Name: Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych przy użyciu komórek PBMC. Techniki cytometrii przepływowej pozwalają mierzyć produkcję cytokin oraz zdolność cytotoksyczną komórek efektorowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest finansowana przez R.J. Reynolds Tobacco Company (RJRT) na podstawie umowy o współpracy badawczej z Wake Forest University School of Medicine. G.L. Prasad jest pełnoetatowym pracownikiem RJRT.

UWAGA: Pisemna świadoma zgoda na przeprowadzenie tego badania została uzyskana w lokalnej jednostce badań klinicznych na podstawie zatwierdzenia IRB, zgodnie z Dobrymi Praktykami Klinicznymi. Przetwarzanie krwi, izolacja PBMC i inne eksperymenty z hodowlami komórkowymi są przeprowadzane w sterylnych warunkach, przy użyciu sterylnych mikrobiologicznie materiałów i odczynników.
1. Przygotowanie do WS-CM
<ol>
	<li>Wygeneruj WS-CM zgodnie z wcześniejszym opisem12.
	<ol>
		<li>Przygotuj WS-CM, przepuszczając dym z czterech papierosów referencyjnych 3R4F przez podłoże Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 bez czerwieni fenolowej, stosując następujący schemat palenia: odpowiednio 35-60-2, objętość zaciągnięcia w ml, odstęp między zaciągnięciami w sekundach i czas zaciągnięcia w sekundach. Z każdego preparatu pobierana jest próbka o objętości 20 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz rurkę (tuby) datą, godziną zakończenia oraz nazwą i numerem papierosa. Przechowywać 500 μl porcji w temperaturze -80 °C natychmiast po zakończeniu wędzenia.</li>
	<li>Przeanalizuj podwielokrotności zamrożonego WS-CM, aby określić poziomy nikotyny, nitrozoamin specyficznych dla tytoniu i wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, jak opisano wcześniej12.</li>
</ol>
2. Izolacja PBMC
<ol>
	<li>Pobranie świeżej krwi od zdrowych dawców (którzy nie są konsumentami wyrobów tytoniowych) Odizoluj PBMC od świeżej krwi, jak opisano poniżej, na podstawie oddzielnego zezwolenia Wake Forest Baptist Health IRB15.
	<ol>
		<li>Przed przybyciem worka na krew należy przygotować butelkę o pojemności 500 ml, nożyczki, bufor izolacyjny i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) (RT) firmy Dulbecco w kapturze do hodowli komórkowych na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Bufor izolacyjny musi być chroniony przed światłem.</li>
		<li>Trzymaj worek na krew do góry nogami i przetnij rurkę tuż poniżej miejsca, w którym została zaciśnięta, pozostawiając co najmniej 3 cm rurki.</li>
		<li>Zdjąć nakrętkę z butelki o pojemności 500 ml i przytrzymać probówkę nad otworem butelki. Podnieś worek na krew i odwróć go, aby krew mogła swobodnie przepływać z worka do butelki, aż worek będzie pusty. Pozwól, aby krew spłynęła na wewnętrzną ściankę butelki, a nie prosto w dół, aby uniknąć tworzenia pęcherzyków.</li>
		<li>Wlać bufor izolacyjny do butelki w stosunku 1:5 buforu izolacyjnego do krwi. Szczelnie zakręć butelkę i delikatnie odwróć ją od końca do końca, 10 razy. Pozostawić butelkę w kapturze do hodowli komórkowej do inkubacji przy wyłączonym świetle, na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nad krwią utworzy się jasna, słomkowa warstwa. Usunąć tę warstwę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Pobrana ilość może wahać się od 50 do 300 ml, w zależności od osoby, która oddała krew.</li>
		<li>Odwirować probówki o sile 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać półprzezroczysty supernatant, pozostawiając ciemny krwisty granul. Granulka będzie luźna, ale lepka.</li>
		<li>Odpipetować 3 ml buforu izolacyjnego do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Do osadu zawiesinowego dodać 20 ml DPBS na każde 50 ml płynu o barwie słomkowej zebranej w kroku 2.1.5. Wirować, aby dokładnie wymieszać i skonsolidować zawieszoną ciecz z wielu probówek. Ten płyn zawiera zawieszone krwinki.</li>
		<li>Za pomocą pipety do przenoszenia przenieść 5 ml zawieszonych krwinek na 3 ml buforu izolacyjnego zgodnie z krokiem 2.1.8. Powoli i delikatnie przechylić stożkową probówkę o pojemności 15 ml, która zawiera zawiesinę komórek, aby utworzyć dwie oddzielne warstwy. Wirować probówki o sile 400 x g przez 40 minut przy temperaturze pokojowej przy minimalnym przyspieszeniu i bez hamulca.</li>
		<li>Za pomocą pipety transferowej usunąć powstałą mętną warstwę środkową (kożuchową powłokę) zawierającą PBMC do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Unikaj rysowania innych przezroczystych warstw pod nim. Przenieść nie więcej niż 25 ml do każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Dodać 25 ml buforu do pracy na zimno (lub więcej, aby wypełnić całą pozostałą objętość stożkowej probówki o pojemności 50 ml) w celu przemycia komórek. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad za pomocą 10 ml buforu bieżącego. Zawiera PBMCs. Policz komórki i użyj natychmiast lub umieść na lodzie do zamrożenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zamrażanie i rozmrażanie PBMC
<ol>
	<li>Odwirować PBMC zebrane w kroku 2.1.13 przez 10 minut przy 400 x g.</li>
	<li>Napełnij pojemnik do zamrażania alkoholem izopropylowym zgodnie z instrukcjami producenta. UWAGA: Alkohol izopropylowy jest łatwopalny i silnie toksyczny.</li>
	<li>Zawiesić osad za pomocą pożywki RPMI 1640 (4 °C) zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Jest to medium zamrażające RPMI 1640. Zawiesić osad z taką ilością pożywki do zamrażania, że w wyniku zawiesiny będzie miała około 5 x 107 komórek/ml. Liczba komórek dostępnych do zamrożenia będzie się różnić.</li>
	<li>Dozować 1 ml porcji zawiesiny komórkowej do 2 ml krioprobówek i umieścić krioprobówki w pojemniku do zamrażania. Umieścić pojemnik do zamrażania z krioprobówkami w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu przechowywania O/N, a następnie wyjąć krioprobówki i przenieść do przechowywania w zamrażarce kriogenicznej w temperaturze od -150 °C do -190 °C.</li>
	<li>Wyjąć krioprobówkę z magazynu kriogenicznego i szybko ją rozmrozić, delikatnie mieszając, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Natychmiast przenieś rozmrożone PBMC w krioprobówce do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 10 ml RPMI 1640 kompletnej pożywki (4 °C) zawierającej 10% FBS, 1% Pen/Strep i 1% L-glutaminy. Zawartość rozmrożonej krioprobówki należy przenieść tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać maksymalną żywotność komórek15.</li>
	<li>Odwirować PBMC przy 400 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad za pomocą 5 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 i policzyć komórki.</li>
	<li>Zmierz żywotność komórek za pomocą ustalonych metod, takich jak metoda wykluczania błękitu trypanowego. Generalnie żywotność komórek tą metodą wynosi około 90 - 95%. PBMC są teraz gotowe do użycia w eksperymentach.</li>
</ol>
4. Determinacja śmierci komórki

