Name: Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę tworzenia ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy z wykorzystaniem stabilizacji szpilką szpikową oraz oceny radiograficznej i histologicznej procesu gojenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy personelowi i weterynarzom z Oddziału Medycyny Porównawczej Szpitala Scott & White, Temple, Texas, za ich nieocenione rady i pomoc podczas rozwoju tej techniki. Praca ta została częściowo sfinansowana przez The Institute for Regenerative Medicine Program Funds, grant Scott & White RGP #90172, NIH 2P40RR017447-07 i NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Dziękujemy dr Suzanne Zeitouni za korektę manuskryptu.

<ol><li>Brinker, M. R., O'Connor, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+fractures+and+dislocations+referred+for+orthopaedic+services+in+a+capitated+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population.</a> J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).</li>
<li>Cheung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Podiatr+Med+Surg%22%5BJournal%5D)">The future of bone healing.</a> Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).</li>
<li>Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).</li>
<li>Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+long-bone+non-unions%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Prevalence of long-bone non-unions.</a> Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).</li>
<li>Marsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+fracture+union%2C+delayed+union%2C+and+nonunion%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion.</a> Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).</li>
<li>Spicer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bone+regeneration+using+the+rat+critical+size+calvarial+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect.</a> Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).</li>
<li>Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors%2C+treatment%2C+and+outcomes+associated+with+nonunion+of+the+midshaft+humerus+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Orthop+Adv%22%5BJournal%5D)">Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture.</a> J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).</li>
<li>Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+health+economics+of+the+treatment+of+long-bone+non-unions%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">The health economics of the treatment of long-bone non-unions.</a> Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).</li>
<li>Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+following+autologous+bone+graft+harvesting+from+the+iliac+crest+and+using+the+RIA%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review.</a> Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).</li>
<li>Boer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+bone+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">The history of bone grafts.</a> Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).</li>
<li>Aro, H. T., Aho, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+bone+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical use of bone allografts.</a> Ann Med. 25, 403-412 (1993).</li>
<li>Burstein, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac.+J%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes.</a> Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).</li>
<li>Kao, S. T., Scott, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+bone+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Maxillofac+Surg+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">A review of bone substitutes.</a> Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).</li>
<li>Boden, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+biology+of+lumbar+spine+fusion+and+principles+for+selecting+a+bone+graft+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute.</a> Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).</li>
<li>Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+size+defect+as+an+experimental+model+to+test+bone+repair+materials%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniofac+Surg%22%5BJournal%5D)">The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials).</a> J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).</li>
<li>Key, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+local+calcium+depot+on+osteogenesis+and+healing+of+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+%28Am%29%22%5BJournal%5D)">The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures.</a> J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).</li>
<li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration).</a> J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).</li>
<li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+bone+healing+models%3A+standards%2C+tips%2C+and+pitfalls+results+of+a+consensus+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting.</a> Bone. 49, 591-599 (2011).</li>
<li>Cheung, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+externally+fixed+femoral+fracture+model+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">An externally fixed femoral fracture model for mice.</a> J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).</li>
<li>Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+experimental+fracture+in+the+mouse+tibia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">A standardized experimental fracture in the mouse tibia.</a> J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).</li>
<li>Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+closed+femur+fracture+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Characterization of a closed femur fracture model in mice.</a> J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+reliable+non-union+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a reliable non-union model in mice.</a> J Surg Res. 147, 84-91 (2008).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relief+of+pain+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The relief of pain in laboratory animals.</a> Lab Anim. 18, 147-160 (1984).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+on+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines on the Euthanasia of Animals</a>. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).</li>
<li>Neill, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50, 1357-1367 (2012).</li>
<li>Bagi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+micro-CT+to+evaluate+cortical+bone+geometry+and+strength+in+nude+rats%3A+correlation+with+mechanical+testing%2C+pQCT+and+DXA%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA.</a> Bone. 38, 136-144 (2006).</li>
<li>Hadjiargyrou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+bone+regeneration.+Insight+into+the+molecular+complexity+of+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair.</a> J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).</li>
<li>Clough, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+regeneration+with+osteogenically+enhanced+mesenchymal+stem+cells+and+their+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins.</a> J Bone Miner Res. , (2014).</li>
<li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+for+age-related+changes+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular basis for age-related changes in fracture repair.</a> J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).</li>
<li>Jepsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+patterns+of+skeletal+progenitor+cell+differentiation+and+progression+during+endochondral+bone+formation+affects+the+rate+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing.</a> J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).</li>
<li>Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonobese+diabetic+mice+to+understand+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Metab+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).</li>
<li>Jee, W. S., Yao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+animal+models+of+osteopenia+and+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisujemy prostą metodę generowania krytycznej wielkości stabilizowanego szpilkowo ubytku mysiej kości udowej przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i weterynaryjnego. Chociaż montaż szpilek i sam zabieg chirurgiczny wymaga praktyki, leży w zakresie możliwości dobrze wyszkolonego naukowca zajmującego się badaniami biomedycznymi lub weterynarza.
Szpilka jest umieszczana w kanale szpikowym bez dodatkowego mocowania, dzięki czemu procedura jest technicznie bardziej wykona...

