Name: Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę utrwalania chemicznego komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej. Protokół obejmuje przygotowanie okienek z azotku krzemu, hodowlę komórek, utrwalanie i płukanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Stefanowi Vogtowi za pomoc w dopasowaniu reprezentatywnych danych pokazanych w tym artykule oraz za pomocne dyskusje. Autorzy dziękują również Chrisowi Jacobsenowi za jego wsparcie dla Q. J. 
Użycie Zaawansowanego Źródła Fotonów, linii badawczych 2-ID-E i 8-BM-B, w Argonne National Laboratory było wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, w ramach Kontraktu Nr. DE-AC02-06CH11357.

1. Przygotowanie instrumentów, substratów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Obsługa okien z azotku krzemu (Si,3, N, 4).
	<ol>
		<li>Kapsułkę należy lekko otworzyć, ściskając jeden koniec zawierający okienko w taki sposób, aby nie ściskać samego okienka, jednocześnie obracając drugi koniec kapsułki drugą ręką.</li>
		<li>Sprawdź parę odwróconych pęsety z cienką końcówką pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że na końcówce nie ma kleju, szczelin ani zagięć. W przeciwnym razie szyby mogą zostać wybite pęsetą lub odlecieć z nich podczas kolejnych kroków.</li>
		<li>Wyjmij okienko z kapsułki, ostrożnie chwytając ramę okna pęsetą, jednocześnie delikatnie ściskając kapsułkę w pobliżu otwartego końca, wywierając nacisk w kierunku tak, aby kapsułka była szersza w miejscu, w którym krawędzie okienka muszą wyjść.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne mycie okien (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>W razie potrzeby umyj okna wstępnie, delikatnie zanurzając je w wodzie destylowanej na 5 sekund, a następnie umyj 2 minuty w 70% etanolu i 2 minuty w 100% etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocowanie i sterylizacja okien na szalce hodowlanej.
	<ol>
		<li>Aby przymocować okna, ustaw okienko płaską stroną do góry na dnie naczynia hodowlanego, umieść kawałek taśmy na czystym szkiełku podstawowym. Odetnij około ćwierć cala paska wzdłuż dłuższego boku taśmy. Zdejmij kawałek taśmy z krótszego boku (o wymiarach 1/8" na 3/4") czystą żyletką.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby przyłożyć plasterek taśmy do krawędzi siatki lub okna. Użyj tyle, aby bezpiecznie przykleić go bez zasłaniania samego otworu okiennego. Manipulując przyklejoną taśmą pęsetą, połóż okienko na dnie naczynia hodowlanego. Użyj końcówki pęsety, aby mocno przykleić taśmę do dna naczynia hodowlanego.</li>
		<li>Przyłóż kolejny pasek taśmy do drugiej krawędzi i mocno przyklej go do dna końcówką pęsety.</li>
		<li>Po zaklejeniu wszystkich okien wysterylizuj okna w naczyniach hodowlanych promieniowaniem ultrafioletowym (UV). W tym celu należy umieścić naczynie pod lampą UV w okapie z przepływem laminarnym na około 1 godzinę.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Jeśli okna mają być wstępnie pokryte polilizyną, należy to zrobić po sterylizacji okien. Pokryj okienko 10 μl sterylnego 0,01% roztworu poli-L-lizyny przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, a następnie spłucz pozostały roztwór pożywką hodowlaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj do końcowego mycia przed XFM.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor sacharozy tris-glukozy lub piperazyno-N,N'-bis(kwas etanosulfonowy) (PIPES) (PIPES) wolny od jakichkolwiek metali śladowych o osmolalności i pH równoważnym soli fizjologicznej buforu fosforanowego Dulbecco bez wapnia i magnezu. Użyj jednego z tych do płukania komórek po chemicznym utrwaleniu komórek.
		<ol>
			<li>Aby przygotować roztwór Tris-glucose (10 mM Tris, 260 mM glukozy, 9 mM kwas octowy) dodać 1,4 g glukozy, 36 mg zasady Tris i 16 μl kwasu octowego do 20 ml ultraczystej wody. Następnie dostosuj końcową objętość do 30 ml z ultraczystą wodą. Nie jest wymagana regulacja pH. Przechowywać w temperaturze RT do tygodnia.</li>
			<li>Aby wytworzyć sacharozę (20 mM RURY, 200 mM sacharozy) dodaj 0,18 g RUREK i 2,0 g sacharozy do 20 ml ultraczystej wody i dostosuj pH do 7,4 za pomocą niewielkich ilości stężonego kwasu octowego. Następnie dostosuj końcową objętość do 30 ml z ultraczystą wodą. Przechowywać w temperaturze RT do jednego tygodnia. 
