Name: Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj metodę oceny tworzenia połączeń synaptycznych w systemie kokulturowym z neuronami pochodzącymi z komórek iPSC i pierwotnymi neuronami kory mózgowej. Technika optogenetyczna z wykorzystaniem channelrhodopsin-2 umożliwia precyzyjną stymulację neuronów światłem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy K. Deisseroth i S. Je za odpowiednio konstrukcje lentiwirusowe ChR2 i Synapsin1-tdTomato, C. Chai za podzielenie się wiedzą i protokołem generowania iPSC, W.Y. Leongowi za wsparcie techniczne, członkom laboratorium Goh za podzielenie się odczynnikami i ekspertyzą. Prace te były wspierane przez Abbott Nutrition i Academic Centre of Excellence (ACE) Research Award od GlaxoSmithKline (GSK) dla E.L.G., przez National Research Foundation Singapore w ramach Konkurencyjnego Programu Badawczego (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) dla E.L.G. i G.J.A., a także przez program World Class Institute (WCI) Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji. Science and Technology of Korea (MEST) (numer grantu NRF: WCI 2009-003) na rzecz G.J.A.

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li>
<li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li>
<li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li>
<li>Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li>
<li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935(2012).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Optogenetyka zapewnia czasową i przestrzenną precyzję aktywacji zdefiniowanych populacji neuronów13. W naszych eksperymentach całe pole obiektywu mikroskopu było oświetlane przez 30 sekund, aby fotostymulować tylko neurony korowe wyrażające ChR2. Pozwoliło nam to ustalić, czy połączenia synaptyczne zostały utworzone między różnymi populacjami neuronów w obrębie kokultury. Nasze wyniki ujawniły, że fotostymulacja zwiększa częstotliwość PSC w neuronach pochodzących z iPSC, co pokazuje, że neurony te otrzymują dane synaptyczne z presynaptycznych neuronów korowych eksprymujących ChR2. To z kolei pozwoliło ustalić, że neurony pochodzące z iPSC z powodzeniem integrują się z obwodami z neuronami korowymi.
Istnieje kilka kluczowych etapów tworzenia tego systemu kokultur. Ważne jest, aby upewnić się, że hodowle astrocytów pochodzące z mysich NPC są zdrowe, z minimalną śmiercią komórki, przed przystąpieniem do posiewu innych typów komórek. Neurony korowe i ludzcy NPC dobrze przyczepiają się do zdrowych astrocytów, a zapisy elektrofizjologiczne zależą w dużym stopniu od warunków hodowli. Innymi kluczowymi krokami w tym protokole są elektroporacja i posiew neuronów korowych na kulturach astrocytów. Ponieważ duża liczba komórek umiera po elektroporacji, ważne jest, aby upewnić się, że co najmniej 6 milionów neuronów korowych jest elektroporowanych w celu posiewu na kulturach astrocytów na 24-dołkowych płytkach. Zaobserwowaliśmy, że gdy mniej niż 6 milionów komórek zostało poddanych elektroporacji, liczba neuronów, które przeżyły, nie tworzyła gęstej sieci neuronalnej, co wpływało na zapisy elektrofizjologiczne. Liczba elektroporowanych neuronów korowych powinna być również spójna dla każdego eksperymentu z udziałem współkultur, aby umożliwić porównanie różnych badań. W przypadku wszystkich etapów związanych z trawieniem enzymatycznym ważne jest, aby nie pozostawiać komórek w roztworze trawiennym zbyt długo, ponieważ może to prowadzić do śmierci komórki.
