Obrazowanie dyfuzyjne w szyjnym rdzeniu kręgowym szczura
7 kwietnia 2015
Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej jakości obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (DWI) rdzenia kręgowego szczura w celu nieinwazyjnej charakterystyki mikrostruktury tkanki. Protokół ten opisuje optymalizacje sekwencji rezonansu magnetycznego, cewki o częstotliwości radiowej i metod analizy, aby umożliwić tworzenie obrazów DWI wolnych od artefaktów.
Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości obrazowania metodą dyfuzyjnego rezonansu magnetycznego rdzenia kręgowego szczura w celu nieinwazyjnej charakterystyki mikrostruktury tkanki. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie szczura w skanerze MR z odpowiednią mobilizacją i monitorowaniem oddechu. Drugim krokiem jest wykonanie niestandardowego rezonansu magnetycznego z dyfuzją ważoną z bramkowaniem oddechowym.
Następnie obrazy są korygowane pod kątem artefaktów podatności. Ostatnim krokiem jest dopasowanie sygnału MRI do modelu matematycznego. Ostatecznie porównanie parametrów modelu w obrębie obszarów zainteresowania służy do pokazania właściwości mikrostruktury tkanki.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak skanowanie ex vivo, jest to, że można ją zastosować w praktyce klinicznej w celach diagnostycznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące urazów rdzenia kręgowego, takie jak identyfikacja wtórnych mechanizmów urazowych i rokowanie w przypadku powrotu do zdrowia. Procedurę zademonstrują technicy Natasha Wilkins i Matt Renquist z mojego laboratorium przed wykonaniem kroków opisanych w tym protokole.
Po pierwsze, należy uzyskać zgodę odpowiednich komitetów ds. opieki i użytkowania dla wszystkich procedur. Zacznij od znieczulenia szczura w komorze indukcyjnej przy użyciu 5% izofluoru w powietrzu medycznym. Gdy nie ma odruchu wyciągania łapy i pisania, zmniejsz znieczulenie do 2%, a następnie przenieś zwierzę na łóżko skanera w pozycji leżącej głową do przodu.
Utrzymuj 2% fluoru ISO przez stożek nosowy przez cały zabieg i utrzymuj przepływ powietrza medycznego na poziomie około jednego litra na minutę. Nałóż również niewielką ilość maści nawilżającej na oczy szczura, aby uniknąć uszkodzenia rogówki podczas znieczulenia. Umieść bezpiecznie pas do monitorowania oddechu wokół tułowia szczura i podłącz go do systemu bramkowania układu oddechowego.
Sprawdź komputer monitorujący oddech, aby upewnić się, że cykl oddechowy jest jasny i spójny. W razie potrzeby wyreguluj pasek, ponieważ ten krok jest niezbędny dla jakości obrazu. Używaj systemu ogrzewania ciepłym powietrzem oraz monitoruj i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia za pomocą sondy doodbytniczej, aby upewnić się, że jest ona utrzymywana na poziomie 37 stopni Celsjusza.
Utrzymuj częstość oddechów od 30 do 45 oddechów na minutę, regulując poziom znieczulenia w zakresie od 1,2 do 2% Teraz umieść szczura w uchwycie głowy za pomocą pręta do gryzienia i wkręć nauszniki i wsuń głowę do kwadraturowej cewki objętościowej, aż kręgosłup szyjny znajdzie się w środku cewki. Na koniec wsuń szczura i uchwyty podtrzymujące do otworu skanera, jeśli to możliwe, dostosuj dostrojenie i dopasowanie kondensatorów cewki do odpowiedniej częstotliwości i impedancji zgodnie z instrukcjami dostawcy. Zdobądź domyślny skan zwiadowczy trzech samolotów, aby upewnić się, że pozycja jest prawidłowa.
Ten pierwszy skan aktywuje zautomatyzowane procedury systemu MRI do wykrywania wymuszeń częstotliwości rezonansowej, kalibracji mocy częstotliwości radiowej i regulacji wzmocnienia odbiornika. Sprawdź, czy środek kręgosłupa szyjnego jest wyrównany zarówno ze środkiem magnesu, jak i ze środkiem cewki MRI. Następnie dodaj do protokołu obrazowania echoplaner, dyfuzyjną ważoną sekwencję echa spinowego.
Użyłem domyślnych ustawień sekwencji, ale zaleciłem 12 plasterków o grubości 0,75 milimetra i ustaw je prostopadle do głównej osi rdzenia szyjnego. Użyj podstawy móżdżku jako wewnętrznego odniesienia, aby zapewnić spójne rozmieszczenie plastrów między zwierzętami i między sesjami. Włącz pasma nasycenia.
Następnie umieść cztery pasma nasycenia o grubości 10 milimetrów na zewnątrz rdzenia kręgowego, aby zminimalizować sygnał z tych tkanek i zmniejszyć ich potencjał do wywoływania artefaktów. Pamiętaj też, aby włączyć bramkowanie oddechowe. Teraz skonfiguruj sekwencję, korzystając z ustawień oczekiwania na dyfuzję, jak pokazano na ekranie tutaj.
Następnie rozpocznij skanowanie. Całkowity czas akwizycji wyniesie około 25 minut podczas skanowania. Monitorował oprogramowanie do bramkowania oddechowego i dostosował okres opóźnienia między wyzwoleniem a sygnałem do systemu MRI tak, aby akwizycja zachodziła tylko w spokojnej części cyklu oddechowego.
Należy pamiętać, że opóźnienie wyzwalania od 100 do 400 milisekund będzie konieczne w zależności od wzorca oddychania zwierzęcia. Pomoże to zmniejszyć artefakty, które pojawiają się podczas ruchu oddechowego. Jeśli to możliwe, powtórz sekwencję z niestandardowymi odwróconymi znacznikami ustawionymi na włączone po zakończeniu obrazowania.
Wyjmij zwierzę z uchwytu i umieść je z powrotem w klatce. Monitoruj zwierzę do momentu odzyskania przytomności. Aby utrzymać mostek w pozycji leżącej.
Rozpocznij przetwarzanie obrazu, wykonując najpierw korekcję artefaktów podatności. Następnie wyodrębnij wolumin B równe zero z każdego skanowania do jednego pliku za pomocą narzędzi dostarczonych z FSL lub innymi pakietami oprogramowania MRI. Przykładowy kod jest widoczny tutaj.
Wymagany jest jeden plik dla każdej fazy w kierunku kodu. Następnie użyj polecenia doładowania w FSL, aby utworzyć poprawiony plik ze zredukowanymi artefaktami zniekształceń obrazu. Zastosuj tę korekcję do nieprzetworzonych obrazów DWI, które mają być używane do tworzenia map parametrów.
Załaduj ten poprawiony plik DWI do widoku FSL i wybierz plik. Utwórz maskę z menu. Użyj narzędzi ołówka, aby narysować obszar zainteresowania w obrębie jednego typu tkanki.
Zapisz ten plik i powtórz te czynności dla innych żądanych obszarów zainteresowania lub ROI. Użyj pliku ROI, aby zamaskować plik DWI, a następnie oblicz średni sygnał w ROI dla każdej objętości obrazu. Skopiuj pierwsze osiem wyników do programu do obliczeń numerycznych, takiego jak MATLAB, jako wektor sygnału poprzecznego, a drugie osiem wyników jako wektor sygnału podłużnego, gdzie osiem to liczba użytych wartości B.
Skopiuj również wartości B do programu jako wektor ośmiu wartości B. Wartości B dla kierunku poprzecznego i wzdłużnego powinny być identyczne, jeśli to możliwe. Efektywną wartość B, a nie nominalną wartość B, należy uzyskać ze skanera.
Użyj zestawu narzędzi do dopasowywania krzywych, aby dopasować dane sygnału i wartości B do żądanego modelu. Wpisując narzędzia CF w wierszu polecenia, wybierz wartości B jako dane X, a wektory sygnału jako dane y. Następnie wybierz menu dopasowania i wprowadź równanie dopasowania.
Należy pamiętać, że podczas wprowadzania równania może być konieczne ustawienie punktów początkowych i limitów dla zmiennych, które są bardziej rozsądne dla danych. Po zastosowaniu równań do dopasowania zanotuj wartości parametrów, które posłużą jako znaczniki ilościowe. Zdjęcie przedstawia wysokiej jakości obrazy ważone dyfuzją uzyskane przy dyfuzji zastosowanej poprzecznie i podłużnie do głównej osi rdzenia kręgowego.
Dla każdego kierunku pokazane są różne wartości B, które zapewniają najlepszy kontrast między białą a szarą materią. W tym miejscu lewa kolumna pokazuje wycinek zobrazowany za pomocą sekwencji DWI. Środkowa kolumna pokazuje akwizycję z odwróconymi blipami.
Zwróć uwagę, że obiekty, które wydają się rozciągnięte na pierwszym obrazie, są skompresowane w środkowej kolumnie. Prawa kolumna pokazuje obrazy ważone dyfuzją skorygowane za pomocą doładowania. Górny wiersz to obraz ważony bez dyfuzji.
Środkowy rząd pokazuje ważenie dyfuzyjne zastosowane w kierunku poprzecznym, a dolny rząd pokazuje ważenie dyfuzyjne w kierunku wzdłużnym. Tutaj możemy zobaczyć znormalizowany sygnał wykreślony jako funkcja ważenia dyfuzji z kierunkiem kodowania dyfuzji poprzecznej i podłużnej. Wysokiej jakości mapy dyfuzyjności, kurtozy i anizotropii są obliczane na podstawie sygnału dla każdego woksela.
