Aksotomia nerwu twarzowego u myszy: model do badania reakcji neuronów ruchowych na uraz

Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie nerwu twarzowego w celu zbadania uszkodzeń nerwów obwodowych. Nerw twarzowy bierze początek w moście pnia mózgu i opuszcza czaszkę przez otwór stylomastoidalny, a następnie dzieli się na swoje główne komponenty.

Po odsłonięciu nerw zostaje autotomizowany w miejscu jego wyjścia z otworu sutkowatego. W lokalizacji nerwu twarzowego pomagają dwa główne punkty orientacyjne. Pierwszym z nich jest kanał słuchowy, który składa się z perłowo-białych płytek chrzęstnych połączonych cienką błoną.

Drugim jest brzuszek przedni mięśnia dwobrzuchowego, który znajduje się nad nerwem i miejscem jego wyjścia z otworu sutkowo-wyrostkowego. Po uszkodzeniu nerwu twarzowego badacz może analizować wiele czynników, takich jak śmierć neuronów ruchowych lub ekspresja genów. Model uszkodzenia nerwu twarzowego jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych modeli uszkodzenia nerwów obwodowych.

Zaletami tej techniki są jej prostota, wysoka powtarzalność oraz brak wpływu na funkcje życiowe wynikający z następującego po niej porażenia nerwu twarzowego. Dodatkowo, ze względu na wysoką symetrię układu nerwowego, strona nieuszkodzona może służyć jako sparowana kontrola wewnętrzna w przeprowadzanych doświadczeniach. Aby zachować zasady aseptyki podczas całej procedury, należy upewnić się, że wszystkie narzędzia zostały poddane autoklawowaniu, a do sterylizacji narzędzi pomiędzy operacjami przygotowano sterylizator koralikowy.

Przygotuj stanowisko operacyjne, kładąc podkład chłonny na podgrzewaczu, ustawiając mikroskop i przymocowując taśmą stożek nosowy tak, aby znajdował się on na krawędzi pola widzenia. Po znieczuleniu myszy upewnij się, że zwierzę nie wykazuje żadnej reakcji fizycznej na manipulacje, w tym na uciśnięcie palca u nogi. Następnie przekieruj przepływ gazu z komory anestezjologicznej do stożka nosowego i nałóż maść off thalamic.

Umyj mysz na lewym boku na podkładkach chirurgicznych, umieszczając pod nimi matę grzewczą. Stale monitoruj oddech zwierzęcia i w razie potrzeby dostosuj przepływ izofluranu, aby utrzymać znieczulenie. Następnie, aby odsłonić pole operacyjne, przymocuj prawe ucho do stożka nosowego za pomocą taśmy.

Żyła zalustna powinna być widoczna, przebiegając przez obszar ucha. Następnie zwilżono futro 70% etanolem i ogolono miejsce zabiegu. Po usunięciu futra oczyszczono skórę, stosując trzy naprzemienne przemycia jodyną oraz 70% etanolem, aż do całkowitego oczyszczenia pola operacyjnego.

Przystąp do operacji. Upewnij się, że ustna część uchwytu jest ustawiona bokiem, a żyła uszna przebiega poziomo. Ułatwi to zlokalizowanie nerwu twarzowego.

Aby wyznaczyć miejsce pierwszego nacięcia, należy prześledzić żyłę zatwarną od ucha w kierunku obszaru znajdującego się za wypukłością ucha. Następnie, używając nożyczek sprężynowych, należy wykonać nacięcie o długości 4 mm, w odległości 2–3 mm za wypukłością (w celach dydaktycznych). Nacięcie to zostanie następnie poszerzone, aby odsłonić leżącą pod nim anatomię.

Następnie wykonaj rozwarstwienie tępe tkanki tłuszczowej podskórnej i powięzi. Naczynia krwionośne oraz mięśnie mogą zostać łatwo uszkodzone przez nożyczki. W przypadku wystąpienia krwawienia.

Uciskać miejsce wkłucia sterylnym patyczkiem bawełnianym przez co najmniej 30 sekund. Jeśli wystąpiła znaczna utrata płynów, wstrzyknąć do 0,5 ml soli fizjologicznej do jamy otrzewnej za pomocą igły o rozmiarze 25 lub 27 G. Następnie zlokalizować nerw twarzowy, korzystając z kluczowych punktów orientacyjnych.

Nerw dodatkowy jest położony powierzchownie względem nerwu twarzowego i można go zaobserwować, gdy biegnie od bocznej części czaszki. Aby zinnervować mięsień czworoboczny, należy zidentyfikować chrząstkę kanału słuchowego. Ma ona perłowobiały kolor i znajduje się rostralnie względem nerwu twarzowego.

Nerw twarzowy owija się wokół bębenkowej części kanału słuchowego. Następnie zlokalizuj brzusiec przedniego brzuszka mięśnia dwbrzuszkowego, który znajduje się nad nerwem twarzowym i w jego pobliżu. Przeprowadź preparację pod tą strukturą, aby odsłonić nerw twarzowy.

Jest to biała, stała struktura, przylegająca do warstwy leżącej poniżej powięzi. Zidentyfikuj główne gałęzie nerwu twarzowego. Prześledź je grzbietowo do miejsca ich wyjścia z otworu sutkowo-stylнцеowego.

