Name: Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu neurotoksyn Clostridial na przekaźnictwo synaptyczne w kulturach neuronów pochodzących z mysich komórek macierzystych. Technika ta umożliwia badanie patofizjologii botulizmu i tężca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (numer IAA AOD12058-0001-0000) oraz Defense Threat Reduction Agency - Joint Science and Technology Office, Medical S&T Division (numery grantów CBM. THRTOX.01.10.RC.023 oraz CBM. THRTOX.01.RC.014). Badania te zostały przeprowadzone w czasie, gdy P.B. posiadał nagrodę Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Research Associateship Award, a K.H. posiadał nagrodę National Research Council Research Associateship Award. Dziękujemy Angeli Adkins i Kaylie Tuznik (USAMRICD) za pomoc techniczną; oraz Cindy Kronman (USAMRICD) za pomoc redakcyjną. Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autorów i nie odzwierciedlają oficjalnej polityki Departamentu Armii, Departamentu Obrony ani rządu USA.

1. Adaptacja ESC do bezkomórkowej hodowli zawiesinowej
<ol>
	<li>Rozmrażać ESC w temperaturze 37 °C, aż pozostanie odłamek lodu.</li>
	<li>Używając pipety P1000, delikatnie przenieś 1 - 2,5 x 106 zdysocjowanych ESC do naczynia niepoddanego hodowli tkankowej, zawierającego 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki ESC. Inkubować w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 20 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po 20 godzinach przemyć komórki, delikatnie przenosząc kulturę zawiesiny do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. ESC na pelety przez 3 min przy 200 x g. Podczas wirowania dodaj 10 ml świeżej pożywki ESC z powrotem do naczynia o niskiej przyczepności.</li>
	<li>Odessać supernatant, uważając, aby nie przemieścić się osadu komórkowego, i dodać 1 ml świeżej pożywki ESC do osadu komórkowego. Przenieś komórki do naczynia bakteryjnego za pomocą pipety P1000 i wróć do inkubatora.</li>
	<li>Obserwuj komórki codziennie, aż agregaty staną się widoczne gołym okiem (zwykle 4 - 8 dni (d); agregaty będą miały 0,2 - 0,5 mm). Jeżeli agregaty nie są widoczne po 4 dniach, należy powtórzyć krok 1.3. Gdy agregaty są widoczne, należy oddzielić i utrzymać ESC zgodnie z opisem w sekcji 2.</li>
</ol>
2. Przekazywanie i konserwacja ESC
<ol>
	<li>Przenieść agregaty ESC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml i pozostawić kruszywa do postaci zwartego osadu (zwykle 3 - 5 minut). Odessać supernatant, uważając, aby nie uszkodzić osadu komórkowego, a następnie przepłukać kruszywa 5 ml PBS. Chociaż zaleca się osiadanie grawitacyjne, alternatywnie zamiast tego granuluj komórki o gramaturze 100 x g przez 2,5 minuty, aby zaoszczędzić czas.</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować agregaty w trypsynie przez 3 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 500 μl pożywki ESC w celu rozcieńczenia trypsyny i delikatnie rozcierać 10 razy pipetą P1000 w celu rozdrobnienia agregatów. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zdeocjowane komórki osadzać przez 3 minuty przy 200 x g i ponownie zawiesić komórki do końcowego stężenia 1,0 x 107 komórek/ml w pożywce ESC. Przenieść 150 μl (1,5 x 106 komórek) do 10 ml świeżej pożywki ESC w naczyniu bakteryjnym o średnicy 10 cm i wrócić do inkubatora do hodowli tkankowych na 48 godzin. Nadmiar ESC można różnicować, kriokonserwować w stężeniu 1 - 5 x 106 komórek/ml w 90% pożywce ESC uzupełnionej 10% DMSO lub wyrzucić.</li>
	<li>Agregaty przejazdowe co 48 godzin. Kruszywa gotowe do przeładunku będą dobrze widoczne, o średnicach przekraczających 0,5 mm. 
	UWAGA: Rozmrażanie i hodowla kriokonserwowanych, przystosowanych do zawiesiny komórek odbywa się zgodnie z krokami 1,2 - 1,4. Agregaty będą gotowe do przejazdu w ciągu 48 - 72 godzin.</li>
</ol>
3. Różnicowanie neuronalne
UWAGA: Wykonaj kroki 3.1 - 3.5 przed południem i krok 3.7 po południu. Przegląd procedur różnicowania przedstawiono na rysunku 1A.
<ol>
	<li>Oddziel ESC jak w krokach 2.1 - 2.5. Przenieść 350 μl (3,5 x 106) zdysocjowanych ESC do 10-centymetrowego naczynia o niskim stopniu przylegania, zawierającego 25 ml pożywki różnicującej. Umieścić na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30 - 45 obr./min w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Jest to pierwszy dzień różnicowania, określany jako dzień in vitro (DIV) -8, 
	UWAGA: Użycie szalki o bardzo niskim nasadce zwiększa koszt metody, ale daje nieco większe plony niż bakteryjne szalki Petriego, ponieważ agregaty mogą czasami przylegać do szalek Petriego. Jeśli preferowane są różne rozmiary naczyń, średnie objętości i numery komórek mogą być odpowiednio skalowane.</li>
	<li>Po 48 godzinach (DIV -6) za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieść agregacje komórek różnicujących się do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Natychmiast dodać świeże 25 ml pożywki różnicującej do szalki Petriego.</li>
	<li>Pozwól kruszywu osiąść przez 2 - 5 minut, wytwarzając widoczną granulkę o głębokości 1 - 2 mm. Zignoruj pojedyncze komórki lub małe agregaty pozostające w zawiesinie. Ostrożnie odessać pożywkę i przenieść osad komórkowy z powrotem na szalkę Petriego za pomocą P1000. Umieścić na wytrząsarce obrotowej w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Przy DIV -4 powtórz krok 3.2. Pellet będzie miał głębokość 2 - 4 mm. Zastąp 30 ml pożywki różnicującej uzupełnionej 6 μM kwasem all-trans-retinowym (RA) na płytkę Petriego. Wróć do wytrząsarki obrotowej w inkubatorze do hodowli tkankowych na dodatkowe 48 godzin.</li>
	<li>Przy DIV -2 powtórz krok 3.3. W tym momencie śrut będzie miał głębokość 4 - 8 mm.</li>
	<li>W DIV -1 przygotować powierzchnie galwaniczne jak w sekcji 4.</li>
	<li>W DIV 0 rozmrozić 5 ml wstępnie zamrożonej pożywki do trypsynizacji NPC w temperaturze 37 °C przez 5 - 10 minut i umieścić w kapturze do hodowli tkankowych. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieść kruszywo różnicujące do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Pozwól, aby agregaty opadły i ostrożnie zassaj podłoże. Przemyć granulat dwukrotnie 10 ml PBS, pozwalając kruszywu osiąść między praniami.</li>
	<li>Po drugim przemyciu PBS dodać do osadu 5 ml pożywki trypsynizacyjnej NPC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 2,5 minuty delikatnie przesunąć probówkę.</li>
	<li>Dodaj 5 ml 0,1% inhibitora trypsyny sojowej (STI), aby dezaktywować trypsynę i wymieszać przez odwrócenie. Delikatnie rozcierać 10 - 15 razy pipetą serologiczną o pojemności 10 ml, aż do uzyskania względnie jednorodnej zawiesiny komórek.</li>
	<li>Powoli przenieść zawiesinę komórek do sitka o wielkości 40 μm lub 70 μm umieszczonego w górnej części stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po przefiltrowaniu całej zawiesiny dodać 1 ml pożywki N2, aby przepłukać pozostałe komórki przez filtr i granulować zdysocjowaną zawiesinę komórek przez 6 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Zassać podłoże bez naruszania osadu. Przemyć komórki dwukrotnie 10 ml pożywki N2, granulować komórki przez 5 minut przy 200 x g i rozcierać między praniami za pomocą P1000. Przed drugim płukaniem policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce N2 w ilości 1 x 107 komórek na ml i umieścić ESN w gęstości komórek 150 000 - 200 000 komórek/cm2.</li>
	<li>Przenieść nowo posiane ESN do wilgotnego inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i utrzymywać jak w sekcji 5.</li>
</ol>
4. Przygotowanie powierzchni hodowlanych do posiewu prekursorów neuronalnych w DIV 0
<ol>
	<li>Potrawy poddane działaniu kultur tkankowych należy przygotować co najmniej 1 dzień przed posiewem. Dodać wystarczającą ilość polietylenoiminy (PEI; 25 μg/ml w sterylnymH2O) lub poli-D-lizyny (PDL; 100 μg/ml w sterylnymH2O) w celu przykrycia plastikowych naczyń poddanych kulturom tkankowym i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rano w dniu posiewu umyć naczynia dwukrotnie podwójnie destylowanymH2Oi raz PBS. Po ostatnim umyciu dodaj wystarczającą ilość pożywki N2, aby przykryć naczynie (np. 1 ml na dołek naczynia 12-dołkowego lub 4 ml na naczynie o średnicy 6 cm).</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 18 mm należy przygotować co najmniej jeden dzień przed posiewem neuronów. Szkiełka nakrywkowe czyścić metodą plazmy przez 4 minuty.</li>
	<li>Natychmiast przenieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe na przemyty etanolem parafilm na dnie dużego sterylnego naczynia i dodać 400 μl roztworu PEI lub PDL, przygotowanego jak w kroku 4.1. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Rano umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie wodą i dodaj 5 μg/ml lamininy do PBS przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C. Przed dysocjacją neuronów należy odessać lamininę i natychmiast przenieść szkiełko nakrywkowe do studzienki 12-dołkowego naczynia zawierającego 1 ml pożywki NPC, upewniając się, że strona poddana działaniu środka jest skierowana do góry.</li>
	<li>Przechowuj naczynia i szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C, aż NPC będą gotowi do podania na talerzu.</li>
</ol>
5. Utrzymanie neuronów
<ol>
	<li>W DIV 1 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną N2.</li>
	<li>W DIV 2 i 4 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną B27.</li>
	<li>W DIV 8 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną B27 zawierającą inhibitory mitotyczne w celu wyeliminowania zanieczyszczających komórek nieneuronalnych.</li>
	<li>W DIV 12 zastąp pożywką hodowlaną B27.</li>
	<li>Nie usuwaj DIV 12+ ESN z 5% CO2, dopóki nie będą gotowe do użycia.</li>
</ol>
6. Zmierzony test hamowania transmisji synaptycznej (MIST) do ilościowego określania miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych
UWAGA: Neurotoksyny Clostridium są najbardziej trującymi znanymi substancjami, z szacowanymi wartościami LD50 dla ludzi tak niskimi, jak 0,1 - 1 ng/kg. Przed użyciem tych toksyn należy uzyskać niezbędne zgody i zastosować odpowiednie środki ostrożności.
<ol>
	<li>Ostrożnie rozcieńczyć BoNT/A do 100x pożądanego stężenia końcowego w pożywce hodowlanej ESN i ogrzać do 37 ºC. Dodać odpowiednią ilość toksyny do kultur ESN DIV 21+, zamieszać szalkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Jeśli komórki będą analizowane dłużej niż 4 godziny po zatruciu, dodaj toksynę do naczynia i mieszaj bez usuwania z 5% CO2 , na przykład bezpośrednio w inkubatorze lub w komorze o stałym CO2 .</li>
	<li>W odpowiednim momencie odessać pożywkę hodowlaną ESN i dwukrotnie przemyć zewnątrzkomórkowym buforem zapisującym (ERB). Dodać 4 ml ERB uzupełnionego 5,0 μM tetrodotoksyną i 10 μM bicukuliną, blokując odpowiednio potencjały czynnościowe i antagonizując aktywność receptora GABAA.</li>
	<li>Przenieś naczynie na stanowisko do elektrofizjologii. Do testu mgły nie jest wymagana ani perfuzja, ani kontrola temperatury.</li>
	<li>Wyciągnąć szkło borokrzemianowe za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać pipetę rejestrującą o rezystancji 5-10 mΩ i napełnić ją wewnątrzkomórkowym buforem rejestrującym. Przed nagraniem delikatnie zanurz napełnioną pipetę nagrywającą w odczynniku silikonowym.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem zapewnij nadciśnienie, gdy pipeta rejestrująca jest opuszczana do ERB. Po delikatnym wylądowaniu pipety rejestrującej na somie neuronu, który ma być rejestrowany, usuń nadciśnienie i utwórz gigaseal. Zmniejsz napięcie podtrzymania do -70 mV. Ostrożnie zastosuj podciśnienie, aby rozbić się na konfigurację całych komórek.</li>
	<li>Przełącz na cęgi prądowe, aby monitorować i rejestrować spoczynkowy potencjał membrany. Bez regulacji potencjałów złączy cieczy, spoczynkowy potencjał błonowy będzie wynosił od -67 do -82 mV.</li>
	<li>Wykonuj ciągły zapis cęgowy napięcia -70 mV przez 4 - 5 minut, aby wykryć miniaturowe wzbudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC).</li>
	<li>Analizuj 4 minuty zarejestrowanych danych pod kątem wykrywania mEPSC za pomocą oprogramowania do wykrywania szczytów z następującymi ustawieniami: Próg, 5; Okres wyszukiwania lokalnego maksimum, 10 000 μs; Czas przed szczytem dla linii podstawowej, 5 000 μs; Okres wyszukiwania czasu rozpadu, 20 000 μs; Ułamek szczytu, aby znaleźć czas rozpadu, 0,37; Okres do uśrednienia linii podstawowej, 1 000 μs; Próg obszaru, 20; Liczba punktów do średniego szczytu, 1; Kierunek szczytu, ujemny.</li>
	<li>Zbieraj i zapisuj informacje o wykrytych zdarzeniach. Podziel liczbę wykrytych zdarzeń w ciągu 4 minut przez 240, aby określić częstotliwość mEPSC w Hz.</li>
	<li>Zbierz częstotliwości mEPSC dla 8 - 12 próbek kontrolnych i 8 - 12 próbek poddanych działaniu BoNT dla każdego warunku ekspozycji. Analizuj częstotliwość w porównaniu z kontrolami dopasowanymi pod względem wieku i partii. Określ istotność statystyczną % hamowania aktywności synaptycznej za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA i testu post-hoc Dunnetta.</li>
</ol>