Podejście to można wykorzystać do badania przesiewowego zdolności neuronów pochodzących z fibroblastów specyficznych dla pacjenta do tworzenia kontaktów synaptycznych z innymi neuronami. Neurony pochodzące z fibroblastów od pacjentów cierpiących na zaburzenie neurorozwojowe Zespół Retta (RTT) wykazują defekty transmisji synaptycznej: neurony RTT wykazują znaczny spadek częstotliwości i amplitudy PSC w porównaniu ze zdrowymi neuronami, prawdopodobnie z powodu mniejszej łączności synaptycznej14. Nasz system kohodowli pozwala na badanie wpływu leków na neurony wykazujące wady rozwojowe. Można to przeprowadzić poprzez dodawanie interesujących związków podczas wysiewu chorych ludzkich NPC, a także podczas ciągłej ekspozycji na związki przez cały czas różnicowania neuronów.
Chociaż ten system kohodowli może być również używany jako model do testowania leków, ograniczeniem tego podejścia jest to, że proces badania skutków każdego kandydującego związku może być długi i żmudny, ponieważ nie jest to wysokoprzepustowa metoda przesiewowa. Po leczeniu związkami kandydującymi, neurony pochodzące z iPSC muszą być indywidualnie łatane, aby określić wpływ każdego związku na PSC. Co więcej, obecnie nie ma wielu dostępnych fibroblastów i iPSC od pacjentów. W związku z tym w najbliższej przyszłości interesujące będzie posiadanie większej liczby komórek pacjentów, a także dostosowanie tego protokołu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Na przykład, znakując neurony pochodzące z iPSC za pomocą wskaźnika aktywności, takiego jak genetycznie kodowane czujniki jonów lub potencjału błonowego, możliwe byłoby znaczne zwiększenie przepustowości poprzez pominięcie czasochłonnej procedury elektrofizjologicznej. Ponieważ cały proces generowania tego systemu kohodowli, od przeprogramowania fibroblastów po wykonywanie zapisów elektrofizjologicznych, wymaga ponad 90 dni, zaleca się, aby ludzkie iPSC lub NPC zostały namnażone, po odpowiednio etapach przeprogramowania i indukcji neuronalnej, i kriokonserwowane w celu skrócenia czasu potrzebnego na przyszłe eksperymenty.
W naszych eksperymentach wykazaliśmy ekspresję ChR2 w neuronach korowych pod promotorem synapsyny1. Ponieważ ten promotor jest panneuronalny, przypuszczalnie fotostymulowaliśmy zarówno hamujące, jak i pobudzające neurony korowe. Jeśli celem przyszłych eksperymentów jest specyficzne badanie obwodów hamujących lub pobudzających, można zastosować bardziej specyficzne promotory. Alternatywnie, neurony korowe można uzyskać od myszy transgenicznych (lub wstrzykniętych wirusem), u których ekspresja ChR2 jest specyficznie ukierunkowana na genetycznie zdefiniowane subpopulacje neuronów. Na przykład pobranie tkanek korowych od myszy, u której rekombinaza Cre ulega ekspresji w interneuronach zawierających parwalbuminę (interneurony PV), która jest krzyżowana z myszą z floksowanym ChR2, da sytuację, w której jedynymi neuronami korowymi wyrażającymi ChR2 będą interneurony PV15. Zastosowanie takich interneuronów wykazujących ekspresję ChR2 w naszym systemie kohodowli umożliwi określenie, czy neuron pochodzący z iPSC jest w stanie włączyć się do obwodu z interneuronami PV.
Na podstawie poprzedniego badania9 stwierdzono, że neurony korowe są dojrzałe z nakładającymi się dendrytami po 14 dniach in vitro. Tak więc, jeśli fotostymulacja nie wywołuje odpowiedzi z łatanego neuronu pochodzącego z iPSC, powinno to wskazywać, że neuron nie ma zdolności do tworzenia połączeń synaptycznych z neuronami korowymi. Neuron pochodzący z iPSC jest w stanie odbierać sygnały synaptyczne z innych neuronów pochodzących z iPSC lub neuronów korowych. Gdyby użyto tradycyjnych nagrań z zaciskiem krosowym, nie byłoby możliwe rozróżnienie, skąd pochodzi wejście synaptyczne. Zaletą naszego systemu jest to, że odpowiedzi postsynaptyczne z korowego sygnału presynaptycznego mogą być selektywnie wywoływane i identyfikowane. Przedstawione tutaj procedury zapewniają proste podejście do oceny zdolności neuronów pochodzących z iPSC do integracji ze zdefiniowaną siecią neuronalną.

