Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wpływu preparatu wyrobu tytoniowego na wydzielanie cytokin i zabijanie komórek docelowych przez P BMC. Osiąga się to poprzez najpierw traktowanie hodowanych P BMC całym stanem dymu, pożywką lub nikotyną, a następnie przeprowadza się barwienie wewnątrzkomórkowe traktowanych p BMC w celu określenia ich produkcji cytokin. Alternatywnie, komórki K 5 62 znakowane CFSE są hodowane wspólnie z komórkami efektorowymi PBMC traktowanymi w całości pod wpływem dymu, a żywotność komórek K 5 62 jest określana przez barwienie siedmioma A a d.

Ostatecznie, wpływ palnych preparatów wyrobów tytoniowych na P BMC z obu testów mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej. Głównymi zaletami naszych technik lub istniejących metod, takich jak test uwalniania chromu lub plamka ALI, jest to, że nasze metody są wysokoprzepustowe, nieradioaktywne i możemy zmierzyć funkcjonalność ogniwa. Chociaż ta metoda może dostarczyć informacji na temat biologicznych skutków preparatów wyrobów tytoniowych.

Może być również stosowany do oceny innych związków, które wpływają na funkcje komórek efektorowych PBMC, w których pośredniczy receptor tolike, i STIC przed rozpoczęciem procedury barwienia. Rozcieńczyć całe palenie, pożywkę i nikotynę w podanych stężeniach. W RPMI kompletne podłoże do całkowitej objętości 100 mikrolitrów na studzienkę w płytce 96-dołkowej.

Następnie dodać 100 mikrolitrów P BMC, zawieszonych w kompletnym podłożu o stężeniu jeden razy 10 do sześciu komórek na studzienkę, co daje całkowitą objętość 200 mikrolitrów na studzienkę. Następnie przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po trzech godzinach umyj komórki i odessaj supernatant.

Następnie ponownie przykryj płytkę i zwiruj ją, aby oddzielić granulki. Umyj komórki jeszcze dwa razy, raz w lodowatym buforze i raz w pełnym podłożu po drugim płukaniu. Potraktuj je 200 mikrolitrami na studzienkę kompletnego podłoża uzupełnionego korkiem Golgiego i LPS przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Następnie umyj komórki lodowatym buforem i potraktuj je 100 mikrolitrami cyto fix na studzienkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza po 20 minutach, umyj komórki trzykrotnie lodowatym płynem do trwałej ondulacji. Następnie dodaj 45 mikrolitrów cyto perm do każdej studzienki, a następnie pięć mikrolitrów każdego z wymienionych przeciwciał. Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki trzykrotnie i utrwal je w 200 mikrolitrach lodowatego 2% para formaldehydu.

Następnie przenieś komórki do probówek o wymiarach 12 na 75 milimetrów i przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym. Po przygotowaniu płytki z wyrobem tytoniowym potraktowanym pbmc, jak właśnie pokazano, umyj kulturę komórek K 5 62, zebranych z 80% płynnością co w 10 mililitrach DPBS. Resus. Zawieś osad w pięciu mililitrach DPBS i policz komórki.

Następnie dodać jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu roboczego CFSE do jednego do dwóch razy 10 do siódmych komórek K 5 62 w jednym mililitrze kompletnego podłoża i rozproszyć plamę komórkową przez wirowanie. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej dokładnie po dwóch minutach, dodaj 200 mikrolitrów FBS i ponownie wiruj komórki, inkubując je przez kolejne dwie minuty. Po drugiej inkubacji umyj komórki w 10 mililitrach kompletnej pożywki, a następnie ponownie zawieś osad w kolejnych 10 mililitrach kompletnej pożywki i policz komórki.

Teraz odwirować b BMC poddane obróbce tytoniu i zdekantować supernatant. Następnie załóż pokrywę, ponownie zawieś komórki przez wirowanie i umyj je w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża na studzienkę. Aby rozpocząć test zabijania, dodaj komórki K 5 62 znakowane CFSE do pbmc w stosunku jeden do 15 i inkubuj kokulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Po pięciu godzinach odwirować komórki i wyrzucić supernatant. Zawiesić granulki przez wirowanie, a następnie umyć komórki 200 mikrolitrami buforu do pracy na studzienkę, a następnie dodać 95 mikrolitrów buforu do pracy, a następnie pięć mikrolitrów po siedem A a d, co daje całkowitą objętość 100 mikrolitrów na studzienkę. Na koniec inkubuj komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do każdej studzienki i przenieś całą objętość do odpowiednich odpowiednich lamp faksowych, aby określić procent siedmiu komórek dodatnich a, a d i CFSE. Za pomocą analizy cytometrii przepływowej obserwuje się zależny od dawki wzrost śmierci komórek przy całym pożywce kondycjonowanej dymem po 24 godzinach, przy czym prawie 80% komórek jest martwych przy czterech mikrogramach na mililitr jednostek nikotyny. Jednak traktowanie p BMC tylko przez trzy godziny nie powoduje znaczącej toksyczności nawet przy pięciu mikrogramach na mililitr jednostek nikotyny equin w całym środowisku kondycjonowanym dymem po 24 godzinach.

Porównywalny stopień śmierci komórki nie jest odnotowywany przed leczeniem 3000 mikrogramów na mililitr nikotyny po trzech godzinach, leczenie nikotyną nie powoduje mierzalnej śmierci komórki przed leczeniem stężeniem 2000 mikrogramów na mililitr w stanie pełnego dymu, pożywki i nikotyny, a następnie stymulacja receptora TLR cztery przez LPS powoduje zależny od dawki spadek wydzielanych cytokin. Chociaż stopień supresji różni się w zależności od poszczególnych cytokin. Ponadto, gdy komórki są leczone LPS i zatyczką Golgiego tylko przez sześć godzin, obserwuje się zmniejszenie liczby wewnątrzkomórkowych komórek dodatnich cytokin po ekspozycji na całe podłoże dymologiczne, nawet przy niższych stężeniach jednostek nikotyny w porównaniu z ekspozycją na nikotynę.

Rzeczywiście, wyniki tego testu zabijania ilustrują, że narażenie na 1,56 mikrograma na mililitr całego podłoża dymu znacznie zmniejsza zdolność zabijania populacji efektorowego PBMC w porównaniu z kontrolą i niższymi stężeniami dawki. Natomiast leczenie nikotyną w wysokich lub niskich stężeniach nie wpływa na zdolność zabijania populacji efektorowego PBMC podczas prób tych procedur. Ważne jest, aby być precyzyjnym w znakowaniu CFSE, a także w oznaczaniu rozcieńczeń przeciwciał, czasu i temperatur inkubacji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać techniki znakowania przeciwciał w cytometrii przepływowej w celu określenia wpływu preparatów wyrobów tytoniowych lub innych metod leczenia na komórki jednojądrzaste krwi obwodowej.