Szacuje się, że połowa populacji USA dozna złamania do 65. roku życia1. W przypadku pacjentów, u których złamania leczono chirurgicznie, 500 000 procedur obejmuje zastosowanie przeszczepu kostnego2, a liczba ta prawdopodobnie wzrośnie wraz z postępującym starzeniem się społeczeństwa3. Choć kość jest jednym z niewielu organów zdolnych do całkowitego wygojenia bez powstawania blizn, zdarzają się przypadki, w których proces ten nie powodzi się3,4. W zależności od okoliczności i jakości leczenia od 2% do 30% złamań kości długich nie goi się prawidłowo, prowadząc do braku zrostu3,5. Mimo że definicja ta jest wciąż przedmiotem dyskusji, rzekomy staw (pseudoartroza) oraz urazy kostne o rozmiarze krytycznym lub brak zrostu odnosi się zazwyczaj do urazu, który nie goi się w naturalnym cyklu życia badanego obiektu6. W celach eksperymentalnych czas ten skraca się do średniego czasu wymaganego do całkowitego wygojenia urazu kości o przeciętnej wielkości. Zmiany kostne z brakiem zrostu występują z wielu powodów, jednak głównymi czynnikami są: ciężka trauma prowadząca do powstania szczeliny o rozmiarze krytycznym, infekcja, słaba angiogeneza, palenie tytoniu lub ograniczona zdolność do osteoregeneracji spowodowana chorobą lub wiekiem7. Nawet jeśli brak zrostu zostanie pomyślnie leczony, koszt jednej procedury może przekroczyć 60 000 USD, w zależności od rodzaju urazu i zastosowanych metod8.
W przypadkach o umiarkowanym nasileniu stosuje się autologiczne przeszczepy kostne. Strategia ta polega na pobraniu kości z miejsca dawcy i implantacji w miejscu urazu. Chociaż podejście to jest niezwykle skuteczne, objętość dostępnej kości pochodzącej od dawcy jest ograniczona, a procedura wymaga dodatkowej operacji, co u wielu pacjentów skutkuje uporczywym bólem9,10. Ponadto skuteczność autologicznego przeszczepu kostnego zależy od stanu zdrowia pacjenta. Substytuty kostne wykonane z materiałów syntetycznych lub przetworzonej kości zwłokowej są szeroko dostępne11-13, lecz posiadają istotne ograniczenia, w tym słabe właściwości adhezyjne komórek gospodarza, zmniejszoną osteokonduktywność oraz ryzyko odrzucenia immunologicznego14. Istnieje zatem pilna potrzeba opracowania technologii regeneracji kości, które byłyby bezpieczne, skuteczne i powszechnie dostępne.
Nasza zdolność do udoskonalania strategii regeneracji kości jest krytycznie zależna od możliwości odwzorowania poważnych urazów kostnych u zwierząt doświadczalnych, jednak tworzenie i stabilizacja dużych ubytków kostnych stanowią wyzwanie techniczne. W większości przypadków poważne urazy kości długich imituje się eksperymentalnie poprzez stworzenie defektu, który nie ulegnie naturalnemu zagojeniu. Choć może to być zależne od gatunku15, osiąga się to poprzez całkowite usunięcie segmentu kości, którego długość przekracza 1,5-krotność średnicy przekroju kości16. Następnie kość stabilizuje się za pomocą metalowego implantu, aby zachować właściwą orientację krawędzi złamania i umożliwić mobilność. Ze względu na niewielkie rozmiary i kruchość kości długich u myszy, tworzenie takich ubytków wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W związku z tym modele defektów kości długich ograniczają się do szczurów i większych zwierząt. Niemniej jednak myszy oferują istotne zalety badawcze, ponieważ mogą być modyfikowane genetycznie i hodowane jako szczepy z niedoborem odporności, które nie odrzucają ludzkich komórek i tkanek.
