostępna jest pełna kolekcja ~ 6,000 mutantów delecji genów i hipomorficznych mutantów genów podstawowych. Te zbiory mutantów mogą być wykorzystywane do systematycznego wykrywania interakcji chemiczno-genowych, tj. genów niezbędnych do tolerowania substancji chemicznej. Informacje te z kolei informują o prawdopodobnym sposobie działania związku. W tym miejscu opisujemy protokół szybkiej identyfikacji interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Demonstrujemy metodę przy użyciu chemioterapeutyku 5-fluorouracyl (5-FU), który ma dobrze zdefiniowany mechanizm działania. Nasze wyniki pokazują, że egzosom jądrowego RNA TRAMP i enzymy naprawcze DNA są potrzebne do proliferacji w obecności 5-FU, co jest zgodne z wcześniejszymi podejściami genetyki chemicznej opartej na mikromacierzach opartych na kodach kreskowych i wiedzą, że 5-FU niekorzystnie wpływa zarówno na metabolizm RNA, jak i DNA. Opisano również wymagane protokoły walidacji tych ekranów o wysokiej przepustowości.

W ramach walidacji tego podejścia przeprowadziliśmy reprezentacyjny screening interakcji chemiczno-genetycznych dla środka chemioterapeutycznego 5-fluorouracylu (5-FU) zgodnie z powyższym protokołem. Wiadomo, że 5-FU zaburza działanie syntazy tymidylanowej, a także metabolizm DNA i RNA18. Interakcje chemiczno-genetyczne 5-FU są dobrze poznane i zostały zbadane za pomocą technik mikromacierzy kodów kreskowych drożdży z wykorzystaniem kolekcji delecji heterozygotycznych i homozygotycznych8,19. Tutaj w...

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie komórek drożdży do znalezienia procesów biologicznych, na które ukierunkowuje się substancja chemiczna będąca przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez określenie najpierw profilu odpowiedzi na dawkę substancji chemicznej dla drożdży. Drugim krokiem jest wyhodowanie pełnej kolekcji szczepów drożdży z nokautem genów na subletalnej dawce substancji chemicznej i na płytce kontrolnej.Następnie identyfikowane są mutanty drożdży, które są nadwrażliwe na tę substancję chemiczną. Ta lista jest analizowana bioinformatycznie, aby ujawnić wszystkie geny potrzebne do tolerowania tej substancji chemicznej. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie biologicznej repliki eksperymentu przy niskiej przepustowości.Potwierdza to wszelkie znalezione interakcje chemiczne genów. Ostatecznie ta wysokoprzepustowa metoda chemicznych badań przesiewowych w genetyce jest wykorzystywana do pokazania, które produkty genowe i szlaki biologiczne są wykorzystywane do tolerowania interesującej nas substancji chemicznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak konkurencyjny wzrost mutantów z kodami kreskowymi w hodowli płynnej, jest to, że

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka identyfikacja interakcji chemiczno-genetycznych w Saccharomyces cerevisiae

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę identyfikacji chemiczno-genetycznych interakcji u Saccharomyces cerevisiae. Technika pozwala wykrywać mutacje nadwrażliwe na substancje chemiczne i analizować genetyczne podstawy tolerancji.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów