Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustanowienie systemu kohodowli do oceny zdolności indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych do tworzenia funkcjonalnych połączeń przy użyciu podejścia genowego opartego na fotostymulacji hodowanych neuronów za pośrednictwem kanału RUSIN drugiego lub CR drugiego. Osiąga się to poprzez wyizolowanie pierwotnych mysich nerwowych komórek progenitorowych lub NPC i umożliwienie im różnicowania się w astrocyty. Następnie pierwotne neurony korowe szczura są transfekowane CH R dwa i powlekane warstwą astrocytów, która służy jako istniejąca populacja neuronów.

Następnie ludzkie NPC pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub kultur IPSC są transdukowane synapsyną jednego wirusa pomidora 2D, a następnie umieszczane w kulturze neuronów astrocytów i indukowane do różnicowania, a następnie tworzenia połączeń synaptycznych. Wyniki pokazują, że neurony pochodzące z IPSC tworzą połączenia synaptyczne z neuronami korowymi szczurów w oparciu o elektrofizjologiczne zapisy prądów postsynaptycznych w neuronach pochodzących z IPSC po genowej fotostymulacji CHR dwóch neuronów korowych eksprymujących. Główną przewagą tej materii nad istniejącymi, takimi jak te, w których hoduje się tylko astrocyty z ludzkimi neuronami pochodzącymi z IPSC, jest to, że czas dojrzewania tych ludzkich neuronów jest krótszy

Dzieje się tak dlatego, że obecność pierwotnych neuronów może przyspieszyć dojrzewanie tych ludzkich neuronów, co pokazuje, że procedura będzie Uni Chin, doktorantem z mojego laboratorium i pozywa Y z laboratorium George'a Augustine'a Po pobraniu embrionalnych mózgów szczurów i wyizolowaniu tkanki korowej zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś tkanki korowe do naczynia zawierającego wstępnie podgrzany roztwór trawienia tkanki korowej. Zmiel tkanki korowe tak drobno, jak to możliwe, przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji przenieść tkanki korowe do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, oddzielić tkanki za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodnego roztworu bez kawałków tkanki.

Przepuść roztwór tkankowy przez sitko do komórek o wielkości 70 mikronów, aby odfiltrować wszelkie pozostałe grudki tkanek. Podaczuj trzy mililitry roztworu na 15 mililitrów. Probówki wirówkowe.

Dodaj 800 mikrolitrów 7,5% BSA w jednym XPBS na dno każdej probówki, tworząc warstwę pod wirówką warstwy tkankowej o stężeniu 200 G przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant przez zasysanie z granicy dwóch warstw. Unikaj naruszania granulki selp na dnie tuby.

Po użyciu jednego mililitra pierwotnej pożywki neuronowej do ponownego zawieszenia każdej palety komórek, połącz je wszystkie w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie użyj hemocytometru, aby określić wirówkę gęstości komórek. 6 milionów neuronów korowych szczurów w temperaturze 200 G przez pięć minut i usunąć supernatant.

Do elektroporacji potrzebnych jest co najmniej 6 milionów neuronów korowych. Aby zapewnić utworzenie sieci neuronalnej przez neurony, które przeżyły, dodaj 100 mikrolitrów roztworu do elektroporacji do osadu komórkowego i delikatnie ponownie zawiesij. Następnie połącz 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z sześcioma mikrogramami dwuplazmidowego CR i przenieś do certyfikowanego weterynarza.

Wybierz i zastosuj odpowiedni program do elektroporacji zgodnie z instrukcjami producenta. Po elektroporacji dodaj 500 mikrolitrów MEM do weterynarza. Przenieś komórki do 11,5 mililitra pierwotnego neuronu, pożywki i delikatnie zawiesić resus.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów do każdej studzienki 24-dołkowej płytki zawierającej astrocyty myszy. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po wygenerowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPC, indukuj i utrzymuj komórki jako ludzką neuronalną komórkę progenitorową lub hodowlę NPC zgodnie z protokołem tekstowym.

W tym przykładzie NPC są oznaczane za pomocą synapsy wektora lentiwirusowego w jednym pomidorze TD dzień po dodaniu pierwotnych neuronów do hodowli astrocytów. Użyj jednego XPBS, aby raz umyć ludzkich NPC, a następnie dodaj roztwór do odłączania komórek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały odłączone.

