Name: Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę MALDI-TOF SNP do jednoczesnego wykrywania cech komarów przenoszących malarię. Ta technika identyfikuje gatunek, oporność na insektycydy i zakażenie pasożytem, wspierając badania epidemiologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Anthony'emu Cornelowi i Laurze Norris z UC Davis oraz dr Katharinie Kreppel z Uniwersytetu w Glasgow za dostarczenie próbek komarów z Tanzanii. Dziękujemy Pani Smicie Das i dr Douglasowi Norrisowi z Johns Hopkins School of Public Health za udostępnienie próbek komarów z Zambii. Dziękujemy również panu Lee V. Millonowi z Laboratorium Genetyki Weterynaryjnej za szkolenie w zakresie projektowania testów. Prace te były wspierane przez grant Narodowego Instytutu Zdrowia R01AI 078183 i R21AI062929.

1. Amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Wymieszaj wszystkie startery PCR (patrz tabela uzupełniająca S1) w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Każdy SNP ma dwie startery (do przodu i do tyłu). Upewnij się, że stężenie podstawowe każdego startera PCR jest utrzymywane na poziomie 100 μM. Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki starterów na 500-1 000 reakcji, aby zmniejszyć błąd pipetowania i czas pracy na stole (patrz tabela uzupełniająca S2). W razie potrzeby przygotować porcje na 100-200 reakcji na probówkę i przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Przygotować koktajl PCR zgodnie z opisem w protokole producenta (tabela 1). Objętość dla 96 reakcji obejmuje zwis 20%. Lekko zmieszać probówkę zawierającą koktajl PCR i odwirować przez 30 sekund przy 2 000 x g.</li>
	<li>Dozować 3 μl koktajlu PCR do każdej studzienki 96-dołkowej płytki bez osłony. Pipeta powtarzalna może zaoszczędzić czas potrzebny na ten proces.</li>
	<li>Dodać 2 μl odpowiedniego genomowego DNA komarów do każdej studzienki. 
	UWAGA: Proces pozyskiwania genomowego DNA z tkanek komara (głowa/klatka piersiowa, brzuch lub całe ciało) jest opisany w innych literaturach29-32. Wybierz odpowiedni protokół ekstrakcji DNA, aby odróżnić osoby z Plasmodium we krwi (brzuchu) od zakaźnych komarów (Plasmodium w głowie/klatce piersiowej). Zazwyczaj używamy DNA wyekstrahowanego z części ciała (głowa/klatka piersiowa lub brzuch) komarów, więc stężenie DNA waha się od 0,05-2 ng / μl. Chociaż całkowity wkład DNA jest niższy niż zalecany przez producenta (5-10 ng / rxn), zazwyczaj otrzymujemy solidne wywołania SNP z 98% próbek DNA bez amplifikacji całego genomu.</li>
	<li>Zamknąć płytkę, delikatnie wymieszać lub zwirować i odwirować przez 1 minutę przy 370 x g.</li>
	<li>Użyj następującego protokołu termocyklera, aby przeprowadzić amplifikację PCR: (1) 94°C przez 2 minuty, (2) 94°C przez 30 sekund, (3) 56°C przez 30 sekund, (4) 72°C przez 1 minutę, (5) powtórz krok (2)-(4) przez 45 cykli, (6) 72°C przez 1 minutę i przytrzymaj 4°C.</li>
</ol>
2. Traktowanie SAP
<ol>
	<li>Przygotować roztwór enzymu SAP na płytce 96-dołkowej (patrz Tabela 2). Przetwarzaj 96 próbek na płytce. Objętość dla 96 reakcji obejmuje zwis 20%.</li>
	<li>Lekko przetrząsnąć probówkę z roztworem enzymu SAP i wirować przez 30 sekund przy 2 000 x g. Dozować 2 μl roztworu enzymu SAP do każdej studzienki. Również w tym przypadku pipeta powtarzalna może zaoszczędzić czas na tym procesie.</li>
	<li>Zamknąć płytkę, delikatnie wymieszać lub wirować i wirować przez 1 minutę przy 370 x g. Inkubować płytkę w następujący sposób: (1) 37°C przez 40 min, (2) 85°C przez 5 min w celu inaktywacji enzymu, (3) 4°C utrzymać. Po zakończeniu tego etapu, przed kontynuacją, przechowuj płytkę w temperaturze -20°C. Przechowujoną płytkę przetworzyć w ciągu 2 tygodni.</li>
</ol>
3. Rozszerzenie SNP
<ol>
	<li>Jeśli płytka próbki jest zamrożona po obróbce SAP, przed kontynuowaniem pozwól jej rozmrozić się do temperatury RT.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę podkładów przedłużających (tabela uzupełniająca S2). Każdy SNP posiada jeden podkład przedłużający. Utrzymuj stężenie wyjściowe każdego startera przedłużającego na poziomie 500 μM. Opcjonalnie porcję na 100-200 reakcji na probówkę i przechowuj w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę przedłużającą zgodnie z opisem w Tabeli 3. Objętość reakcyjna 96 obejmuje zwis 20%.</li>
	<li>Lekko przemieszaj probówkę koktajlu przedłużającego i odwiruj przez 30 sekund przy 2,000 x g. Dozuj 2 μl koktajlu przedłużającego do każdej studzienki. Również w tym przypadku pipeta powtarzalna może zaoszczędzić czas na tym procesie.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę, delikatnie wymieszaj lub zwiruj i odwiruj przez 1 minutę przy 370 x g. Poddać płytkę cyklowi termicznemu, jak pokazano na rysunku 1. W tym momencie należy przejść do spektrometrii mas lub przechowywać płytkę w temperaturze -20°C do 2 tygodni.</li>
</ol>
4. Kondycjonowanie produktu rozszerzenia SNP w celu optymalizacji analizy spektrometrii mas
<ol>
	<li>Jeśli płytka próbki zostanie zamrożona po wydłużeniu SNP, przed kontynuowaniem pozwól jej rozmrozić się do RT.</li>
	<li>Przenieś 15 mg żywicy z pojemnika na płytkę z wgłębieniami za pomocą wydłużonej łyżki. Użyj skrobaka, aby rozprowadzić żywicę w dołkach płytki z wgłębieniami. Przesuń skrobak z boku na bok po płytce z wgłębieniami, aby rozprowadzić żywicę. Upewnij się, że w każdej studzience znajduje się żywica.</li>
	<li>Zeskrob nadmiar żywicy z płytki z wgłębieniami za pomocą skrobaka. Pozostaw żywicę w płytce z wgłębieniami na co najmniej 20 minut. Pozostawiając żywicę w płytce z wgłębieniem, dodaj 41 μl wody klasy HPLC do każdej studzienki płytki próbki.</li>
	<li>Delikatnie umieść płytkę próbki do góry nogami, na płytce z wgłębieniami. Upewnij się, że płytka próbki resetuje się do małego zaokrąglonego słupka płytki z wgłębieniami, co wyrównuje dołki w płytce z wgłębieniami w płytce z wgłębieniami.</li>
	<li>Trzymając razem płytkę próbki i płytkę z wgłębieniami, delikatnie odwróć je, aby żywica wypadła z płytki z wgłębieniami do zagłębień płytki próbki. Postukaj w płytkę z wgłębieniami, aby żywica wpadła do płytki próbki. Upewnij się, że cała żywica z płytki z wgłębieniami wpadnie do dołków na płytkę próbki. Odwirować płytkę o sile 3 200 x g przez 30 sekund.</li>
	<li>Obracać płytkę próbki na rotatorze przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Rotator musi obracać płytkę próbki o 360° wokół osi długiej.</li>
	<li>Odwirować płytkę z próbką o masie 3 200 x g przez 5 minut. Po tym etapie należy przechowywać płytkę z próbką w temperaturze -20°C do 2 tygodni przed przejściem do następnego etapu.</li>
</ol>
5. Spektrometria mas MALDI-TOF
<ol>
	<li>Przenieś kondycjonowany produkt rozszerzający SNP do macierzy biologicznej, takiej jak SpectroCHIP, zgodnie z instrukcjami producenta. Do tego kroku używamy MassArray Nanodispenser.</li>
	<li>Po zakończeniu transferu określ, w jaki sposób testy i płytki mają być konfigurowane w bazie danych testów. Nazwij test i płytki w taki sposób, aby każda tabliczka miała niepowtarzalny identyfikator, który łączy się z konkretnym projektem testu (tabela uzupełniająca S3).</li>
	<li>Po zdefiniowaniu testu i płytki należy uzyskać widma za pomocą spektrometru masowego.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Wykonuj analizę danych za pomocą oprogramowania do interpretacji danych do analizy PCR w czasie rzeczywistym, takiego jak Typer Analyzer lub TyperViewer (Sequenom). Uzyskać dane w .xml formacie, który zawiera układ próbki, spektrogram masowy dla każdego studzienki, informacje o markerze, w tym nazwę, oczekiwaną masę dla każdego wariantu odpowiedniego SNP oraz wszelkie komunikaty o błędach lub ostrzeżeniach związane z każdą reakcją. Patrz rysunek 2 dla wynikowego spektrogramu masowego.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę grupowania genotypu SNP, ustawiając próg wykrywania (wielkość lub stosunek sygnału do szumu) oraz tolerancję/wariancję dozwoloną dla każdego genotypu. Rysunek 3 przedstawia przykład klastrów genotypu SNP 04707-KDR#2</li>.
	<li>Wyeksportuj wynikowe wywołania genotypu SNP do programu arkusza kalkulacyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Ayala, F. J., Coluzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+speciation%3A+humans%2C+Drosophila%2C+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).</li>
<li>Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+African+malaria+mosquitoes+belonging+to+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex.</a> Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).</li>
<li>Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+ribosomal+DNA+polymorphisms+discriminating+among+chromosomal+forms+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).</li>
<li>Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+species+and+molecular+forms+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+PCR-RFLP%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Vet+Entomol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP.</a> Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+reveal+discrepancies+among+results+of+commonly+used+methods+for+Anopheles+gambiae+molecular+form+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification.</a> Malar J. 10, 215(2011).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+polymorphisms+of+SINE200+retrotransposons+within+speciation+islands+of+Anopheles+gambiae+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms.</a> Malar J. 7, 163(2008).</li>
<li>Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+report%3A+A+new+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism+method+to+identify+Anopheles+arabiensis+from+An.+gambiae+and+its+two+molecular+forms+from+degraded+DNA+templates+or+museum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples.</a> Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. , (2013).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction.</a> Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+of+physically+unlinked+islands+of+genomic+divergence+in+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).</li>
<li>Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+biased+co-transmission+of+speciation+islands+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).</li>
<li>Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+kdr+mutation+and+resistance+to+pyrethroid+and+DDT+insecticides+in+natural+populations+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).</li>
<li>Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kdr+mutation+occurs+in+the+Mopti+form+of+Anopheles+gambiae+s.s.+through+introgression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression.</a> Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).</li>
<li>Tripet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+survey+of+knockdown+resistance+to+pyrethroid+%28kdr%29+in+Mali%2C+West+Africa%2C+and+evidence+of+its+emergence+in+the+Bamako+form+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s.</a> Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).</li>
<li>Martinez-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pyrethroid+knockdown+resistance+%28kdr%29+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).</li>
<li>Diabate, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDR+mutation%2C+a+genetic+marker+to+assess+events+of+introgression+between+the+molecular+M+and+S+forms+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+the+tropical+savannah+area+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa.</a> J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).</li>
<li>Chandre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+distribution+of+a+pyrethroid+resistance+gene+%28kdr%29+in+Anopheles+gambiae+complex+from+west+Africa+and+further+evidence+for+reproductive+isolation+of+the+Mopti+form%5BTitle%5D)+AND+%22Parassitologia%22%5BJournal%5D)">Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form.</a> Parassitologia. 41, 319-322 (1999).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+anthropophily+in+the+potential+secondary+malaria+vectors+Anopheles+coustani+s.l.+and+Anopheles+squamosus+in+Macha%2C+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).</li>
<li>Snounou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+detection+of+human+malaria+parasites+by+the+use+of+nested+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction.</a> Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).</li>
<li>Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genus-+and+species-specific+nested+polymerase+chain+reaction+malaria+detection+assay+for+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.</a> Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).</li>
<li>Oyedeji, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR-based+detection+of+Plasmodium+falciparum+infections+based+on+single+and+multicopy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes.</a> Malar J. 6, 112(2007).</li>
<li>Gama, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+versus+conventional+PCR+for+malaria+parasite+detection+in+low-grade+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia.</a> Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome.</a> B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+endophily+by+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis+in+southern+Zambia+and+identification+of+digested+blood+meals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals.</a> Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).</li>
<li>Teeter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+genomic+architecture+of+isolation+between+hybridizing+species+of+house+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice.</a> Evolution. 64, 472-485 (2010).</li>
<li>Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+survival+in+small-cell+lung+cancer+patients+treated+with+irinotecan+plus+cisplatin+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+pharmacogenomics+journal%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy.</a> The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).</li>
<li>Chakraborti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+polyethyleneimine-functionalized+ZnO+nanoparticles+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).</li>
<li>Marsden, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+differentiation%2C+and+linkage+disequilibrium%3A+prospects+for+association+mapping+in+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis.</a> G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).</li>
<li>Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from:
 <a target="_blank" href="
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx">
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx</a> 1725-1732 (2010).</li>
<li>Tripet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+analysis+of+transferred+sperm+reveals+significant+levels+of+gene+flow+between+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).</li>
<li>Slotman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+subdivision+within+the+M+molecular+form+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).</li>
<li>Basu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+Spectrometry+is+More+Sensitive+Than+PreTect+HPV-Proofer+and+Consensus+PCR+for+Type-Specific+Detection+of+High-Risk+Oncogenic+HPV+Genotypes+in+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer.</a> J Clin Microbiol. , (2011).</li>
<li>Fu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+assay%3A+a+more+accurate+method+for+JAK2V617F+mutation+detection+in+Chinese+patients+with+myeloproliferative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders.</a> Leukemia. 22, 660-663 (2008).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+the+Sequenom+MassARRAY+iPLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform.</a> Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).</li>
<li>Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+MassARRAY+technology+for+high+throughput+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).</li>
<li>Wright, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+MassARRAY+spectrometry+%28iPLEX%29+produces+a+fast+and+economical+test+for+56+familial+hypercholesterolaemia-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations.</a> Clin Genet. 74, 463-468 (2008).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-population-specific+selection+and+differentiation+between+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).</li>
<li>Stump, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-proximal+differentiation+and+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+for+high-throughput+genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa.</a> J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).</li>
<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MDA składa się z pięciu głównych etapów: amplifikacji PCR, reakcji fosfatazy alkalicznej krewetek (SAP), przedłużenia SNP, kondycjonowania produktu przedłużającego oraz spektrometrii mas wspomaganej matrycowo desorpcji/jonizacji laserowej – czasu przelotu (MALDI-TOF)33-37. Pierwszy etap amplifikacji PCR amplifikuje DNA po bokach każdego SNP, tak aby wystarczająca ilość matrycowego DNA była dostępna na etapie przedłużenia SNP. Reakcja SAP neutralizuje nieużywane dNTP, które mogą zakłócać następujący krok rozsze...

