Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Witam, nazywam się Helen Kuster i pracuję w grupie badawczej dr Harolda zajmującej się badaniami sercowo-naczyniowymi i profesorem na Uniwersytecie Auto Vica w MacBooku. Jesteśmy zainteresowani charakterystyką izolacyjną monocytów morskich w celu wykorzystania ich jako nośników we wzroście naczyń pobocznych. Do hodowli monocytów pochodzących ze szpiku kostnego konieczne są następujące główne kroki, pierwsze znieczulenie myszy i zwichnięcie szyjki macicy, drugie ekstrakcja i płukanie kości udowej.

Trzecie filtrowanie szpiku kostnego. Po czwarte do mycia etapami z podłożem piątym, hodowla komórek na ultraniskich płytkach mocujących. Szósta cytometria przepływowa.

W celu ekstrakcji monocytów ze szpiku kostnego mysz zostanie znieczulona za pomocą fluoru ISO i poddana eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Mysz zostanie unieruchomiona, a obie kończyny dolne zostaną oddzielone skalpelem sterydowym. Zarówno kość udowa, jak i piszczelowa zostały pobrane i umyte 96% etanolem Ethan przez co najmniej 90 sekund.

Następnie wszystkie kroki muszą być ściśle sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia. Mięśnie lub ścięgna zostaną usunięte z kości. Kość udową i piszczelową kilkakrotnie przepłukuje się ciepłym PBS.

W celu pobrania szpiku kostnego proksymalne i dystalne końce każdej kości są cięte cienkimi nożyczkami. Aby wypłukać kość, potrzebujemy jednej igły sterydowej 28 G, jednej, jednej mililitrowej strzykawki i od 10 do 15 mililitrów pożywki na kość. Następnie szpik kostny jest filtrowany przez 70 mikrometrów S, przytrzymując kość cienkimi kleszkami.

Opłucz kości jedna po drugiej, aż staną się złudzeniami. Aby zminimalizować stres komórek, należy ostrożnie docisnąć stempel strzykawki. Przepłukać sito za pomocą PBS.

Następnie komórki są odwirowywane z stężeniem 250 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. A czy reus jest zawieszony z podłożem? Po tym kroku powtórz go jeszcze raz.

W przypadku monocytów pochodzących ze szpiku kostnego z natywnego szpiku kostnego stosujemy M 199 z 1% penicyliną i streptomycyną oraz 10% płodową surowicą kaszlową. Dodatkowo pierwszego dnia dodajemy 20 nanogramów na mililitr INE MCSF. Osiem nanogramów na mililitr interfer gamma dodaje się w ostatnim dniu hodowli do pożywki.

Jeśli pożądana jest regulacja MHC dwa w górę, komórki są wysiewane do bardzo niskich płytek mocujących z grubymi dołkami, aby zapobiec trwałemu przyleganiu do dna. Używamy stężenia jednorazowego od 10 do sześciu komórek na mililitr z maksymalnie sześcioma mililitrami na studzienkę. Okres uprawy trwa pięć dni w temperaturze 37 stopni i 5% dwutlenku węgla.

Komórki są sprawdzane codziennie po pięciu dniach, od 60 do 80% komórek to monocyty. Nazywam się Martin Bachner i jestem studentem medycyny na Uniwersytecie Auto Fungi na Wydziale Kardiologii, Anologii i Chronologii. A kiedy wykonujesz wstrzyknięcie dożylne, ważne jest, aby dużo ćwiczyć przed wykonaniem tego, ponieważ w przeciwnym razie nie będziesz w stanie zastosować monocytów w odpowiedni sposób.

Eksperymenty wykazały, że monocyty są najbardziej skuteczne w poprawie agenezji sztuki, gdy są stosowane systemowo. Powszechnym sposobem stosowania leków ogólnoustrojowych jest wstrzyknięcie ogona WA. W naszym przypadku wstrzykujemy 2,5 miliona monocytów, które są ponownie zawieszane i chlorek sodu.

W ogonie tętnic myszy znajdują się cztery naczynia po stronie brzusznej i grzbietowej oraz dwa ubytki po stronie bocznej. Tak więc do wtrysku WA musimy obrócić ogon o około 90 stopni. Dla łatwiejszej procedury mysz należy rozgrzać za pomocą poduszki grzewczej przez około 10 minut.

Zwierzęta należy obserwować poprzez ocieplenie. Jest to ważne dla rozpoznania oznak przegrzania. Co więcej, potrzebujemy tego czynnika infekcyjnego i igły z 30 genami ustawionymi na jednomililitrowej strzykawce insulinowej.

