Namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie dużych ilości wirusa grypy o wysokim mianie w opłacalnym systemie. Osiąga się to poprzez uzyskanie najpierw świeżo zapłodnionych jaj kurzych wolnych od patogenów w surowicy. W drugim etapie jaja są zarażane wirusem grypy za pośrednictwem korzenia Alan Toic.

Przez 48 godzin płyn Alan Toic, który zawiera wirusa, jest następnie zbierany, a wirus jest zamrażany w ciekłym azocie. Ostatecznie można przeprowadzić testy płytki nazębnej i hemaglutyniny w celu określenia wpływu miana wirusa pobranego Alana Toica. Płynna wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy zbioru są bardzo wrażliwe i wymagają ostrożnego obchodzenia się z jajami oraz dobrej znajomości ich anatomii.

Przed przystąpieniem do zabiegu pobrano surowicę wolną od patogenów, świeżo zapłodnione jaja dawianu od odpowiedniego dostawcy. Natychmiast po przyjeździe umieść jaja w nawilżonym inkubatorze z automatyczną obracarką do jaj, aby regularnie obracać jaja w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności od 55 do 60% przez 10 do 11 dni. Po siedmiu do ośmiu dniach inkubacji, nosząc rękawiczki zdezynfekowane 70% etanolem.

Przetrzyj świecę do jaj etanolem i przenieś jaja z inkubatora do pustych kartonów po jajkach. Następnie wyłącz światła i przyłóż duży koniec jajek, jedno po drugim, do świecznika. Jeśli komórka jajowa jest płodna, cienkie naczynia krwionośne prowadzące do zarodka w kształcie fasoli powinny być wyraźnie widoczne.

Jeśli jajo jest niezapłodnione, zaobserwuje się małą plamkę krwi z widocznym żółtkiem jaja. Następnie wyrzuć niezapłodnione jaja i włóż żywotne do inkubatora. Jeśli nie można potwierdzić statusu jaja, należy oznaczyć je do późniejszej obserwacji w 10 lub 11 dniu po zapłodnieniu i bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć zapas wirusa grypy A raz 10 do trzeciego do 10 do czwartego PFU na mililitr w sterylnym PBS uzupełnionym hipisami i umieścić na lodzie.

Następnie ponownie zapal każde jajo i wyeliminuj wszelkie martwe, nieruchome zarodki. Następnie wyjmij trzy jaja z inkubatora i ułóż je w osobnym uchwycie. Z podniesionymi workami powietrznymi zaznacz przestrzeń powietrzną jaj trwałym markerem.

Następnie umyj obszar nad przestrzenią powietrzną 70% etanolem i przenieś przestrzeń powietrzną jaj do kartonu na jajka w dwustopniowym kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Teraz użyj sterylnej igły o rozmiarze 18, aby przebić mały otwór w skorupce nad workiem powietrznym każdego jajka. Uważając, aby nie wbić igły zbyt głęboko, aby uniknąć dźgnięcia zarodka lub żółtka.

Następnie pobrać rozcieńczonego wirusa grypy do sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Przymocuj igłę o rozmiarze 22 i ostrożnie wsuń igłę pod kątem 45 stopni do jamy Alan Toic pierwszego jajka. Wstrzyknąć 0,2 mililitra rozcieńczonego wirusa do jajka, a następnie po wstrzyknięciu pozostałych dwóch jaj wyrzucić strzykawkę i igłę, uszczelnić każdy otwór kroplą kleju z pistoletu do klejenia.

Dbając o to, aby klej nie przeciekał do wnętrza jajka, a następnie umieść jaja z powrotem w inkubatorze. Po zaszczepieniu wszystkich jaj należy inkubować zainfekowane jaja w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności 60% bez obracania, aby uzyskać optymalny czas inkubacji. W zależności od typu wirusa grypy.

Pod koniec okresu inkubacji schładzaj jaja przez co najmniej cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zabić zarodek i zwęzić naczynia krwionośne. Gdy jaja są wystarczająco schłodzone. Przenieś je do kaptura bezpieczeństwa biologicznego i mocnego uchwytu, a następnie wyczyść powierzchnie jaj 70% etanolem.

Następnie użyj sterylnych nożyczek, aby otworzyć skorupkę jajka nad workiem powietrznym pierwszego jajka. Usuń skorupę wokół worka powietrznego. Uważając, aby nie uszkodzić błony chorio Alan Toic.

Następnie za pomocą sterylnych kleszczyków otwórz błonę chorio Alan Toic i delikatnie odsuń zarodek i worek z żółtkiem małą szpatułką lub łyżką, uważając, aby nie rozerwać żółtka. Następnie, za pomocą jednomililitrowej pipety einor, ostrożnie zbierz płyn Alan Toic, przechylając jajko na bok, aby zebrać jak najwięcej płynu, jak to konieczne. Każde jajko powinno dać od pięciu do 10 mililitrów lekko żółtawego płynu podczas zbierania każdego jajka.

Zbierz płyn Alan Toic w 50-mililitrowych plastikowych stożkowych rurkach na lodzie. Po zebraniu całego płynu odkręć wirusa i przenieś przezroczysty płyn do nowej 50-mililitrowej probówki na lodzie. Na koniec wyrzuć jaja do pojemnika na dwa odpady BSL i natychmiast Eloqua do oczyszczonego płynu LAN toic.

Następnie zamroź wirusa w ciekłym azocie i umieść zamrożone łodygi w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. W przypadku długotrwałego przechowywania zakażenie wirusem grypy powoduje efekt cytopatyczny, w wyniku którego powstają okrągłe strefy połączonych komórek lub blaszek, które tworzą się na jednej warstwie komórek. W tym eksperymencie blaszki wizualizowano poprzez barwienie komórek fioletem krystalicznym, a 65 blaszek policzono w studzience z rozcieńczeniem wirusa 10 razy do minus 12, ponieważ na komórkach wyhodowano 500 mikrolitrów rozcieńczonego materiału wirusowego.

W tym eksperymencie końcowe miano wynosiło 1,3 razy 10 do 14. PFU na mililitr. Test narodu hemaglutyniny jest metodą mianowania wirusa grypy w oparciu o zdolność wirusa do przyczepiania się do powierzchni czerwonych krwinek. Jak zaobserwowano, zawiesina wirusa aglutynuje czerwone krwinki, zapobiegając osadzaniu się czerwonych krwinek poza zawiesiną.

Wyraźnie ujemny wynik zaobserwowano przy rozcieńczeniu wirusa od dwóch do minus 10 w 50 mikrolitrach. Dlatego końcowe miano wynosi 2,1 razy 10 do czwartego HAU na mililitr. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozprzestrzeniać wirusa grypy poprzez szczepienie jaj kurzych i zbieranie płynu atlantyckiego zawierającego wirusa.