Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Celem niniejszej procedury jest precyzyjny pomiar wpływu neurotoksyn Clostridium na transmisję synaptyczną w sieciowych kulturach neuronów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Jest to realizowane poprzez wstępną adaptację embrionalnych komórek macierzystych do hodowli zawiesinowej bez wykorzystania komórek karmionek oraz utrzymywanie zaadaptowanych komórek w stanie pluripotencyjnym. Drugim krokiem jest różnicowanie zaadaptowanych do zawiesiny komórek macierzystych w neurony lub ESN, z wykorzystaniem modyfikacji techniki różnicowania czterech faz.

Następnie sieci neuronowe pochodzące z embrionów (ESN) poddaje się inkubacji w serii pożywek, aby wspomóc ich dojrzewanie do postaci synaptycznie aktywnych sieci neuronów. Ostatnim etapem jest traktowanie ESN neurotoksynami klostrydy lub innymi neurotoksynami oraz pomiar wpływu tych substancji na aktywność monosynaptyczną z wykorzystaniem elektrofizjologii metodą patch-clamp na całej komórce (whole cell patch clamp). Ostatecznie zmiany w spontanicznej produkcji aktywności monosynaptycznej są kwantyfikowane na podstawie zapisów elektrofizjologicznych, znormalizowanych względem neuronów kontrolnych o tym samym wieku i pochodzących z tej samej partii, a następnie porównywane pomiędzy różnymi warunkami, takimi jak dawki, czasy ekspozycji lub zastosowane leki.

Główną zaletą tej techniki jest to, że ESN są pierwszym modelem komórkowym odtwarzającym patologie funkcjonalne odpowiedzialne za objawy kliniczne botulizmu i tężca. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy odkryliśmy, że ESN są wysoce podatne na wszystkie neurotoksyny klastrydy działające poprzez rozszczepianie białek SNARE, a także wykazują spontaniczną aktywność synaptyczną w wyłaniającym się zachowaniu sieci. Procedurę zaprezentuje pani Megan Lyman, technik z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od przeniesienia zaadaptowanej zawiesiny hodowlanej wolnej od komórek karmicieli.

Przenieś agregaty ESC do 15 mililitrowej probówki stożkowej i pozwól im osiąść w postaci zwartego pelletu. Po osiadnięciu agregatów odessaj nadsącz, uważając, aby nie naruszyć pelletu komórkowego. Następnie dodaj pięć mililitrów PBS w celu przemycia komórek i wiruj przy 100 ×g przez 2,5 minuty.

Ostrożnie odessaj PBS, a następnie dodaj 500 µL trypsyny i kilkukrotnie odwróć probówkę, aby delikatnie rozbić osad komórkowy. Następnie umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubuj przez trzy minuty. Po upływie czasu inkubacji przenieś probówkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i dodaj 500 µL pożywki ESC w celu rozcieńczenia trypsyny.

Następnie pipetą P 1000 wykonaj od pięciu do 10 powtórzeń trituracji zawiesiny CEL, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę. Policz komórki w aliquocie, używając hematocytometru, a pozostałą część zawiesiny komórkowej odwiruj z prędkością 200 ×g przez trzy minuty. Po odessaniu nadsączu, resuspenduj komórki w medium ESC do końcowego stężenia 1 × 10⁷ komórek/ml.

Następnie przenieś 150 µL zawiesiny do 10 mL medium ESC w 10 cm szalce do hodowli bakterii i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2. ESC są rutynowo pasażowane zgodnie z tym protokołem. Co 48 godzin, podczas rutynowego pasażowania komórek, rozpoczyna się różnicowanie ESC w neurony.

Dysocjuj ESC w ten sam sposób co wcześniej, ale przygotuj dodatkową płytkę do różnicowania neuronalnego. Przenieś 350 µL zawiesiny komórkowej do 10 cm naczynia o niskim stopniu przylegania zawierającego 25 mL Medium do różnicowania. Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30–45 RPM w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubuj przez 48 godzin.

Po 48 godzinach, za pomocą pipety 25 ml, przenieś różnicujące się agregaty komórkowe do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie niezwłocznie dodaj 25 ml świeżego pożywki do różnicowania do szalki Petriego.

Pozostaw agregaty do osiadania przez dwie do pięciu minut, aż powstanie widoczny pellet o głębokości od jednego do dwóch milimetrów. Ostrożnie odessaj medium, pomijając pojedyncze komórki lub małe agregaty pozostające w zawiesinie, a następnie za pomocą pipety P 1000 przenieś pellet komórkowy z powrotem do szalki Petriego. Umieść szalkę ponownie na wytrząsarce rotacyjnej w inkubatorze.

