Modelowanie cyklu życiowego wirusa Ebola w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 z cząstkami wirusopodobnymi zawierającymi minigenomy tetracistroniczne

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest modelowanie cyklu życiowego wysoce patogennego wirusa Ebola w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Osiąga się to poprzez wytwarzanie cząsteczek wirusopodobnych, które mają taki sam skład białkowy jak cząsteczki wirusa Ebola, ale przenoszą minigenom zamiast genomu wirusowego. Minigenom jest miniaturową wersją genomu wirusowego, w której geny wirusowe zostały usunięte i zastąpione genem reporterowym, takim jak lucyferaza.

Co istotne, minigenom wykorzystany w tym eksperymencie nadal niesie szereg genów wirusowych, które kodują białka wirusowe – VP40, GP-1, GP-2 oraz VP24. Cząsteczki wirusopodobne są wytwarzane poprzez ekspresję minigenomu w komórkach 293T, nazywanych komórkami producentami, wraz z białkami wirusowymi NP, VP35, VP30 i L, które wspólnie określa się mianem białek RNP.

Następnie minigenom jest replikowany i transkrybowany do mRNA przez białka wirusowe. mRNA kodują reporter lucyferazę oraz dodatkowe białka wirusowe VP40, GP-one two i VP24. Wspólnie te trzy białka prowadzą do produkcji cząsteczek wirusopodobnych, które nazywa się cząsteczkami wirusopodobnymi zdolnymi do transkrypcji i replikacji lub TRVLPs, ponieważ zawarte w nich nukleokapsydy są w stanie przejść proces replikacji i transkrypcji genomu. Ponieważ TLPs przenoszą glikoproteinę wirusa Ebola GP-one two, są one w stanie infekować komórki docelowe.

Komórki docelowe te zostały uprzednio przetransfekowane plazmidem ekspresyjnym dla np, VP35, VP30 oraz L. Te białka RNP wspólnie rozpoznają mini genom, który został wprowadzony do komórek docelowych wewnątrz TRVLP. Następnie mini genom ulega replikacji i transkrypcji, co prowadzi do aktywności reporterowej, a także do produkcji nowych TRVLP, które mogą zostać ponownie wykorzystane do zakażenia nowych komórek docelowych.

Co istotne, minigenom nie niesie informacji genetycznej niezbędnej do jego replikacji. W związku z tym TRVLP nie mogą produktywnie infekować komórek, które nie wykazują ekspresji czterech białek RNP. Dzięki temu system ten jest bezpieczny do stosowania w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.

Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na modelowanie pełnego cyklu życiowego wirusa, w tym replikacji genomu, ekspresji produktów genów wirusowych, produkcji cząstek wirusa oraz infekcji komórek docelowych w wielu cyklach wprowadzania czynników, w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego dwa. Oznacza to, że prace te mogą być prowadzone bez konieczności korzystania z laboratorium o maksymalnym stopniu zabezpieczeń, które jest niezbędne w przypadku pracy z żywymi wirusami Ebola. Metodę tę można łączyć z innymi technikami, takimi jak wyciszanie czynników komórkowych za pomocą RNA lub nadekspresja tych czynników, aby zbadać ich rolę w biologii wirusa. Możemy również wprowadzać mutacje w genach wirusa, aby zbadać rolę tych genów oraz ich produktów w biologii wirusa.

Przeprowadź pasaż komórek, usuwając pożywkę z 80-90% konfluencyjnych komórek 293T, płucząc je dwukrotnie w PBS i dodając do nich dwa mililitry trypsyny. Odczekaj, aż komórki przybiorą okrągły kształt.

Następnie oderwij je, opukując kolbę i dodając do komórek 8 mL pożywki z 10% FBS. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, a następnie rozcieńcz je do stężenia 2×10⁵ komórek/mL i nanieś 2 mL do każdej studzienki płytki 6-dołkowej. Przenieś komórki do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po 24 godzinach przeprowadź transfekcję komórek plazmidami niezbędnymi do produkcji TRVLP. W komorze BSC pipetuj DNA do probówki, używając końcówek z filtrem. Jako kontrolę negatywną w jednej studzience należy pominąć plazmid kodujący polimerazę wirusową L; zamiast niego można przeprowadzić transfekcję plazmidem kodującym GFP w celu wizualizacji wydajności transfekcji. Następnie dodaj 100 µL Opti-MEM na studzienkę do DNA. Wymieszaj zawartość probówki w wirówce vorex i odwiruj.

Następnie do rozcieńczonego DNA należy dodać 7,5 µL odczynnika do transfekcji transIT LT-one. Probówkę należy delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach należy delikatnie wymieszać mieszaninę do transfekcji poprzez pipetowanie, a następnie nanieść po 100 µL kroplami do każdego dołka płytki sześciodołkowej.

Po dodaniu kompleksów transfekcyjnych do komórek, delikatnie kołysz płytką w przód i w tył oraz na boki. Nie obracaj płytki kolistym ruchem, ponieważ spowoduje to nierównomierną transfekcję. Następnie przenieś komórki z powrotem do inkubatora. 24 godziny po transfekcji usuń nadosad z komórek. Następnie dodaj do komórek cztery mililitry pożywki z 5% FBS i przenieś je z powrotem do inkubatora.

24 godziny po transfekcji komórek producentów przeprowadź pasaż komórek 293T zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. 24 godziny po pasażu dokonaj ich transfekcji plazmidami kodującymi białka RNP wirusa Ebola oraz Tim-1, który pełni funkcję czynnika adhezyjnego dla wirusów Ebola. 72 godziny po transfekcji komórek producentów i 24 godziny po transfekcji komórek docelowych zbierz nadsącz z komórek producentów i przenieś go pipetą do probówki o pojemności 15 ml.

Po zebraniu supernatantu usunąć pozostałą ciecz, dodać 250 µL buforu do lizy glow do komórek i inkubować je przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie oznaczyć aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w kroku trzecim niniejszego filmu. W międzyczasie odwirować supernatant z komórek producenta przez pięć minut przy 800 g w temperaturze pokojowej.

Następnie usunąć medium z komórek docelowych i dodać 3 mL klarownego supernatantu z komórek P-zero do komórek docelowych. Czynność tę należy wykonywać dla każdego dołka osobno. Po zakończeniu przenieść komórki docelowe z powrotem do inkubatora. Inkubować przez 24 h po infekcji.

Usuń nadsącz z komórek docelowych. Następnie dodaj do komórek cztery mililitry pożywki z 5% FBS i przenieś je z powrotem do inkubatora. Aby określić aktywność reportera w komórkach producentach lub docelowych, komórki te zbiera się 72 godziny po transfekcji w przypadku komórek producentów oraz 72 godziny po infekcji w przypadku komórek docelowych.

Aby to zrobić, należy usunąć nadsącz z komórek, dodać do nich 250 µL buforu do lizy glow i inkubować przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby nadsącz można wykorzystać do zainfekowania nowej partii komórek docelowych. W takim przypadku należy zebrać nadsącz i zainfekować komórki docelowe zgodnie z opisem w kroku drugim tego filmu.

W międzyczasie rozmrozić bufor do testu lucyferazy w ilości 40 µL na dołek i dodać do buforu substrat lucyferazy w objętości 1/100. Wymieszać gotowy odczynnik do lucyferazy za pomocą vortexa i upewnić się, że osiągnął on temperaturę pokojową przed kontynuacją. Następnie pipetować 40 µL odczynnika do białej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej. Aby uniknąć problemów z przenikaniem sygnału (crosstalk), zaleca się pozostawienie jednego wolnego dołka pomiędzy dołkami z próbkami. Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji wypłukać komórki do buforu lizującego za pomocą pipety i przenieść lizat komórkowy do probówki. Wirować lizaty przez trzy minuty przy 10 000 g w temperaturze pokojowej. Następnie pipetować 40 µL lizatów do płytki 96-dołkowej z odczynnikiem do lucyferazy. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach zmierzyć aktywność lucyferazy przy użyciu luminometru. Czas całkowania pomiaru luminescencji powinien wynosić jedną sekundę. W luminometrze do mikropłytek Modulus typowe sygnały luminescencji dla kontroli dodatniej powinny wynosić od 1×10⁶ do 1×10⁷, podczas gdy sygnał dla kontroli ujemnej powinien być co najmniej o 2–3 rzędy wielkości niższy. W kolejnych pasażach aktywność reportera w kontrolach dodatnich powinna pozostać stabilna, natomiast aktywność reportera w kontrolach ujemnych powinna spaść do poziomu tła.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo potrafić wytworzyć cząstki wirusopodobne zdolne do replikacji i transkrypcji wirusa Ebola, wykorzystać je do zakażenia komórek docelowych oraz zmierzyć aktywność reporterową w komórkach produkcyjnych i docelowych.

Co istotne, metodę tę można łączyć z innymi technikami, takimi jak wyciszanie czynników komórkowych za pośrednictwem RNA, aby badać rolę tych czynników w biologii wirusa. Można również wprowadzać mutacje w komponentach wirusowych wykorzystywanych w tej metodzie, w celu zbadania roli tych komponentów w cyklu życiowym wirusa Ebola. Dalsze szczegóły eksperymentalne oraz specyficzne odczynniki znajdują się w manuskrypcie towarzyszącym temu filmowi.