W ostatnich latach nasze zrozumienie neuronów i funkcji obwodów neuronalnych zostało zrewolucjonizowane przez kilka narzędzi optogenetycznych, które kontrolują pobudliwość neuronów. Jednym z takich narzędzi jest aktywowany światłem kanał kationowy, rodopsyna kanałowa-2 (ChR2): neurony wyrażające potencjały czynnościowe ChR2 w odpowiedzi na stymulację światłem1-3. Ponieważ neurony zwykle nie są wrażliwe na światło, ta niezwykła zdolność otwiera nowe możliwości precyzyjnej czasowej i przestrzennej kontroli aktywności genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów4 i znacznie przyspieszyła badania nad funkcjonowaniem mózgu. ChR2 został zastosowany w badaniach nad komórkami macierzystymi do różnych celów, od monitorowania rozwoju neuronów5 po regulację aktywności sieci neuronowych6.
Tutaj użyliśmy ChR2, aby zwiększyć użyteczność systemu kokultury neuronów. Systemy kohodowli umożliwiają ocenę interakcji między różnymi typami komórek. Kohodowle neuronów i gleju, głównych typów komórek układu nerwowego, są powszechnie stosowane do badania sygnalizacji między tymi różnymi typami komórek, a także do oceny znaczenia tej sygnalizacji dla odpowiedzi fizjologicznych, propagacji uszkodzeń i do badania mechanizmów molekularnych, które są potencjalnie zaangażowane w tę sygnalizację7. Poprzednie badanie wykazało, że ludzkie iPSC bardzo szybko różnicują się w neurony w obecności pierwotnej kultury kory mózgowej szczura zawierającej neurony, astrocyty, oligodendrocyty i mikroglej8.
W tym protokole demonstrujemy metodę, która wykorzystuje ChR2 w systemie kohodowlanym do badania połączeń synaptycznych między neuronami korowymi szczura a neuronami pochodzącymi z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Opisujemy etapy preparowania i pobierania tkanek mózgowych9, a także utrzymywania i różnicowania mysich nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w astrocyty i ludzkich NPC w neurony w celu stworzenia systemu kohodowli. Aby ustanowić ten system kokultur, użyliśmy metody przeprogramowania bez integracji opisanej przez Okita i wsp.10 w celu wytworzenia ludzkich iPSC. Te iPSC zostały następnie skutecznie zróżnicowane w NPC w warunkach zdefiniowanych chemicznie przy użyciu małocząsteczkowych inhibitorów, jak opisali Li i wsp.11
W kokulturach, różne populacje neuronów mogą być identyfikowane poprzez wykrywanie ekspresji ChR2 w neuronach korowych i oznaczanie neuronów pochodzących z iPSC za pomocą białka fluorescencyjnego, tandemowego dimeru pomidorowego (tdTomato). Połączenie zapisów elektrofizjologicznych z neuronów pochodzących z iPSC z optogenetyczną fotostymulacją neuronów korowych pozwala na ocenę zdolności tych dwóch typów neuronów do tworzenia ze sobą obwodów. W szczególności fotostymulacja neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 wywołuje reakcje synaptyczne w neuronach pochodzących z iPSC, które utworzyły obwody synaptyczne z fotostymulowaną siecią neuronów korowych. Wykazaliśmy, że w takich warunkach zwiększone prądy postsynaptyczne są rzeczywiście wykrywane w neuronach pochodzących z iPSC. Protokół ten umożliwia ocenę obwodów synaptycznych w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym rekapitulację różnych modeli chorób neurologicznych przy użyciu iPSC pochodzących z fibroblastów pacjentów z chorobą.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do proliferacji Neurocult (mysz)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>Zawiera pożywkę podstawową NSC i suplement proliferacyjny NSC</td></tr><tr><td>Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasel medium</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>MEM bez glutaminy</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>suplement GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Human LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Klasa badawcza FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>Do podłoża różnicowania astrocytów</td></tr><tr><td>Zdefiniowany FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>Dla pierwotnego podłoża neuronowego</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Dla pierwotnego podłoża neuronowego</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>EMD Milipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Dla zbieranie mózgów</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m sitko komórkowe</td><td>BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &mikro; m jednostka filtrująca</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>Do badań elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>K-glukonian</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Do badań elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Kolby Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Okulary korekcyjne Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit& nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>Do elektroporacji pierwotnych neuronów korowych</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Do elektroporacji ludzkich fibroblastów</td></tr><tr><td>Mini analiza&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>Do pomiaru PSC</td></tr><tr><td>Normalne ludzkie fibroblasty skórne</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Lampa rtęciowa o krótkim łuku</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Tutaj opisujemy protokół generowania kokultury składającej się z 2 różnych populacji neuronów. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są przeprogramowywane z ludzkich fibroblastów za pomocą wektorów episomalnych. Kolonie iPSC można obserwować po 30 dniach od rozpoczęcia przeprogramowania fibroblastów. Kolonie pluripotencjalne są ręcznie zbierane i hodowane w pożywce do indukcji neuronów, aby umożliwić różnicowanie się w neuronalne komórki progenitorowe (NPC). Komórki iPS szybko przekształcają się w komórki neuronabłonkowe w ciągu 1 tygodnia i zachowują zdolność do samoodnawiania, gdy są utrzymywane w wysokiej gęstości hodowli. Pierwotne mysie NPC różnicują się w astrocyty przez ekspozycję na pożywkę zawierającą surowicę przez 7 dni i tworzą monowarstwę, do której dodaje się embrionalne neurony korowe szczura w 18. dniu (E18) (transfekowane rodopsyną kanałową-2 (ChR2)). Ludzcy NPC oznaczeni białkiem fluorescencyjnym, tandemowym dimerem pomidorowym (tdTomato), są następnie umieszczani w kulturze neuronów astrocytów/kory mózgowej następnego dnia i pozostawiani do różnicowania przez 28 do 35 dni. Wykazaliśmy, że system ten tworzy połączenia synaptyczne między neuronami pochodzącymi z iPSC a neuronami korowymi, co jest widoczne we wzroście częstotliwości prądów synaptycznych po fotostymulacji neuronów korowych. Ten system współhodowli stanowi nowatorską platformę do oceny zdolności neuronów pochodzących z iPSC do tworzenia połączeń synaptycznych z innymi populacjami neuronów.

W niniejszym materiale przedstawiono protokół opisujący wieloetapowy proces tworzenia kokultury składającej się z astrocytów, neuronów korowych i neuronów ludzkich. Ludzkie iPSC uzyskano poprzez reprogramowanie fibroblastów z użyciem wektorów episomalnych10, a następnie zróżnicowano w kierunku linii neuronalnej za pomocą koktajlu inhibitorów małocząsteczkowych, otrzymując NPC11, które utrzymywano w wysokiej gęstości (Rycina 1A). Do stworzenia kokultury wymagane jest przeprowadzenie kilku etapów: zróżnicowania mysich NPC w astrocyty, wysiania szczurzych neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 oraz wysiania ludzkich NPC znakowanych tdTomato (Rycina 1B). W 2. dniu różnicowania w naszych kulturach można łatwo zaobserwować astrocyty GFAP+ (białka kwaśnego włókienka gliało-fibrylarnego) (Rycina 1C). Myszim NPC pozwolono różnicować się przez co najmniej tydzień przed wysianiem neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 na monowarstwę astrocytów (Rycina 1D). Po 3 do 4 tygodniach różnicowania ludzkich NPC w kulturach wykryto neurony tdTomato+ (Rycina 1E).