UWAGA: Podane tutaj rozcieńczenia służą do celów tego badania. Rozcieńczenia można odpowiednio zmienić.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć WS-CM lub nikotynę w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnego podłoża RPMI do całkowitej objętości 100 μl/dołek, jak wskazano poniżej.</li>
	<li>Rozcieńczyć WS-CM do następujących stężeń: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 i 5 μg/ml jednostek ekwitotynowych nikotyny (w oparciu o zawartość nikotyny w WS-CM)12.</li>
	<li>Rozcieńczyć nikotynę w pożywce RPMI do następujących stężeń: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 i 3000 μg/ml. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBMC zawieszonych w kompletnym pożywce RPMI do każdej studzienki w stężeniu 1 x 106 komórek/studzienkę. Całkowita objętość komórek plus WS-CM lub nikotyna wyniesie 200 μl/studzienkę.</li>
	<li>Na potrzeby tego opracowania przygotuj dwa zestawy płytek jak wyżej. Przykryć płytki i inkubować jedną płytkę przez 24 godziny, a jedną płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W razie potrzeby dostosuj punkty czasowe.</li>
	<li>Przemyć komórki w temperaturze pokojowej przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty, zasysanie supernatantu, wirowanie dna płytki z płytką pokrytą, a na koniec ponowne zawieszenie komórek za pomocą 200 μl lodowatego buforu i powtórzyć etap płukania jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać 95 μl buforu do pracy, a następnie 5 μl 7-aminoaktynomycyny D (7AAD) do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl/basenik. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl działającego buforu do probówek zbiorczych. Przenieść całą objętość zawiesiny komórek z każdej studzienki płytki do probówek zbiorczych i pobrać próbki na cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Określ procent komórek 7AAD-dodatnich za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Oznaczanie EC50
<ol>
	<li>Wartości EC50 WS-CM i nikotyny są określane przez barwienie PBMC z dodatnim wynikiem 7AAD.</li>
	<li>Wartość EC50 definiuje się jako stężenie, przy którym 50% komórek nie było już zdolnych do życia w 24-godzinnym teście, a wartości są wyrażone jako μg jednostek ekwitotynowych/ml.</li>
	<li>Na potrzeby tego badania wartości EC50 określono na 1,56 μg/ml i 1,650 μg/ml odpowiednio dla WS-CM i nikotyny.</li>
</ol>
6. Wydzielane cytokiny
UWAGA: Podane tutaj rozcieńczenia służą do celów tego badania. Rozcieńczenia można odpowiednio dostosować.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć WS-CM w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę przy stężeniu 0,3, 1,56, 3 i 5 μg/ml jednostek ekwitonikotyny.</li>
	<li>Rozcieńczyć nikotynę do stężeń: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 i 3000 μg/ml. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBMC zawieszonych w kompletnym pożywce RPMI do każdej studzienki w stężeniu 1 x 106 komórek/studzienkę. Całkowita objętość komórek plus WS-CM lub nikotyna wyniesie 200 μl/studzienkę.</li>
	<li>Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Umyć komórki w temperaturze pokojowej przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty, zasysanie supernatantu, wirowanie dna płytki z płytką pokrytą, a na koniec zawieszenie komórek z 200 μl lodowatego buforu i powtórzenie etapu przemywania jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać 200 μl kompletnego podłoża RPMI i powtórzyć etap prania jeszcze raz.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 200 μl pożywki o stężeniu 10 μg/ml LPS.</li>
	<li>Przykryć płytkę i inkubować przez 4 godziny, 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W razie potrzeby dostosuj czasy inkubacji.</li>
	<li>Odwirować płytkę o masie 300 × g przez 3 minuty.</li>
	<li>Pobrać 175 μl supernatantu z każdej studzienki i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu przeprowadzenia testów w krokach 7 i 8.</li>
</ol>
7. Test cytometryczny z matrycą kulek
<ol>
	<li>Rozmrozić supernatanty komórkowe przygotowane z kroku 6.10 i użyć w teście CBA. Wykonaj test cytometrycznej matrycy kulkowej (CBA) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
8. Test ELISA IL-8
<ol>
	<li>Rozmrozić supernatanty komórkowe z kroku 6.10 i użyć w teście IL-8 ELISA. Wykonaj test ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
9. Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa
UWAGA: Podane tutaj rozcieńczenia służą do celów tego badania. Rozcieńczenia można odpowiednio dostosować.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć WS-CM w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę przy stężeniu 0,3, 1,56, 3 i 5 μg/ml jednostek ekwitonikotyny.</li>
	<li>Na tej samej płytce rozcieńczyć nikotynę do następujących stężeń: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 i 4000 μg/ml. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBMC zawieszonych w kompletnym pożywce RPMI o stężeniu 1 ×10 6 komórek/basenik. Całkowita objętość komórek plus WS-CM lub nikotyna wyniesie 200 μl/studzienkę.</li>
	<li>Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przemyć komórki w temperaturze pokojowej przez odwirowanie w temperaturze 300 × g przez 3 minuty, zasysanie supernatantu, wirowanie dna płytki z płytką pokrytą, a na koniec ponowne zawieszenie komórek za pomocą 200 μl lodowatego buforu i powtórzyć etap mycia jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać 200 μl kompletnego podłoża RPMI na płytkę i powtórzyć etap mycia jeszcze raz.</li>
	<li>Przygotować stężenia robocze 2 μl/ml GolgiPlug i 10 μg/ml LPS przy użyciu kompletnego podłoża RPMI i dodać 200 μl do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Pod koniec kroku 9.8 przemyć komórki buforem (4 °C) i wirować w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 100 μl Cytofix do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy, jak opisano w kroku 9.9, za pomocą 1x Permwash (4 °C) w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 45 μl 1x Cytoperm do każdej studzienki, a następnie 5 μl każdego z następujących przeciwciał do każdej studzienki: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki dwa razy, jak opisano w kroku 9.9, 1x Permwash (4 °C) i jeden raz z buforem (4 °C) przy 300 x g przez 3 minuty w 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić komórki za pomocą 200 μl 2% paraformaldehydu (4 °C). Przenieś komórki do probówek o średnicy 12 × 75 mm i przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym. UWAGA: Paraformaldehyd jest, silnie toksyczny i stanowi zagrożenie dla zdrowia.</li>
