Name: Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności transportu jonów chlorkowych w proteoliposomach z użyciem elektrody chlorkowej. Technika umożliwia ilościowe określenie jednostkowej szybkości transportu i geometrii kompleksu białkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez GM085232 grantowe NIH oraz nagrodę Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (dla AA).

1. Przygotowanie lipidów
<ol>
	<li>Odważ odpowiednią ilość lipidów do przezroczystej probówki szklanej. Należy użyć ekstraktu lipidów polarnych z E. coli, jednak można zastosować większość składów lipidowych. Jeśli lipidy są w formie proszku, resuspender je w chloroformie do stężenia 20 mg/ml. Suszyć lipidy w temperaturze RT pod strumieniem gazu N2 aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.</li>
	<li>Resuspender lipidy w pentanie i ponownie wysuszyć stałym strumieniem gazu N2, aby usunąć pozostałe ślady chloroformu. Suszyć do całkowitego odparowania rozpuszczalnika. Podczas suszenia delikatnie obracać probówkę, aby lipid utworzył jednolity film pokrywający dolną jedną trzecią probówki, zamiast formować gęstą masę na dnie.</li>
	<li>Dodać bufor do rekonstytucji zawierający detergent (300 mM KCl, 50 mM kwasu cytrynowego, 25 mM K2HPO4, pH 4.5, 35 mM CHAPS), aby rozpuścić lipidy. W przypadku białek o niskiej tolerancji na CHAPS, na tym etapie należy zastosować inne łagodne detergenty.</li>
	<li>Resuspender lipidy do uzyskania klarowności za pomocą sonikatora w kąpieli wodnej. Zanurzyć probówkę w centrum kąpieli sonikatora na maksymalnej mocy, stosując krótkie impulsy (30 sec-1 min) z krótkimi przerwami (30 sec-1 min). Roztwór powinien stać się klarowny. 
	UWAGA: Końcowy stopień uzyskano klarowności zależy od zastosowanego konkretnego składu lipidów. Na tym etapie możliwa jest również pewna zmienność między partiami, nawet w przypadku nominalnie identycznych lipidów. Pozostała mętność wynika z rozpraszania światła przez duże cząstki w zawiesinie, co można usunąć poprzez wirowanie.</li>
	<li>Inkubować resuspenderowane lipidy w temperaturze RT przez 20-60 min.</li>
</ol>
2. Tworzenie proteoliposomów
UWAGA: W celu wprowadzenia białka solubilizowanego detergentem do liposomów można zastosować kilka strategii. W przypadku CLC-ec1 dobrze sprawdza się dializa i jest ona zatem preferowaną metodą 6,9,10.
<ol>
	<li>Dodaj oczyszczone białko, aby uzyskać pożądany stosunek białka do lipidów (P/L) (wyrażony w µg białka/mg lipidów). Wybór stosunku P/L zależy od celu eksperymentu.
	<ol>
		<li>Jeśli celem jest ocena aktywności badanego białka, przeprowadź rekonstytucję przy wysokich wartościach P/L, aby zmaksymalizować sygnał, ponieważ każdy liposom zawiera wiele kopii białka. Aby określić aktywność i/lub jednostkową szybkość transportu białka, przeprowadź rekonstytucję w reżimie rozcieńczenia Poissona przy niskich wartościach P/L, tak aby każdy pęcherzyk zawierał średnio 1 białko. Szczegółową analizę zastosowania każdego z tych reżimów przedstawiono w kroku 7 oraz w sekcji Dyskusja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wyznaczyć optymalne wartości P/L dla poszczególnych reżimów, przeprowadź pełną miareczkę aktywności w funkcji stężenia białka 8,11-13. Jednak w przypadku każdego białka, dla którego znana jest masa cząsteczkowa (MW, wyrażona w kDa) jednostki aktywnej, jako wstępne szacunki można zastosować następujące wartości P/L: 
	<img alt="Wzór na równowagę statyczną; X = (0,002 × MW) μg/mg; schemat analizy masy cząsteczkowej." fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
	<img alt="Wzór na wysokie stężenie polimeru, X = (0,05 × MW) μg/mg; stosowany w analizie masy cząsteczkowej." fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 2"></li>
	<li>Wprowadź mieszaninę białka i lipidów do uprzednio namoczonej rurki dializacyjnej lub kasety. Umieść urządzenie dializacyjne w zlewce zawierającej 500-1000x objętość buforu do rekonstytucji lipidów (t.j. 1 L buforu na 1 ml resuspensji lipidów) przy łagodnym mieszaniu.
	<ol>
