Name: Namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę namnażania wirusa grypy A w zarodkach kurzych jaj z wysokim mianem. Technika ta umożliwia produkcję dużych ilości wirusa do badań wirusologicznych i rozwoju szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było wspierane przez granty NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) oraz American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

UWAGA: Uwagi ogólne: Wszystkie procedury związane z manipulacją jajkiem należy wykonywać w sterylnych warunkach, a technika sterylna powinna być stosowana odpowiednio. Przed użyciem należy wstępnie oczyścić wszystkie urządzenia 70% etanolem. Ogólnie rzecz biorąc, inokulacja i zbiór wirusa grypy powinny być przeprowadzane w laboratorium BSL-2. Jeśli jednak protokół ten jest stosowany do rozprzestrzeniania znacznie większej liczby patogennych wirusów grypy (np. szczepów pandemicznych i przedpandemicznych, szczepów stanowiących zagrożenie dla drobiu i zwierząt gospodarskich, wysoce zjadliwych szczepów ptasiej grypy, szczepu H1N1 z 1918 r.), wymagane są wyższe poziomy bezpieczeństwa biologicznego, a w niektórych przypadkach wymagane są środki ostrożności i zezwolenia w zakresie bezpieczeństwa biologicznego. Lokalny Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego powinien zatwierdzać wszystkie badania dotyczące wirusa grypy.
1. Przygotowanie jaj do inokulacji
<ol>
	<li>Uzyskać świeżo zapłodnione jaja ptaków wolne od surowicy patogenów (SPF) od odpowiedniego dostawcy. Zazwyczaj używa się jaj kurzych. Jajka należy zużyć natychmiast po przyjeździe.</li>
	<li>Po przyjeździe umieść jaja w nawilżonym inkubatorze z automatyczną obracarką do jaj, aby regularnie obracać jaja. Jeśli automatyczna obracarka do jaj nie jest dostępna, ręcznie obracaj jajka co najmniej 2-3 razy dziennie (pamiętaj, aby nosić rękawiczki i utrzymywać wszystko tak sterylne, jak to możliwe).</li>
	<li>Wysiadywać jaja w temperaturze 37 °C i wilgotności 55-60% przez 10-11 dni.</li>
</ol>
2. Puszkowanie jajek
<ol>
	<li>Użyj świecy do jaj, aby zbadać jajko w jasnym świetle w ciemnym pomieszczeniu, aby sprawdzić jaja pod kątem niepłodności przez świecowanie po około 7 lub 8 dniach inkubacji.
	<ol>
		<li>Przetrzyj świecę do jajek 70% etanolem. Często zmieniaj rękawice i dezynfekuj 70% etanolem, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia patogenami.</li>
		<li>Wyjmij jaja z inkubatora i umieść je w pustych kartonach po jajkach.</li>
		<li>Wyłącz światła w pokoju.</li>
		<li>Trzymaj duży koniec każdego jajka pojedynczo przy świeczniku.</li>
		<li>Obserwuj jajo, aby określić, czy jest płodne, czy bezpłodne. 
		UWAGA: Cienkie naczynia krwionośne prowadzące do zarodka w kształcie fasoli powinny być wyraźnie widoczne. Niezapłodnione jaja pojawią się jako mała plamka krwi z widocznym żółtkiem jaja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrzuć jaja, które nie są zapłodnione, i zwróć żywe jaja do inkubatora. Nie pozostawiaj jaj poza inkubatorem na dłużej niż 30 minut. Jeśli nie można potwierdzić statusu jajka, oznacz je i obserwuj później.</li>
</ol>
3. Przygotowanie inokulum wirusa
<ol>
	<li>Rozcieńczyć zapas wirusa grypy do około 103 – 104 pfu/ml w sterylnym PBS zawierającym 10 mM HEPES (pH 7,4). Etap krytyczny: Rozcieńczyć zapas wirusa bezpośrednio przed użyciem i cały czas utrzymywać rozcieńczonego wirusa na lodzie.</li>
</ol>
4. Inokulacja wirusa grypy drogą omocznikową
<ol>
	<li>W dniu inokulacji wirusa (dzień 10 lub 11) ponownie zapal jaja i wyeliminuj wszelkie martwe zarodki. Rozróżniaj żywe zarodki, szukając ruchu wewnątrz komórki jajowej.</li>
	<li>Wyjmij trzy jaja z inkubatora i ułóż jaja w osobnym uchwycie workiem powietrznym do góry.</li>
	<li>Zaznacz przestrzeń powietrzną jaj trwałym markerem.</li>
	<li>Umyj skorupkę jajka nad przestrzenią powietrzną 70% etanolem.</li>
	<li>Umieść jaja z przestrzenią powietrzną do góry w kartonie na jajka i do okapu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).</li>
	<li>Użyj sterylnej igły 18G, aby przebić mały otwór w skorupce nad workiem powietrznym każdego jajka. Należy uważać, aby nie wbić igły zbyt głęboko, aby uniknąć dźgnięcia zarodka lub żółtka.</li>
	<li>Pobrać rozcieńczony wirus grypy do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i założyć igłę 22G.</li>