			UWAGA: Powodem, dla którego należy unikać stosowania PBS w końcowym płukaniu, jest to, że stężenia fosforanów, chlorków i potasu w PBS są tak wysokie, że mogą zakłócać XFM, jeśli nie zostaną całkowicie usunięte przed suszeniem na powietrzu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować do posiewu komórek.
	<ol>
		<li>Przygotuj lub wyjmij wszystkie pożywki, takie jak pożywka RPMI 1640, 1x roztwór trypsyny-EDTA, D-PBS i wszelkie inne odczynniki potrzebne dla konkretnej przylegającej linii komórkowej, tak jak normalnie miałoby to miejsce w przypadku pasażowania przylegających komórek będących przedmiotem zainteresowania, i ogrzej je do 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Posiewanie komórek
<ol>
	<li>Do wysterylizowanego naczynia hodowlanego zawierającego okna, w okapie z przepływem laminarnym, delikatnie dodać pożywkę (10 ml na naczynie hodowlane o średnicy 100 mm) wzdłuż boku naczynia hodowlanego, przechylonego pod kątem. Unikaj tworzenia niepotrzebnego napięcia powierzchniowego lub upuszczania mediów bezpośrednio na powierzchnię okienek azotku krzemu. W miarę dodawania nośnika powoli zmniejszaj kąt nachylenia, aby pokryć siatkę i okno nośnikiem.</li>
	<li>Odpowiednio przygotuj przylegającą linię komórkową, która Cię interesuje, próbując lub zeskrobując komórki z płytek, jak zwykle w celu przejścia linii komórkowej. Wykonaj zliczanie komórek lub inne niezbędne przygotowania przed nałożeniem komórek na świeżą płytkę.</li>
	<li>Dodać komórki do szalki hodowlanej z okienkami o gęstości komórek, która jest zwykle potrzebna do osiągnięcia 50%-70% konfluencji w ciągu 24-72 godzin, i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Obserwuj wzrost komórek od czasu do czasu, używając mikroskopu z odwróconym światłem, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek (zwykle 50%-70% konfluencji).</li>
</ol>
3. Utrwalenie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj świeży 4% paraformaldehyd w D-PBS, rozcieńczając zakupiony bulion (taki jak 25% paraformaldehydu) i dostosowując pH do 7,4 kwasem octowym (aby uniknąć dodawania nadmiaru sodu do próbki).</li>
	<li>Gdy komórki zostaną wyhodowane zgodnie z oczekiwaniami, a wszelkie istotne plamy (takie jak Hoescht) zostaną nałożone i zobrazowane, usuń pożywkę przez delikatne aspiracje, przechylając naczynie pod kątem 45° jedną ręką i odsysając pipetą ręczną drugą ręką. 
	UWAGA: Zamiast pipetowania zużytych pożyw, alternatywą jest podniesienie okienka, dwukrotne zanurzenie go w probówkach mikrowirówek z D-PBS, a następnie umieszczenie go w nowym naczyniu hodowlanym z roztworami utrwalającymi na 20 minut, a następnie 2-krotne przemycie PBS w celu usunięcia resztek utrwalaczy. Jeśli ta opcja jest wybrana, przejdź bezpośrednio do kroku 3.5.</li>
	<li>Delikatnie opłucz naczynie za pomocą D-PBS i natychmiast zastąp usunięty płyn, delikatnie dodając świeże 4% PFA/PBS, trzymając naczynie pod kątem 45°, pipetując w kierunku boku naczynia i powoli rozluźniając kąt nachylenia, aby roztwór utrwalający mógł zakryć okna. Utrzymuj komórki przykryte utrwalaczem przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń płyn przez delikatne zasysanie, ponownie jak wyżej, lekko przechylając naczynie i zasysając ręką.</li>
	<li>Zastąp usuniętą ciecz, delikatnie dodając trochę roztworu PIPES/Sacharozy, stosując metodę przechylania i pipetowania opisaną w kroku 3.3.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.4 i 3.5.</li>
	<li>Przygotuj materiały do suszenia.
	<ol>
		<li>Zbierz niestrzępiące się ręczniki, takie jak chusteczki Kimwipes, i wyciągnij jeden z pudełka, aby był pod ręką bardzo szybko i łatwo.</li>
		<li>Przygotuj czyste, nierówne miejsce, aby ustawić okno do wyschnięcia. Ustaw gumową matę siatkową, taką jak używana w mikroskopii elektronowej, która ma grzbiety, dzięki czemu okno można podeprzeć na jednym końcu podczas wysychania. Zapobiegnie to przyklejaniu się okienka do suszącej się powierzchni podczas wysychania i spuści pozostały bufor do krawędzi próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie pęseta przymocowana do okna, aby utrzymać okno przed płynem. Odzyskaj okienka, które odpadają od taśmy, nakładając niewielką ilość RUREK/sacharozy, aby unosiły się na wodzie, a następnie podnosząc je pęsetą odwrotną.</li>