		<li>Wymień bufor 3-4 razy w odstępach &gt;3 h. Przy każdej wymianie roztworu przemyj kasetę/rurkę oraz zlewkę wodą destylowaną i napełnij zlewkę świeżym buforem do rekonstytucji. Uwzględnij 1-2 interwały nocne (O/N) podczas wymiany roztworu. Dokładna liczba i czas trwania wymian roztworu zależą od zastosowanych lipidów i detergentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu ostatniego kroku wyjmij liposomy z naczynia dializacyjnego, podziel je na alikwoty w probówkach i zamroź gwałtownie w ciekłym N2 lub zamroź w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Konfiguracja rejestracji
UWAGA: Układ rejestracyjny (Rysunek 2A) składa się z dwóch komór (cylindrów o płaskim dnie, objętość ~3-4 ml), elektrody Cl- (patrz poniżej), pH-metru z analogowym lub cyfrowym wyjściem elektrycznym, digitaizera oraz komputera z odpowiednim oprogramowaniem akwizycyjnym.
<ol>
	<li>Podłącz elektrodę Cl- do pH-metru, a wyjście pH-metru do cyfryzatora połączonego z komputerem. Umieść elektrodę odniesienia w jednej komorze, a drut pomiarowy w drugiej (Rysunek 2B). 
	UWAGA: Polaryzacja przewodów jest poprawna, jeśli wartość ΔVCal (patrz krok 6.4 i 7.2) jest dodatnia.</li>
	<li>Umieść komory na mieszalce magnetycznej, wprowadzając mieszadełko do komory pomiarowej (Rysunek 1B). Upewnij się, że mieszadełko nie dotyka elektrody.</li>
	<li>Połącz komory za pomocą mostka agarowego (Rysunek 2B) (100 mM KCl i 2% agarozy). Przechowuj mostki agarowe w 100 mM KCl.</li>
</ol>
4. Przygotowanie elektrody Cl-
<ol>
	<li>Należy pobrać starą i – być może – niedziałającą elektrodę pH. Rozbić powłokę szklaną, aby całkowicie odsłonić srebrne druty.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć powłokę z srebrnych drutów za pomocą ostrza skalpela. Oczyścić druty, używając obfitych ilości H2O i EtOH.</li>
	<li>Umieścić w nasyconym roztworze FeCl3 (lub wybielaczu), aż druty zostaną pokryte jednolitym, ciemnym nalotem AgCl.</li>
</ol>
5. Przygotowanie pęcherzyków jednowarstwowych
<ol>
	<li>W noc poprzedzającą eksperymenty należy namoczyć 1 g kulek Sephadex G-50 w 15 ml buforu zewnętrznego (1 mM KCl, 150 mM K2SO4, 25 mM kwasu cytrynowego, pH 4.5) przy łagodnym wstrząsaniu (nie mieszać) przez co najmniej 3 h w temperaturze pokojowej przed użyciem. Każdy eksperyment wymaga ~3 ml namoczonych kulek. Namoczone kulki można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez kilka dni.</li>
	<li>Podczas gdy liposomy rozmrażają się w temperaturze pokojowej, do każdej kolumny należy wsypać ~3 ml namoczonych kulek G-50. Pozostawić je do osuszenia poprzez przepływ grawitacyjny w temperaturze pokojowej; zazwyczaj zajmuje to 1-2 min.</li>
	<li>Przygotować pęcherzyki jednowarstwowe, przepuszczając proteoliposomy 11 razy przez Mini-Extruder z użyciem membrany teflonowej o rozmiarze porów 0,4 µm.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w plastikowej probówce z okrągłym dnem. Wirować kolumny, aby usunąć nadmiar roztworu. Odwirować przez 20-30 s przy 1 400 x g w wirówce klinicznej.</li>
	<li>Odlać filtrat, umieścić kolumnę w szklanej probówce o wymiarach 13 x 100 mm i dodać do kolumny 100 µl pęcherzyków uzyskanych po ekstruzji. Wirować kolumnę przez 1 min przy 500 x g w wirówce klinicznej.</li>
	<li>Zebrać ~200 µl filtratu, który zostanie dodany do komory pomiarowej w kroku 6.5.</li>
</ol>
6. Pomiar efektu wypływu
<ol>
	<li>Wlej 2 ml 100 mM KCl do komory referencyjnej (masy) oraz 1,8 ml buforu zewnętrznego (1 mM KCl, 150 mM K2SO4, 25 mM kwasu cytrynowego, pH 4,5) do komory pomiarowej. Niewielka różnica osmotyczna między roztworami wewnętrznymi a zewnętrznymi nie wpływa na pomiar.</li>
	<li>Uruchom program akwizycji danych. Odczekaj do ustabilizowania się linii bazowej, co może potrwać kilka minut.</li>
	<li>Gdy sygnał osiągnie stabilną linię bazową (liposomy są gotowe, a kolumny suche), rozpocznij rejestrację (Rycina 3A).</li>
	<li>Dodaj 15 µl roztworu 10 mM KCl w celu kalibracji systemu (Rycina 2A).</li>