Po kolejnych 48 godzinach powtórz procedurę wymiany pożywki. Tym razem użyj 30 ml pożywki do różnicowania uzupełnionej o sześć mikromoli kwasu retinowego (all-trans retinoic acid). Po inkubacji komórek utworzony pellet będzie miał głębokość od dwóch do czterech mm.

Podobnie jak wcześniej, powtórz procedurę wymiany pożywki z dodatkiem kwasu retinowego po raz ostatni. Następnego dnia osad będzie miał głębokość od czterech do ośmiu milimetrów. W popołudnie w dniu wysiewania przygotuj powierzchnie do wysiewania zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu, a także po 5 mL pożywki MPC z trypsyną do wstępnego powlekania oraz 0,1% inhibitora trypsyny z soi w temperaturze 37 °C.

Następnie za pomocą pipety 25 ml przenieść różnicujące się agregaty z płytki hodowlanej do probówki stożkowej 50 ml. Pozostawić agregaty do osiadania przez trzy do pięciu minut, a następnie ostrożnie odessać medium, nie naruszając osadu. Następnie przemyć osad od 5 do 10 ml PBS i odczekać, aż agregaty osiądą.

Odssać PBS i powtórzyć płukanie. Po drugim płukaniu PBS dodać pięć mililitrów medium do MPCyzacji do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut.

Podczas inkubacji należy delikatnie dwa do trzech razy stuknąć probówką. Następnie do komórek dodać 5 ml 0,1% inhibitora trypsyny z soi i szybko wymieszać poprzez odwracanie. Następnie delikatnie utriturować komórki 10 do 15 razy za pomocą pipety 10 ml, aż do uzyskania względnie homogenicznej zawiesiny komórkowej.

Powoli przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o oczkach 40 lub 70 µm umieszczone na probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Po przefiltrowaniu całej zawiesiny dodaj 1 ml medium N2 do filtra, aby wypłukać pozostałe komórki przez sito. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez 6 minut przy 200 ×g. Po odessaniu medium, nie naruszając osadu, rozbij go w 2 ml medium N2, a następnie dopełnij medium N2 do całkowitej objętości 10 ml.

Wiruj przez pięć minut przy 200 ×g. Odsącz medium i ponownie powtórz proces płukania osadu. Resuspenduj osad w 10 ml medium N2.

Pobrać alikwot komórek i policzyć je za pomocą hemocytometru, a następnie powtórzyć wirowanie. Zawiesić komórki w medium N2 do końcowego stężenia 1×10⁷ komórek/ml i wysiać w gęstości od 150 000 do 200 000 komórek/cm². Przygotować płytki w dniu DIV-1 i umieścić je w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C.

Utrzymuj ESN zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Najpierw rozcieńcz neurotoksynę botulinową serotypu A do stężenia 100-krotnie większego niż pożądane stężenie końcowe w pożywce hodowlanej ESN i ogrzej do 37 °C. Następnie dodaj odpowiednią objętość toksyny do kultur ESN w DIV 21.

Napełnij naczynie hodowlane i przenieś je z powrotem do inkubatora na wybrany czas. Odsącz punktowo pożywkę ESN i przemyj dwukrotnie buforem do rejestracji zewnątrzkomórkowej lub ERB. Następnie dodaj cztery mililitry ERB uzupełnionego o pięć mikromoli tetrodotoksyny w celu zablokowania potencjałów czynnościowych oraz 10 mikromoli bikolin w celu antagonizowania aktywności receptorów gabaa.

Następnie przenieś szalkę do zestawu do elektrofizjologii. W przypadku pomiaru hamowania transmisji synaptycznej lub testu mist perfuzja ani kontrola temperatury nie są wymagane. Po przygotowaniu za pomocą wyciągarki do mikropipet dwóch pipet borokrzemowych o oporności od 5 do 10 MΩ, wypełnij jedną z pipet od tyłu buforem do rejestracji wewnątrzkomórkowej.

Następnie delikatnie zanurz pipetę w odczynniku silikonowym. Zamocuj pipetę rejestrującą w uchwycie do elektrod i podłącz wypełnioną powietrzem strzykawkę do rurki prowadzącej do uchwytu. Podczas wprowadzania pipety rejestrującej do ERB, za pomocą strzykawki wytwórz stałe nadciśnienie.

Po delikatnym przyłożeniu pipety rejestrującej do SOM neuronu, z którego ma być dokonana rejestracja, sprawdź ciśnienie dodatnie, zrywając uszczelnienie strzykawki. Ponownie podłącz strzykawkę i zastosuj stałe ciśnienie ujemne poprzez delikatne zasysanie, aby utworzyć uszczelnienie rzędu gigaomów.