	<li>Ostrożnie (nie dotykając samego okna) i dokładnie zetrzyj nadmiar RUREK/sacharozy z krawędzi okna za pomocą Kimwipe. Nałóż również wcięty obszar z tyłu za pomocą zaokrąglonego fałdu Kimwipe. 
	UWAGA: Celem jest jak najmniejsza krystalizacja soli lub na powierzchni okna.</li>
	<li>Umieść okno na macie siatkowej. Upewnij się, że okno nie leży płasko na macie siatkowej, ale jest podparte o krawędź (za pomocą grzbietów maty rusztowej) i jak najmniej dotyka maty siatkowej. Pozostaw okno do wyschnięcia.</li>
</ol>
4. Montaż i obrazowanie próbki
<ol>
	<li>Po wyschnięciu próbki sprawdź obecność komórek na oknach za pomocą mikroskopu świetlnego. Należy przeprowadzić tę weryfikację przed przygotowaniem próbek do transportu do synchrotronu.</li>
	<li>Zapakuj okna do transportu do synchrotronowej linii badawczej, na której znajduje się Twój eksperyment. Delikatnie przymocuj okna taśmą z dwóch stron do szklanego szkiełka, a następnie przymocuj szklane szkiełko taśmą do dna plastikowej szalki Petriego. Zaklej szalkę Petriego taśmą. 
	UWAGA: Przed tym punktem te kroki można wykonać w dowolnym typowym laboratorium. Poniższe kroki najlepiej byłoby wykonać na linii synchrotronowej.</li>
	<li>Delikatnie usuń taśmę z okna za pomocą pęsety. Użyj lakieru do paznokci, w cienkiej, równomiernej powłoce wzdłuż krawędzi okna, aby przymocować okna do aluminiowego uchwytu dostarczonego przez współpracowników linii badawczej w synchrotronie.</li>
	<li>Włóż aluminiowy uchwyt do uchwytu kinematycznego, a następnie umieść go na miejscu w mikroskopie rentgenowskim. Zamontuj próbkę na wsporniku łączącym ją ze stopniami zmotoryzowanymi, wewnątrz komory próbki na linii badawczej.</li>
	<li>Po wyjściu z obszaru instrumentu mikroskopu rentgenowskiego próbki (klatka wykonana ze ścianek wypełnionych ołowiem) należy skonfigurować skanowanie. Korzystając z oprogramowania specyficznego dla linii badawczej, wybierz odpowiedni obszar próbki do skanowania, jednocześnie wyświetlając położenie wiązki promieniowania rentgenowskiego na próbce za pomocą kamery wyposażonej w krzyż celownika wideo i wstępnie ustawionej z kamerą scyntylacyjną znajdującą</li> się za próbką.
	<li>Wybierz odpowiednią rozdzielczość dla próbki, na podstawie oszacowania rozmiaru najmniejszej cechy będącej przedmiotem zainteresowania. Do obrazowania pojedynczych komórek ssaków (o wielkości ~20-40 μm) należy użyć rozdzielczości 0,25-0,5 μm. Do obrazowania obszarów tkanek i rozróżniania warstw komórkowych od siebie należy używać rozdzielczości 2-20 μm.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni czas przebywania dla próbki, opierając się na oszacowaniu ilości obecnego metalu będącego przedmiotem zainteresowania. Aby uzyskać szybki skan przeglądowy lub jeśli obecne są duże ilości metali, użyj skanowania w locie z czasem przebywania 30-300 ms na piksel. Jeśli występuje niewielka ilość materiału lub do pomiaru metali o niskiej względnej obfitości, należy użyć skanowania krokowego z czasem przebywania 1-2 sekundy na piksel.</li>
	<li>Zaprogramuj skany w oprogramowaniu specyficznym dla danej linii badawczej. Uzyskaj obraz ze skanowaniem rastrowym. Współpracuj ze współpracownikami linii badawczej, aby przeanalizować dane za pomocą oprogramowania, które zidentyfikuje charakterystyczne piki energii dla każdego pierwiastka.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie fluorescencyjne rentgenowskie jest przydatne w wielu dziedzinach, w tym w naukach o Ziemi, materiałoznawstwie i biologii chemicznej26-34. Postępy w synchrotronowym promieniowaniu rentgenowskim i jego ogniskowaniu pozwoliły na uzyskanie wiązek o bardzo wysokiej intensywności. Obecnie istnieją skoncentrowane wiązki promieniowania rentgenowskiego wystarczające do wzbudzenia metali endogennych w komórkach, wytwarzające sygnał, który można zmierzyć za pomocą obecnie dostępnej technologii krzemowych dete...