<ol><li>Simpson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+major+steps+in+botulinum+toxin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Pharmacology+And+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Identification of the major steps in botulinum toxin action.</a> Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).</li>
<li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).</li>
<li>Singh, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+structure%2C+engineering%2C+and+novel+cellular+trafficking+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting.</a> Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).</li>
<li>Larsen, J. C. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Army+botulinum+neurotoxin+%28BoNT%29+medical+therapeutics+research+program%3A+past+accomplishments+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+Research%22%5BJournal%5D)">Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions.</a> Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).</li>
<li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel%2C+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).</li>
<li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).</li>
<li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+quantitative+detection+of+botulinum+neurotoxin+in+neurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).</li>
<li>Mesngon, M., McNutt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Latrotoxin+Rescues+SNAP-25+from+BoNT%2FA-Mediated+Proteolysis+in+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons.</a> Toxins. 3, 489-503 (2011).</li>
<li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Whitemarsh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+application+of+human+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+highly+sensitive+botulinum+neurotoxin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection.</a> Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).</li>
<li>Hubbard, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+derivation+of+enriched+glutamatergic+neurons+from+suspension-cultured+mouse+ESCs+for+neurotoxicology+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research.</a> BMC Neurosci. 13, 127(2012).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Embryology+And+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+RNA+sequencing+of+the+deep+transcriptome+during+neurogenesis+of+cortical+glutamatergic+neurons+from+murine+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs.</a> F1000Research. 2 (35), (2013).</li>
<li>Gut, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+application+of+stem+cell-derived+neurons+to+evaluate+the+time-+and+dose-dependent+progression+of+excitotoxic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury.</a> PLoS One. 8, e64423(2013).</li>
<li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).</li>
<li>Capek, P., Dickerson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+the+deadliest+toxin%3A+technologies+for+botulinum+neurotoxin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection.</a> Toxins. 2, 24-53 (2010).</li>
<li>Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+protein+interactions+in+vivo%3A+evidence+from+botulinum+A%2C+C%2C+D+and+E+action+at+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+Of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction.</a> The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).</li>
<li>Baskaran, P., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+effects+of+botulinum+neurotoxin+a+on+the+mammalian+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction.</a> Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).</li>
</ol>

Rząd Stanów Zjednoczonych złożył dwa międzynarodowe wnioski patentowe, które obejmują metody opisane w tym artykule: PCT/US2014/22042, zatytułowany "Metody wykrywania neurotoksyn przy użyciu aktywności synaptycznej"; oraz PCT/US13/40641, zatytułowany "Wykrywanie toksyn za pomocą neuronów pochodzących z komórek macierzystych".