W zastosowaniach opartych na ludzkich komórkach myszy z niedoborem odporności są atrakcyjnym modelem badawczym, ponieważ są one dobrze scharakteryzowane fizjologicznie, łatwe w utrzymaniu, ekonomiczne oraz podlegają łatwej analizie radiologicznej i histologicznej. Kluczowe jest to, że myszy z niedoborem odporności nie odrzucają komórek z innych gatunków, w tym z gatunku ludzkiego. Ich niewielki rozmiar pozwala również na testowanie bardzo małych liczb komórek lub objętości rusztowań eksperymentalnych w zastosowaniach ortopedycznych. Opisano kilka mysich modeli ortopedycznych, które zapewniają różny stopień stabilności kości17,18. Systemy zapewniające bardzo wysoką stabilność, takie jak stabilizatory zewnętrzne i płyty blokowane, goją się głównie poprzez kostnienie błoniaste, choć zgłaszano również gojenie chrzęstno-kostne19. W przeciwieństwie do nich, systemy dopuszczające pewien stopień mikro- i/lub makroruchów, np. te wykorzystujące nieustabilizowane lub częściowo ustabilizowane gwoździe śródszpikowe, zazwyczaj goją się z przewagą kostnienia chrzęstnego20,21. Defekty z opóźnionym zrostem lub brakiem zrostu kości długich są szczególnie trudne do uzyskania u myszy ze względu na wymaganą dodatkową stabilizację. Jednakże opisano szereg podejść, w tym zastosowanie gwoździ śródszpikowych z gwoździem blokowanym, płyt blokowanych oraz stabilizatorów zewnętrznych22. Systemy te zazwyczaj działają dobrze, ale ze względu na ich skomplikowaną konstrukcję mogą być technicznie trudne w implantacji. Na przykład Garcia et al.23 opracowali elegancki system gwoździ blokowanych do zastosowania u myszy, jednak procedura ta wymaga nacięć w dwóch oddzielnych miejscach i rozległej modyfikacji kości udowej w celu dopasowania gwoździ. Procedury te były przeprowadzane pod mikroskopem dissectingowym.
W niniejszym opracowaniu opisujemy prosty gwóźdź śródszpikowy kości udowej z centralnym kołnierzem, zaprojektowany w celu zapobiegania zamykaniu się 3 mm ubytku kostnego oraz wyznaczenia pierwotnych krawędzi defektu. Chociaż gwóźdź nie był utrwalony do samej kości, precyzyjne dopasowanie średnicy gwoździa oraz rozwiercanie jamy szpiku zapewniają wystarczające zaklinowanie, aby zminimalizować ruchy skrętne (Rycina 1). Dzięki starannemu doborowi myszy inbredowych o tym samym wieku, płci i szczepie, wynikiem jest wysoce powtarzalny ubytek z przerostowym brakiem zrostu22, który można łatwo ocenić radiologicznie. Ponadto, po mikrotomografii komputerowej (µCT), można powtarzalnie zdefiniować obszary zainteresowania w celu pomiaru tworzenia kości de novo oraz parametrów histomorfologicznych. Gwoździe zostały opracowane prototypowo w naszym laboratorium przy użyciu ogólnodostępnych narzędzi.
<img alt="Schemat belki konstrukcyjnej z wymiarami; ilustracja montażu i projektu mechanicznego." src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zasada eksperymentu. Schematyczne podsumowanie modelu ubytku segmentowego. Centralny odcinek o długości 3 mm kości udowej myszy o długości 9-10 mm jest usuwany chirurgicznie (lewo). Chirurgiczna rurka ze stali o średnicy 19 G i długości 3 mm jest nasuwana na rurkę ze stali nierdzewnej o średnicy 22 G i długości 9 mm, a następnie mocowana klejem dokładnie w centrum (prawo). Powstały pin jest wprowadzany do kanałów szpikowych pozostałych części proksymalnej i dystalnej kości udowej, przy czym kołnierz 19 G zastępuje 3 mm segmentu kości (poniżej, centrum).