Ten system kokultury umożliwia spójną detekcję prądów postsynaptycznych z pojedynczych neuronów pochodzących z iPSC w odpowiedzi na stymulację światłem (Rycina 2A). Po stymulacji światłem w neuronach korowych wykazujących ekspresję ChR2 generowane były potencjały czynnościowe (Rycina 2B). Neurony pochodzące z iPSC są również pobudliwe (Rycina 2C), wykazując zwiększoną częstotliwość wyładowań potencjałów czynnościowych wraz ze wzrostem amplitudy depolaryzujących impulsów prądowych (Rycina 2D). Zatem komórki te wykazują dojrzałe właściwości neuronalne. W absence światła neurony pochodzące z iPSC otrzymywały spontaniczne sygnały synaptyczne (Rycina 2E). Te dośrodkowe prądy postsynaptyczne były pośredniczone głównie przez receptory AMPA, ponieważ prądy przez receptory GABA byłyby odśrodkowe, a receptory NMDA nie przewodzą prądu przy potencjale spoczynkowym -70 mV. Przynajmniej część tych sygnałów pochodziła z presynaptycznych neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2, ponieważ stymulacja światłem znacznie zwiększyła częstotliwość prądów postsynaptycznych (Rycina 2E). Przebieg czasowy tego wzrostu sygnałów synaptycznych przedstawiono na Rycini 2F: fotostymulacja neuronów korowych była utrzymywana przez cały czas trwania 30 s błysku światła. Podczas gdy częstotliwość PSC była podwyższona podczas fotostymulacji neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 (Rycina 2G), ich amplituda nie uległa zmianie (Rycina 2H). Podsumowując, wyniki te wskazują, że neurony pochodzące z iPSC wykazują dojrzałe właściwości neuronalne i mogą tworzyć połączenia synaptyczne z presynaptycznymi neuronami korowymi.
<img alt="Oś czasu różnicowania iPSC; przeprogramowanie fibroblastów; indukcja NPC i neuronów; obrazy z mikroskopii." src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematy generowania systemu kokultury. (A) Oś czasu przeprogramowania ludzkich fibroblastów do iPSC oraz indukcji neuronalnej do NPC. (B) Oś czasu różnicowania końcowego ludzkich NPC w dojrzałe neurony na kulturach neuronów korowych i astrocytów. (C) Mysie NPC szybko różnicują się w astrocyty GFAP+ po 2 dniach in vitro. (D) Po jednym tygodniu neurony korowe wykazujące ekspresję ChR2 zostały wysiane na astrocyty GFAP+. (E) Od 4 do 5 tygodni po różnicowaniu ludzkich NPC przeprowadzono pomiary elektrofizjologiczne neuronów tdTomato+. Paski skali oznaczają 100 µm.
<img alt="Aktywacja optogenetyczna neuronów pochodzących z iPSC; stymulacja ChR2, analiza danych elektrofizjologicznych." src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza optogenetyczna funkcjonalnej łączności synaptycznej. (A) Komórki pochodzące z iPSC znakowane tdTomato (czerwony) współhodowano z neuronami korowymi wykazującymi ekspresję kanału aktywowanego światłem, ChR2 (zielony). Rejestracje z neuronów pochodzących z iPSC ujawniły odpowiedzi w postaci prądów postsynaptycznych (PSC), które mogły pochodzić zarówno z neuronów korowych, jak i z innych neuronów pochodzących z iPSC. (B) Naświetlanie (niebieski pasek) wywołało serię potencjałów czynnościowych w neuronach korowych wykazujących ekspresję ChR2. (C)Komórki pochodzące z iPSC są aktywowane poprzez wstrzyknięcie prądu. (D) Krzywa częstotliwości wyładowań w funkcji prądu dla komórek pochodzących z iPSC. (E) Fotostymulacja neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 (niebieski pasek) zwiększyła częstotliwość PSC w neuronach pochodzących z iPSC. (F)Przebieg czasowy zwiększenia częstotliwości PSC wywołanego fotostymulacją. Niebieski pasek oznacza czas fotostymulacji. (G, H) Podczas gdy częstotliwość PSC wzrosła pod wpływem fotostymulacji (G), amplituda PSC nie uległa zmianie (H). * oznacza p < 0,05 w porównaniu do kontroli, test t studenta.

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ustanowienie systemu kokultury do oceny zdolności neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do tworzenia funkcjonalnych połączeń, z wykorzystaniem podejścia genicznego opartego na fotostymulacji hodowanych neuronów za pomocą kanału ChR2 lub CR2. Osiąga się to poprzez wstępne wyizolowanie pierwotnych mysich komórek progenitorowych neuronów lub NPC i umożliwienie im zróżnicowania w astrocyty. Następnie pierwotne neurony korowe szczura są transfekowane ChR2 i wysiewane na warstwę astrocytów, która pełni rolę istniejącej populacji neuronalnej.Następnie ludzkie NPC pochodzące z kultur indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są transdukowane wirusem synapsyny 1 2D tomato, a następnie wysiewane na kulturę astrocytów i neuronów i indukowane do różnicowania, co w konsekwencji prowadzi do tworzenia połączeń synaptycznych. Wyniki wskazują, że neurony pochodzące z iPSC tworzą połączenia synaptyczne z neuronami korowymi szczura, co wykazano na podstawie rejestracji elektrofizjologicznej prądów postsynaptycznych w neuronach pochodzących z iPSC podczas genicznej fotostymulacji neuronów korowych wykazujących ekspresję CHR2. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami, takimi jak kokultury samych astrocytów z ludzkimi neuronami pochodzącymi z iPSC, jest krótszy czas dojrzewania tych ludzkich neuronów.Dzieje się tak, ponieważ obecność neuronów pierwotnych może przyspieszyć dojrzewanie tych neuronów ludzkich. Procedurę zaprezentują Uni Chin, doktorant z mojego laboratorium, oraz suing Y z laboratorium George'a Augustine'a. Po pobraniu embrionalnych mózgów szczura i wyizolowaniu tkanki kory zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś tkanki kory do szalki zawierającej uprzednio ogrzany roztwór do trawienia tkanki kory. Posiekaj tkanki kory tak drobno, jak to możliwe, przed inkubacją w 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji przenieś tkanki kory do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL i dysocjuj tkanki za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodnego roztworu pozbawionego fragmentów tkanki.Przepuść zawiesinę tkankową przez sitko komórkowe o oczkach 70 micron, aby odfiltrować pozostałe grudki tkanki. Odmień trzy mililitry roztworu do probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów.Do dna każdej probówki dodać 800 µL 7,5% BSA w XPBS, tworząc warstwę pod warstwą tkanki, a następnie wirować z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Następnie usunąć nadsącz, aspirując go z poziomu styku obu warstw. Należy unikać naruszenia osadu selp na dnie probówki.Po zawieszeniu każdego pelletu komórkowego w 1 ml pożywki dla neuronów pierwotnych, należy połączyć je wszystkie w probówce do wirowania o pojemności 15 ml. Następnie, używając komory licznikowej (hemocytometru), należy oznaczyć gęstość komórek. 6 milionów neuronów kory szczura wirować przy 200 G przez pięć minut, a następnie usunąć nadsącz.Do elektroporacji wymagane są co najmniej 6 milionów neuronów korowych. Aby zapewnić utworzenie sieci neuronalnej przez przeżyłe neurony, należy dodać 100 µL roztworu do elektroporacji do osadu komórkowego i delikatnie go resuspenderować. Następnie 100 µL zawiesiny komórkowej należy połączyć z sześcioma µg plazmidu CR two i przenieść do certyfikowanej kuwety.Wybierz i zastosuj odpowiedni program elektroporacji zgodnie z instrukcjami producenta. Po elektroporacji dodaj 500 µL MEM do kuwety. Przenieś komórki do 11,5 mL pożywki dla pierwszorzędowych neuronów i delikatnie resuspenduj.Następnie dodaj 500 µL do każdego dołka płytki 24-dołkowej zawierającej astrocyty mysie. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po wygenerowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPCs, indukuj i utrzymuj komórki jako hodowlę ludzkich neuralnych komórek progenitorowych lub NPC zgodnie z protokołem tekstowym.W tym przykładzie NPC są znakowane przy użyciu wektora lentiwirusowego synapse in one TD tomato dzień po dodaniu neuronów pierwotnych do hodowli astrocytów. Należy użyć XPBS do jednorazowego przemycia ludzkich NPC, a następnie dodać roztwór do odrywania komórek i inkubować przez pięć minut w temperaturze 30 °C. Należy upewnić się, że wszystkie komórki zostały oddzielone.Następnie przenieś je do probówki o pojemności 15 ml zawierającej dwukrotność objętości D-M-E-M-F 12 i wiruj przy 200 G przez pięć minut. Usuń nadsącz i za pomocą medium do różnicowania neuronalnego delikatnie resuspenduj osad do uzyskania pojedynczych komórek. Użyj hemocytometru do policzenia komórek.Następnie ostrożnie odessać medium z płytki z kulturami neuronów korowych astrocytów. Ludzkie NPC w zagęszczeniu 5 000 komórek na centymetr kwadratowy na dołek w medium do różnicowania neuronalnego. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2, wymieniając medium co dwa lub trzy dni przez co najmniej 28 dni.Aby potwierdzić, czy ludzkie IPC zachowują się jak dojrzałe neurony, należy użyć mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw imersyjny z wodą 60x w celu odnalezienia komórek zróżnicowanych z ludzkich IPC. Wykorzystując wizualizację TD tomato, należy dociągnąć pipetę rejestrującą do oporu od czterech do sześciu ohm perfuse.Komórki w temperaturze pokojowej w roztworze zewnętrznym były stale napowietrzane mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Używając roztworu wewnętrznego, wypełniono mikropipetę rejestrującą, wykonano patch komórki TD pomidora w trybie whole cell i zarejestrowano wyzwalanie potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na wtryskiwanie prądu w trybie current clamp. W celu potwierdzenia, że potencjał czynnościowy komórek korowych wykazujących ekspresję ChR2 jest wiarygodnie wywoływany przez stymulację światłem.Najpierw należy zlokalizować komórki kory wyrażające CR dwa poprzez wizualizację GFP przy użyciu oświetlenia lampą łukową rtęciową i filtra wzbudzenia o długości fali 480/40 nm. Należy sprawdzić, czy potencjał czynnościowy jest wiarygodnie wywoływany za pomocą rejestracji w konfiguracji current clamp w trybie whole-cell. Aby przeprowadzić stymulację geniczną, należy poddać patchowaniu komórkę pozytywną pod kątem TD tomato w trybie whole-cell i ustawić voltage clamp na -70 mV, korzystając z lampy rtęciowej o szerokim polu oraz filtra wzbudzenia 480/40 nm.Stymuluj całe pole przez 30 sekund. Zarejestruj prądy postsynaptyczne lub PSC w komórce poddanej patch-clampowi, wywołane fotostymulacją presynaptycznych neuronów kory wykazujących ekspresję CHR2. Ustaw próg dla amplitudy oraz pola prądów na 5 pA i pA odpowiednio; ręcznie sprawdź te zdarzenia, aby odrzucić wszelkie ślady niebędące PSC.Jak pokazano w tym filmie, wygenerowanie kokultury neuronów pochodzących z IPC, pierwotnych neuronów korowych i astrocytów wymaga wykonania kilku kroków. Ten obraz pokazuje, że w drugim dniu różnicowania mysich NPC w astrocyty można łatwo zaobserwować astrocyty wykazujące pozytywną reakcję na białko kwaśne włókienka glejowej lub GFAP. Mysie NPC różnicowano przez co najmniej tydzień przed wysianiem neuronów korowych wykazujących ekspresję CR two na monowarstwę astrocytów; oba typy komórek zidentyfikowano w tej kokulturze za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na GFAP i CHR two.Po trzech do czterech tygodniach różnicowania ludzkich NPC, w kulturach wykryto neurony wykazujące ekspresję TD tomato, co przedstawiono tutaj. Po stymulacji światłem w neuronach korowych wykazujących ekspresję CHR two IPSC generowane były potencjały czynnościowe. Pochodne neurony są również pobudliwe, wykazując zwiększoną aktywność.Potencjalne wyładowania wraz ze wzrostem amplitudy depolaryzujących impulsów prądowych. W ciemności neurony pochodzące z IPSC otrzymywały spontaniczne sygnały synaptyczne. Te dośrodkowe prądy postsynaptyczne były zapośredniczone głównie przez receptory AMPA.Fotostymulacja neuronów korowych była kontynuowana przez cały czas trwania 32. długiego błysku światła, podczas którego częstotliwość PSC była podwyższona. W przypadku fotostymulacji neuronów korowych wykazujących ekspresję CHR two, ich amplituda nie uległa zmianie. Po przeprowadzeniu tej procedury możemy wykorzystać inne systemy kokultury z różnymi typami komórek specyficznych dla pacjenta, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ kandydujących związków leków na konkretne schorzenia.

an-optogenetic-approach-for-assessing-formation-neuronal-connections

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronowych w systemie współhodowli

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Ten film demonstruje metodę różnicowania ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych (NPC) w neurony. NPC są wprowadzane do ustalonej kokultury neuronów korowych astrocytów myszy i szczurów, promując różnicowanie NPC w neurony. Różnicowanie potwierdza się poprzez wizualizację komórek pod mikroskopem konfokalnym.

Technika kohodowli do różnicowania ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych w neurony

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Film demonstruje zapis elektrofizjologiczny w celu oceny połączeń neuronalnych między neuronami pochodzącymi z iPSC a neuronami korowymi szczura, potwierdzając kontakty synaptyczne w kokulturze poprzez aktywację światłoczułych kanałów jonowych i wykrywanie prądów postsynaptycznych.

Ocena tworzenia połączeń nerwowych w kokulturze za pomocą zapisów elektrofizjologicznych

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Mechanizmy molekularne, które koordynują powstawanie hamujących synaps GABA-ergicznych podczas ontogenezy, są w dużej mierze nieznane. Aby zbadać te procesy, opracowaliśmy system modelu kohodowli, który obejmuje embrionalne średnio kolczaste neurony GABA-ergiczne hodowane razem ze stabilnie transfekowanymi ludzkimi embrionalnymi komórkami nerkowymi 293 (HEK293) wyrażającymi funkcjonalne receptoryGABA A.

Hamujące tworzenie synaps w modelu kokultury obejmującym średnie neurony kolczaste GABA-ergiczne i komórki HEK293 stabilnie eksprymujące receptory GABAA

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Poznaj metodę oceny tworzenia połączeń synaptycznych w systemie kokulturowym z neuronami pochodzącymi z komórek iPSC i pierwotnymi neuronami kory mózgowej. Technika optogenetyczna z wykorzystaniem channelrhodopsin-2 umożliwia precyzyjną stymulację neuronów światłem.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Przeglądaj więcej filmów