Obecnym złotym standardem w wykrywaniu CNT, oznaczaniu serotypów i oznaczaniu ilościowym jest MLA. MLA bada cały zakres interakcji gospodarz-toksyna wymaganych do zatrucia in vivo (np. Wiązanie toksyny z receptorem na powierzchni komórki, internalizacja kompleksu toksyna-receptor, translokacja LC do cytoplazmy, rozszczepienie substratu za pośrednictwem LC i hamowanie neurotransmisji synaptycznej)18. Jednakże, chociaż MLA oferuje fizjologicznie istotny model zatrucia, jest on zasobożerny, może być mylony przez zanieczyszczenia i obejmuje dużą liczbę myszy, których punktem końcowym jest śmierć. Alternatywnie, testy komórkowe do wykrywania i oznaczania ilościowego BoNT zostały ograniczone do pierwotnych hodowli neuronów, które również wymagają wykorzystania na zwierzętach, lub do linii komórkowych nerwiaka zarodkowego, które nie tworzą synaps i zazwyczaj wykazują słabą wrażliwość na neurotoksyny8. Do tej pory większość pomiarów zatrucia w tych platformach komórkowych opierała się na wykrywaniu proteolitycznego rozszczepienia SNAP-25, VAMP1/2 lub syntaksyny-1 11. Jest to problematyczne, ponieważ wykazano, że rozszczepienie białka SNARE jest nieliniowo związane z hamowaniem synaps in vivo , a zatem może nie reprezentować dokładnie zatrucia lub powrotu do zdrowia po zatruciu19,20.
Idealny model oparty na komórkach do wykrywania CNT byłby (i) oparty na neuronach; (ii) być synaptycznie sprzężone z neurotypowymi reakcjami elektrycznymi; (iii) być wysoce wrażliwe na wszystkie serotypy lub podtypy CNT; oraz (iv) oferują skalowalność, przepustowość i czasy testów, które są równoważne lub ulepszone w stosunku do MLA, przy niższych kosztach i bez konieczności stosowania na zwierzętach. Aby sprostać tym wymaganiom, opracowaliśmy metodę wytwarzania dużych ilości wysoce wzbogaconych, połączonych w sieć kultur neuronów glutaminergicznego i GABA-ergicznego z dostępnych na rynku mysich linii ESC. Następnie opracowaliśmy test MIST w celu ilościowego określenia hamowania synaps w odpowiedzi na zatrucie TeNT i BoNT / A-/G. Podczas gdy test MIST można przeprowadzić na dowolnej populacji neuronów aktywnych synaptycznie (np. neuronach pierwotnych lub wycinkach mózgu), obecnie ESN są jedynym modelem neuronów pochodzącym z in vitro , który w sposób powtarzalny rozwija emergentne zachowania sieciowe i dlatego jest odpowiedni dla testu MIST.
Wyprodukowanie wystarczającej ilości neuronów o określonej linii do badań nad CNT wymagało wprowadzenia kilku innowacji w hodowli i różnicowaniu ESC. Po pierwsze, poprzez selekcję i hodowlę ESC, które mogą przetrwać adaptację zawiesiny, wyeliminowaliśmy możliwość zanieczyszczenia przez komórki zasilające i potrzebę oczyszczania komórek zasilających z ESC na początku różnicowania. Chociaż mechanizmy molekularne leżące u podstaw adaptacji zawiesiny są nieznane, ESC przystosowane do zawiesiny pozostają mitotycznie aktywne, zachowują ekspresję Oct3/4 i nadal są neurogenne. Korzystając z tej metody, zwykle odzyskiwane są ~1,5 x 107 ESC w każdym przejściu. Po drugie, produkcja NPC została zwiększona o ~300% poprzez włączenie mieszania mechanicznego w celu zapobieżenia aglomeracji podczas różnicowania, rzekomo zwiększając dostępność składników odżywczych do wnętrza kruszyw. W trakcie tego procesu odkryliśmy, że surowica używana do hodowli ESC i różnicowania neuronów jest najbardziej krytycznym składnikiem w utrzymaniu neurogennych ESC. Aby uzyskać najlepszy sukces, zalecamy stosowanie zawiesiny adaptującej komórki ES do każdej partii surowicy i gromadzenie surowicy w temperaturze -20 °C w celu wsparcia hodowli ESC i różnicowania neuronów przez datę ważności.
Podobnie jak w przypadku większości kultur aktywnych synaptycznie, ESN DIV 14+ są bardzo podatne na nagłe zmiany pH, a nawet krótkie narażenie na stężenia CO2 w atmosferze może spowodować neurotoksyczność w ciągu 24 godzin. W przypadku doświadczeń wymagających traktowania kultur, po których następuje inkubacja trwająca O/N lub dłużej, neurony powinny być poddawane działaniu bezpośrednio w inkubatorze lub przenoszone do komory o stałym stężeniu CO2 przed eksperymentem.
Różne techniki potwierdziły neurogenezę i dojrzewanie neuronów, w tym ICC, profilowanie transkrypcyjne i elektrofizjologię klamrów krosowych całych komórek. Czasowe zmiany w ekspresji genów i morfologii neuronów były zgodne z szybką progresją przez etapy rozwojowe neurogenezy, a do DIV 16 ESN wykazywały pobudzające i hamujące miniaturowe prądy postsynaptyczne z wyłaniającymi się zachowaniami sieciowymi16. Dowody na aktywność synaptyczną sugerują, że ESN mogą replikować patofizjologie odpowiedzialne za kliniczne objawy zatrucia jadem kiełbasianym i tężca. Zostało to potwierdzone za pomocą MIST w celu wykazania, że zatrucie BoNT/A-/G lub TeNT upośledzało częstość mEPSC o >95% w porównaniu z neuronami leczonymi nośnikiem lub nieleczonymi.
Pomiary czułości MIST dla BoNT/A wykazały medianę stężenia hamującego (IC50) wynoszącą 0,013 pM (co odpowiada 0,5 jednostki śmiertelnej myszy/ml) i granicę wykrywalności poniżej 0,005 pM, mierzoną po 20 godzinach od dodania kąpieli. Opierając się na tych wartościach, MIST jest około dwa razy bardziej czuły i 2-4 razy szybszy niż MLA i 30-krotnie bardziej czuły niż wykrywanie rozszczepionego SNAP-25 na podstawie immunoplam.
Podsumowując, dane te sugerują, że połączone w sieć populacje neuronów pochodzących z komórek macierzystych oferują fizjologicznie istotny, oparty na komórkach model zatrucia. W połączeniu z ulepszonymi metodami wyprowadzania sieciowych kultur ESN z ESC dostosowanych do zawiesiny, stosowanie MIST powinno zmniejszyć potrzebę przeprowadzania testów na zwierzętach i związane z tym wady, koszty i obawy etyczne związane z MLA, zapewniając jednocześnie szybszą, bardziej czułą i specyficzną miarę zatrucia. Chociaż elektrofizjologia z klamrami krosowymi całych komórek jest niskoprzepustową metodą identyfikacji obecności aktywnych neurotoksyn, oferuje rozdzielczość i szybkość, które są nieosiągalne przy użyciu metod molekularnych. Odkrycia te dostarczają również dowodów na to, że zastosowanie metod zależnych od aktywności do oceny aktywności synaptycznej i zachowania sieci może umożliwić szybkie i specyficzne wykrywanie neurotoksyn. Takie podejścia o wyższej przepustowości umożliwiłyby badania mechanistyczne, przesiewowe badania terapeutyczne lub testy diagnostyczne dla szerokiej gamy czynników neuromodulujących, w tym CNT.

Ogólnym celem tej metody jest funkcjonalna ocena aktywności synaptycznej w sieciowych kulturach neuronów pochodzących z komórek macierzystych narażonych na działanie neurotoksyn clostridium. Jest to pierwsza demonstracja modelu uzyskanego in vitro, który funkcjonalnie replikuje patofizjologie odpowiedzialne za kliniczne objawy zatrucia jadem kiełbasianym i waliduje ESN jako odpowiedni model do wykrywania CNT, terapeutycznych badań przesiewowych i badań mechanistycznych.
BoNTs to wysoce śmiercionośne neurotoksyny bakteryjne wytwarzane przez przedstawicieli gatunku Clostridium. Łącznie z niedawno zaproponowanym BoNT/H opisano osiem antygenowo odrębnych serotypów BoNT (/A-/H)1,2. Wszystkie serotypy są wyrażane jako peptydy o masie 150 kDa, które są nacinane potranslacyjnie w celu wytworzenia diłańcucha składającego się z łańcucha ciężkiego (HC) o masie 100 kDa i łańcucha lekkiego (LC) o masie 50 kDa połączonych wiązaniem dwusiarczkowym3. HC pośredniczy w wiązaniu się z receptorami presynaptycznymi i wnikaniu toksyny do neuronu poprzez endocytozę synaptyczną. Podczas przetwarzania endosomalnego HC ulega reorganizacji strukturalnej w celu utworzenia porów w błonie pęcherzyka, ułatwiając translokację LC do cytozolu presynaptycznego. LC następnie specyficznie celuje i rozszczepia rozpuszczalne białka receptora białka przyłączeniowego wrażliwego na N-etylomaleimid (SNARE) w przedziale presynaptycznym: SNAP-25 (BoNT / A, /C, /E), VAMP2 (BoNT / B, /D, /F, /G) lub syntaksyna (BoNT / C)1. Rozszczepienie któregokolwiek z tych białek SNARE zapobiega gromadzeniu się maszynerii egzocytozy synaptycznej, blokując w ten sposób uwalnianie neuroprzekaźników. To połączenie skutecznego celowania neuronalnego i lokalizacji presynaptycznej sprawia, że BoNT są najsilniejszymi znanymi truciznami, z szacowanymi dawkami śmiertelnymi dla ludzi tak niskimi, jak 0,1 - 1 ng / kg1.
Testy biochemiczne mogą być używane do wykrywania obecności lub aktywności LC CNT z wysoką czułością. Jednak metody te nie badają zdolności toksyny do wiązania, wnikania, aktywacji i funkcjonowania w neuronach, a zatem są pośrednimi i prawdopodobnie wprowadzającymi w błąd miarami obecności aktywnej toksyny. W przeciwieństwie do tego, funkcjonalne testy zatrucia, takie jak test śmiertelności myszy (MLA), kompleksowo oceniają zdolność CNT do skutecznego negocjowania wszystkich faz wychwytu i aktywacji, zapewniając bardziej odpowiednie i szczegółowe oceny aktywności toksyn. Chociaż MLA jest złotym standardem wykrywania BoNT, jest to metoda in vivo, która wykorzystuje śmierć jako punkt końcowy i dlatego ma ograniczoną użyteczność jako platforma badawcza. Próby opracowania komórkowych modeli zatrucia CNT, nadających się do badań mechanistycznych i terapeutycznych badań przesiewowych, również napotkały znaczne ograniczenia. Podczas gdy pierwotne hodowle neuronów oferują wysoki stopień znaczenia fizjologicznego, ich zastosowanie komplikuje szereg czynników, w tym wysokie koszty zasobów, stosunkowo niska wydajność, obecność wielu podtypów neuronów oraz rozległy nadzór regulacyjny i administracyjny związany z wykorzystaniem zwierząt. Jako alternatywę dla neuronów pierwotnych, neurogenne linie komórkowe (które można skłonić do przyjęcia właściwości podobnych do neuronów poprzez stymulację chemiczną), takie jak nerwiaki zarodkowe i chromochłonne komórki nadnerczy, zostały wykorzystane jako modele zatrucia in vitro. Ponieważ komórki te są hodowane w sposób ciągły przed indukcją, są wysoce skalowalne i dlatego dobrze nadają się do podejść o umiarkowanej przepustowości. Jednak ich znaczenie jest wątpliwe, ponieważ indukowane fenotypy są zazwyczaj heterogeniczne, są słabo wrażliwe na CNT i nie wykazują krytycznych zachowań neuronalnych, w tym niezdolności do tworzenia przedziałów pre- i postsynaptycznych, które łączą się w funkcjonujące synapsy4. W przypadku braku fizjologicznie nienaruszonych przedziałów presynaptycznych nie można replikować pełnego zakresu interakcji toksyna-neuron, a zatem nie są możliwe funkcjonalne pomiary zatrucia5. Nic dziwnego, że próby przeprowadzenia badań mechanistycznych lub badań przesiewowych leków w kierunku BoNT przy użyciu indukowanych neurogennych linii komórkowych przyniosły wyniki, które są niezgodne z badaniami in vivo i pierwotnymi neuronami6.
Zaproponowano, że neurony ośrodkowego układu nerwowego (OUN) pochodzące z komórek macierzystych mogą stanowić platformę komórkową nowej generacji do badań nad BoNT, która łączy znaczenie pierwotnych neuronów z elastycznością hodowanych linii komórkowych7-10. W szczególności stwierdzono, że neurony pochodzące z mysich komórek macierzystych (ESN) są bardzo wrażliwe na fizjologiczne dawki BoNT / A / G i replikują wiele odpowiedzi in vivo na zatrucie, w tym zróżnicowane trwałość, zatrucie zwiększoną aktywnością i potencje specyficzne dla serotypu5,8,11. Zachowania te sugerują, że mechanizmy in vivo wychwytywania, przetwarzania, transportu i aktywności BoNT są zachowane w ESN. Jednak hamowanie aktywności synaptycznej jest charakterystycznym objawem zatrucia jadem kiełbasianym, a zatem wykazanie utraty aktywności synaptycznej po zatruciu CNT jest niezbędne przed stwierdzeniem, że ESN są odpowiednim modelem komórkowym pochodzącym in vitro do badań CNT.
Aby zmierzyć wpływ zatrucia CNT na aktywność synaptyczną, elektrofizjologia z całokomórkowymi klamrami została użyta do ilościowego określenia prądów monosynaptycznych w DIV 21+ ESN traktowanych nośnikiem lub CNT. Stwierdziliśmy, że zatrucie ESN BoNT/A-/G lub TeNT spowodowało >95% utratę aktywności synaptycznej w ciągu 20 godzin we wszystkich przypadkach. Dalsza charakterystyka przeprowadzona 20 godzin po zatruciu BoNT/A wykazała zależny od dawki wpływ na aktywność synaptyczną, z granicą wykrywalności poniżej 0,005 pM i wartością IC50 wynoszącą 0,013 pM. Odkrycia te wskazują, że czułość i ramy czasowe elektrofizjologicznego wykrywania zatrucia są znacznie lepsze w porównaniu z porównywalnymi analizami rozszczepienia SNAP-25 opartymi na immunoblot i testami śmiertelności in vivo u myszy, co pokazuje, że funkcjonalne pomiary zatrucia w synaptycznie aktywnych kulturach neuronów mogą ułatwić bardziej czułe, specyficzne i szybkie metody charakteryzowania odpowiedzi komórkowej na BoNT.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 1. ESC i ESN</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>Podłoże: Pożywka hodowlana ESC Formulacja i uwagi: 500 ml</td></tr><tr><td>100x MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Podłoże: przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 miesiąca Formulacja i uwagi: 6 ml</td></tr><tr><td>200 mM L-alanylo-L-glutaminy</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>6 ml</td></tr><tr><td>Kwalifikowana przez ES FBS</td><td>Applied Stem Cell</td><td>ASM-5007</td><td>90 ml</td></tr><tr><td>100x antybiotyki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>55 mM 2-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>1,1 ml</td></tr><tr><td>107 jednostek/ml LIF</td><td>Milipory</td><td>ESG1107</td><td>60 &mu; L</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>Media: Medium różnicujące ESC Formulacja i uwagi: 436,6 ml</td></tr><tr><td>100x MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Media: przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 miesiąca Formulacja i uwagi: 5 ml</td></tr><tr><td>200 mM L-alanylo-L-glutaminy</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>surowicy z kwalifikacją ESC</td><td>Zastosowana komórka macierzysta</td><td>ASM-5007</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>100x antybiotyki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>55 mM 2-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>0,9 ml</td></tr><tr><td>PBS</td> <td>firmy DulbeccoSigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Podłoże: Pożywka trypsynizacyjne NPC Formulacja i uwagi: 100 ml</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (18,3%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td>Pożywka: zamrozić w 5 ml porcji Formulacja i uwagi: 0,266 ml</td></tr><tr><td>trypsyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>Polietylenoiminy (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Media: Roztwory do powlekania powierzchni Formulacja i uwagi: 2,5 i mikro; g / ml w H20</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Podłoże: zużyć w ciągu 1 tyg Formulacja i uwagi: 100 &mikro; g/ml w H20</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>5 &mikro; g/ml w H20</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td>Podłoże: Pożywka hodowlana NPC Formulacja i uwagi: 492,5 ml</td></tr><tr><td>100x witaminy N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Media: przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 miesiąca Formulacja i uwagi: 5 ml</td></tr><tr><td>100x antybiotyki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2,5 mL</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>Podłoże: Pożywka hodowlana ESN Formulacja i uwagi: 482,5 ml</td></tr><tr><td>50x witaminy B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Głoska bezdźwięczna: przechowywać pod adresem 4 & st.; C przez okres do 1 miesiąca Formulacja i uwagi: 10 ml</td></tr><tr><td>200 mM L-alanylo-L-glutaminy</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>100x antybiotyki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>5-fluoro-2'-deoksyurydyny (5FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>Media: 2000x Inhibitory mitotyczne podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C Formulacja i uwagi: dd 150 mg 5FDU i 350 mg urydyny do 10 ml Neurobaseal A. Sterylny filtr, podwielokrotność i zamrożenie. Użyj 2000x w pożywce hodowlanej ESN.</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Media: Różne Formuła i uwagi: przechowywać w RT</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>inhibitor trypsyny sojowej (STI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td>przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>Przygotować 100 mM bulionu, rozpuszczając 100 mg kwasu askorbinowego w 5,7 ml mieszanki 50:50 DMSO/etanol.</td></tr><tr><td>kwas retinowy (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Zawiesić 15 mg RZS w 9 ml 50:50 DMSO/etanol. Uzupełnij 1 ml 100 mM bulionu kwasu askorbinowego. Podwielokrotność i przechowywana w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Stabilna przez 6 mies.</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 2. MIST</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71386</td><td>Media: Zewnątrzkomórkowy bufor zapisu Stężenie końcowe (mM): 58,44 MW: 140</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60135</td><td>Media: (ERB; pH = 7,3, 315 mO) Stężenie końcowe (mM): 74,56 MW: 3,5</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>Media: Stabilny przy 4 & stopniach; C dla co najmniej 6 mies. Stężenie końcowe (mM): 119,98 MW: 1,25</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>Stężenie końcowe (mM): 110,98 MW: 2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td>Stężenie końcowe (mM): 95,21 MW: 1</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8644</td><td>Stężenie końcowe (mM): 180,16 MW: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>Końcowe stężenie (mM): 238,3 MW: 10</td></tr><tr><td>K-glukonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td>Media: Wewnątrzkomórkowy bufor zapisu Stężenie końcowe (mM): 234,5 MW: 140</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71386</td><td>Media: (IRB; pH = 7,3, 320 mO) Stężenie końcowe (mM): 58,44 MW: </td></tr><tr><td>5 Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Media: stabilny w 4 & stopniach; C dla co najmniej 6 mies. Stężenie końcowe (mM): 507,18 MW: 2</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5884</td><td>Stężenie końcowe (mM): 523,18 MW: 0,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>Media: stabilne przy 4 & stopniach; C dla co najmniej 6 mies. Stężenie końcowe (mM): 110,98 MW: 0,1</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td>Media: stabilne przy 4 & stopniach; C dla co najmniej 6 mies. Stężenie końcowe (mM): 95,21 MW: 1</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>380,35</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>Media: stabilne przy 4 & stopniach; C dla co najmniej 6 mies. Stężenie końcowe (mM): 238,3 MW: 10</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>Media: Różne Stężenie końcowe (mM): 0,01 MW: 417,85</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>Stężenie końcowe (mM): 0,01 MW: 276,12</td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8001</td><td>Stężenie końcowe (mM): 0,005 MW: 645.74</td></tr><tr><td>BoNT/A-/G</td><td>Metabiologics</td><td>N/A</td><td>Media: Stężenie końcowe (mM): TBD MW: 150 000</td></tr><tr><td>Toksyna tężcowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3194</td><td>Stężenie końcowe (mM): TBD MW: 150 000</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL-2</td><td>Stężenie końcowe (mM): N/A MW: N/A</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3. Sprzęt i oprogramowanie</td></tr><tr><td>MiniAnalysis (wersja 6.0.7)</td><td>Synaptosoft, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie do wykrywania zdarzeń</td></tr><tr><td>Igor Pro (wersja 6.22A)</td><td>WaveMetrics</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji nagrań</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Heka</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus IX51</td><td>Mikromanipulator Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wzmacniacz</td> krosowy <td>Sutter Instrument MPC-365</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ściągacz do</td><td></td> mikropipet Heka ECB10USB <td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>borokrzemianowe rurki kapilarne</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-10</td><td>Corning 7740</td></tr><tr><td>18 mm szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-545-84</td><td></td></tr><tr><td>myjka plazmowa</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>sitko do komórek (40 &mikro; m)</td> <td>Fisher</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Stovall Belly Dancer Shaker</td><td>Fisher</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>naczynia o niskiej przyczepności</td><td>Fisher</td><td>05-539-101</td><td>Corning 3262</td></tr><tr><td>naczynia bakteryjne</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>100 x 15 mm</td></tr></tbody></table>

ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Terapeutyczne i mechanistyczne badania presynaptycznie ukierunkowanych neurotoksyn clostridial (CNT) były ograniczone przez potrzebę skalowalnego, opartego na komórkach modelu, który wytwarza funkcjonujące synapsy i przechodzi fizjologiczne reakcje na zatrucie. W tym artykule opisujemy prostą i solidną metodę skutecznego różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) w określone linie synaptycznie aktywnych, połączonych w sieć neuronów. Zgodnie z 8-dniowym protokołem różnicowania, embrionalne neurony pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych myszy (ESN) szybko wyrażają i dzielą na segmenty białka neurotypowe, tworzą morfologię neuronów i rozwijają wewnętrzne odpowiedzi elektryczne. Do 18 dni po różnicowaniu (DIV 18) ESN wykazują aktywne synapsy glutaminergiczne i kwasu γ-aminomasłowego (GABA) oraz emergentne zachowania sieciowe charakteryzujące się równowagą pobudzającą: hamującą. Aby ustalić, czy zatrucie CNT funkcjonalnie antagonizuje neurotransmisję synaptyczną, replikując w ten sposób patofizjologię in vivo, która jest odpowiedzialna za kliniczne objawy zatrucia jadem kiełbasianym lub tężca, elektrofizjologię klamr z całych komórek zastosowano do ilościowego określenia spontanicznych miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych (mEPSC) w ESN narażonych na serotypy neurotoksyny tężcowej (TeNT) lub neurotoksyny botulinowej (BoNT) /A-/G. We wszystkich przypadkach ESN wykazywały prawie całkowitą utratę aktywności synaptycznej w ciągu 20 godzin. Zatrute neurony pozostały żywotne, o czym świadczą niezmienione spoczynkowe potencjały błonowe i wewnętrzne reakcje elektryczne. Aby dokładniej scharakteryzować czułość tego podejścia, zmierzono zależny od dawki wpływ zatrucia na aktywność synaptyczną 20 godzin po dodaniu BoNT / A. Zatrucie 0,005 pM BoNT / A spowodowało znaczny spadek mEPSC, przy medianie stężenia hamującego (IC50) wynoszącej 0,013 pM. Porównania średnich dawek wskazują, że funkcjonalne pomiary hamowania synaps są szybsze, bardziej szczegółowe i bardziej czułe niż testy rozszczepienia SNARE lub testy śmiertelności myszy. Dane te potwierdzają słuszność wykorzystania sprzężonych synaptycznie neuronów pochodzących z komórek macierzystych do wysoce specyficznego i czułego wykrywania CNT.