Następnie przenieś je do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwukrotnie większą ilość D-M-E-M-F 12 i odwiruj przy 200 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i użyć pożywki różnicującej neurony, aby delikatnie zawiesić osad w pojedynczych komórkach. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.

Następnie ostrożnie odessaj pożywkę z płytki kultur neuronów korowych astrocytów. Ludzcy NPC mają 5 000 komórek na centymetr kwadratowy na studzienkę w różnicowaniu neuronalnym. Średni. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 i wymieniać pożywkę co dwa lub trzy dni przez co najmniej 28 dni.

Aby potwierdzić, czy ludzkie IPC zachowują się jak dojrzałe neurony, użyj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w 60-krotną soczewkę zanurzeniową w wodzie, aby znaleźć komórki zróżnicowane od ludzkich IPC. Wizualizując pomidora TD. Pociągnij pipetę rejestrującą do rezystancji perfufu od czterech do sześciu omów.

Komórki w temperaturze pokojowej w roztworze zewnętrznym stale bulgotały 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Użyj roztworu wewnętrznego, aby napełnić mikropipetę rejestrującą, nałaść komórkę pomidorowo-dodatnią TD w trybie całego ogniwa i zarejestrować wyzwolenie potencjału czynnościowego w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu w cęgi prądowe. Potwierdzenie, że potencjał czynnościowy komórek korowych wyrażających CHR dwa jest niezawodnie wywoływany przez stymulację światłem.

Po pierwsze, znajdź komórki korowe wyrażające CR dwa poprzez wizualizację GFP poprzez oświetlenie światłem za pomocą rtęciowej lampy łukowej i przy użyciu filtra wzbudzenia o długości fali 480 na 40 nanometrach. Sprawdzić, czy potencjał czynnościowy jest niezawodnie wywoływany poprzez aktualny zapis cęgowy w trybie całego ogniwa. Aby przeprowadzić stymulację genową, należy załatać dodatnie ogniwo pomidora TD w trybie całego ogniwa i ustawić zacisk napięcia na ujemne 70 miliwoltów z lampą rtęciową całego pola i filtrem wzbudzenia 480 na 40.

Stymuluj całe pole przez 30 sekund. Rejestruj prądy postsynaptyczne lub PSC łatanej komórki indukowane przez fotostymulację CHR dwóch presynaptycznych neuronów korowych. Ustaw próg dla obszaru amplitudy i prądów na pięć Pico Amp tutaj i PICO odpowiednio ręcznie sprawdź te zdarzenia, aby odrzucić wszelkie ślady inne niż PSC.

Jak pokazano w tym filmie, do wygenerowania kokultury neuronów pochodzących z IPC, pierwotnych neuronów korowych i astrocytów wymaganych jest kilka kroków. Obraz ten pokazuje, że w drugim dniu różnicowania mysich NPC w astrocyty, można łatwo zaobserwować kwaśne białko fibrylarne gleju lub astrocyty GFAP-dodatnie. Mysim NPC pozwolono różnicować się przez co najmniej tydzień przed posiewem neuronów korowych, wyrażając CR dwa na monowarstwie astrocytów, a oba są identyfikowane w tej kokulturze poprzez barwienie immunofluorescencyjne GFAP i CHR dwa.

Po trzech do czterech tygodniach różnicowania ludzkich NPC, w kulturach wykryto neurony TD pomidorowo-dodatnie, jak pokazano tutaj. Po stymulacji światłem potencjały czynnościowe zostały wygenerowane w neuronach korowych wyrażających CHR dwa IPSC. Neurony pochodne są również pobudliwe, wykazując zwiększone działanie.

Potencjalne wyzwalanie wraz ze wzrostem amplitudy depolaryzujących impulsów prądu. Przy braku światła neurony pochodzące z IPSC otrzymywały spontaniczne sygnały synaptyczne. Te wewnętrzne prądy postsynaptyczne były głównie pośredniczone przez receptory AMPA.

Fotostymulacja neuronów korowych utrzymywała się przez cały 32-gi długi błysk światła, podczas gdy częstotliwość PSC była podwyższona. Gdy CHR dwa neurony korowe wykazujące ekspresję były fotostymulowane, ich amplituda pozostała niezmieniona. Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy użyć innych systemów kohodowli z różnymi typami komórek specyficznych dla pacjenta, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ potencjalnych związków leczniczych na określone choroby będące przedmiotem zainteresowania.