	<li>Dodaj liposomy. Może wystąpić niewielki przeskok sygnału z powodu niepełnego usunięcia zewnętrznych jonów Cl- z proteoliposomów (Rycina 3A). Odczekaj do ustabilizowania się linii bazowej.</li>
	<li>Dodaj walinomycynę (1 µl w stężeniu 1 mg/ml w EtOH), aby zainicjować odpływ (Rycina 3A).</li>
	<li>Pozostaw odpływ do czasu osiągnięcia plateau (Rycina 3A).</li>
	<li>Dodaj 40 µl 1,5 M β-oktyloglukozydy (β-OG) przygotowanego w buforze zewnętrznym, aby rozpuścić wszystkie liposomy (Rycina 3A). Zakończ rejestrację.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Wyeksportuj plik zapisu w formacie ascii lub tekstowym i zaimportuj go do wybranego programu analitycznego.</li>
	<li>Zmierz napięcie w następujących punktach (Rycina 3A): 
	Na początku rejestracji (V0); 
	Po dodaniu impulsu kalibrującego (Vcal); 
	Po dodaniu liposomów (Vlipo); 
	Na koniec wypływu (Vfin); 
	Po dodaniu detergentu (Vtot); 
	Ustaw linię bazową napięć tak, aby V0=0.</li>
	<li>Użyj równania Nernsta-Planka, aby wyznaczyć wartość eksperymentalną <img alt="Równanie stanu równowagi α=RT/zF, formuła termodynamiczna, schemat edukacyjny." fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> poprzez pomiar 
	<img alt="Równanie dla statycznej równowagi; obliczanie α; analiza badawcza." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 4"> 
	Gdzie VolCal to objętość impulsu kalibrującego w µl, 1 800 to objętość komory na początku eksperymentu wyrażona w µl, [Cl]cal/in to stężenia Cl- impulsu kalibrującego oraz buforu zewnętrznego w mM, a ΔVcal to skok w mV zmierzony po impulsie kalibrującym. 
	UWAGA: To empiryczne wyznaczenie α służy trzem celom: zapewnia prawidłowe działanie systemu, pozwala ocenić powtarzalność odpowiedzi instrumentu między eksperymentami oraz służy do sprawdzenia, czy nie popełniono błędów podczas przygotowywania roztworów.</li>
	<li>Oblicz stężenia Cl po każdym etapie w następujący sposób: 
	<img alt="Równanie stężenia chlorków, Cl_lipo=([Cl]_in+3/400[Cl]_cal)e^(V_lipo-V_cal)/α, Równanie 2." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 5"> 
	<img alt="Równanie stężenia jonów chlorkowych [Cl]_fin dla objętości liposomów, równanie analityczne." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 6"> 
	<img alt="Równanie gradientu stężenia w liposomach; formuła wykładnicza, Równanie 4." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 7"> 
	Współczynnik 3/400 wynika z rozcieńczenia 15 µl impulsu kalibrującego w końcowej objętości 2 000 µl.</li>
	<li>Oblicz zmiany [Cl] na każdym etapie, ΔCllipo/fin/tot.</li>
	<li>Przelicz V(t) na Cl(t) za pomocą 
	<img alt="Formuła kinetyki chemicznej, Cl(t)=Cl_in(e^(Vc/α)-1); analiza równania w kontekście badawczym." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 8"> 
	Wyznacz bezpośrednio wartości [Cl] w punktach krytycznych i porównaj je z wartościami obliczonymi w ramach kontroli wewnętrznej.</li>
	<li>Znormalizuj zapis tak, aby Clrellipo=0 i Clreltot=1 
	<img alt="Formuła statycznej równowagi ΔC_rel=(C(t)-C_lipo)/ΔC_tot; równanie obliczeniowe." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 9"></li>
	<li>Dopasuj przebieg czasowy wypływu do następującego równania: 
	<img alt="Równanie kinetyki absorpcji przejściowej, symbol, dla badań fotonicznych, Równanie 7." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 10"> 
	Gdzie L to szybkość przecieku Cl-, wyznaczana eksperymentalnie poprzez pomiar wypływu Cl- z liposomów pozbawionych białek przygotowanych w tych samych warunkach, a τ to stała czasowa procesu.</li>
	<li>Oblicz v, prędkość początkową: 
	<img alt="Formuła statycznej równowagi, v=(ΔC/τ)·V, odniesienie do równania, analiza naukowa." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 11"> 
	Gdzie ΔClfin jest wyrażone w milimolach, a V to objętość komory w μl.</li>
	<li>Oblicz szybkość transportu/przewodność 
	<img alt="statyczna równowaga; formuła γ=v·MW/1.2p; edukacyjne równanie fizyczne" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 12"> 
	Gdzie p to P/L, a MW to masa cząsteczkowa kompleksu aktywnego wyrażona w kDa</li>
</ol>

<ol><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14, 673-681 (2006).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Almo, S. C., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+and+faster%3A+improvements+and+optimization+for+mammalian+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).</li>
<li>Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cells+to+improve+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering cells to improve protein expression.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).</li>
<li>Accardi, A., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+active+transport+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> Nature. 427, 803-807 (2004).</li>
<li>Nguitragool, W., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+a+CLC+Cl-%2FH%2B+exchange+transporter+by+polyatomic+anions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions.</a> J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).</li>
<li>Walden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+and+turnover+in+a+Cl-%2FH%2B+exchange+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter.</a> J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).</li>
<li>Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).</li>
<li>Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+required+for+H%28%2B%29%2FCl%28-%29+exchange+mediated+by+a+CLC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter.</a> Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).</li>
<li>Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+TMEM16A+is+sufficient+to+form+Ca2%2B+activated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nature Communications. 4, 2367(2013).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+of+substrate+binding+and+conservation+of+selectivity+in+the+CLC+family+of+channels+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).</li>
<li>Stockbridge, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride+resistance+and+transport+by+riboswitch-controlled+CLC+antiporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr Biol. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Nimigean, C. M., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+block+and+permeation+in+a+K%2B+channel+of+known+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure.</a> J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).</li>
<li>Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+substrate+binding+determines+the+stoichiometry+of+transport+of+a+prokaryotic+H%28%2B%29%2FCl%28-%29+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger.</a> Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).</li>
<li>Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sided+functions+of+an+arginine-agmatine+antiporter+oriented+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes.</a> Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).</li>
<li>Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+a+prokaryotic+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).</li>
<li>Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function%3A+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).</li>
<li>Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride-dependent+interruption+of+the+transport+cycle+of+a+CLC+Cl%28-%29%2FH%28%2B%29+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter.</a> Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).</li>
<li>Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+fluoride-specific+ion+channels+with+dual-topology+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture.</a> Elife. 2, e01084(2013).</li>
<li>Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+nucleotide+modulated+prokaryotic+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 124, 7(2004).</li>
<li>Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Human+K2P+TRAAK%2C+a+Lipid-+and+Mechano-Sensitive+K%2B+Ion+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel.</a> Science. 335, 436-441 (2012).</li>
<li>Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+slow+CLC+Cl-%2FH%2B+antiporter+from+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium.</a> Biochemistry. 50, 788-794 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisaliśmy szczegółowy protokół pomiaru transportu Cl- pośredniczonego przez oczyszczone kanały lub transportery selektywne dla anionów, zrekonstytuowane w liposomach. Jako przykład wykorzystano prokariotyczny wymiennik H+/Cl- CLC-ec1. Metodologia ta może jednak zostać łatwo dostosowana do badania kanałów sterowanych ligandami 12,13,15, napięciem 11,12 lub wykazujących inną selektywność anionową 15,16 poprzez zastąpienie elektrody Ag:AgCl elektrodą odpowie...

W ciągu ostatnich dwóch dekad zdolność do nadekspresji i oczyszczania białek transportujących błonę znacznie wzrosła: kanały jonowe, transportery pierwotne i wtórne są teraz rutynowo oczyszczane z heterologicznych systemów ekspresji, jak również z naturalnych źródeł. Stale opracowywane są nowe podejścia do monitorowania ekspresji, poprawy i ułatwienia ekstrakcji oraz zwiększenia stabilności tych białek 1-5. Te przełomowe odkrycia technologiczne odegrały zasadniczą rolę w wywołaniu eksplozji informacji strukturalnych na poziomie atomowym białek błonowych, co z kolei poszerzyło naszą wiedzę na temat strukturalnych podstaw ich funkcji. W przeciwieństwie do tego, nasza zdolność do badania właściwości funkcjonalnych oczyszczonych białek nie rosła w tym samym tempie, tak że w niektórych przypadkach informacjom strukturalnym o wysokiej rozdzielczości towarzyszą jakościowe dane funkcjonalne, co ogranicza naszą zdolność do ilościowego testowania przewidywań opartych na strukturze. W związku z tym opracowanie ilościowych i uogólnionych testów funkcjonalnych jest kluczowym krokiem w kierunku wyjaśnienia mechanistycznych podstaw funkcji białek błonowych.
Tutaj opisujemy test wypływu, który może być użyty do ilościowego określenia kluczowych właściwości funkcjonalnych oczyszczonych i odtworzonych kanałów i transporterów Cl-. Zasady leżące u podstaw testu można uogólnić na różne systemy transportowe, a także na białka nietransportujące jonów. Liposomy są odtwarzane za pomocą oczyszczonych kanałów / transporterów Cl w obecności dużego gradientu Cl (ryc. 1A, B). Wypływ Cl- jest inicjowany przez dodanie jonoforu, aby umożliwić strumień przeciwjonowy, w naszym przypadku jonofor K+ walinomycynę, który bocznikuje napięcie ustalone przez gradient Cl- i ustawia początkowy potencjał błony na potencjał równowagi K+6,7. Bez jonoforu nie dochodzi do znaczącego wypływu netto Cl-, ponieważ zapobiega mu wytwarzanie potencjału transbłonowego. Dane są ilościowo opisane za pomocą dwóch mierzalnych parametrów (rysunek 1C): τ, stałej czasowej Cl- wypływu, oraz f0, frakcji liposomów niezawierających aktywnego białka. Z τ i f0 można wyprowadzić jednostkową szybkość transportu Cl-, frakcję aktywnych białek i masę cząsteczkową kompleksu aktywnego 8. Technika ta została zilustrowana tutaj przy użyciu proteoliposomów odtworzonych za pomocą CLC-ec1, dobrze scharakteryzowanego wymiennika H+/Cl- typu CLC o znanej budowie i funkcji. Test ten można łatwo uogólnić na kanały lub transportery o różnej selektywności jonowej lub których aktywność zależy od obecności napięcia i / lub ligandów. Ponadto test ten można wykorzystać do określenia, czy małe cząsteczki bezpośrednio wpływają na odtworzone białko, do ilościowego określenia działania tych związków oraz do tego, jak skład błonowy lub odczynniki modyfikujące lipidy wpływają na funkcję odtworzonych kanałów i transporterów.

<table><tbody><tr><td>Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>&nbsp; Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2 Stacjonarny</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion Research Model 701A Cyfrowy miernik</td><td></td><td></td> pH-mV <td>Można je znaleźć w serwisie Ebay.</td></tr><tr><td>Niedziałająca sonda</td><td></td><td></td> pH <td>Każda sonda pH-metru ze srebrnymi drutami będzie działać. Powłokę szklaną/plastikową należy usunąć, a przewody oczyścić.</td></tr><tr><td>Rejestrator danych DI-710</td><td>Instrumenty</td><td></td><td></td>DATAQ</tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji WinDAQ</td><td>Instrumenty</td><td></td><td></td>DATAQ</tr><tr><td>Pierce Jednorazowe kolumny plastikowe, przepływ grawitacyjny, 2ml</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>29922</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane KIMAX, jednorazowe, szkło borokrzemianowe</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wytłaczarki z uchwytem/blokiem grzewczym</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>Komputer 610000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów cl

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Ostatnie 15 lat charakteryzowało się eksplozją zdolności do nadekspresji i oczyszczania białek błonowych z organizmów prokariotycznych, jak również z eukariontów. Wzrost ten był w dużej mierze spowodowany udanym dążeniem do uzyskania informacji strukturalnych na temat białek błonowych. Jednak zdolność do funkcjonalnego badania tych białek nie rozwija się w tym samym tempie i często ogranicza się do testów jakościowych o ograniczonej wartości ilościowej, ograniczając w ten sposób mechanistyczne wglądy, które mogą dostarczyć. Opisano test do ilościowego zbadania aktywności transportowej odtworzonych kanałów lub transporterów Cl. Test opiera się na pomiarze szybkości wypływu Cl- z proteoliposomów po dodaniu jonoforu K+ walinomycyny w celu bocznikowania potencjału błonowego. Elektroda wrażliwa na jony służy do śledzenia w czasie wypływu jonów z proteoliposomów odtworzonych w pożądanym białku. Metoda ta doskonale nadaje się do badań mechanistycznych, ponieważ pozwala na ilościowe określenie kluczowych właściwości odtworzonego białka, takich jak jego jednostkowa szybkość transportu, frakcja białka aktywnego i masa cząsteczkowa jednostki funkcjonalnej. Test może być również wykorzystany do określenia wpływu związków małocząsteczkowych, które bezpośrednio hamują/aktywują odtworzone białko, a także do testowania modulacyjnego wpływu składu błony lub odczynników modyfikujących lipidy. Tam, gdzie było to możliwe, stwierdzono, że bezpośrednie porównanie wyników uzyskanych przy użyciu tej metody jest w dobrej zgodności z wynikami uzyskanymi przy użyciu metod elektrofizjologicznych. Technika ta została zilustrowana na przykładzie CLC-ec1, wymiennika CLC typu H+/Cl-, jako systemu modelowego. Test wypływu może być wykorzystany do badania dowolnego kanału/transportera przewodzącego Cl i, przy minimalnych zmianach, może być dostosowany do badania dowolnego białka transportującego jony.

Opisujemy szczegółowy i niezawodny protokół pomiaru transportu Cl- pośredniczonego przez oczyszczone białko CLC-ec1, prokariotyczny wymiennik H+/Cl- typu CLC, zrekonstytuowany w liposomach. Schematyczna reprezentacja eksperymentu przedstawiona jest na Rysunku 3. Proteoliposomy zrekonstytuowane z oczyszczonym CLC-ec1 i zawierające wysoką wewnętrzną koncentrację Cl- są zanurzone w roztworze kąpieli o niskiej zawartości Cl-. W tych warunkach całkowity o...

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe oznaczenie aktywności transportowej zrekonstruowanych kanałów chlorkowych lub transporterów. Jest to osiągane poprzez uprzednią rekonstrukcję czystego, oczyszczonego transportera w liposomach przy niskiej gęstości, tak aby każdy liposom zawierał zero lub jedną kopię aktywnego kompleksu; po usunięciu zewnętrznych jonów chlorkowych, w celu wytworzenia gradientu jonowego skierowanego na zewnątrz, liposomy dodaje się do komory pomiarowej, w której monitoruje się stężenie chlorków za pomocą elektrody czułej na chlorki. Następnie przepływ chlorków z liposomów jest inicjowany poprzez dodanie walmycyny, jonoforu potasowego, który znosi potencjał błonowy.Gdy sygnał osiągnie stan stacjonarny, eksperyment kończy się poprzez dodanie detergentu w celu rozpuszczenia liposomów. Ostatecznie, mierząc szybkość odpływu chlorków z proteoliposomów, w których zrekonstytuowano oczyszczony kanał lub transporter, możliwe jest ilościowe określenie jednostkowej szybkości transportu oraz stechiometrii aktywnego kompleksu białkowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi podejściami, takimi jak pomiary strumienia oparte na fluorescencji, jest m

a-proteoliposome-based-efflux-assay-to-determine-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test oparty na proteoliposomach do oznaczania pojedynczych właściwości kanałów i transporterów Cl-

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Przedstawiamy protokół do badania in vitro pomp wypływowych z Pseudomonas aeruginosa. Protokół ten pozwala na generowanie solidnego, odwracalnego i przestrajalnego gradientu protonów w błonie liposomowej, a zatem powinien być przystosowany do dowolnego białka błonowego zasilanego siłą protomotoryczną.

Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Nanociała są ważnymi narzędziami w biologii strukturalnej i stanowią ogromny potencjał dla rozwoju terapii. Jednak wybór nanociał o właściwościach hamujących może być wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) do klasyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczne transportery błonowe.

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj metodę pomiaru aktywności transportu jonów chlorkowych w proteoliposomach z użyciem elektrody chlorkowej. Technika umożliwia ilościowe określenie jednostkowej szybkości transportu i geometrii kompleksu białkowego.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek ^{kanałów i} transporterów Cl

Przeglądaj więcej filmów