</ol>
10. Test zabijania K562
UWAGA: Komórki K562 powinny być hodowane w kulturze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z kompletną pożywką RPMI, aż osiągną 80% konfluencji przed testem.
<ol>
	<li>Przygotować 5 mM roztwór podstawowy estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), dodając do fiolki 18 μl DMSO.</li>
	<li>Rozcieńczyć WS-CM lub nikotynę w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę, aby osiągnąć pożądane jednostki ekwitozyny lub stężenia nikotyny dla każdej studzienki. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBMC do kompletnej pożywki RPMI o stężeniu 1,5 x 106 komórek/dołek. Całkowita objętość komórek z WS-CM lub nikotyną wyniesie 200 μl/studzienkę.</li>
	<li>Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przemyć komórki K562 dodając 10 ml DPBS i odwirować przy 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml DPBS i policzyć komórki K562.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy CFSE, dodając 1 μl roztworu podstawowego CFSE do 1 ml DPBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu roboczego CFSE do 1 ml zawiesiny komórek K562 zawierającej 1-2 x10,7 komórek. Wirować i inkubować dokładnie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 200 μl FBS. Wirować i inkubować dokładnie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI i odwirować probówkę o sile 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant RPMI, rozbić osad i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml kompletnej pożywki RPMI i policzyć komórki K562 znakowane CFSE.</li>
	<li>Przemyć PBMC przez odwirowanie płytki o sile 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant przez dekantację cieczy. Załóż pokrywę i przekręć spód płyty. Dodać 200 μl pożywki RPMI complete i powtórzyć etap prania jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać komórki K562 znakowane CFSE w stosunku 1:15 (100 000 K562s: 1,5 x 106 PBMC) do każdej studzienki próbki na płytce PBMC i dalej inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przemyć mieszaninę komórek przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant odrzucając płyn. Załóż pokrywę i przekręć spód talerza.</li>
	<li>Dodać 200 μl bieżącego buforu i powtórzyć etap płukania opisany w kroku 10.14 jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać 95 μl buforu bieżącego, a następnie 5 μl 7AAD do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl/studzienkę. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu do każdej studzienki i przenieść całą objętość zawiesiny komórek z każdej studzienki płytki do probówek zbiorczych i pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Określ procent komórek 7AAD-dodatnich i CFSE za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22How+Tobacco+Smoke+Causes+Disease%3A+The+Biology+and+Behavioral+Basis+for+Smoking-Attributable+Disease%2C+A+Report+of+the+Surgeon+General%22">How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General</a>. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).</li>
<li>Zeller, M., Hatsukami, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strategic+Dialogue+on+Tobacco+Harm+Reduction%3A+a+vision+and+blueprint+for+action+in+the+US%5BTitle%5D)+AND+%22Tob.+Control%22%5BJournal%5D)">The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US.</a> Tob. Control. 18, 324-332 (2009).</li>
<li>Sopori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cigarette+smoke+on+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects of cigarette smoke on the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).</li>
<li>Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tobacco-smoke+on+key+signaling+pathways+in+the+innate+immune+response+in+lung+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages.</a> J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).</li>
<li>Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+inhibits+lipopolysaccharide-induced+production+of+inflammatory+cytokines+by+suppressing+the+activation+of+activator+protein-1+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells.</a> J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).</li>
<li>Moodie, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+cigarette+smoke+alter+chromatin+remodeling+but+differentially+regulate+NF-kappaB+activation+and+proinflammatory+cytokine+release+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells.</a> Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).</li>
<li>Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+induces+IL-8%2C+but+inhibits+eotaxin+and+RANTES+release+from+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle.</a> Respir. Res. 6, 74(2005).</li>
<li>Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+coordinate+activation+of+HSF+and+inhibition+of+NFkappaB+in+human+monocytes%3A+effects+on+TNFalpha+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).</li>
<li>Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+alveolar+type+II+epithelial+cell+chemokine+release%3A+effects+of+cigarette+smoke+and+neutrophil+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).</li>
<li>Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+and+nicotine+product+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nicotine+Tob.+Res%22%5BJournal%5D)">Tobacco and nicotine product testing.</a> Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).</li>
<li>Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Regulatory+Science%3A+Research+to+Inform+Regulatory+Action+at+the+Food+and+Drug+Administration%27s+Center+for+Tobacco+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Nicotine+Tob.+Res%22%5BJournal%5D)">Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products.</a> Nicotine Tob. Res. , (2014).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+of+different+tobacco+product+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).</li>
<li>Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cell-specific+cytotoxic+responses+of+oral+cavity+cells+to+tobacco+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations.</a> Toxicol In Vitro. , (2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combustible+and+non-combustible+tobacco+product+preparations+differentially+regulate+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li>
<li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li>
<li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

