Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek ^{kanałów i} transporterów Cl

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie aktywności transportowej odtworzonych kanałów chlorkowych lub transporterów. Osiąga się to poprzez najpierw odtworzenie czystego oczyszczonego transportera do liposomów o niskiej gęstości, tak aby każdy liposom zawierał zero lub jedną kopię aktywnego kompleksu po usunięciu zewnętrznych jonów chlorkowych, tak aby wystąpił gradient jonowy skierowany na zewnątrz, liposomy dodaje się do komory rejestracyjnej, w której stężenie chlorku jest monitorowane za pomocą elektrody wrażliwej na chlorki. Następnie chlorek flx z liposomów jest inicjowany przez dodanie Val Mycin, jonoforu potasu, który zwiększa potencjał błonowy.

Gdy sygnał osiągnie stan ustalony, eksperyment zostaje zakończony przez dodanie detergentu w celu rozpuszczenia liposomów. Ostatecznie, mierząc szybkość wypływu chlorków z liposomów protei, odtworzonych za pomocą oczyszczonego kanału lub transportera, możliwe jest ilościowe określenie jednostkowej szybkości transportu i stechiometrii aktywnego kompleksu białkowego. Główną przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi podejściami, takimi jak pomiary strumienia na podstawie fluorescencji, jest to, że dzięki tej technice możliwe jest ilościowe określenie kluczowych parametrów odtworzonego transportera, takich jak jednostkowy współczynnik obrotu i geometria kompleksu.

Oprócz zapewnienia ilościowych pomiarów tych kluczowych parametrów, metoda ta może być wykorzystana do szybkiego i precyzyjnego określenia wpływu mutacji małych cząsteczek oraz monitorowania podjednostek w odtworzonym białku transferowym. Zestaw do rejestracji składa się z dwóch komór, elektrody chlorkowej, pH-metru z analogowym lub cyfrowym wyjściem elektrycznym, digitizera oraz komputera z odpowiednim oprogramowaniem do akwizycji. Podłącz elektrodę chlorkową do pH-metru, a następnie podłącz wyjście pH-metru do digitizera, który jest podłączony do komputera.

Umieść elektrodę odniesienia w jednej komorze, a przewód kodujący w drugiej. Następnie umieść komory na płytce mieszającej z mieszadłem w komorze nagrywającej. Upewnij się, że mieszadło nie dotyka elektrody.

Połącz komory za pomocą mostka agarowego w noc poprzedzającą eksperymenty, spęczniej jeden gram kulek cidex G 50 w 15 mililitrach zewnętrznego buforu, delikatnie wstrząsając przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej przed użyciem. Każdy eksperyment wymaga około trzech mililitrów spęczniałych kulek, podczas gdy liposomy rozmrażają się w temperaturze pokojowej. Wlej około trzech mililitrów spęczniałych kulek G 50 do każdej kolumny.

Pozwól im wyschnąć grawitacyjnie. Przepływ w temperaturze pokojowej. Zwykle zajmuje to od jednej do dwóch minut.

Następnie przygotuj pęcherzyki umięśnione, wytłaczając liposomy protei 11 razy przez mini wytłaczarkę za pomocą odcięcia teflonowego 0,4 mikrona. Następnie umieścić kolumnę w plastikowej wirówce z okrągłym dnem na 20 do 30 sekund w temperaturze 1400 G w wirówce klinicznej w celu usunięcia nadmiaru roztworu. Następnie, strzegąc przepływu, umieść kolumnę w szklanej rurce o wymiarach 13 na 100 milimetrów i dodaj 100 mikrolitrów wytłaczanych pęcherzyków do kolumny.

Wirować kolumnę przez jedną minutę w temperaturze 500 G.In wirówkę kliniczną, zebrać około 200 mikrolitrów przepływu, przez który zostanie dodany do komory rejestrującej. Aby wykonać pomiar wypływu, należy umieścić dwa mililitry 100-milimolowego chlorku potasu w komorze referencyjnej, a 1,8 mililitra buforu zewnętrznego w komorze rejestrującej. Uruchom program akwizycyjny.

Niech linia bazowa się zrównoważy. Może to potrwać kilka minut. Gdy sygnał osiągnie stabilną linię bazową, rozpocznij nagrywanie.

Dodać 15 mikrolitrów jasnobrązowego molowego roztworu chlorku potasu, aby skalibrować system. Następnie dodaj liposomy. Niewielki skok może być widoczny z powodu niepełnego usunięcia zewnętrznego chlorku z liposomów protei.

Poczekaj, aż linia bazowa się ustabilizuje. Następnie dodaj CIN, aby zainicjować flx. Pozwól FLX biec swoim biegiem czasu, aż się ustabilizuje.

W tym momencie dodaj 40 mikrolitrów 1,5-molowego glukozydu beta Octa przygotowanego w zewnętrznym buforze, aby rozpuścić wszystkie liposomy. Następnie odczekaj od 10 do 15 sekund. Zakończ nagrywanie i przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Gdy liposomy zawierające wysoki chlorek wewnętrzny są zanurzone w niskim chlorku, wytwarzając 300-krotny gradient chlorków, nie obserwuje się strumienia jonów netto. Dzieje się tak, ponieważ liposomy wolne od białek mają niską wewnętrzną przepuszczalność jonów. Nie obserwuje się makroskopowego FLX z liposomów prot odtworzonych za pomocą transportera chlorków sprzężonego z protonami, C-L-C-E-C.

Ponieważ niewielka ilość chlorku wydostającego się z pęcherza pęcherzowego wytwarza dodatni ładunek netto w liposomach, dodanie CIN umożliwia jonom potasu przemieszczanie się przez błonę, zmniejszając potencjał elektryczny i inicjując chlorek flx. Reakcja zostaje zakończona i mierzy się całkowitą ilość jonów chlorkowych zawartych w pęcherzykach w celu określenia właściwości pojedynczych odtworzonych białek. Surowe dane dotyczące przebiegu czasu wypływu są najpierw przekształcane z miliwoltów na stężenie chlorków, a następnie normalizowane, a następnie dopasowywany jest przebieg czasu.

Ustalono, że stała czasowa wypływu wynosi 41 sekund, a frakcja liposomów zawierających zero aktywnych kopii C-L-C-E-C wynosi punkt 31, co wskazuje, że około jedna trzecia liposomów zawiera zero aktywnych białek z tych wartości i mierzy zawartość chlorków w pęcherzykach zawierających co najmniej jedną kopię C-L-C-E-C jednego, możliwe jest wyznaczenie jednostkowej szybkości transportu C-L-C-E-C równej około 2 500 jonów chlorkowych na sekundę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić potrzebę obrotu transportera. Eksperymenty te można przeprowadzić w ciągu 10 do 15 minut, jeśli zostaną wykonane ostrożnie.

Bardzo ważne jest, aby dokładnie ocenić jakość liposomów, ponieważ nieszczelności niekorzystnie wpływają na oszacowanie wskaźnika rotacji.