Obrazowanie fluorescencyjne rentgenowskie pozwala na przestrzenne określenie zarówno tożsamości, jak i ilości pierwiastków obecnych w próbce. Padające promienie rentgenowskie o energii wybranej jako większa niż energia wiązania elektronów najcięższego pierwiastka będącego przedmiotem zainteresowania, pokonują energię wiązania elektronów powłoki wewnętrznej z jądrem1. W ten sposób powstaje "" w powłoce elektronowej. Gdy elektrony o wyższej energii opadają do tych, emitowane są fluorescencyjne promieniowanie rentgenowskie, którego długość fali zależy od separacji energetycznej tych orbitali. Ponieważ odstępy energetyczne orbitali są charakterystyczne dla danego pierwiastka, emisja fluorescencji promieniowania rentgenowskiego ma również charakterystyczne długości fal, zależne od pierwiastka. To właśnie ta emisja na charakterystycznej długości fali pozwala na identyfikację obecnych pierwiastków. Kalibracja intensywności fluorescencji pozwala na ilościowe określenie obecnych pierwiastków.
Mikroskopia fluorescencji rentgenowskiej (XFM) stała się coraz bardziej stosowana, częściowo dzięki rozwojowi bardzo jasnych źródeł synchrotronu rentgenowskiego, takich jak te w Spring-8 w Japonii, Europejski Synchrotron Radiacyjny (ESRF) we Francji i Zaawansowane Źródło Fotonów (APS) w USA2. Źródła te zapewniają wiązki promieniowania rentgenowskiego o bardzo dużym natężeniu. Jednocześnie ulepszenia w optyce rentgenowskiej, takie jak technologia płytek strefowych, pozwoliły na skupienie tych wiązek na punktach submikronowych, choć raczej nieefektywnie3. Przy wiązkach o bardzo dużej intensywności nawet stosunkowo niewielka ilość światła, którą można skupić, wystarcza do wzbudzenia metali endogennych w komórkach, wytwarzając sygnał, który można zmierzyć za pomocą obecnie dostępnej technologii detektorów. Tak więc badanie biologii chemicznej metali w komórce jest jednym z zastosowań, które wykorzystuje wiele najnowszych osiągnięć w tej technice4-10.
Istnieje wiele krytycznych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas stosowania XFM do badania rozkładu pierwiastków i kwantyfikacji hodowanych komórek ssaków lub innych próbek biologicznych. Po pierwsze, próbka musi być zachowana w stanie nienaruszonym, zarówno pod względem strukturalnym, jak i pod względem składu pierwiastkowego, aby pomiar był miarodajny. Po drugie, próbka musi być również w jakiś sposób zakonserwowana, aby była odporna na uszkodzenia promieniowania, które mogą być spowodowane przez skupioną wiązkę promieniowania rentgenowskiego. Jednym ze sposobów, w jaki próbka może spełniać oba te kryteria jednocześnie, jest szybkie zamrożenie w szklistym, amorficznym lodzie11,12. Szybkie zamrażanie często osiąga się za pomocą różnych technik kriokonserwacji, takich jak zamrażanie wgłębne lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem13-16. Ogólnie przyjmuje się, że kriokonserwacja zachowuje ogólną architekturę komórkową i skład chemiczny w próbkach biologicznych jak najbardziej zbliżonych do stanu rodzimego. Z drugiej strony, utrwalanie chemiczne, ze względu na powolną i selektywną penetrację utrwalaczy do komórek i tkanek, a także późniejsze zmiany przepuszczalności błony, może pozwolić na wypłukiwanie, utratę lub przemieszczenie różnych jonów komórkowych, zwłaszcza jonów dyfuzyjnych, takich jak Cl, Ca i K, co sprawia, że badanie tych pierwiastków jest nieoptymalne17-19. Pomimo wyraźnej przewagi kriofiksacji nad utrwalaniem chemicznym w ogóle, w szczególności w przypadku przylegających komórek ssaków, kriokonserwacja ma różne ograniczenia20-23. Najbardziej oczywistą z nich jest to, że nie każde laboratorium badawcze ma łatwy dostęp do instrumentów do krioprezerwacji. Większość obecnych zamrażarek wysokociśnieniowych, a nawet zamrażarek wgłębnych, jest kosztowna i posiada tylko podzbiór urządzeń kriogenicznych, które mogą znajdować się daleko od miejsca, w którym inkubowane są komórki. Korzyści płynące z kriokonserwacji mogą być zamienione na wadę stresu związanego z podróżą wywieranego na komórki. Tak więc, chociaż kriokonserwacja jest z pewnością najbardziej rygorystycznym sposobem przechowywania próbek do analizy fluorescencji rentgenowskiej, z pewnością nie jest najbardziej dostępna dla wszystkich badaczy w każdych okolicznościach; Nie zawsze jest to też konieczne – jeśli interesujące metale są ściśle związane z możliwymi do utrwalenia makrocząsteczkami, a rozdzielczość, w której próbka zostanie zobrazowana, jest większa niż uszkodzenie ultramikrostruktury, które może wystąpić podczas suszenia. Pamiętając o zastrzeżeniach24, odpowiednim wyborem może być chemiczne utrwalanie i suszenie.
Inne czynniki udanego eksperymentu z obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej obejmują właściwą analizę. Obrazowanie fluorescencyjne w promieniowaniu rentgenowskim to zasadniczo spektroskopia emisyjna fluorescencji rentgenowskiej połączona ze skanowaniem rastrowym w celu zapewnienia rozdzielczości przestrzennej. Zebrane widma emisyjne fluorescencji rentgenowskiej zawierają kombinację nakładających się na siebie pików emisji, tła oraz elastycznych i nieelastycznych pików rozpraszania padającej wiązki. Oprogramowanie, które umożliwia dekonwolucję tych wkładów i dopasowanie szczytów emisji, było kluczowym osiągnięciem w tej dziedzinie25. Bardzo ważne było również opracowanie i komercyjna dystrybucja cienkowarstwowych wzorców o znanym składzie, stosowanych do kalibracji intensywności fluorescencji w stosunku do ilości materiału.
Ten protokół zawiera opis przygotowania przylegających komórek przez chemiczne utrwalanie i suszenie powietrzem. Istotnym krokiem w tym procesie jest wzrost komórek na okienkach z azotku krzemu, które często nie przylegają dobrze, co sprawia, że delikatne płukanie w określony sposób jest kluczem do sukcesu.