My i inni wykazaliśmy wcześniej, że leczenie PBMC TPP hamuje kilka reakcji, w tym ekspresję i wydzielanie cytokin oraz środki funkcjonalne, takie jak zabijanie komórek docelowych14. Metody eksperymentalne opisane w poprzedniej pracy wymagają dłuższych okresów inkubacji i były skromne pod względemwielkości 14. Biorąc pod uwagę potencjalne zastosowania tego atrakcyjnego modelu ex vivo do badań podstawowych i stosowanych, zbadaliśmy, czy którykolwiek z parametrów testowych w tych wieloetapowyc...

Znaczna ilość wiedzy wskazuje na niekorzystne skutki zdrowotne przewlekłego palenia papierosów, w tym choroby układu krążenia (CVD), przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP) i raka1,2. Wiadomo, że przewlekłe palenie papierosów powoduje stan zapalny i supresję immunologiczną, a zmiany te przyczyniają się do zwiększonego ryzyka infekcji bakteryjnych i raka u palaczy3. Techniki in vitro i ex vivo są przydatne w wyjaśnianiu molekularnych podstaw patofizjologicznych skutków dymu papierosowego4-9 (Tabela 1) i są uznawane za ważne narzędzia do kierowania pojawiającymi się regulacjami dotyczącymi różnych wyrobów tytoniowych10,11.
Na przykład, wykazaliśmy, że preparaty palnych wyrobów tytoniowych (TPP), takie jak całe medium kondycjonowane dymem (WS-CM) i całkowita ilość cząstek stałych (TPM) są znacznie bardziej cytotoksyczne i szkodliwe dla DNA niż niepalne TPP lub nikotyna12,13. Zgodnie z opublikowaną pracą, niedawno doniesiono, że palne TPP lub nikotyna12,13. Zgodnie z opublikowaną pracą, niedawno informowaliśmy, że palne TPP powodowały wyraźną immunosupresję. Zostało to udowodnione przez supresję ligandów receptora Toll-podobnego (TLR), stymulowanie wydzielania cytokin i celowane zabijanie komórek (K562) przez PBMC w modelu ex vivo 14. Biorąc pod uwagę znaczenie stanu zapalnego w procesach chorobowych wywołanych dymem papierosowym, w niniejszym raporcie przedstawiono dalszą optymalizację warunków testowych w celu oceny immunomodulacyjnego wpływu dymu papierosowego.
Testy ex vivo zazwyczaj mierzyły wewnątrzkomórkowe i wydzielane cytokiny, a także cytolityczną funkcję cytotoksycznych komórek T i NK w testach zabijania komórek K56214. Testy obejmowały wstępną inkubację z WS-CM i nikotyną, a następnie stymulację PBMC agonistami TLR przez okres 3 dni; końcowe odczyty wykonuje się za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA) i/lub cytometrii przepływowej. Wykorzystano lipopolisacharyd bakteryjny (LPS), który wiąże się z receptorami TLR-4 i stymuluje PBMC, powodując produkcję cytokin wewnątrzkomórkowych i wydzielanie cytokin. Oprócz optymalizacji różnych etapów testów do oceny efektów immunomodulacyjnych TPP, przedstawiamy również metody izolacji PBMC, testów śmierci komórkowej i kwantyfikacji IL-8. Metody te mogą być stosowane w celu odpowiedzi na inne pytania badawcze i dalej udoskonalane w celu oceny wyrobów tytoniowych w kontekście regulacyjnym.
Tabela 1. Opublikowane doniesienia z badań nad metodami in vitro i ex vivo stosowanymi do badania patofizjologicznego działania preparatów wyrobów tytoniowych na varilus. CS, medium do dymu papierosowego; CSC, kondensat dymu papierosowego; CSE, ekstrakt dymu papierosowego; ELISA, test immunoenzymatyczny immunoenzymatyczny; GADPH, dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego; qPCR, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy; RT, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym; TS, dym tytoniowy.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autor (rok studiów)</td>
			<td>Laan i in. (2004)</td>
			<td>Moodie i in. (2004)</td>
			<td>Oltmanns i in. (2005)</td>
			<td>Vayssier (1998)</td>
			<td>Witherden i in. (2004)</td>
			<td>Birrell i in. (2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Użyte ogniwa</td>
			<td>Ludzkie komórki śródbłonka oskrzeli (BEAS-2B), ludzkie neutrofile</td>
			<td>Ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych (A549)</td>
			<td>Ludzkie komórki mięśni gładkich dróg oddechowych (HASMC)</td>
			<td>Ludzkie komórki premonocytarne U937, ludzkie monocyty</td>
			<td>Komórki nabłonkowe pęcherzyków płucnych typu II (ATII)</td>
			<td>Ludzka monocytowa linia komórkowa (THP-1), ludzkie makrofagi płucne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Używany TPP</td>
			<td>Cse</td>
			<td>Csc</td>
			<td>Cse</td>
			<td>Ts</td>
			<td>Cse</td>
			<td>Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zastosowana metoda</td>
			<td>ELISA, qPCR, migracja, zmiana elektromobilności</td>
			<td>Immunohistochemia, elektroforeza, zestaw do skanowania, RT-PCR, ELISA</td>
			<td>ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforeza</td>
			<td>Zmiana mobilności żelu</td>
			<td>Mikroskopia świetlna, mikroskopia elektronowa, elektroforeza, ELISA</td>
			<td>qPCR, ELISA, zestaw E-toxate (Sigma), test płytki p65 (TransAM), elektroforeza, różne zestawy do testów immunologicznych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miara</td>
			<td>IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, migracja</td>
			<td>Acetylotransferazy histonowe, deacetylazy histonowe, NF-κB, IL-8, p-I κB-α, GADPH</td>