Po uzyskaniu uszczelnienia gigaomowego należy obniżyć napięcie podtrzymujące do -70 mV. Następnie, przy użyciu strzykawki, ostrożnie przyłożyć krótkie impulsy podciśnienia, aby przejść do konfiguracji whole-cell. Przez 30 sekund należy monitorować skoki pojemności, aby potwierdzić stabilność patcha.

Wyłącz skoki pojemności w oprogramowaniu HEA i przełącz na tryb clamp prądowy, aby monitorować i rejestrować spoczynkowy potencjał błonowy bez korekty o potencjały złącza cieczowego. Spoczynkowy potencjał błonowy może wynosić od minus 67 do minus 82 mV. Ustaw wzmocnienie na 2 mV/pA.

Przełącz urządzenie w tryb clamp napięciowy i wykonaj ciągły pomiar przy napięciu -70 mV przez trzy do pięciu minut w celu wykrycia miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych. Przeanalizuj trzy do pięciu minut zarejestrowanych danych w celu wykrycia mEPSC, stosując domyślne ustawienia dla EPC receptorów AMPA w analizie mini, a następnie zbierz i zapisz informacje o wykrytych zdarzeniach. Po zebraniu częstotliwości mEPSC dla ośmiu do 12 kontroli oraz ośmiu do 12 próbek traktowanych neurotoksyną botulinową dla każdego warunku ekspozycji.

Przeanalizować częstość w odniesieniu do grup kontrolnych dopasowanych pod względem wieku i partii, a następnie określić istotność statystyczną procentowego zahamowania aktywności synaptycznej przy użyciu odpowiednich testów statystycznych od 7. do 49. dnia in vitro (div). ESN wykazują obecność przedziałów neurotropowych i tworzą punkcje synaptyczne. Interfejsy taksodendrytyczne. ESN podlegają zahamowaniu aktywności synaptycznej po ekspozycji na neurotoksynę botulinową serotypów A, G oraz toksynę tężcową.

Te reprezentatywne zapisy z ESN zostały zebrane 20 godzin po dodaniu do kąpieli neurotoksyny botulinowej serotypu A, neurotoksyny tężcowej lub nośnika. Każda neurotoksyna zredukowała aktywność synaptyczną o ponad 95% w porównaniu z kontrolami. Następne cztery obrazy pokazują czułość zastosowania mist do pomiaru aktywności monosynaptycznej w ESN traktowanych neurotoksyną botulinową serotypu A.

Ten pierwszy obraz przedstawia reprezentatywne zapisy z pomiarów aktywności synaptycznej wykonanych 20 godzin po dodaniu do kąpieli neurotoksyny botulinowej serotypu A. Fragmenty zapisów z zacisku napięciowego wykazały spadek częstotliwości M-E-P-S-C po ekspozycji na neurotoksynę botulinową serotypu A. Ten obraz przedstawia ilościowe oznaczenie częstotliwości M-E-P-S-C i potwierdza zależny od dawki spadek częstotliwości M-E-P-S-C. Mediana stężenia inhibicyjnego została wyznaczona metodą najmniejszych kwadratów regresji nieliniowej z wykorzystaniem czterech parametrów zmiennego nachylenia. Należy zauważyć, że granica wykrywalności w SNS wynosi co najmniej 0,005 pM.

Ten wykres słupkowy przedstawia ilościowe oznaczenie cytometryczne cięcia białka SNAP 25 pomiarowane metodą western blot. Należy zwrócić uwagę na obniżoną czułość cięcia białka SNARE jako wskaźnika intoksykacji. W porównaniu do grupy mist, pojedyncza gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05.

Potrójna gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0.001. Wyniki te wykazują, że sieciowe populacje neuronów pochodzących z komórek macierzystych stanowią fizjologicznie istotny model komórkowy zatrucia neurotoksyną klostrydialną. Oczekuje się, że zastosowanie SNS znacząco ograniczy cierpienie i śmiertelność zwierząt, służąc jako odpowiedni zamiennik dla testu letalności u myszy, z dodatkową korzyścią w postaci zwiększonej szybkości, swoistości i czułości.

Technika ta otwiera badaczom w dziedzinie neurotoksykologii drogę do zastosowania metod przesiewowych o umiarkowanej przepustowości, opartych na aktywności sieci neuronalnych, co ma ułatwić przesiewy terapeutyczne oraz wykrywanie neurotoksyn klostridialnych.