Istnieje wyraźna różnica w parametrach między istotą białą i szarą, a także różnice regionalne w obszarach istoty białej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o uważnym monitorowaniu oddechu zwierzęcia i dostosowaniu opóźnienia w znieczuleniu w celu zmniejszenia artefaktów ruchowych. Jest to szczególnie ważne u rannych szczurów, które mogą mieć nieprawidłowe tempo oddychania lub inne powikłania fizjologiczne, które mogą wymagać dostosowania procedur.
Przegląd
Ten protokół opisuje proces uzyskania wysokiej jakości obrazów dyfuzyjnie ważonej rezonansu magnetycznego (DWI) rdzenia kręgowego szczurów. Skupia się na nieinwazyjnym charakteryzowaniu mikrostruktury tkanki za pomocą zoptymalizowanych technik MRI.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Wizualizacja medyczna
- Badania rdzenia kręgowego
Tło
- Rezonans magnetyczny dyfuzyjnie ważony jest kluczowy dla oceny mikrostruktury tkanki.
- Istniejące metody często obejmują skanowanie ex vivo, co ogranicza przydatność kliniczną.
- Ten protokół ma na celu ulepszenie technik obrazowania in vivo.
- Rozumienie urazów rdzenia kręgowego może prowadzić do lepszych strategii diagnostycznych i terapeutycznych.
Cel badania
- Nieinwazyjne charakteryzowanie mikrostruktury tkanki w rdzeniu kręgowym szczurów.
- Optymalizacja sekwencji MRI i metod analizy dla obrazowania bez artefaktów.
- Ułatwienie przekładu klinicznego technik obrazowania w przypadku urazów rdzenia kręgowego.
Stosowane metody
- Przygotowanie szczura z anestezją i monitorowaniem oddechu.
- Indywidualne skanowanie dyfuzyjnie ważone MRI z bramkami oddechowymi.
- Korekcja artefaktów wrażliwości w obrazach uzyskiwanych.
- Modelowanie matematyczne sygnałów MRI w celu analizy właściwości tkanki.
Główne wyniki
- Udana akwizycja wysokiej jakości obrazów DWI rdzenia kręgowego.
- Skuteczna korekcja artefaktów prowadząca do poprawy czystości obrazu.
- Wykazana zdolność do porównywania parametrów mikrostruktury tkanki.
- Potencjał zastosowania klinicznego w diagnozowaniu urazów rdzenia kręgowego.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę in vivo obrazowania DWI.
- Zwiększa zrozumienie urazów rdzenia kręgowego i ich powrotu do zdrowia.
- Technika ta może być dostosowana do zastosowań klinicznych, poprawiając zdolności diagnostyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive diffusion weighted imaging of the rat cervical spinal cord enables quantitative assessment of tissue microstructure, supporting target validation and mechanistic de-risking in preclinical models of spinal cord injury. This approach provides predictive confidence for therapeutic efficacy by linking imaging biomarkers to pathophysiological changes, informing go/no-go decisions in early discovery. The protocol enhances translational continuity by generating clinically relevant imaging endpoints that can be adapted for diagnostic and prognostic use in CNS drug development programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying microstructural changes in white and gray matter compartments.
- Operational Value: Supports biological de-risking through longitudinal monitoring of tissue integrity in disease models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that mitigate diffusion alterations associated with secondary injury mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline diffusion parameters in healthy tissue.
- Quantitative Outputs: Generates diffusivity, kurtosis, and anisotropy maps that serve as reproducible, multidimensional readouts for compound screening.
- Platform Scalability: Enables standardized imaging workflows across laboratories through respiratory gating and artifact correction protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for monitoring injury progression and recovery in preclinical spinal cord injury models.
- Translational Biomarker Alignment: Derives imaging biomarkers that correlate with histopathological outcomes, supporting biomarker qualification efforts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by quantifying microstructural preservation or restoration following intervention.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical development, providing imaging-based metrics that bridge phenotypic screening and mechanistic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling non-invasive, longitudinal assessment of tissue microstructure in response to pharmacological modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized DWI acquisition and post-processing pipelines that ensure reproducibility across time points and treatment groups.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., axial and radial diffusivity, fractional anisotropy) that allow comparison of microstructural states across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation by generating imaging endpoints with direct clinical correlates in spinal cord injury assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for CNS portfolio programs requiring non-invasive structural and microstructural phenotyping.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in CNS target engagement and downstream pathophysiological effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through respiratory gating, susceptibility correction, and ROI-based quantification.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of ineffective compounds, reducing late-stage failure risk due to lack of target-mediated microstructural effect.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying candidates that demonstrate preservation of spinal cord microstructure, aligning with disease-modifying potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small-animal MRI setup, anesthesia management, and respiratory gating systems.
- Depends on access to a small-bore animal MRI system capable of high-resolution diffusion weighting and multi-b-value acquisitions.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols, artifact correction procedures, and ROI definition for multi-site studies.
- Involves adaptation considerations across rodent models and injury severities, particularly regarding respiratory stability and motion control.
- Practical limitations include scan time constraints (~25 minutes per session) and the need for precise thermal and physiological monitoring to maintain data quality.