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Zestaw pinów</td></tr><tr><td>Narzędzie obrotowe Dremel</td><td>8220</td><td>lub równoważne</td><td></td></tr><tr><td>Wytrzymałe koło do cięcia</td><td>Dremel</td><td>420</td><td></td></tr><tr><td>Rurki chirurgiczne 19&nbsp; G</td><td>Małe części (Amazon)</td><td>B000FMZ8LY</td><td>OD 1.07&nbsp; mm, ID 0,889&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Rurka chirurgiczna 21&nbsp; G</td><td>Małe części (Amazon)</td><td>B000FMZ8YQ</td><td>OD 0,82&nbsp; mm, ID 0,635&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Rurka chirurgiczna 22&nbsp; G</td><td>Małe części (Amazon)</td><td>B000FMYLZS</td><td>OD 0,719&nbsp; mm, ID 0,502&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Rurka chirurgiczna 23&nbsp; G</td><td>Małe części (Amazon)</td><td>B000FN0SY0</td><td>OD 0,643&nbsp; mm, średnica wewnętrzna 0,444&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td></td></tr><tr><td>Ściernica</td><td>Dremel</td><td>413</td><td></td></tr><tr><td>Gumowy trzpień polerski</td><td>Dremel</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Filcowa tarcza polerska</td><td>Dremel</td><td>414</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka żelatynowa</td><td>Surgifoam/Ethicon</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do biopsji stempla</td><td>Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Surgery/pooperacyjny</td></tr><tr><td>Ciepła podkładka i pompa cyrkulacyjna</td><td>Stryker/Thermocare</td><td>TP700, TP700C, TPP722</td><td></td></tr><tr><td>Zasięg czwartorzędowy spray</td><td>Steris</td><td>1429-77</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator koralików</td><td>Germinator/CellPoint Scentific</td><td>Germinator 500</td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny</td><td>VetEquip Inc</td><td>901806 lub 901807/901809</td><td></td></tr><tr><td>Izofluoran znieczulający</td><td>VETone/MWI</td><td>501017, 502017</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczny środek dezynfekujący</td><td>Chloraprep/CareFusion</td><td>260449</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>różne</td><td>polecają Niemiecka</td></tr><tr><td>ochrona twarzy</td><td>Splash Shield</td><td>4505</td><td></td></tr><tr><td>Akumulatorowa wiertarka szybkoobrotowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowa tarcza tnąca</td><td>Strauss Diaiond</td><td>361.514.080HP</td><td></td></tr><tr><td>Szwy wchłanialne&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>UM-213</td><td></td></tr><tr><td>Szwy zewnętrzne</td><td>Ethicon</td><td>668G</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Żel nawilżający</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-1082</td><td></td></tr><tr><td>Żel dietetyczny</td><td>Clear H2O</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Reckitt i Benckser</td><td>12496-0757-01</td><td>substancja kontrolowana</td></tr><tr><td>Igloo myszy</td><td>Bio Serv</td><td>K3328, 3570,3327</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl eutanazyjny</td><td>Euthasol/Virbac</td><td>710101</td><td>substancja</td></tr><tr> kontrolowana<td colspan="4">Analysis</td></tr><tr><td>Live animal imager&nbsp;</td><td>Orthoscan</td><td>FD Pulse</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Jednostka Micro-CT i oprogramowanie</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1174</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca/Parafilm M</td><td>VWR lub Fisher</td><td>100501-338, S37441</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Źródła ogólne są odpowiednie dla wszystkich innych przedmiotów, takich jak gause, zasłony, odzież ochronna, sprzęt do pielęgnacji zwierząt.</td></tr></tbody></table>

prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Chociaż kość ma niezwykłą zdolność do regeneracji, poważne urazy kości często skutkują uszkodzeniami, które nie goją się prawidłowo. W rzeczywistości jedna dziesiąta wszystkich złamań kości kończyn nie goi się całkowicie ze względu na zakres urazu, chorobę lub wiek pacjenta. Nasza zdolność do poprawy strategii regeneracji kości jest krytycznie zależna od zdolności do naśladowania poważnych urazów kości u zwierząt doświadczalnych, ale generowanie i stabilizacja dużych zmian kostnych jest technicznie trudne. W większości przypadków poważny uraz kości długiej jest naśladowany eksperymentalnie poprzez ustalenie defektu, który nie goi się w sposób naturalny. Osiąga się to poprzez całkowite usunięcie segmentu kostnego, który jest większy niż 1,5-krotność średnicy przekroju poprzecznego kości. Kość jest następnie stabilizowana za pomocą metalowego implantu, aby utrzymać prawidłową orientację krawędzi złamania i umożliwić mobilność. 
Ze względu na ich mały rozmiar i kruchość ich długich kości, ustalenie takich zmian u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W związku z tym modele ubytków kości długich są ograniczone do szczurów i większych zwierząt. Niemniej jednak myszy dają znaczące korzyści badawcze, ponieważ mogą być genetycznie modyfikowane i hodowane jako szczepy o obniżonej odporności, które nie odrzucają ludzkich komórek i tkanek.
Tutaj demonstrujemy technikę, która ułatwia generowanie segmentalnego defektu w kości udowej myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i weterynaryjnego. Przy odrobinie wprawy wyprodukowanie urządzenia mocującego i implantacji chirurgicznej jest możliwe dla większości przeszkolonych lekarzy weterynarii i personelu badawczego na zwierzętach. Korzystając z przykładowych danych, udostępniamy również metodologie analizy ilościowej gojenia się kości dla modelu.

Myszy zazwyczaj odzyskują przytomność i ruchomość kończyn tylnych od 5 do 10 minut po wycofaniu znieczulenia. W ciągu pierwszych 5 dni zaleca się trzymanie myszy indywidualnie oraz wprowadzenie wzbogacenia środowiskowego, aby zapobiec nadmiernemu obciążeniu kończyny. W tym celu gniazda typu igloo ograniczają potrzebę budowania gniazda i sprzyjają odpoczynkowi. Zaobserwowaliśmy również, że podawanie pokarmu i hydrożelu bezpośrednio na dno klatki zmniejsza prawdopodobieństwo przemieszczenia się pinów. W okresie 5 dni leki ...

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie prostego, eksperymentalnego defektu o rozmiarze krytycznym w kości udowej myszy. Jest to realizowane poprzez przygotowanie w pierwszym kroku gwoździa śródszpikowego z chirurgicznej rurki stalowej. W drugim kroku w kości udowej znieczulonej myszy wytwarzany jest defekt o rozmiarze krytycznym.Następnie implantuje się pin w celu stabilizacji kości. Ostatecznie, do oceny stopnia gojenia kości można wykorzystać radiografię oraz histologię. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kość mocować wyłącznie za pomocą kleszczyków i upewnić się, że kołnierz przylega do krawędzi przeciętej kości.Zacznij od naniesienia 10 µL kleju cyjanoakrylowego na środek trzpienia dziewięciomilimetrowego odcinka igły podskórnej ze stali nierdzewnej o rozmiarze 22 G. Nasuń trzymilimetrowy kołnierz na trzpień, aż dotrze on do centrum, a następnie obróć go, aby równomiernie rozprowadzić klej pomiędzy kołnierzem a trzpieniem, zgodnie z ilustracją. W zależności od konkretnych celów badania oraz charakterystyki biorcy można opracować prototypy różnych konfiguracji pinów.Następnie należy zmierzyć wymiary trzpienia za pomocą suwmiarki cyfrowej. Każda sekcja powinna mieć około 3 mm długości. Pozostawić kołnierz do utwardzenia na co najmniej 15 h, a następnie użyć tarczy z tlenkiem glinu o ziarnistości 20, aby usunąć wszelkie zadziory lub nadmiar kleju.Następnie należy użyć narzędzia rotacyjnego do wypolerowania pinu za pomocą filcowej tarczy polerskiej, a następnie opłukać pin wodą dejonizowaną i osuszyć go sprężonym powietrzem. Teraz należy sprawdzić integralność, umieszczając tępe igłę hipodermiczną o rozmiarze 19 G nad trzpieniem pinu i dociskając igłę do kołnierza, aby potwierdzić, że kołnierz wytrzymuje obciążenie wynoszące około 25 g. Następnie pin należy opłukać w sterylnym filtrowanym PBS i sprawdzić dopasowanie, wsuwając pin do jamistej części kości udowej preparatu kostnego, upewniając się, że trzpień przylega ściśle, a kołnierz znajduje się na równi z krawędziami przeciętej kości.Należy upewnić się, że końcówka pinu penetruje również kość beleczkową trzonu, aby zmaksymalizować stabilizację i poprawić dopasowanie ciasne. Za pomocą noża do biopsji skóry należy wyciąć cylinder gąbki żelatynowej o średnicy 3 mm i przebić jego środek igłą 21 G. Następnie należy wprowadzić cylinder gąbki żelatynowej i wyrównać go z kołnierzem.Na koniec wysterylizuj pin w autoklawie w cyklu suszenia w temperaturze 120 °C i pod ciśnieniem 15 PSI. Pianka wyschnie i ściemnieje. Po potwierdzeniu sedacji odpowiednią, zatwierdzoną instytucjonalnie metodą, rozpocznij procedurę chirurgiczną, kładąc znieczulone zwierzę z kończynami tylnymi skierowanymi do góry na sterylnym polu operacyjnym.Nanieś maść do oczu zwierzęciu, a następnie po usunięciu futra przykryj zwierzę czystym polem operacyjnym z otworem i zlokalizuj bliższy i dalszy koniec kości udowej. Wykonaj nacięcie skóry na długości od 5 do 10 mm wzdłuż osi podłużnej. Następnie użyj skalpela nr 15, aby oddzielić warstwę skóry od powięzi, odsłaniając boczny dostęp do kości udowej poprzez mięsień dwugłowy ramienia (dla MAs) oraz mięsień obszerny boczny.Zlokalizuj miejsce, w którym spotykają się przegrody obu mięśni. Wzdłuż linii białej tkanki widocznej na tle różowego zabarwienia mięśnia ostrożnie wykonaj skalpelem nacięcie wzdłuż tej granicy międzymięśniowej, aż do momentu odsłonięcia kości udowej. Następnie, używając tępego zgłębika okostnowego, poszerz nacięcie, aby odsłonić całą trzon.Następnie należy dodatkowo odsłonić środkowe dwie trzecie kości udowej, dbając o zachowanie tylnego pęczka naczyniowo-nerwowego po stronie przyśrodkowej. Za pomocą skalpela delikatnie zeskrobać tkankę miękką z kości, a następnie osuszyć kość sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką. Teraz należy użyć sterylnej linijki lub suwmiarki, aby zlokalizować środek kości udowej i zaznaczyć na kości punkt oddalony o około 1.5 mm w kierunku dystalnym od środka.Następnie delikatnie chwyć kość udową za pomocą pęsety z wąskimi końcówkami, przygotowanej zgodnie z aktualnym standardem, i użyj precyzyjnego wiertła z zamontowaną tarczą tnącą powleczoną drobnym diamentem, aby wykonać pierwsze cięcie, pozostawiając w miejscuy podważak w celu ochrony tkanek. Poniżej. Unieś przeciętą kość udową pod kątem 45 stopni, mocno trzymając koniec trzonu. Wykonaj drugie cięcie, usuwając segment o długości 3 mm, przy jednoczesnej immobilizacji kości za pomocą pęsety.Ostrożnie rozszerz jamy szpikowe każdego z końców za pomocą tępej igły hipodermicznej o rozmiarze 23 G. Następnie, używając gotowego pogłębiacza wykonanego z odcinka rurki o rozmiarze 22 G umieszczonej w rurce o rozmiarze 19 G, potwierdź, że głębokość jamy wynosi 3 mm. Gdy kość będzie gotowa, wprowadź przygotowany trzpień najpierw do proksymalnej, a następnie do dystalnej jamy szpikowej, aby przywrócić kości udowej jej pierwotną długość i utworzyć stabilną szczelinę o szerokości 3 mm.Należy upewnić się, że pin ściśle przylega do obu jam szpikowych, a krawędzie przeciętej kości są zrównane z kołnierzem. Następnie należy przywrócić na miejsce mięśnie i tkanki obwodowe nad pinem i zamknąć je ciągłym szwem wchłanialnym 5-0. Skórę należy zamknąć szwem nylonowym 5-7 węzłem kwadratowym oraz szwami 5-0, a następnie zabezpieczyć nacięcie chirurgicznym klejem do zwierząt.Zutylizowano zgodnie z wytycznymi AVMA oraz zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Po dwóch do pięciu tygodniach odsłonięto bliższą część kości udowej oraz miednicę od strony przyśrodkowej zwierzęcia, aby ostrożnie wypreparować kończynę tylną. Następnie delikatnie uciśnięto staw do wewnątrz od strony bocznej kończyny, używając skalpela do oddzielenia głowy kości udowej od panewki.Za pomocą ostrego skalpela odetnij pozostałe mięśnie i skórę, uwalniając całą kończynę z miednicy. Następnie odetnij nadmiar tkanki oraz dolną część kończyny tylnej około pięciu milimetrów poniżej stawu kolanowego i usuń skórę, pozostawiając mięśnie na miejscu. Następnie utrwal tkankę w 10% Buffered formin uzupełnionym o fiksator 10 millimolar calcium chloride przez jeden tydzień, a następnie przechowuj w PBS uzupełnionym o 10 millimolar calcium chloride do jednego miesiąca przed obrazowaniem.Aby przeanalizować preparaty, należy owinąć tkanki cienką warstwą folii plastikowej i ustawić je pionowo, pojedynczo. W komorze obrazowania mikro-CT należy ustawić parametry skanowania zgodnie z poniższymi wytycznymi.Napięcie do 29 kilowoltów, natężenie prądu do 661 miliamperów, moc do 19 watów. Rozmiar piksela obrazu do 21 mikronów. Obrót o 360 stopni: tak, uśrednianie klatek: włączone, krok obrotu: jeden stopień, ruchy losowe: włączone.W miarę pozyskiwania poszczególnych obrazów, należy zapisywać je jako pliki jpeg w jednym folderze docelowym dla każdego skanu. Następnie, wykorzystując obrazy osiowe oraz oprogramowanie analityczne dla każdego pliku, należy wybrać przekroje obejmujące wyłącznie kołnierz, aby wyznaczyć proksymalną i dystalną krawędź pierwotnego ubytku oraz zdefiniować obszar zainteresowania. Na koniec należy wyrysować strefę wykluczenia z marginesem 100 micron wokół kołnierza, aby wyłączyć go z obliczeń, a następnie przenieść tę strefę na każdy z przekrojów w obszarze zainteresowania.Bez interwencji terapeutycznej krawędzie ubytku zazwyczaj rozszerzają się o 0.5 mm w ciągu pierwszych 21 dni po operacji. Po 14 do 21 dniach gojenia objętość nowo powstałej kości można łatwo określić na podstawie obrazów osiowych uzyskanych w wyniku mikro-tomografii komputerowej (micro CT). Objętość nowo powstałej kości zwiększa się wraz z upływem czasu, lecz zazwyczaj nie przekracza łącznie 1 mm³.W przypadku braku interwencji terapeutycznej po 21 dniach, polarny moment bezwładności nowo powstałej kości w odległości 0,25 mm od krawędzi ubytku mieści się w zakresie od 0,05 do 0,35 mm⁴, w porównaniu do 0,02–0,08 mm⁴ w centrum ubytku. Dalsze potwierdzenie obecności braku zrostu w przypadkach nieleczonych, co przedstawiono na tym reprezentatywnym obrazie, umożliwia barwienie metodą Massona (trichrom) dekalcyfikowanych przekrojów podłużnych, pozwalając na wizualizację endochondralnego wzrostu kości z czołem chrząstki, za którym następuje kość gąbczasta. Chociaż podczas sekcji nieuniknione są pewne uszkodzenia, przy ostrożnym usunięciu pinu struktura histologiczna kości i tkanki łącznej pozostanie wyraźna.Alternatywnie można przeprowadzić zatapianie w metakrylanie metylu i krojenie nieodwapnionych sekcji z zachowaniem ich pierwotnego ułożenia. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 30 minut. Po zastosowaniu tej procedury w odzyskanej tkance można przeprowadzić metody takie jak CAR TPCR Microarray lub immuno-blotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: w jaki sposób określone genotypy komórek, białka, a nawet związki wpływają na naprawę kości? W naszych badaniach stosujemy ludzkie komórki i ludzkie białka u myszy z niedoborem odporności.

a-simple-critical-sized-femoral-defect-model-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prosty krytycznie rozmiarowany model defektu kości udowej u myszy

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną technikę osteosyntezy wykorzystującą śródszpikową do standaryzowanej stabilizacji złamań kości udowej, która może być wykorzystana do analizy endochrzęstnego gojenia kości u myszy.

Minimalnie inwazyjny model do analizy gojenia złamań śródchrzęstnych u myszy w standaryzowanych warunkach biomechanicznych

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Modele in vivo krytycznych wymiarów kości u ssaków są niezbędne dla badaczy badających mechanizmy leczenia i terapie ortopedyczne. W tym miejscu wprowadzamy protokół tworzenia powtarzalnych, segmentowych ubytków kości udowej u szczurów stabilizowanych za pomocą stabilizacji zewnętrznej.

Wiarygodny i powtarzalny model segmentalnej wady kości udowej o krytycznej wielkości u szczurów stabilizowany za pomocą niestandardowego stabilizatora zewnętrznego

Ten protokół opisuje metodę wykonywania złamań u dorosłych myszy i monitorowania procesu gojenia.

Złamanie poprzeczne kości udowej myszy ze sworzniem stabilizującym

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Badanie to ustanowiło model defektu półsegmentalnego szczura kości udowej do oceny mechanicznej i osteogenicznej wydajności materiałów zastępczych kości w warunkach nośnych, bez użycia wewnętrznego lub zewnętrznego fiksacji.

Model defektu kości dwułopowatej półsegmentalnej u szczurów do oceny wydajności substytucji kości w obszarach nośnych

Aby ocenić nowe paradygmaty terapeutyczne w leczeniu glejaka, niezbędne są modele istotne fizjologicznie. Wykorzystujemy procedurę z implantowalną śrubą prowadzącą do tworzenia ksenograftów wewnątrzczaszkowych, która jest szybsza i bezpieczniejsza niż podejścia stereotaktyczne.

Prosta metoda prowadnicy śrubowej do badań ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych u myszy

Niniejszy artykuł opisuje metodę stabilizacji złamań kości długich opartą na zastosowaniu zmodyfikowanych zewnętrznych stabilizatorów Ilizarova 1-3. Po zastosowaniu stabilizatorów i wywołaniu urazu kostnego można oceniać proces gojenia, przeprowadzać osteogenezę dystrakcyjną lub tworzyć staw rzekomy bądź defekt o rozmiarze krytycznym w celu badania interwencji terapeutycznych.

Tworzenie sztywno stabilizowanych złamań do oceny kostnienia błonowego, osteogenezy dystrakcyjnej lub gojenia ubytków o rozmiarze krytycznym

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Poznaj metodę tworzenia ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy z wykorzystaniem stabilizacji szpilką szpikową oraz oceny radiograficznej i histologicznej procesu gojenia.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

Przeglądaj więcej filmów