Opracowaliśmy protokół różnicowania, który umożliwia ekonomiczną produkcję dużych ilości wysokiej czystości neuronów pochodzących z komórek macierzystych z mysich ESC (szczegóły w Rysunku 1A)8,11. Metoda ta była stosowana przez lata do powtarzalnego różnicowania linii ESC generowanych wewnętrznie oraz dostępnych komercyjnie w neurony o określonych liniach komórkowych12-14. Krytyczne elementy tego protokołu obejmują (1) adaptację ESC do hodowli w zawiesinie bez komórek zasilających (feeder cells); (2) prawidłowe prowadzenie hodowli w zawiesinie oraz (3) różnicowanie w warunkach rotacyjnych. Przejście na hodowlę w zawiesinie drastycznie skraca czas i obniża koszty utrzymania ESC oraz eliminuje konieczność usuwania komórek zasilających przed różnicowaniem. Po adaptacji do zawiesiny ekspresja Oct3/4 pozostaje stała przez co najmniej 30 pasażu, co wskazuje, że adaptacja do zawiesiny nie zmienia ekspresji markerów pluripotencji (Rysunek 1B-D). Komórki ESC nadają się do różnicowania neuronalnego, gdy wydajność komórkowa konsekwentnie przekracza 1 x 107 komórek na pasaż. Zazwyczaj dzieje się to w ciągu dziesięciu pasaży po adaptacji do zawiesiny lub pięciu pasaży po rozmrożeniu ESC, które wcześniej zostały zaadaptowane do zawiesiny. Stwierdzono również, że mechaniczna rotacja różnicujących się agregatów jest kluczowa dla zwiększenia wydajności neuronów. Zastosowanie wytrząsarki rotacyjnej wyeliminowało tworzenie się super-agregatów, zwiększając żywotność agregatów i prowadząc do około 300% wzrostu wydajności neuronalnych komórek progenitorowych (NPCs) w dniu DIV 0 (Rysunek 1E).
Typowy proces różnicowania rozpoczyna się od 3,5 x 106 ESC w DIV -8 i pozwala na uzyskanie 115 x 106 NPC w DIV 0, z których około 60% przeżyje i przekształci się w neurony. Pozostałe 40% stanowią komórki nieneuronalne, które zostają w dużej mierze wyeliminowane poprzez deprywację surowicy między DIV 0 a 1. Niewielka liczba przetrwałych komórek glejowych może zostać usunięta poprzez dodanie inhibitorów mitotycznych w DIV 2 - 4 lub DIV 8 - 12. Gęstość wysiewu w DIV 0 jest krytyczna; neurony wysiane zbyt rzadko nie przeżyją dłużej niż 2 tygodnie. W ciągu kilku dni od wysiewu zróżnicowane neurony wykazują morfologię neuronalną i kompartymentują białka neurotypowe, takie jak marker somatodendrytyczny MAP2 i marker aksonalny Tau (Rysunek 2A). Do DIV 14 na stykach aksonodendrytycznych można zidentyfikować punkty synapsyny-1+, co sugeruje tworzenie się synaps. Jest to zgodne z ekspresją białek markerowych synaps przed DIV 7 8,11. Morfologia neuronów dojrzewa nadal do DIV 21, kiedy to kultury wykazują rozbudowane drzewa aksonodendrytyczne i duże punkty synaptyczne (Rysunek 2A). Przy odpowiednim utrzymaniu, ESN pozostają żywe i aktywne przez co najmniej 4 tygodnie po wysiewie.
Podłużne profilowanie ekspresji za pomocą sekwencjonowania RNA potwierdziło morfologiczne i proteomiczne dowody na specyfikację i dojrzewanie neuronów11,15. Reprezentatywne markery postępu rozwojowego wykazywały etapy-specyficzne profile ekspresji, w tym Oct3/4, Nestin, DCX, NeuN oraz KCC2 (Rysunek 2B). W dniu DIV 0 ESNs wykazywały obfitą ekspresję neuronowo-specyficznych białek strukturalnych, w tym MAP2 i Tau. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, zaobserwowano markery tylko dla dwóch podtypów neuronów: glutaminergicznych neuronów śródmózgowia/tylomoźgowia wykazujących ekspresję vGluT2 oraz interneuronów GABAergicznych8. Odpowiednio, szeroki zestaw markerów glutaminergicznych i GABAergicznych wykazał gwałtowne wzrosty ekspresji między DIV 0 a DIV 7, w tym presynaptyczne białka SNARE niezbędne do uwalniania neuroprzekaźników; receptory neuroprzekaźników wymagane do odpowiedzi postsynaptycznych; oraz białka rusztowaniowe niezbędne do zakotwiczenia tych receptorów w błonie postsynaptycznej. Neurony wykazują dojrzałe wewnętrzne charakterystyki elektryczne do DIV 14 oraz spontaniczne miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne do DIV 16 16.
Do oceny wpływu intoksykacji na aktywność synaptyczną wykorzystano test MIST (Measured Inhibition of Synaptic Transmission). Poprzez porównanie częstotliwości mEPSC pomiędzy zaintoksykowanymi a traktowanymi nośnikiem ESN w 24+ DIV, MIST umożliwia ilościowy i specyficzny pomiar intoksykacji w oparciu o funkcjonalne hamowanie aktywności synaptycznej (Rycina 3A). MIST zastosowano do pomiaru wpływu BoNT/A-/G lub TeNT na aktywność synaptyczną w ESN po 20 hr od dodania każdej toksyny do kąpieli. Toksyny dodawano w stężeniu odpowiadającym 10-krotności wartości EC50, wyznaczonej wcześniej w analizie immunoblotowej cięcia białek SNARE11. Wszystkie toksyny zredukowały częstotliwość mEPSC do poziomu poniżej 5% w stosunku do kontroli traktowanych nośnikiem. Spadki częstotliwości synaptycznej nie wynikały z śmierci komórek ani zmienionych odpowiedzi wewnętrznych, ponieważ zaintoksykowane ESN można było poddać technice patch-clamp; komórki te generowały powtarzalne potencjały czynnościowe w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu i nie wykazywały istotnych zmian w spoczynkowym potencjale błonowym (Rycina 3B,C).
Aby porównać czułość metody MIST z istniejącymi metodami wykrywania CNT, wyznaczono granicę wykrywalności oraz medianą stężenie hamujące (IC50) 20 godz. po dodaniu BoNT/A do ESN. Intoksykacja dawką zaledwie 0,005 pM BoNT/A spowodowała statystycznie istotną redukcję częstotliwości mEPSC, przy wartości IC50 wynoszącej 0,013 pM i całkowitym wyciszeniu aktywności synaptycznej powyżej 0,5 pM (Rysunek 4A). Ta wartość IC50 odpowiada w przybliżeniu 0,5 jednostkom śmiertelnym dla myszy/ml, co sugeruje, że MIST jest dwukrotnie bardziej czuła i od 2 do 4 razy szybsza niż MLA w wykrywaniu obecności BoNT/A. Pomiary immunoblottowe cięcia SNAP-25 pozwoliły uzyskać wartość EC50 równą 0,38 pM oraz minimalną dawkę wykrywalną wynoszącą 0,05 pM, co wskazuje, że MIST jest około 30-krotnie bardziej czuła niż detekcja przeciętych białek SNARE oparta na immunoblottingu (Rysunek 4B).
<img alt="Proces różnicowania ESC; schematy i wykresy etapów hodowli komórkowej, żywotności komórek oraz dojrzewania." src="/files/ftp_upload/52361/52361fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zaadaptowane do hodowli w zawiesinie ESN pozostają mitotycznie stabilne i wykazują ekspresję markerów pluripotencji. (A) Schemat utrzymania i różnicowania ESC. Obecność lub brak kwasu retinowego (RA) lub czynnika hamującego białaczkę (LIF) oznaczono znakami + lub –. Przedstawiono porównanie dni in vitro (DIV) i klasycznych etapów rozwojowych (DS) dla pierwotnych kultur neuronów17. (B) Szybkość proliferacji linii komórek ES R1, D3 i C57BL/6J stabilizuje się po pięciu pasażach od przejścia na hodowlę w zawiesinie. (C) Dane z cytometrii przepływowej wykazują brak istotnych zmian w ekspresji Oct3/4 w liniach komórek ES R1, D3 i C57BL/6J mierzonych przez 25 pasaży w hodowli w zawiesinie (n = 6 dla każdej). (D) Rzeczywiste wydajności komórkowe podczas rutynowego pasażowania linii R1 ESC zaadaptowanej do zawiesiny, mierzone między 5. a 30. pasażem (linia czarna). Przedstawiono również teoretyczne wydajności kumulatywne przy założeniu, że żadne komórki nie są odrzucane podczas pasażowania (linia czerwona). (E) Obrazy w jasnym polu agregatów w DIV 0 wytworzonych w warunkach statycznych (lewo) lub rotacyjnych (prawo). Warunki rotacyjne pozwoliły uzyskać sferyczne agregaty bez aglomeracji i zwiększyły wydajność NPC 3-krotnie (p &lt; 0.001, określone testem t Studenta)11. * oznacza P &lt; 0.05. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Hubbarda et al.11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozwój neuronalny poprzez immunofluorescencję, dane o ekspresji genów, etapy DIV, wyniki mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/52361/52361fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Dowody morfologiczne, proteomiczne i transkrypcyjne na specyfikację i dojrzewanie neuronów. (A) Immunocytochemia z dni DIV 7 – DIV 49 wykazuje arboryzację neuronalną oraz pojawienie się punktów synaptycznych na stykach aksonodendrytycznych. Aksony są znakowane Tau (zielony), dendryty są znakowane MAP2 (czerwony), przedsynaptyczne przedziały są znakowane synapsyną (biały), a jądra są barwione DAPI (niebieski). (B>) Podłużne profilowanie ekspresji reprezentatywnych genów, wykazujące ekspresję specyficzną dla etapu rozwoju i określającą neuronalne podtypy. Wszystkie transkrypty genów są przedstawione jako przybliżona liczba transkryptów na komórkę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Eksperyment elektrofizjologiczny z neurotoksyną botulinową; wykres analizy potencjału błonowego, rejestracje potencjałów czynnościowych." src="/files/ftp_upload/52361/52361fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. ESNs wykazują hamowanie aktywności synaptycznej po ekspozycji na BoNT/A-G i TeNT. (A) Reprezentatywne ślady z ESNs zarejestrowane 20 h po dodaniu do kąpieli wartości ok. 10 x EC50 BoNT/A - /G, TeNT lub nośnika. Każda neurotoksyna zredukowała aktywność synaptyczną o ponad 95% w porównaniu z kontrolami. (B) Zainfekowane neurony zachowały zdolność do generowania powtarzalnych potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu depolaryzującego (wykazano dla BoNT/A, ale zaobserwowano we wszystkich zainfekowanych kulturach) i (C) nie wykazały zmian w ujemnym spoczynkowym potencjale błonowym (C; n &gt; 18 dla każdej grupy badawczej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Efekty inhibicji BoNT/A, wykres częstotliwości mEPSC, Western blot cięcia białka, analiza SNAP-25 i syntaksyny." src="/files/ftp_upload/52361/52361fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wyznaczenie czułości metody MIST w ESN traktowanych BoNT/A. (A) Pomiary MIST aktywności synaptycznej 20 h po dodaniu BoNT/A do kąpieli. Reprezentatywne fragmenty zapisów zaciskowania napięcia wykazały spadek częstotliwości mEPSC po ekspozycji na BoNT/A (lewa strona). Ilościowe określenie częstotliwości mEPSC (wykres słupkowy, prawa strona, n = 20 dla kontroli; n = 11 - 22 dla każdej dawki) potwierdza zależny od dawki spadek częstotliwości mEPSC. Mediana stężenia hamującego została wyznaczona za pomocą dopasowania metodą najmniejszych kwadratów regresji nieliniowej z wykorzystaniem czterech parametrów o zmiennym nachyleniu (R2 &gt; 0,91). Należy zauważyć, że granica wykrywalności metodą MIST w ESN wynosi co najmniej 0,005 pM. (B) Intoksykacja ESN za pomocą BoNT/A prowadzi do cięcia SNAP-25, co zobrazowano poprzez przesunięcia ruchomości w żelu (reprezentatywny Western blot po lewej stronie oraz wykres słupkowy przedstawiający ilościowe określenie cięcia SNAP-25 po prawej; n = 4). Zwrócić uwagę na niższą czułość przy zastosowaniu cięcia białka SNARE (SNAP-25) jako punktu końcowego (EC50 wynoszące 0,36 pM) w porównaniu z MIST (IC50 wynoszące 0,013 pM). * oznacza P &lt; 0,05; *** oznacza P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Celem niniejszej procedury jest precyzyjny pomiar wpływu neurotoksyn Clostridium na transmisję synaptyczną w sieciowych kulturach neuronów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Jest to realizowane poprzez wstępną adaptację embrionalnych komórek macierzystych do hodowli zawiesinowej bez wykorzystania komórek karmionek oraz utrzymywanie zaadaptowanych komórek w stanie pluripotencyjnym. Drugim krokiem jest różnicowanie zaadaptowanych do zawiesiny komórek macierzystych w neurony lub ESN, z wykorzystaniem modyfikacji techniki różnicowania czterech faz.Następnie sieci neuronowe pochodzące z embrionów (ESN) poddaje się inkubacji w serii pożywek, aby wspomóc ich dojrzewanie do postaci synaptycznie aktywnych sieci neuronów. Ostatnim etapem jest traktowanie ESN neurotoksynami klostrydy lub innymi neurotoksynami oraz pomiar wpływu tych substancji na aktywność monosynaptyczną z wykorzystaniem elektrofizjologii metodą patch-clamp na całej komórce (whole cell patch clamp). Ostatecznie zmiany w spontanicznej produkcji aktywności monosynaptycznej są kwantyfikowane na podstawie zapisów elektrofizjologicznych, znormalizowanych względem neuronów kontrolnych o tym samym wieku i pochodzących z tej samej partii, a następnie porównywane pomiędzy różnymi warunkami, takimi jak dawki, czasy ekspozycji lub zastosowane leki.Główną zaletą tej techniki jest to, że ESN są pierwszym modelem komórkowym odtwarzającym patologie funkcjonalne odpowiedzialne za objawy kliniczne botulizmu i tężca. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy odkryliśmy, że ESN są wysoce podatne na wszystkie neurotoksyny klastrydy działające poprzez rozszczepianie białek SNARE, a także wykazują spontaniczną aktywność synaptyczną w wyłaniającym się zachowaniu sieci. Procedurę zaprezentuje pani Megan Lyman, technik z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od przeniesienia zaadaptowanej zawiesiny hodowlanej wolnej od komórek karmicieli.Przenieś agregaty ESC do 15 mililitrowej probówki stożkowej i pozwól im osiąść w postaci zwartego pelletu. Po osiadnięciu agregatów odessaj nadsącz, uważając, aby nie naruszyć pelletu komórkowego. Następnie dodaj pięć mililitrów PBS w celu przemycia komórek i wiruj przy 100 ×g przez 2,5 minuty.Ostrożnie odessaj PBS, a następnie dodaj 500 µL trypsyny i kilkukrotnie odwróć probówkę, aby delikatnie rozbić osad komórkowy. Następnie umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubuj przez trzy minuty. Po upływie czasu inkubacji przenieś probówkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i dodaj 500 µL pożywki ESC w celu rozcieńczenia trypsyny.Następnie pipetą P 1000 wykonaj od pięciu do 10 powtórzeń trituracji zawiesiny CEL, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę. Policz komórki w aliquocie, używając hematocytometru, a pozostałą część zawiesiny komórkowej odwiruj z prędkością 200 ×g przez trzy minuty. Po odessaniu nadsączu, resuspenduj komórki w medium ESC do końcowego stężenia 1 × 10⁷ komórek/ml.Następnie przenieś 150 µL zawiesiny do 10 mL medium ESC w 10 cm szalce do hodowli bakterii i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2. ESC są rutynowo pasażowane zgodnie z tym protokołem. Co 48 godzin, podczas rutynowego pasażowania komórek, rozpoczyna się różnicowanie ESC w neurony.Dysocjuj ESC w ten sam sposób co wcześniej, ale przygotuj dodatkową płytkę do różnicowania neuronalnego. Przenieś 350 µL zawiesiny komórkowej do 10 cm naczynia o niskim stopniu przylegania zawierającego 25 mL Medium do różnicowania. Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30–45 RPM w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubuj przez 48 godzin.Po 48 godzinach, za pomocą pipety 25 ml, przenieś różnicujące się agregaty komórkowe do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie niezwłocznie dodaj 25 ml świeżego pożywki do różnicowania do szalki Petriego.Pozostaw agregaty do osiadania przez dwie do pięciu minut, aż powstanie widoczny pellet o głębokości od jednego do dwóch milimetrów. Ostrożnie odessaj medium, pomijając pojedyncze komórki lub małe agregaty pozostające w zawiesinie, a następnie za pomocą pipety P 1000 przenieś pellet komórkowy z powrotem do szalki Petriego. Umieść szalkę ponownie na wytrząsarce rotacyjnej w inkubatorze.Po kolejnych 48 godzinach powtórz procedurę wymiany pożywki. Tym razem użyj 30 ml pożywki do różnicowania uzupełnionej o sześć mikromoli kwasu retinowego (all-trans retinoic acid). Po inkubacji komórek utworzony pellet będzie miał głębokość od dwóch do czterech mm.Podobnie jak wcześniej, powtórz procedurę wymiany pożywki z dodatkiem kwasu retinowego po raz ostatni. Następnego dnia osad będzie miał głębokość od czterech do ośmiu milimetrów. W popołudnie w dniu wysiewania przygotuj powierzchnie do wysiewania zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu, a także po 5 mL pożywki MPC z trypsyną do wstępnego powlekania oraz 0,1% inhibitora trypsyny z soi w temperaturze 37 °C.Następnie za pomocą pipety 25 ml przenieść różnicujące się agregaty z płytki hodowlanej do probówki stożkowej 50 ml. Pozostawić agregaty do osiadania przez trzy do pięciu minut, a następnie ostrożnie odessać medium, nie naruszając osadu. Następnie przemyć osad od 5 do 10 ml PBS i odczekać, aż agregaty osiądą.Odssać PBS i powtórzyć płukanie. Po drugim płukaniu PBS dodać pięć mililitrów medium do MPCyzacji do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut.Podczas inkubacji należy delikatnie dwa do trzech razy stuknąć probówką. Następnie do komórek dodać 5 ml 0,1% inhibitora trypsyny z soi i szybko wymieszać poprzez odwracanie. Następnie delikatnie utriturować komórki 10 do 15 razy za pomocą pipety 10 ml, aż do uzyskania względnie homogenicznej zawiesiny komórkowej.Powoli przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o oczkach 40 lub 70 µm umieszczone na probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Po przefiltrowaniu całej zawiesiny dodaj 1 ml medium N2 do filtra, aby wypłukać pozostałe komórki przez sito. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez 6 minut przy 200 ×g. Po odessaniu medium, nie naruszając osadu, rozbij go w 2 ml medium N2, a następnie dopełnij medium N2 do całkowitej objętości 10 ml.Wiruj przez pięć minut przy 200 ×g. Odsącz medium i ponownie powtórz proces płukania osadu. Resuspenduj osad w 10 ml medium N2.Pobrać alikwot komórek i policzyć je za pomocą hemocytometru, a następnie powtórzyć wirowanie. Zawiesić komórki w medium N2 do końcowego stężenia 1×10⁷ komórek/ml i wysiać w gęstości od 150 000 do 200 000 komórek/cm². Przygotować płytki w dniu DIV-1 i umieścić je w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C.Utrzymuj ESN zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Najpierw rozcieńcz neurotoksynę botulinową serotypu A do stężenia 100-krotnie większego niż pożądane stężenie końcowe w pożywce hodowlanej ESN i ogrzej do 37 °C. Następnie dodaj odpowiednią objętość toksyny do kultur ESN w DIV 21.Napełnij naczynie hodowlane i przenieś je z powrotem do inkubatora na wybrany czas. Odsącz punktowo pożywkę ESN i przemyj dwukrotnie buforem do rejestracji zewnątrzkomórkowej lub ERB. Następnie dodaj cztery mililitry ERB uzupełnionego o pięć mikromoli tetrodotoksyny w celu zablokowania potencjałów czynnościowych oraz 10 mikromoli bikolin w celu antagonizowania aktywności receptorów gabaa.Następnie przenieś szalkę do zestawu do elektrofizjologii. W przypadku pomiaru hamowania transmisji synaptycznej lub testu mist perfuzja ani kontrola temperatury nie są wymagane. Po przygotowaniu za pomocą wyciągarki do mikropipet dwóch pipet borokrzemowych o oporności od 5 do 10 MΩ, wypełnij jedną z pipet od tyłu buforem do rejestracji wewnątrzkomórkowej.Następnie delikatnie zanurz pipetę w odczynniku silikonowym. Zamocuj pipetę rejestrującą w uchwycie do elektrod i podłącz wypełnioną powietrzem strzykawkę do rurki prowadzącej do uchwytu. Podczas wprowadzania pipety rejestrującej do ERB, za pomocą strzykawki wytwórz stałe nadciśnienie.Po delikatnym przyłożeniu pipety rejestrującej do SOM neuronu, z którego ma być dokonana rejestracja, sprawdź ciśnienie dodatnie, zrywając uszczelnienie strzykawki. Ponownie podłącz strzykawkę i zastosuj stałe ciśnienie ujemne poprzez delikatne zasysanie, aby utworzyć uszczelnienie rzędu gigaomów.Po uzyskaniu uszczelnienia gigaomowego należy obniżyć napięcie podtrzymujące do -70 mV. Następnie, przy użyciu strzykawki, ostrożnie przyłożyć krótkie impulsy podciśnienia, aby przejść do konfiguracji whole-cell. Przez 30 sekund należy monitorować skoki pojemności, aby potwierdzić stabilność patcha.Wyłącz skoki pojemności w oprogramowaniu HEA i przełącz na tryb clamp prądowy, aby monitorować i rejestrować spoczynkowy potencjał błonowy bez korekty o potencjały złącza cieczowego. Spoczynkowy potencjał błonowy może wynosić od minus 67 do minus 82 mV. Ustaw wzmocnienie na 2 mV/pA.Przełącz urządzenie w tryb clamp napięciowy i wykonaj ciągły pomiar przy napięciu -70 mV przez trzy do pięciu minut w celu wykrycia miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych. Przeanalizuj trzy do pięciu minut zarejestrowanych danych w celu wykrycia mEPSC, stosując domyślne ustawienia dla EPC receptorów AMPA w analizie mini, a następnie zbierz i zapisz informacje o wykrytych zdarzeniach. Po zebraniu częstotliwości mEPSC dla ośmiu do 12 kontroli oraz ośmiu do 12 próbek traktowanych neurotoksyną botulinową dla każdego warunku ekspozycji.Przeanalizować częstość w odniesieniu do grup kontrolnych dopasowanych pod względem wieku i partii, a następnie określić istotność statystyczną procentowego zahamowania aktywności synaptycznej przy użyciu odpowiednich testów statystycznych od 7. do 49. dnia in vitro (div). ESN wykazują obecność przedziałów neurotropowych i tworzą punkcje synaptyczne. Interfejsy taksodendrytyczne. ESN podlegają zahamowaniu aktywności synaptycznej po ekspozycji na neurotoksynę botulinową serotypów A, G oraz toksynę tężcową.Te reprezentatywne zapisy z ESN zostały zebrane 20 godzin po dodaniu do kąpieli neurotoksyny botulinowej serotypu A, neurotoksyny tężcowej lub nośnika. Każda neurotoksyna zredukowała aktywność synaptyczną o ponad 95% w porównaniu z kontrolami. Następne cztery obrazy pokazują czułość zastosowania mist do pomiaru aktywności monosynaptycznej w ESN traktowanych neurotoksyną botulinową serotypu A.Ten pierwszy obraz przedstawia reprezentatywne zapisy z pomiarów aktywności synaptycznej wykonanych 20 godzin po dodaniu do kąpieli neurotoksyny botulinowej serotypu A. Fragmenty zapisów z zacisku napięciowego wykazały spadek częstotliwości M-E-P-S-C po ekspozycji na neurotoksynę botulinową serotypu A. Ten obraz przedstawia ilościowe oznaczenie częstotliwości M-E-P-S-C i potwierdza zależny od dawki spadek częstotliwości M-E-P-S-C. Mediana stężenia inhibicyjnego została wyznaczona metodą najmniejszych kwadratów regresji nieliniowej z wykorzystaniem czterech parametrów zmiennego nachylenia. Należy zauważyć, że granica wykrywalności w SNS wynosi co najmniej 0,005 pM.Ten wykres słupkowy przedstawia ilościowe oznaczenie cytometryczne cięcia białka SNAP 25 pomiarowane metodą western blot. Należy zwrócić uwagę na obniżoną czułość cięcia białka SNARE jako wskaźnika intoksykacji. W porównaniu do grupy mist, pojedyncza gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05.Potrójna gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0.001. Wyniki te wykazują, że sieciowe populacje neuronów pochodzących z komórek macierzystych stanowią fizjologicznie istotny model komórkowy zatrucia neurotoksyną klostrydialną. Oczekuje się, że zastosowanie SNS znacząco ograniczy cierpienie i śmiertelność zwierząt, służąc jako odpowiedni zamiennik dla testu letalności u myszy, z dodatkową korzyścią w postaci zwiększonej szybkości, swoistości i czułości.Technika ta otwiera badaczom w dziedzinie neurotoksykologii drogę do zastosowania metod przesiewowych o umiarkowanej przepustowości, opartych na aktywności sieci neuronalnych, co ma ułatwić przesiewy terapeutyczne oraz wykrywanie neurotoksyn klostridialnych.