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii i Anopheles gambiae są głównymi wektorami odpowiedzialnymi za przenoszenie malarii w Afryce1. Te trzy gatunki są morfologicznie nie do odróżnienia2 i można je odróżnić tylko za pomocą testów molekularnych3-9. Ponadto istnieje wiele dalszych testów rutynowo przeprowadzanych w celu wspięcia badań epidemiologicznych i genetyki populacyjnej. Obejmują one (1) test genotypowania dla wysp specjacyjnych10-12, (2) test genotypowania rozpoznający niesynonimiczne SNP w pozycji kodonu 1014th aminokwasu genu para (oporność na knock-down lub kdr, SNP)13-18, (3) wykrywanie pasożytów PCR19-23 oraz (4) badanie przesiewowe na obecność specyficznego dla gospodarza DNA w jelicie środkowym komarów24,25.
Opracowaliśmy test wielokrotnego wykrywania (MDA), który łączy wszystkie te testy w jedną reakcję multipleksową w celu analizy ważnych epidemiologicznie cech wektorów malarii w Afryce. Test MDA obejmuje wiele markerów do wykrywania (1) gatunków (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii lub innych (żaden z trzech)), (2) odporności na insektycydy reprezentowanej w SNP kdr (zarówno L1014F, jak i L1014S), (3) obecności dwóch głównych pasożytów malarii, Plasmodium falciparum i P. vivax, oraz (4) źródła krwi od jednego ptasiego i sześciu ssaków żywicielskich.
Tradycyjnie, te testy były przeprowadzane w oddzielnych reakcjach łańcuchowych polimerazy. Gdy wszystkie te testy są wykonywane przy użyciu konwencjonalnej platformy PCR, wymaga to przeprowadzenia 8-10 testów reakcji PCR i towarzyszących im etapów elektroforezy żelowej. Każda pojedyncza reakcja PCR od przygotowania do udokumentowania wyników trwa 4-5 godzin, podczas gdy przedstawiona tu metoda MDA trwa łącznie około 5 godzin. Jest to równoznaczne z 90% oszczędnościami w samych kosztach pracy. Prezentowany tutaj MDA kosztuje 5 USD za próbkę w celu genotypowania wszystkich 33 SNP. Jest to znacznie tańsze niż pojedyncze testy na bazie żelu agarozowego, które kosztują około 1,50 USD za próbkę. Testy wykrywające wszystkie cechy objęte MDA wymagałyby co najmniej 8-10 oddzielnych testów na bazie żelu agarozowego w cenie 12-15 USD za próbkę. Co więcej, MDA znacznie zmniejsza ryzyko wygenerowania fałszywie dodatniego lub ujemnego wyniku poprzez wykorzystanie co najmniej trzech markerów dla każdego wykrycia pasożyta lub źródła żywiciela.
Platforma, z której korzystaliśmy, nie ogranicza się do wektorów malarii, ale może być używana w wielu różnych zastosowaniach, takich jak medycyna, weterynaria i podstawowa biologia26-28. Dogłębne badania asocjacyjne lub badania genetyki populacyjnej obejmujące dużą (rzędu 100) liczbę próbek wymagają opłacalnych badań przesiewowych pod kątem wielu markerów jednocześnie. Większość badań, które wykorzystują dwa lub więcej oddzielnych testów PCR, może wdrożyć MDA w celu uzyskania szybszych wyników przy niższych kosztach.