Użyj precyzyjnej pęsety, aby rozszerzyć pole operacyjne, a następnie za pomocą końcówki nożyczek sprężynowych wykonaj preparację wzdłuż przebiegu nerwu twarzowego. Pęsetą można wyczuć kostną strukturę wyrostka sutkowatego. Teraz zidentyfikuj pień nerwu twarzowego, aby go zmiażdżyć.

Uciśnij to miejsce precyzyjną pęsetą przez 30 sekund, wywierając stały nacisk. Spowoduje to przerwanie wszystkich aksonów. Następnie powtórz uciśnięcie pod kątem prostym przez kolejne 30 sekund.

Zachowaj stały nacisk pomiędzy poszczególnymi eksperymentami. Po zidentyfikowaniu odpowiednich punktów orientacyjnych anatomicznych zaprezentuję bardziej precyzyjną technikę chirurgiczną. Wykonując mniejsze nacięcie, wyśledź żyłę zaluśną od małżowiny usznej w kierunku obszaru za wypukłością ucha, a następnie wykonaj nacięcie o długości 4 mm, dwa do trzech milimetrów za wypukłością.

Następnie wykonaj nacięcie przez tkankę tłuszczową podskórną i powięź, posługując się trzema punktami orientacyjnymi: nerwem dodatkowym, przewodem słuchowym oraz brzuścem przednim mięśnia dwubrzuchego. Odsłoń nerw twarzowy. Śledź przebieg nerwu twarzowego wstecz w kierunku otworu stylomastoidalnego, aby dotrzeć do pnia nerwu twarzowego w celu jego przecięcia; ustabilizuj go delikatnie za pomocą precyzyjnej pęsety i przetnij nożyczkami.

Należy unikać nadmiernego rozciągania nerwu, aby nie doprowadzić do jego wyrwania z pnia mózgu. Następnie należy rozsunąć końce nerwu lub usunąć jego segment, aby zapobiec ponownemu połączeniu. Na koniec należy dokładnie obejrzeć nerw i potwierdzić, że został on całkowicie przerwany.

Po zakończeniu zabiegu przywróć wszystkie tkanki tłuszczowe i mięśnie do ich przybliżonych pierwotnych pozycji. Następnie zamknij ranę, stosując szwy klamrowe 7,5 milimetra lub klej cyjanoakrylowy. W razie potrzeby podaj w tym czasie leki przeciwbólowe, przerwij podawanie znieczulenia i umieść mysz w pustej klatce bez ściółki.

Podczas gdy zwierzę dochodzi do siebie, należy zbadać je pod kątem oznak porażenia twarzy, objawiającego się paraliżem wibrysów. Jeśli są one odchylone w stronę policzka, nos będzie wydawał się skrzywiony, a oko nie zareaguje mrugnięciem na podmuch powietrza. Następnie, jeśli zwierzę jest samicą, należy umieścić ją w jednej klatce z inną samicą.

Jeśli jednak zwierzę pozostaje samo, do czasu powrotu funkcji mrugania oka należy codziennie stosować maść okulistyczną, aby zapobiec powikłaniom rogówki. W tym czasie należy monitorować mysz pod kątem objawów infekcji lub innych powikłań, aż do zagojenia się miejsca operacyjnego. Występuje znaczna zmienność w utracie neuronów ruchowych po enukleacji, zależnie od wieku i tła genetycznego myszy u zwierząt typu dzikiego, u których przeprowadzono przecięcie nerwu twarzowego w ósmym tygodniu życia.

Około 86% neuronów ruchowych przeżywa po 28 dniach od wykonania ostektomii. Obserwowano znacznie większą utratę komórek w modelu mysim SOD1 stwardnienia zanikowego bocznego, jak również w myszach z nokautem genu rekombinującego aktywacyjnego 2 (Rag2) z niedoborem odporności w badaniu laserowej mikrodysekcji.

Do wyizolowania materiału z jądra ruchowego nerwu twarzowego zastosowano mikrodyssekcję. Możliwe było pobranie całego jądra ruchowego nerwu twarzowego. Alternatywnie, poszczególne podjądra mogły być zbierane oddzielnie.

Technika ta charakteryzuje się wysoką precyzją. Możliwe jest wyizolowanie pojedynczych neuronów ruchowych, a pozostała część jądra może zostać zebrana do późniejszej analizy. W celu zbadania ekspresji genów w próbkach podjąder w obrębie podjądra brzuszno-przyśrodkowego (oznaczonego linią przerywaną) oraz podjądra brzuszno-bocznego (oznaczonego linią ciągłą) zastosowano ilościową PCR. Zmierzono ekspresję czterech genów związanych z odpowiedzią regeneracyjną nerwów.

Stwierdzono pewne różnice pomiędzy ich podjądrami. Ekspresja Gap 43 wykazała największą różnicę między podjądrami. Po opanowaniu tej techniki zabieg można przeprowadzić w zaledwie kilka minut.

Ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym ułożeniu zwierzęcia, wykonaniu nacięcia w odpowiednim miejscu oraz wykorzystaniu punktów orientacyjnych anatomicznych do zlokalizowania nerwu twarzowego. W obrębie głowy i szyi łatwo stracić orientację, dlatego w razie trudności należy odnaleźć chrzęstny kanał słuchowy i śledzić go w kierunku tylnym, aby zlokalizować nerw twarzowy.