Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ustanowienie systemu kokultury do oceny zdolności neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do tworzenia funkcjonalnych połączeń, z wykorzystaniem podejścia genicznego opartego na fotostymulacji hodowanych neuronów za pomocą kanału ChR2 lub CR2. Osiąga się to poprzez wstępne wyizolowanie pierwotnych mysich komórek progenitorowych neuronów lub NPC i umożliwienie im zróżnicowania w astrocyty. Następnie pierwotne neurony korowe szczura są transfekowane ChR2 i wysiewane na warstwę astrocytów, która pełni rolę istniejącej populacji neuronalnej.

Następnie ludzkie NPC pochodzące z kultur indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są transdukowane wirusem synapsyny 1 2D tomato, a następnie wysiewane na kulturę astrocytów i neuronów i indukowane do różnicowania, co w konsekwencji prowadzi do tworzenia połączeń synaptycznych. Wyniki wskazują, że neurony pochodzące z iPSC tworzą połączenia synaptyczne z neuronami korowymi szczura, co wykazano na podstawie rejestracji elektrofizjologicznej prądów postsynaptycznych w neuronach pochodzących z iPSC podczas genicznej fotostymulacji neuronów korowych wykazujących ekspresję CHR2. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami, takimi jak kokultury samych astrocytów z ludzkimi neuronami pochodzącymi z iPSC, jest krótszy czas dojrzewania tych ludzkich neuronów.

Dzieje się tak, ponieważ obecność neuronów pierwotnych może przyspieszyć dojrzewanie tych neuronów ludzkich. Procedurę zaprezentują Uni Chin, doktorant z mojego laboratorium, oraz suing Y z laboratorium George'a Augustine'a. Po pobraniu embrionalnych mózgów szczura i wyizolowaniu tkanki kory zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś tkanki kory do szalki zawierającej uprzednio ogrzany roztwór do trawienia tkanki kory. Posiekaj tkanki kory tak drobno, jak to możliwe, przed inkubacją w 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji przenieś tkanki kory do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL i dysocjuj tkanki za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodnego roztworu pozbawionego fragmentów tkanki.

Przepuść zawiesinę tkankową przez sitko komórkowe o oczkach 70 micron, aby odfiltrować pozostałe grudki tkanki. Odmień trzy mililitry roztworu do probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów.

Do dna każdej probówki dodać 800 µL 7,5% BSA w XPBS, tworząc warstwę pod warstwą tkanki, a następnie wirować z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Następnie usunąć nadsącz, aspirując go z poziomu styku obu warstw. Należy unikać naruszenia osadu selp na dnie probówki.

Po zawieszeniu każdego pelletu komórkowego w 1 ml pożywki dla neuronów pierwotnych, należy połączyć je wszystkie w probówce do wirowania o pojemności 15 ml. Następnie, używając komory licznikowej (hemocytometru), należy oznaczyć gęstość komórek. 6 milionów neuronów kory szczura wirować przy 200 G przez pięć minut, a następnie usunąć nadsącz.

Do elektroporacji wymagane są co najmniej 6 milionów neuronów korowych. Aby zapewnić utworzenie sieci neuronalnej przez przeżyłe neurony, należy dodać 100 µL roztworu do elektroporacji do osadu komórkowego i delikatnie go resuspenderować. Następnie 100 µL zawiesiny komórkowej należy połączyć z sześcioma µg plazmidu CR two i przenieść do certyfikowanej kuwety.

Wybierz i zastosuj odpowiedni program elektroporacji zgodnie z instrukcjami producenta. Po elektroporacji dodaj 500 µL MEM do kuwety. Przenieś komórki do 11,5 mL pożywki dla pierwszorzędowych neuronów i delikatnie resuspenduj.

Następnie dodaj 500 µL do każdego dołka płytki 24-dołkowej zawierającej astrocyty mysie. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po wygenerowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPCs, indukuj i utrzymuj komórki jako hodowlę ludzkich neuralnych komórek progenitorowych lub NPC zgodnie z protokołem tekstowym.

W tym przykładzie NPC są znakowane przy użyciu wektora lentiwirusowego synapse in one TD tomato dzień po dodaniu neuronów pierwotnych do hodowli astrocytów. Należy użyć XPBS do jednorazowego przemycia ludzkich NPC, a następnie dodać roztwór do odrywania komórek i inkubować przez pięć minut w temperaturze 30 °C. Należy upewnić się, że wszystkie komórki zostały oddzielone.

Następnie przenieś je do probówki o pojemności 15 ml zawierającej dwukrotność objętości D-M-E-M-F 12 i wiruj przy 200 G przez pięć minut. Usuń nadsącz i za pomocą medium do różnicowania neuronalnego delikatnie resuspenduj osad do uzyskania pojedynczych komórek. Użyj hemocytometru do policzenia komórek.

Następnie ostrożnie odessać medium z płytki z kulturami neuronów korowych astrocytów. Ludzkie NPC w zagęszczeniu 5 000 komórek na centymetr kwadratowy na dołek w medium do różnicowania neuronalnego. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2, wymieniając medium co dwa lub trzy dni przez co najmniej 28 dni.

Aby potwierdzić, czy ludzkie IPC zachowują się jak dojrzałe neurony, należy użyć mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw imersyjny z wodą 60x w celu odnalezienia komórek zróżnicowanych z ludzkich IPC. Wykorzystując wizualizację TD tomato, należy dociągnąć pipetę rejestrującą do oporu od czterech do sześciu ohm perfuse.

Komórki w temperaturze pokojowej w roztworze zewnętrznym były stale napowietrzane mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Używając roztworu wewnętrznego, wypełniono mikropipetę rejestrującą, wykonano patch komórki TD pomidora w trybie whole cell i zarejestrowano wyzwalanie potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na wtryskiwanie prądu w trybie current clamp. W celu potwierdzenia, że potencjał czynnościowy komórek korowych wykazujących ekspresję ChR2 jest wiarygodnie wywoływany przez stymulację światłem.

Najpierw należy zlokalizować komórki kory wyrażające CR dwa poprzez wizualizację GFP przy użyciu oświetlenia lampą łukową rtęciową i filtra wzbudzenia o długości fali 480/40 nm. Należy sprawdzić, czy potencjał czynnościowy jest wiarygodnie wywoływany za pomocą rejestracji w konfiguracji current clamp w trybie whole-cell. Aby przeprowadzić stymulację geniczną, należy poddać patchowaniu komórkę pozytywną pod kątem TD tomato w trybie whole-cell i ustawić voltage clamp na -70 mV, korzystając z lampy rtęciowej o szerokim polu oraz filtra wzbudzenia 480/40 nm.

Stymuluj całe pole przez 30 sekund. Zarejestruj prądy postsynaptyczne lub PSC w komórce poddanej patch-clampowi, wywołane fotostymulacją presynaptycznych neuronów kory wykazujących ekspresję CHR2. Ustaw próg dla amplitudy oraz pola prądów na 5 pA i pA odpowiednio; ręcznie sprawdź te zdarzenia, aby odrzucić wszelkie ślady niebędące PSC.

Jak pokazano w tym filmie, wygenerowanie kokultury neuronów pochodzących z IPC, pierwotnych neuronów korowych i astrocytów wymaga wykonania kilku kroków. Ten obraz pokazuje, że w drugim dniu różnicowania mysich NPC w astrocyty można łatwo zaobserwować astrocyty wykazujące pozytywną reakcję na białko kwaśne włókienka glejowej lub GFAP. Mysie NPC różnicowano przez co najmniej tydzień przed wysianiem neuronów korowych wykazujących ekspresję CR two na monowarstwę astrocytów; oba typy komórek zidentyfikowano w tej kokulturze za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na GFAP i CHR two.

Po trzech do czterech tygodniach różnicowania ludzkich NPC, w kulturach wykryto neurony wykazujące ekspresję TD tomato, co przedstawiono tutaj. Po stymulacji światłem w neuronach korowych wykazujących ekspresję CHR two IPSC generowane były potencjały czynnościowe. Pochodne neurony są również pobudliwe, wykazując zwiększoną aktywność.

Potencjalne wyładowania wraz ze wzrostem amplitudy depolaryzujących impulsów prądowych. W ciemności neurony pochodzące z IPSC otrzymywały spontaniczne sygnały synaptyczne. Te dośrodkowe prądy postsynaptyczne były zapośredniczone głównie przez receptory AMPA.

Fotostymulacja neuronów korowych była kontynuowana przez cały czas trwania 32. długiego błysku światła, podczas którego częstotliwość PSC była podwyższona. W przypadku fotostymulacji neuronów korowych wykazujących ekspresję CHR two, ich amplituda nie uległa zmianie. Po przeprowadzeniu tej procedury możemy wykorzystać inne systemy kokultury z różnymi typami komórek specyficznych dla pacjenta, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ kandydujących związków leków na konkretne schorzenia.