<table><tbody><tr><td>Okna z azotku krzemu</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Wielka Brytania</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Sortuj według rozmiaru. Rozmiar membrany: 1,5 mm x 1,5 mm. Grubość: 200&nbsp; Nm. Rozmiar ramy: 5&nbsp; mm x 5 mm. Grubość ramy: 200 &mikro;m.</td><td>Alternatywne źródło: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Pęseta odwrotna</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Bezpłatny: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &ndash; Ultra cienkie pęsety</td></tr><tr><td>Gumowa mata siatkowa</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Bezpłatny: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Okrągła mata siatkowa</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Faks: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>stężony kwas octowy klasy metali śladowych</td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Faks: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>stały bufor PIPES</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy formaldehydu</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Bezpłatny: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampułki z 20% wodnym roztworem paraformaldehydu</td></tr></tbody></table>

przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Obrazowanie fluorescencji rentgenowskiej pozwala nam nieniszcząco mierzyć rozkład przestrzenny i koncentrację wielu pierwiastków jednocześnie na dużych lub małych obszarach próbki. Znalazł zastosowanie w wielu dziedzinach nauki, w tym w materiałoznawstwie, naukach o Ziemi, badaniu dzieł dziedzictwa kulturowego oraz w biologii chemicznej. Na przykład w przypadku biologii chemicznej wizualizacja rozmieszczenia metali w komórkach pozwala nam badać zarówno naturalnie występujące w komórkach jony metali, jak i egzogennie wprowadzone metale, takie jak leki i nanocząstki. Ze względu na w pełni uwodniony charakter prawie wszystkich próbek biologicznych, krioutrwalanie, po którym następuje obrazowanie w temperaturze kriogenicznej, stanowi idealną dostępną obecnie metodę obrazowania. Jednak w okolicznościach, w których taka kombinacja nie jest łatwo dostępna lub praktyczna, chemiczne wiązanie na bazie aldehydu pozostaje użyteczne, a czasem nieuniknione. W artykule tym opisano jak najbardziej szczegółowo przygotowanie przylegających komórek ssaków przez chemiczne utrwalanie do obrazowania fluorescencyjnego promieniowaniem rentgenowskim.

Zdolność obrazowania fluorescencją rentgenowską do dostarczania informacji o próbkach biologicznych zależy od przygotowania tych próbek w taki sposób, aby były one odporne na uszkodzenia radiacyjne w czasie trwania eksperymentu, a jednocześnie zachowały swoje cechy chemiczne i strukturalne. Analizując wynik obrazowania próbki przygotowanej zgodnie z powyższym opisem, można zauważyć zróżnicowanie obecnych pierwiastków — co wskazuje, że fiksacja pozwoliła zachować te aspekty komórki (Rysunek 1).
<p cla...

Tutaj prezentujemy protokół, jak określić ilość i rozkład metali w próbce za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej. Skupiamy się na komórkach przylegających i opisujemy metodę chemicznego utrwalania w celu przygotowania tej próbki. Następnie opisujemy, jak zamontować i zobrazować próbkę za pomocą synchrotronowego promieniowania rentgenowskiego.

Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie rozkładu metali w populacji komórek. Osiąga się to poprzez przygotowanie sterylnych okien z azotku krzemu, a następnie hodowlę komórek na tych oknach. Następnie komórki są utrwalane, przepłukiwane odpowiednim buforem i suszone.Ostatnim krokiem jest obrazowanie komórek na linii wiązki. W końcowym etapie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencji rentgenowskiej do wykazania rozkładu metali w komórce. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ okienka są bardzo delikatne.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ hodowla komórek na okienkach przy minimalnej agregacji komórek, jak i etapy płukania, są trudne ze względu na słabą adhezję komórek do podłoży fluorescencyjnych RTG. Pierwszym zadaniem jest wyizolowanie okienka. Najpierw, używając stereoskopu, upewnij się, że para pęset z odwróconymi, cienkimi końcówkami jest prosto ustawiona i czysta.Następnie lekko otwórz kapsułkę zawierającą okienko. Ściśnij koniec z okienkiem, obracając jednocześnie drugi koniec. Nie ściskaj samego okienka.Następnie ostrożnie chwyć ramkę pęsetą, delikatnie ściskając kapsułkę w pobliżu otwartego końca. Wywrzyj nacisk, aby rozszerzyć kapsułkę w miejscu, w którym powinny wystawać krawędzie okienka, a następnie wyjmij okienko. Teraz przygotuj taśmę klejącą.Przyklej kawałek taśmy do czystego szkiełka i odetnij pasek taśmy o szerokości ćwierć cala wzdłuż dłuższego boku szkiełka. Następnie przyklej taśmę do krótszego boku i usuń ten fragment taśmy za pomocą pęsety. Przyklej taśmę do krawędzi okienka z siłą wystarczającą do jej przylegnięcia, uważając, aby nie zakryć otworu okienka taśmą.Używając pęsety, umieść okno na dnie naczynia hodowlanego i mocno dociśnij taśmę do naczynia. Następnie powtórz tę procedurę, aby przykleić drugą stronę okna. Naczynie powinno zostać teraz wystawione na działanie promieniowania UV w celu sterylizacji przez jedną godzinę.Niniejszy protokół wymaga, aby komórki osiągnęły 50 do 70% konfluencji na szalkach zawierających dołączone okienko. Wszelkie zastosowane barwniki witalne oraz komórki powinny zostać zobrazowane przed przystąpieniem do fiksacji. Usunąć medium poprzez delikatną aspirację, przechylając szalkę pod kątem 45 stopni.Następnie delikatnie opłucz naczynie za pomocą DPBS. Usunięty płyn niezwłocznie zastąp, powoli dodając świeży 4%P-F-A-P-B-S pod kątem 45 stopni, kierując strumień w stronę ścianki naczynia. Powoli zmniejszaj kąt nachylenia, aby roztwór fiksacyjny pokrył okienka.Pozostaw utrwalacz na komórkach przez 20 minut po przeprowadzeniu utrwalania. Usuń płyn za pomocą delikatnej aspiracji. Stosując tę samą delikatną technikę co poprzednio, powoli wymień płyn za pomocą pipet.Roztwór sacharozy. Technika usuwania i uzupełniania cieczy jest krytyczna, ponieważ komórki nie przylegają dobrze do podłoży. Jest to etap, na którym wiele osób przeprowadzających te doświadczenia po raz pierwszy odnosiło niepowodzenie.Następnie ostrożnie wymień roztwór sacharozy w pipecie, aby wypłukać pozostałości utrwalacza. Teraz usuń okienko, odrywając taśmę za pomocą pęsety. Jeśli okienka odkleją się od taśmy, wynieś je na powierzchnię za pomocą dodanego roztworu i wyjmij pęsetą odwróconą.Teraz, nie dotykając okienka, dokładnie odsącz wszelkie pozostałości roztworu z krawędzi. Odsącz również wgłębienie, używając zaokrąglonego zagięcia chusteczki. Celem jest zminimalizowanie krystalizacji soli lub buforu na okienku.Na koniec ostrożnie umieść okienko na macie kratowej, opierając go o krawędź przy wypukłości maty. Okienko powinno stykać się z matą w jak najmniejszym stopniu. Po wyschnięciu próbki zweryfikuj obecność komórek na okienkach za pomocą mikroskopu świetlnego.Po potwierdzeniu obecności komórek na okienkach, przygotuj okienka do transportu na linię wiązki synchrotronu. Delikatnie przytwierdź okienka taśmą do szkiełka przedmiotowego wzdłuż dwóch krawędzi. Następnie przytwierdź szkiełko przedmiotowe do plastikowej szalki Petriego i szczelnie zaklej szalkę taśmą.Do tego momentu kroki mogą być wykonywane w każdym typowym laboratorium; kolejne etapy najlepiej przeprowadzić na linii promieniowania synchrotronu. Rozpakowywanie okna rozpoczyna się od delikatnego usunięcia taśmy za pomocą pęsety. Następnie okno przenosi się do uchwytu aluminiowego dostarczonego przez współpracowników z linii promieniowania w synchrotronie.Zabezpiecz okno, nakładając cienką, równomierną warstwę lakieru do paznokci wzdłuż jego krawędzi. Następnie włóż aluminiowy uchwyt do mocowania kinematycznego. Przymocuj mocowanie do wspornika połączonego z zmotoryzowanym stołem, który znajduje się wewnątrz komory z próbką i w linii wiązki mikroskopu rentgenowskiego.Po wyjściu z linii osłonowej do obszaru instrumentu mikroskopu rentgenowskiego, skonfiguruj skanowanie za pomocą oprogramowania specyficznego dla linii wiązki. Wybierz odpowiedni obszar próbki do zeskanowania, obserwując pozycję wiązki promieni rentgenowskich na próbce. Do tego celu używa się kamery wyposażonej w wideo-celownik, uprzednio zsynchronizowanej z kamerą scyntylatora znajdującą się w dalszej części toru; dodatkowe szczegóły znajdują się w protokole tekstowym.Stosując te techniki w obrazowaniu rentgenowskim próbki, można zauważyć zmienność obecnych pierwiastków, co wskazuje, że fiksacja pozwala zachować te aspekty komórek, jak ma to miejsce w przypadku ludzkiej komórki HSY five Y. Jednakże, jeśli bufor pozostanie obecny podczas suszenia, rozległe tworzenie się kryształów powoduje uszkodzenia strukturalne komórek i zakłóca zbieranie widm fluorescencji rentgenowskiej. Można to zaobserwować w przypadku niewłaściwie przetworzonej komórki RET B 1 0 3.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować przyległe komórki poprzez fiksację chemiczną do obrazowania metodą fluorescencji rentgenowskiej. Pamiętaj, że praca z formaldehydem i materiałami biologicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej oraz postępowanie zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przygotowanie przywierających komórek do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej przez fiksację chemiczną