<table><tbody><tr><td>MassARRAY Analyzer Kompaktowa</td> spektrometria mas <td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF do zastosowań genomicznych do analizy kwasów nukleinowych.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>Przenosi gotowe produkty reakcji iPLEX do zestawu</td></tr><tr><td>odczynników genotypowania SpectroCHIP iPLEX Gold</td><td>Sequenom</td><td>10158</td><td>Odczynniki używane do testu iPLEX, w tym zestaw SAP.</td></tr></tbody></table>

test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Kompleks gatunkowy Anopheles gambiae obejmuje główne komary przenoszące malarię w Afryce. Ponieważ gatunki te mają tak duże znaczenie medyczne, kilka cech jest zwykle charakteryzowanych za pomocą testów molekularnych, aby pomóc w badaniach epidemiologicznych. Cechy te obejmują identyfikację gatunku, odporność na środki owadobójcze, status infekcji pasożytami i preferencje żywiciela. Ponieważ populacje kompleksu Anopheles gambiae są morfologicznie nie do odróżnienia, do identyfikacji gatunków tradycyjnie stosuje się reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Gdy gatunek jest już znany, rutynowo przeprowadza się kilka dalszych testów w celu wyjaśnienia dalszych cech. Na przykład mutacje znane jako KDR w genie para nadają oporność na insektycydy DDT i pyretroidy. Ponadto do wykrywania pasożytów obecnych w tkankach komarów stosuje się testy immunoenzymatyczne (ELISA) lub testy PCR z wykrywaniem DNA pasożyta Plasmodium. Wreszcie, połączenie PCR i trawienia enzymów restrykcyjnych można zastosować w celu wyjaśnienia preferencji gospodarza (np. krwi ludzkiej i zwierzęcej) poprzez badanie przesiewowe mączki z krwi komara pod kątem DNA specyficznego dla gospodarza. Opracowaliśmy test wielokrotnej detekcji (MDA), który łączy wszystkie wyżej wymienione testy w jeden multipleksowy genotypowanie reakcji 33SNP dla 96 lub 384 próbek jednocześnie. Ponieważ MDA zawiera wiele markerów dla gatunku, wykrywania Plasmodium i identyfikacji krwi gospodarza, prawdopodobieństwo generowania wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych jest znacznie zmniejszone w porównaniu z poprzednimi testami, które zawierały tylko jeden marker na cechę. Ten solidny i prosty test może wykryć te kluczowe cechy komarów w sposób ekonomiczny i w ułamku czasu w porównaniu z istniejącymi testami.

Identyfikacja gatunków: 
Poniższe 5 SNP pozwala łącznie zidentyfikować trzy gatunki (A. arabiensis, A. coluzzii oraz A. gambiae) (Tabela 4). Jeśli próbka nie należy do tych trzech gatunków, trzy SNP (01073-213, 04679-157 oraz 10313-052) nie ulegną amplifikacji.
genotyp kdr służący do wnioskowania o oporności na insektycydy: 
1014-ty kodon napięciowo zależnego kanału ...

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wielodetektorowy test na komary przenoszące malarii

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Ten film demonstruje test odżywiania krwią w celu oceny śmiertelności i płodności badanych związków o nowych sposobach działania na samice komarów. Technika ta pomaga w badaniach przesiewowych nowych klas insektycydów w celu zabicia opornej populacji komarów i kontrolowania rozprzestrzeniania się choroby.

Test żerowania komarów: metoda oceny wpływu badanego związku na śmiertelność i płodność dorosłych samic komarów

Podczas gdy analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości oferuje możliwość różnicowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w heterogenicznej populacji, stronniczość amplifikacji zmutowanego allelu może zwiększyć jego zdolność do wykrywania alleli obecnych w stosunkowo niskich procentach w próbce. W tym protokole opisano ulepszenia, które poprawiają czułość analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Multipleksowe fluorescencyjne testy immunologiczne stają się źródłem informacji do badań serologicznych. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na złożoność i czasochłonne procesy sprzężenia kulki z analizą koralików. Raport ten przedstawia półautomatyczny, powtarzalny protokół multipleksowego mikrokulkowego sprzężenia kulek, który jest porównywalny ze standardową metodą, a jednocześnie znacznie skraca czas oczekiwania na uzyskanie rezultatów.

Multipleksowy test serologiczny do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy

Poznaj metodę MALDI-TOF SNP do jednoczesnego wykrywania cech komarów przenoszących malarię. Ta technika identyfikuje gatunek, oporność na insektycydy i zakażenie pasożytem, wspierając badania epidemiologiczne.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Przeglądaj więcej filmów