functional-evaluation-biological-neurotoxins-networked-cultures-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ocena funkcjonalna biologicznych neurotoksyn w sieciowych kulturach neuronów układu nerwowego pochodzenia komórkowego macierzystych

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Film pokazuje analizę elektrofizjologiczną neuronów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych po ekspozycji na neurotoksyny. Traktowanie tych neuronów neurotoksynami botulinowymi zmniejsza częstotliwość spontanicznych miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych, potwierdzając zahamowanie transmisji synaptycznej.

Technika oceny hamującego wpływu ekspozycji na toksyny na miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC)

Ten film demonstruje technikę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w połączoną w sieć populację neuronów z funkcjonującymi synapsami. Przedstawiono w nim etapy związane z różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych w neurony, indukcją tworzenia sieci neuronalnej i wzbogacaniem kultury w neurony połączone w sieć.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Ten film demonstruje metodę identyfikacji neuronów z mieszanej kultury ziarnistych neuronów móżdżku i komórek glejowych za pomocą podwójnego barwienia dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (PI), gdzie żywe neurony wydają się zielone, a martwe neurony czerwone.

Ocena żywotności neuronów w hodowli neuronów móżdżku za pomocą podwójnego barwienia

Ulepszone testy neurotoksyczności in vitro pomogłyby w identyfikacji nowych związków neuroprotekcyjnych. Przedstawiono przydatność analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określania cytotoksyczności i cytoprotekcji w liniach komórek neuronalnych oraz do wyznaczania udziału szlaków drugiego przekaźnika, uzyskując w ten sposób wgląd w mechanizm neuroprotekcji.

Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

W tym artykule przedstawiono eksperymentalny framework do przeprowadzania eksperymentów w pętli zamkniętej, w którym przetwarzanie informacji (tj. kodowanie i dekodowanie) oraz uczenie się zespołów neuronalnych są badane podczas ciągłej interakcji z ciałem robota.

Eksperymenty neurorobotyczne w pętli zamkniętej w celu przetestowania właściwości obliczeniowych sieci neuronowych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Prezentowany protokół opisuje metodę badania wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych.

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Poznaj metodę oceny wpływu neurotoksyn Clostridial na przekaźnictwo synaptyczne w kulturach neuronów pochodzących z mysich komórek macierzystych. Technika ta umożliwia badanie patofizjologii botulizmu i tężca.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów