Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Celem tej procedury jest precyzyjne zmierzenie wpływu neurotoksyn Clostridium na przekaźnictwo synaptyczne w sieciowych kulturach neuronów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Osiąga się to poprzez przystosowanie embrionalnych komórek macierzystych do hodowli zawiesinowej bez komórek i utrzymanie adaptowanych komórek w stanie pluripotencjalnym. Drugim krokiem jest różnicowanie komórek macierzystych przystosowanych do zawiesiny w neurony lub ESN, przy użyciu wariantu techniki różnicowania czterech czterech.

Następnie ESN są traktowane serią pożywek, aby promować dojrzewanie do synaptycznie aktywnych neuronów sieciowych. Ostatnim krokiem jest leczenie ESN clostridim, neurotoksynami lub innymi neurotoksynami i zmierzenie wpływu na aktywność monosynaptyczną za pomocą elektrofizjologii klamrów z całych komórek. Ostatecznie zmiany w spontanicznej produkcji aktywności monosynaptycznej są określane ilościowo na podstawie zapisów elektrofizjologicznych znormalizowanych do wieku i partii dopasowanych neuronów kontrolnych i porównywane między różnymi warunkami, takimi jak dawki, czasy lub leczenie farmakologiczne.

Główną zaletą tej techniki jest to, że ESN są pierwszym modelem komórkowym, który replikuje funkcjonalne patologie odpowiedzialne za kliniczne objawy zatrucia jadem kiełbasianym i tężca. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że ESN były wysoce podatne na wszystkie neurotoksyny clostridialne oparte na rozszczepieniu białek werbla, a także wykazały spontaniczną aktywność synaptyczną w powstającym zachowaniu sieci. Procedurę zademonstruje pani Megan Lyman, technik z mojego laboratorium Rozpocznij od przeniesienia dostosowanej do bezkomórkowej kultury zawiesinowej z podajnika.

ESC agreguje do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i pozwala agregatom osiąść w zwarty granul. Gdy agregaty osiądą, zassaj natant SUP, uważając, aby nie zakłócić osadu komórkowego. Następnie dodaj pięć mililitrów PBS, aby umyć komórki i odwirować w temperaturze 100 razy G przez 2,5 minuty.

Ostrożnie zassaj PBS, a następnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby delikatnie rozbić osad komórkowy. Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez trzy minuty. Po upływie czasu inkubacji umieścić probówkę z powrotem w kapturze do hodowli tkankowej i dodać 500 mikrolitrów pożywki ESC w celu rozcieńczenia trypsyny.

Następnie należy powtórzyć zawiesinę CEL od pięciu do 10 razy za pomocą pipety P 1000, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Policz elokwa komórek za pomocą hemometru, cytometru i odwiruj pozostałą część zawiesiny komórek w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty. Po odessaniu supinatu zawieszamy komórki do końcowego stężenia jednego razy centa, siedem komórek na mililitr z pożywką ESC.

Następnie przenieś 150 mikrolitrów zawiesiny do 10 mililitrów pożywki ESC w 10-centymetrowym naczyniu bakteryjnym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. E ESC są rutynowo pasażowane przy użyciu tego protokołu. Co 48 godzin rozpoczyna się różnicowanie ESC w neurony podczas rutynowego pasażu komórkowego.

Oddziel ESC tak jak poprzednio, ale dołącz dodatkową płytkę do różnicowania neuronów. Przenieś 350 mikrolitrów zawiesiny komórek do 10-centymetrowego naczynia o niskim nasadce zawierającego 25 mililitrów różnicowania. Średni. Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30 do 45 obr./min w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez 48 godzin.

Po 48 godzinach użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść agregaty komórek różnicujących do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Natychmiast po tym dodaj 25 mililitrów świeżego dyferencjału. Podłoże do szalki Petriego.

Pozwól agregatom osiąść przez dwie do pięciu minut, wytwarzając widoczną granulkę o głębokości od jednego do dwóch milimetrów. Ostrożnie zassać pożywkę, ignorując pojedyncze komórki lub małe skupisko pozostające w zawiesinie, a następnie użyć pipety P 1000 w celu przeniesienia palety komórek z powrotem na szalkę Petriego. Włóż naczynie z powrotem do wytrząsarki obrotowej w inkubatorze.

Po kolejnych 48 godzinach powtórz procedurę wymiany nośnika. Tym razem w 30 mililitrach pożywki różnicującej uzupełnionej sześcioma mikromolowymi kwasami trans retinowymi. Utworzony osad będzie miał teraz od dwóch do czterech milimetrów głębokości po inkubacji komórek.

Tak jak poprzednio, powtórz procedurę zmiany podłoża z suplementacją kwasu retinowego po raz ostatni. Następnego dnia granulka będzie miała od czterech do ośmiu milimetrów głębokości. Przygotuj powierzchnie galwaniczne zgodnie z pisemną częścią protokołu po południu w dniu posiewu lub po pięć mililitrów wstępnie powlekanej pożywki trypsynowej MPC i 0,1% inhibitora tryiny sojowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść agregaty różnicujące z płytki hodowlanej do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Pozwól agregatom osiąść przez trzy do pięciu minut, a następnie ostrożnie zassaj podłoże, nie naruszając osadu. Następnie umyj granulat pięcioma do 10 mililitrami PBS i po osiadaniu kruszyw.

Zassać PBS i powtórzyć pranie. Po drugim praniu PBS. Dodaj pięć mililitrów pożywki MPC do osadu i inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Delikatnie przesuwając probówkę dwa do trzech razy podczas inkubacji. Następnie dodaj do komórek pięć mililitrów 0,1% inhibitora trysyny sojowej i szybko wymieszaj, odwracając. Następnie delikatnie rozdrobnij komórki od 10 do 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety, aż do uzyskania stosunkowo jednorodnej zawiesiny komórek.

Powoli przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 lub 70 mikronów umieszczone na 50-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie, gdy cała zawiesina zostanie przefiltrowana do jednego mililitra N dwóch, pożywkę do filtra, aby przepłukać pozostałe komórki przez sitko. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wiruj przez sześć minut przy 200 razy G. Po zassaniu pożywki bez naruszania osadu rozetrzeć w dwóch mililitrach N dwóch pożywki, a następnie dodać N dwie pożywki do całkowitej objętości 10 mililitrów.

Wirować przez pięć minut 200 razy. G. Zassać podłoże i ponownie powtórzyć proces mycia granulek. Resus zawieszający pelety w 10 mililitrach N dwa podłoża.

Usunąć podwielokrotność komórek i policzyć za pomocą cytometru hemologicznego, a następnie powtórzyć wirowanie Reese'a. Zawieś komórki w pożywce N dwa do końcowego stężenia od jednego razy 10 do siedmiu komórek na mililitr i pokryj je gęstością od 150 000 do 200 000 komórek na centymetr kwadratowy. Indyjski przygotowuje się w temperaturze DIV minus jeden i umieszcza w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Utrzymuj ESN-y zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole. Najpierw rozcieńczyć neurotoksynę botulinową serotyp A do 100-krotności pożądanego stężenia końcowego w kulturze ESN, pożywce i ciepłej do 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj odpowiednią ilość toksyny do kultur DIV 21 plus ESN.

Spęcznieć naczynie hodowlane i wróć do inkubatora w żądanym czasie. Punktowo odessać pożywkę hodowlaną ESN i dwukrotnie przemyć zewnątrzkomórkowym buforem rejestrującym lub ERB. Następnie dodaj cztery mililitry ERB uzupełnione pięcioma mikromolowymi tetrodatoksynami w celu zablokowania potencjałów czynnościowych i 10 mikromolowymi bi coline, aby zantagonizować aktywność receptora gabaa.

Następnie przenieś naczynie na stanowisko do elektrofizjologii. Ani perfuzja, ani kontrola temperatury nie są wymagane do mierzonego zahamowania transmisji synaptycznej lub testu mgły. Po użyciu ściągacza do mikropipet do wyciągania pipet krzemianowych o rezystancji od pięciu do 10 megaomów, należy wypełnić pipetę buforem do zapisu wewnątrzkomórkowego.

Następnie delikatnie zanurz pipetę w odczynniku silikonowym. Przymocuj pipetę rejestrującą do uchwytu elektrody i podłącz strzykawkę wypełnioną powietrzem do rurki umieszczonej w uchwycie elektrody. Zapewnić stałe nadciśnienie za pomocą strzykawki, jednocześnie opuszczając pipetę rejestrującą do ERB.

Po delikatnym wylądowaniu pipety rejestrującej na SOR neuronu, który ma być rejestrowany. Sprawdzić nadciśnienie, zrywając uszczelkę na strzykawce. Ponownie podłączyć strzykawkę i stosować stałe podciśnienie poprzez delikatne wdychanie, aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe.

Po uformowaniu uszczelki giga ome zmniejsz napięcie utrzymywania do minus 70 miliwoltów. Następnie ostrożnie zastosuj krótkie impulsy podciśnienia za pomocą strzykawki, aby rozbić się na konfigurację całych komórek. Monitoruj skoki pojemności przez 30 sekund, aby potwierdzić, że poprawka jest stabilna.

Anuluj skoki pojemności w oprogramowaniu HEA i przełącz się na bieżący tryb cęgowania, aby monitorować i rejestrować spoczynkowy potencjał membrany bez regulacji potencjałów złączy cieczy. Spoczynkowy potencjał błony może wynosić od minus 67 do minus 82 miliwoltów. Dostosuj wzmocnienie do dwóch miliwoltów na pico amper.

Przełącz się w tryb cęgów napięcia i wykonuj ciągły zapis minus 70 miliwoltów przez trzy do pięciu minut, aby wykryć miniaturowe wzbudzające, postsynaptyczne prądy. Analizuj od trzech do pięciu minut zarejestrowanych danych, aby wykryć PSC me przy użyciu domyślnych ustawień dla EPC receptora AMPA w mini analizie, zbieraj i zapisuj informacje o wykrytych zdarzeniach. Po zebraniu częstotliwości M-E-P-S-C dla ośmiu do 12 próbek kontrolnych i ośmiu do 12 próbek traktowanych neurotoksyną botulinową dla każdego warunku ekspozycji.

Przeanalizuj częstość w stosunku do grupy kontrolnej dopasowanej do wieku i partii, a następnie określ istotność statystyczną procentowego hamowania aktywności synaptycznej za pomocą odpowiednich testów statystycznych od div 7 do div 49, ESN wyrażają przedziały neurotropowe i tworzą nakłucie synaptyczne. Interfejsy dendrytyczne takso. ESN ulegają zahamowaniu aktywności synaptycznej pod wpływem neurotoksyny botulinowej, serotypów A, TG i toksyny tężcowej.

Te reprezentatywne ślady z ESN pobrano 20 godzin po edycji kąpieli serotypów neurotoksyny botulinowej, tężca A TG, neurotoksyny lub nośnika. Każda neurotoksyna zmniejszała aktywność synaptyczną o ponad 95% w porównaniu z grupą kontrolną. Poniższe cztery obrazy pokazują czułość stosowania mgły do pomiaru aktywności monosynaptycznej w serotypie neurotoksyny botulinowej, ESN traktowanym przez A.

Ten pierwszy obraz pokazuje reprezentatywne ślady z pominiętych pomiarów aktywności synaptycznej 20 godzin po edycji kąpieli neurotoksyny botulinowej serotypu A. Segmenty śladowe clampów napięciowych wykazały spadek częstotliwości M-E-P-S-C po ekspozycji na neurotoksynę botulinową serotyp A. Ten obraz pokazuje ilościowość częstotliwości M-E-P-S-C i potwierdza zależny od dawki spadek częstotliwości M-E-P-S-C. Medianę stężenia hamującego określono za pomocą dopasowania metodą najmniejszych kwadratów regresji nieliniowej przy użyciu nachylenia zmiennej czteroparametrowej. Należy pamiętać, że granica wykrywania przez mgłę w SNS wynosi co najmniej 0,005 pikamolowca.

Ten wykres słupkowy przedstawia ilościowe oznaczanie cytometryczne rozszczepienia SNAP 25 mierzone za pomocą western blot. Zwróć uwagę na zmniejszoną wrażliwość rozszczepienia białka werbla jako odczyt zatrucia. W porównaniu z mgłą, pojedyncza gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05.

Potrójna gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001. Odkrycia te pokazują, że połączone w sieć populacje neuronów pochodzących z komórek macierzystych oferują fizjologicznie istotny, komórkowy model zatrucia neurotoksynami Clostridium. Oczekuje się, że zastosowanie SNS znacznie zmniejszy stres i śmierć zwierząt, służąc jako odpowiedni zamiennik testu śmiertelności myszy, z dodatkową korzyścią w postaci lepszej prędkości, swoistości i czułości.

Technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie neurotoksykologii do stosowania technik badań przesiewowych o umiarkowanej przepustowości opartych na aktywności sieci neuronalnej w celu ułatwienia terapeutycznych badań przesiewowych i wykrywania toksyn w kierunku neurotoksyn Clostridium.