Źródło: Schumacher, D. i in. Obrazowanie żywymi komórkami fluorescencji pełnego cyklu komórkowego wegetatywnego powoli rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie Myxococcus xanthus, powoli rosnącej bakterii glebowej. Hodowla jest uprawiana w podłożu, nakładana na pokrywę fluorescencyjnych mikrosfer i nakładana na podgrzaną agarozę, aby wspierać nawodnienie i dopływ składników odżywczych. Takie rozwiązanie umożliwia...

Przygotowanie próbek Myxococcus xanthus do obrazowania żywymi komórkami

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.

Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy protokół do bezpośredniej wizualizacji aktywności metabolicznej w komórkach regulowanych przez aminokwasy za pomocą mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (ciężka wodaD2O), która jest zintegrowana z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego (2PEF).

Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Opisany jest prosty protokół do określania neutralnej zawartości lipidów w komórkach glonów za pomocą procedury barwienia czerwienią Nilu. Ta oszczędzająca czas technika stanowi alternatywę dla tradycyjnych protokołów kwantyfikacji lipidów opartych na grawimetrii. Został zaprojektowany z myślą o konkretnym zastosowaniu monitorowania wydajności bioprocesów.

Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

Poznaj metodę utrwalania chemicznego komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej. Protokół obejmuje przygotowanie okienek z azotku krzemu, hodowlę komórek, utrwalanie i płukanie.

Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego

Przeglądaj więcej filmów