			<td>HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaksyna</td>
			<td>Białka szoku cieplnego/stresu (HSP/Hsp70), czynnik transkrypcyjny HF, NF-κB, TNF-α</td>
			<td>Białko powierzchniowo czynne (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ</td>
			<td>IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, fosforylacja MAPK/JNK/ERK, wiązanie cJUN:DNA, glutation, p65:wiązanie DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Efekt końcowy</td>
			<td>CSE obniża produkcję cytokin poprzez supresję aktywacji AP-1.</td>
			<td>H2O2i CSC zwiększają acetylację białek histonowych, zmniejszają aktywność deacetylazy histonowej, różnicowo regulują uwalnianie cytokin prozapalnych.</td>
			<td>Dym papierosowy może powodować uwalnianie IL-8 z HASMC, wzmocnione przez TNF-α, 20% CSE mniej uwalniania IL-8, hamowanie eotaksyny i RANTES przez dym papierosowy.</td>
			<td>Czynnik transkrypcyjny HF aktywowany przez TS, który był związany z nadekspresją Hsp70 i hamowaniem aktywności wiązania NFkB oraz uwalnianiem TNF-α.</td>
			<td>Obniżony poziom chemokiny pochodzącej z komórek ATII upośledza naprawę pęcherzyków płucnych, przyczyniając się do uszkodzenia pęcherzyków płucnych wywołanego dymem papierosowym i rozedmy płuc.</td>
			<td>Dane dostarczają mechanistycznego wyjaśnienia, dlaczego palacze mają zwiększoną liczbę infekcji dróg oddechowych. Tłumieniu odpowiedzi wrodzonej towarzyszy wzrost IL-8.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<table><tbody><tr><td>Probówki 12 x 75 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F papierosy referencyjne</td><td>Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>butelka</td> <td>500 mlCorning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płaska płyta dolna</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe okrągłe płytki denne</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sondy molekularne Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Probówki klastrowe</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>Szkodliwy po połknięciu, rakotwórczy</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek )</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Software analizuje dane CBA</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 kolorów, przy Ex 405 i Em 785.</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 kolory w Ex 495 i Em 785.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Zawiera DMSO, drażniący</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Rakotwórczy, drażniący,</td></tr> <tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw</td> <td>ludzkich cytokin zapalnychBD Nauki biologiczne</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma; V-500 Przeciwciało</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>Działacz uczulający na skórę</td></tr><tr><td>IL-8 Zestaw ELISA Systemy</td><td>R i D</td><td>Bufor izolacyjny DY208</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>Łatwopalna ciecz, drażniąca</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&alpha; Przeciwciało PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>Ostra toksyczność, doustnie</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nikotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Ostra toksyczność, zagrożenie dla środowiska</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>" M"</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Łatwopalny, drażniący skórę</td></tr><tr><td>Pióro/paciorkowiec</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do biegania</td><td>MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa; Przeciwciało Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Wśród innych zmian patofizjologicznych, przewlekłe narażenie na dym papierosowy powoduje stan zapalny i tłumienie odporności, co wiąże się ze zwiększoną podatnością palaczy na infekcje mikrobiologiczne i występowanie nowotworów. Supresja ex vivo odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem receptorów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) traktowanych składnikami dymu jest atrakcyjnym podejściem do badania mechanizmów i oceny prawdopodobnych długoterminowych skutków narażenia na wyroby tytoniowe. W tym miejscu zoptymalizowaliśmy metody wykonywania testów ex vivo przy użyciu PBMC stymulowanych przez bakteryjny lipopolisacharyd, ligand receptora Toll-podobnego-4. Badano wpływ pożywki kondycjonowanej dymem (WS-CM), preparatu palnego wyrobu tytoniowego (TPP) i nikotyny na wydzielanie cytokin i zabijanie komórek docelowych przez PBMC w testach ex vivo. Pokazujemy, że wydzielane cytokiny IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 i IL-8 oraz cytokiny wewnątrzkomórkowe IFN-γ, TNF-α i MIP-1α były tłumione w PBMC narażonych na WS-CM. Funkcja cytolityczna efektorowych PBMC, określona za pomocą testu zabijania komórek docelowych K562, została również zmniejszona przez ekspozycję na WS-CM; Nikotyna była minimalnie skuteczna w tych testach. Podsumowując, przedstawiamy zestaw ulepszonych testów do oceny skutków TPP w testach ex vivo, a metody te można łatwo zaadaptować do testowania innych interesujących produktów.

Wyniki przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (cztery próbki od dawców). Test t-Studenta pomiędzy próbkami traktowanymi a nie traktowanymi próbkami kontrolnymi przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Excel, a także przeprowadzono porównania testem t dla wszystkich traktowań z odpowiadającymi im kontrolami. Istotność statystyczną oznaczono jako: *, P &lt; 0.05; **, P &lt; 0.005; ***, P &lt; 0.0005.
Aby zmierzyć wpływ ekspozycji na WS-CM i nikotynę, PBMC traktowano różnymi stęż...

Korzystając z zoptymalizowanych testów ex vivo ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), wykazaliśmy, że preparat palnego wyrobu tytoniowego wyraźnie hamuje wewnątrzkomórkowo wydzielane cytokiny za pośrednictwem receptorów i cytolityczną zdolność efektorowych PBMC. Te szybkie testy mogą być przydatne w ocenie produktu i zrozumieniu potencjalnych długoterminowych skutków narażenia na palenie tytoniu.

Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena wpływu preparatów produktów tytoniowych na sekrecję cytokin oraz zabijanie komórek docelowych przez PBMC. Jest to realizowane poprzez wstępne traktowanie hodowanych PBMC medium warunkowanym dymem tytoniowym, medium kontrolnym lub nikotyną, a następnie przeprowadzenie barwienia wewnątrzkomórkowego potraktowanych PBMC w celu określenia produkcji cytokin. Alternatywnie, komórki K 5 62 znakowane CFSE są współhodowane z efektorowymi komórkami PBMC traktowanymi medium warunkowanym dymem tytoniowym, a żywotność komórek K 5 62 jest oceniana za pomocą barwienia 7-AAD.Ostatecznie wpływ preparatów produktów tytoniowych do palenia na komórki PBMC z obu testów jest mierzony za pomocą cytometrii przepływowej. Głównymi zaletami naszych technik w stosunku do istniejących metod, takich jak test uwalniania chromu czy ALI spot, jest to, że nasze metody charakteryzują się wysoką przepustowością, nie wykorzystują izotopów promieniotwórczych i pozwalają na pomiar funkcjonalności komórek. Metoda ta może zatem dostarczyć informacji na temat biologicznych efektów działania preparatów produktów tytoniowych.Metodę tę można również zastosować do oceny innych związków wpływających na funkcje receptorów Toll-podobnych oraz STIC komórek efektorowych PBMC. Przed rozpoczęciem procedury barwienia należy rozcieńczyć warunki ekspozycji na dym, medium oraz nikotynę w wymienionych stężeniach w pełnym medium RPMI do całkowitej objętości 100 µL na dołek w płytce 96-dołkowej.Następnie dodać 100 µL P BMCs zawieszonych w pożywce kompletnej w stężeniu 1 × 10⁶ komórek na dołek, tak aby całkowita objętość wyniosła 200 µL na dołek. Następnie przykryć płytkę i inkubować ją w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po trzech godzinach przemyć komórki i odessać nadsącz.Następnie ponownie przykryj płytkę i wymieszaj ją w wirówce typu vortex, aby rozbić osady. Przemyj komórki jeszcze dwa razy: raz w lodowatym buforze do płukania, a po drugim płukaniu w pożywce kompletnej. Inkubuj je przez sześć godzin w temperaturze 37°C i 5%CO2 w 200 µL na dołek pożywki kompletnej uzupełnionej o Golgi plug oraz LPS.Następnie komórki należy przemyć lodowatym buforem do płukania, a po 20 minutach w temperaturze 4 °C potraktować 100 µL cyto fix na dołek, a następnie trzykrotnie przemyć komórki lodowatym roztworem perm wash. Następnie do każdego dołka należy dodać 45 µL cyto perm, a następnie po 5 µL każdego z wymienionych przeciwciał. Po 30 minutach w temperaturze 4 °C komórki należy przemyć trzykrotnie i utrwalić w 200 µL lodowatego, 2%paraformaldehydu.Następnie przenieś komórki do probówek 12 × 75 mm i przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego. Po przygotowaniu płytki z PBMC traktowanymi wyrobami tytoniowymi, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, przemyj kulturę komórek K 5 62, zebranych przy 80% konfluencji, w 10 ml DPBS. Resuspenduj osad w 5 ml DPBS i dokonaj zliczenia komórek.Następnie dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu roboczego CFSE do 1–2 × 10⁷ komórek K 5 62 w jednym mililitrze pożywki kompletnej i wymieszaj barwnik z komórkami za pomocą wirówka typu vortex. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej; po dokładnie dwóch minutach dodaj 200 µL FBS i ponownie wymieszaj komórki w vortexie, inkubując je przez kolejne dwie minuty. Po drugiej inkubacji przemyj komórki w 10 ml pożywki kompletnej, następnie resuspenduj osad w kolejnych 10 ml pożywki kompletnej i dokonaj zliczenia komórek.Następnie odwiruj p BMCs traktowane tytoniem i odlej nadsącz. Po zamknięciu pokrywy resuspenduj komórki za pomocą wirówki laboratoryjnej i przemyj je 200 µL kompletnej pożywki na dołek. Aby rozpocząć test zabijania, dodaj komórki K 5 62 znakowane CFSE do pbmc w stosunku 1:15 i inkubuj kokulturę w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Po pięciu godzinach odwirować komórki i odrzucić nadsącz. Resuspender osad za pomocą vortexa, a następnie przemyć komórki 200 µl buforu do elektroforezy na każdą studzienkę, po czym dodać 95 µl buforu do elektroforezy oraz pięć µl siedmiu A a d, aby uzyskać objętość całkowitą 100 µl na studzienkę. Na koniec inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie do każdej studzienki należy dodać 100 µL buforu do elektroforezy i przenieść całą objętość do odpowiednich probówek FACS w celu oznaczenia procentowej zawartości komórek pozytywnych pod kątem 7-AAD i CFSE. Analiza cytometryczna wykazała zależny od dawki wzrost śmiertelności komórek w pożywce kondycjonowanej pełnym dymem po 24 godzinach, przy czym blisko 80% komórek obumarło przy stężeniu 4 µg/mL ekwiwalentów nikotyny. Jednakże inkubacja PBMC przez zaledwie trzy godziny nie skutkuje znaczącą toksycznością, nawet przy stężeniu 5 µg/mL ekwiwalentów nikotyny w pożywce kondycjonowanej pełnym dymem po 24 godzinach.Porównywalny stopień śmierci komórek nie jest odnotowywany przed traktowaniem nikotyną w stężeniu 3000 µg/mL przez trzy godziny; traktowanie nikotyną nie powoduje mierzalnej śmierci komórek przed zastosowaniem stężenia 2000 µg/mL. W warunkach ekspozycji na medium z dymem tytoniowym oraz nikotynę, po stymulacji receptora TLR4 za pomocą LPS, następuje zależny od dawki spadek wydzielanych cytokin, choć stopień supresji różni się w zależności od konkretnej cytokiny. Ponadto, gdy komórki są traktowane jednocześnie LPS oraz Golgiplug przez zaledwie sześć godzin, po ekspozycji na medium z dymem tytoniowym obserwuje się spadek liczby komórek wykazujących pozytywną ekspresję wewnątrzkomórkowych cytokin, nawet przy niższych, równoważnych stężeniach nikotyny w porównaniu z ekspozycją na samą nikotynę.Rzeczywiście, wyniki tego testu cytotoksyczności wykazują, że ekspozycja na 1,56 µg/mL medium z warunkami dymu papierosowego znacząco obniża zdolność zabijania populacji efektorowych PBMC w porównaniu z kontrolą oraz niższymi stężeniami dawek. Tymczasem traktowanie nikotyną, zarówno w wysokich, jak i niskich stężeniach, nie wpływa na zdolność zabijania populacji efektorowych PBMC. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby zachować precyzję w znakowaniu CFSE, a także w rozcieńczeniach przeciwciał, czasie znakowania i temperaturach inkubacji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania technik znakowania przeciwciałami w cytometrii przepływowej w celu określenia wpływu preparatów wyrobów tytoniowych lub innych metod leczenia na mononuklearne komórki krwi obwodowej.

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów wyrobów tytoniowych podlegających spalaniu

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Ten film pokazuje wpływ preparatów wyrobów tytoniowych, TPP, na produkcję cytokin z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej. Leczenie komórek TPP obniża produkcję cytokin prozapalnych, którą szacuje się po stymulacji lipopolisacharydami, a następnie barwieniu immunologicznym i analizie cytometrii przepływowej.

Analiza wpływu preparatów wyrobów tytoniowych na produkcję cytokin za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej

W tym filmie badamy wpływ całego medium kondycjonowanego dymem, preparatu palnego tytoniu, na zabijanie komórek K562 przez efektorowe komórki jednojądrzaste krwi obwodowej.

Zabijanie komórek K562 przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej wystawione na działanie preparatów wyrobów tytoniowych

Ten film ilustruje technikę oceny cytotoksyczności w precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinkach płuc za pomocą testu WST-1. Precyzyjnie pokrojone ludzkie plastry płuc są poddawane stopniowym stężeniom cytotoksycznej substancji chemicznej w celu ilościowego określenia ich cytotoksyczności. Spadek intensywności koloru służy jako potwierdzenie szkodliwego wpływu substancji chemicznej na komórki płuc.

Test do pomiaru chemicznie indukowanej cytotoksyczności w precyzyjnie pokrojonych ludzkich wycinkach płuc

Celem tego protokołu jest wystawienie ludzkich organotypowych 3D modeli tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt dymu papierosowego (CS) na granicy powietrze-ciecz. Wpływ CS na tkanki jest następnie badany za pomocą testu aktywności cytochromu P450, pomiaru bicia rzęsek i podejścia opartego na biologii systemowej.

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Celem badania była ocena biologicznego wpływu 15 składników dymu papierosowego przy użyciu kombinacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji i platformy opartej na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do oceny toksykologicznej in vitro. Badanie to dostarcza informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i sposobów działania badanych związków.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Ten protokół opisuje metodę wystawiania gryzoni na działanie oparów papierosów elektronicznych (E-vapor) i dymu papierosowego. Komory ekspozycyjne są konstruowane poprzez modyfikację komór anestezjologicznych za pomocą zautomatyzowanego systemu pompowania, który dostarcza gryzoniom parę E lub dym papierosowy. System ten można łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić wiele eksperymentalnych punktów końcowych.

Porównanie wpływu oparów papierosów elektronicznych i dymu papierosowego w nowatorskim systemie ekspozycji in vivo

Tutaj opisujemy programowalne urządzenie laboratoryjne, które może być używane do tworzenia ekstraktów konwencjonalnego dymu papierosowego i aerozolu z papierosów elektronicznych. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do bezpośrednich porównań między tradycyjnymi papierosami a papierosami elektronicznymi i stanowi przystępny punkt wyjścia do badań nad papierosami elektronicznymi.

Sterowane mikrokontrolerem urządzenie do wytwarzania płynnych ekstraktów z konwencjonalnego dymu papierosowego i aerozolu z papierosów elektronicznych

Z punktu widzenia zasady 3R, modele oddechowe jako alternatywa dla badań na zwierzętach ewoluują. Zwłaszcza w odniesieniu do oceny ryzyka związanego z substancjami oddechowymi brakuje odpowiednich testów. W tym miejscu opisujemy zastosowanie precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc do oceny substancji unoszących się w powietrzu.

Ocena cytotoksycznego i immunomodulującego działania substancji w precyzyjnie pokrojonych ludzkich wycinkach płuc

Na całym świecie rośnie liczba użytkowników elektronicznych papierosów (e-papierosów). Niewiele jednak wiadomo na temat skutków zdrowotnych wywoływanych przez wdychane aerozole do e-papierosów. W tym artykule opisano technikę wytwarzania aerozolu w e-papierosach odpowiednią do narażenia zwierząt i późniejszych badań toksykologicznych. Takie protokoły są wymagane do ustanowienia eksperymentalnie odtwarzalnych i znormalizowanych systemów ekspozycji na e-papierosy.

Wytwarzanie aerozolu z papierosów elektronicznych przez urządzenie do waporyzacji maszynowej trzeciej generacji: zastosowanie do badań toksykologicznych

Ustanawiamy ustandaryzowany model in vitro do badania ekspozycji na opary konopi na granicy powietrza i cieczy. Model ten zapewnia systematyczne podejście do badania wpływu waporyzowanej marihuany, odpowiadając na rosnące zainteresowanie waporyzatorami z konopi indyjskich jako alternatywą dla palenia.

Metody in vitro Narażenie komórek nabłonka płuc na działanie konopi indyjskich na granicy faz powietrze-ciecz

Poznaj metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych przy użyciu komórek PBMC. Techniki cytometrii przepływowej pozwalają mierzyć produkcję cytokin oraz zdolność cytotoksyczną komórek efektorowych.

Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Przeglądaj więcej filmów