Ostrożnie przymocuj zwierzę do krępowania, co znacznie ułatwi wstrzyknięcie w ogon. Upewnij się, że mysz ma wystarczająco dużo miejsca do oddychania przed włożeniem roztworu do strzykawki. Vortex, roztwór monocytów, aby upewnić się, że wszystkie monocyty mogą zostać wstrzyknięte.

Dezynfekuje miejsce wstrzyknięcia, aby uniknąć infekcji, weź ogon między uderzenie a palec wskazujący. W najbardziej dystalnym punkcie igła jest wprowadzana pod płaskim kątem. Jeśli zostanie umieszczony w żyle, bardzo łatwo jest wstrzyknąć roztwór monocytów.

Jeśli występuje pęcherz, jest to oznaką niewłaściwego wstrzyknięcia. Powinieneś natychmiast przestać i spróbować więcej. Proksymalnie, zawsze staraj się wstrzykiwać powoli i nie więcej niż pięć mikrolitrów na gram.

Jeśli wstrzyknięcie się powiodło, należy zatamować krwawienie w miejscu wstrzyknięcia, delikatnie uciskając przez około jedną minutę. Pod koniec zabiegu otwórz retraktor i umieść mysz w klatce, aby scharakteryzować monocyty. Efekty wykorzystujemy z kombinacją antygenów, a mianowicie CD 11 B, F four 80, CD 115 i GL one.

Ekspresja tych antygenów koreluje z etapem rozwoju analizy monocytów. Przeprowadziliśmy fakty w dniu 0, 3, 5 i siódmym, czystość monocytów wzrasta do 90% w piątym dniu. Aby osiągnąć tę czystość, ważne jest, aby silnie zubożyć makrofagi terrinowe.

Komórki nieterrynowe są wyczerpywane przez użycie buforu płuczącego wolnego od EDTA. Aby zubożyć komórki terriny, używamy EDTA zawierającego wash, bufor i delikatne pieszczoty. Ten diagram przedstawia główne typy komórek dla ich hodowli jednokońcowej.

Pokazane różne typy komórek to jeden limfocyty, dwa monocyty, trzy granulocyty, zwiększające czystość monocytów po piątym dniu. I kultura. Należy zauważyć, że zmieniający się skład komórkowy podczas hodowli populacji komórek obejmuje jeden monocyt i dwa makrofagi.

Rycina druga, oś czasu ekspresji CD 115 podczas różnicowania. Należy zauważyć, że ponad 95% wszystkich komórek jest CD 115 dodatnich po pięciu dniach różnicowania, co wskazuje, że zdecydowana większość komórek to monocyty lub makrofagi. Klasyfikacja może opierać się na wielkości komórki i ziarnistości, ale określone markery komórkowe są bardziej wiarygodne.

Rycina trzecia, zwiększająca ekspresję dojrzałości makrofagów monocytów. Marker F cztery 80, dzień piąty, zwróć uwagę na pojawienie się populacji z pośrednią ekspresją F four 80, co jest zgodne z fenotypem monocytów. Siódmego dnia zwróć uwagę na przesunięcie w prawo ekspresji F four 80 zgodnej z dojrzewaniem makrofagów.

Izolacja monocytów jest ważna w wielu badaniach in vitro i in vivo. Komórki te są interesującym celem, na przykład w związku z chorobami takimi jak choroba tętnic obwodowych lub choroba niedokrwienna serca, które są związane z niedokrwieniem. Szpik kostny z FEMA i piszczel myszy z biopsji jest pobierany przez płukanie kości ciepłą zawiesiną komórkową pożywki, jest uzupełniany MCSF i hodowany na bardzo niskich powierzchniach przyczepu, aby uniknąć adhezji, wywołane różnicowanie właściwości monocytów i różnicowanie monocytów jest sprawdzane w różnym czasie, a fakty z markerem, takim jak CD 11 b, CD 115 i FO 80 są używane do fenotypu komórek.

Jeśli pożądane jest ogólnoustrojowe podawanie leków, wstrzyknięcie dożylne jest łatwym i skutecznym sposobem, aby to zrobić. Opisaliśmy metodę izolowania dużych ilości monocytów MI ze szpiku kostnego w prosty i opłacalny sposób. Dzięki tej nowej metodzie jesteśmy w stanie wygenerować około 11 milionów monocytów na mysz.