	<li>Ostrożnie wsunąć strzykawkę z igłą pod kątem 45° do jamy omoczniowej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,2 ml rozcieńczonego wirusa grypy.</li>
	<li>Powtórzyć wstrzyknięcie z pozostałymi dwoma jajami, a następnie wyrzucić strzykawkę i igłę.</li>
	<li>Uszczelnij otwór kroplą kleju z pistoletu do klejenia (lub stopionego wosku parafinowego). Uważaj, aby klej nie wyciekł do wnętrza jajka.</li>
	<li>Umieść jaja z powrotem w inkubatorze jaj z przestrzenią powietrzną skierowaną do góry.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.2 – 4.12, aż wszystkie jaja zostaną zaszczepione.</li>
</ol>
5. Czas inkubacji
<ol>
	<li>Wysiaduj zainfekowane jaja bez obracania w temperaturze 37 °C i wilgotności ~60%.</li>
	<li>Wybierz optymalny czas inkubacji w zależności od typu wirusa grypy. Inkubować grypę A przez 48 godzin; inkubować grypę B i C przez 72 godziny.</li>
</ol>
6. Żniwa wirusa grypy
<ol>
	<li>Po okresie inkubacji schładzać jaja w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny (lub O/N) w celu zabicia zarodka i zwężenia naczyń krwionośnych w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia zakażonego płynu omoczniowego krwią. Zrób to, aby zapobiec wchłanianiu wirusa przez czerwone krwinki, co zmniejsza wydajność. Alternatywnie schładzaj jajka przez 30 minut w temperaturze -20 °C; Zwiększa to jednak ryzyko zanieczyszczenia krwi.</li>
	<li>Po wystarczającym schłodzeniu jaj należy przenieść je do okapu bezpieczeństwa biologicznego. Umieść jajko w mocnym uchwycie z workiem powietrznym skierowanym do góry. Oczyść powierzchnię jajka 70% etanolem.</li>
	<li>Użyj sterylnych nożyczek, aby otworzyć skorupkę jajka nad workiem powietrznym. Usuń powłokę wokół worka powietrznego, uważając, aby nie zniszczyć błony kosmówkowo-omoczniowej.</li>
	<li>Otwórz błonę kosmówkowo-omoczniową sterylnymi kleszczami. Delikatnie odsuń zarodek i woreczek żółtkowy małą szpatułką lub łyżką. Uważaj, aby nie pękło żółtko.</li>
	<li>Za pomocą pipety Eppendorf o pojemności 1 ml ostrożnie zebrać płyn omoczniowy. W razie potrzeby przechyl jajko nieco na bok, aby zebrać jak najwięcej płynu.</li>
	<li>Połącz płyn omoczniowy ze wszystkich jaj w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Trzymaj probówki na lodzie przez cały czas zbierania wirusa. Z jednego jajka wydostaje się 5 – 10 ml lekko żółtawego płynu.</li>
	<li>Obracać płyn omoczniowy zawierający wirusa o sile 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby rozdrobnić resztki. Przenieść klarowny płyn do nowej probówki o pojemności 50 ml trzymanej na lodzie. Wyrzuć jaja do pojemnika na odpady BSL-2.</li>
</ol>
7. Przechowywanie
<ol>
	<li>Natychmiast podwielokrotnić oczyszczony płyn omoczniowy (np. 50, 100 lub 500 ul aliquots) i zamrozić w ciekłym azocie. Zamrożone zapasy wirusa należy przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
<li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuing+challenges+in+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li>
<li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSzretter%2C+KJ+%22Current+protocols+in+microbiology%22">Current protocols in microbiology</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li>
<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Grypa powoduje duże globalne obciążenie chorobami, a prace nad zrozumieniem patogenezy uszkodzenia płuc są kontynuowane 7. Aby ułatwić badania nad tą śmiertelną chorobą, opracowano różne metody namnażania wirusa grypy 6. W tym miejscu opisujemy technikę wytwarzania wirusa grypy w jajach kurzych. Zaletą tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna i prowadzi do uzyskania dużych ilości zapasów wirusa grypy o wysokim mianie, co często jest konieczne w badaniach in vitro .
<p class="jove_...

Grypa A nadal stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Jest to potencjalnie wyniszczająca choroba układu oddechowego, o dużym globalnym obciążeniu, powodująca do 500 000 zgonów rocznie na całym świecie1. Wirusy grypy należą do rodziny Orthomyxoviridae i przenoszą w swoim genomie 8 jednoniciowych RNA o ujemnym znaczeniu 1,2. Wysoka mutowalność (tj. "dryf" antygenowy) genomu wirusa zapobiega długotrwałej odporności. Ponadto grypa jest coraz bardziej oporna na leki przeciwwirusowe 3.
Pandemia grypy H1N1 w 2009 roku uwypukliła wszystkie trudne problemy związane z chorobą grypową (szczep pandemiczny, oporność przeciwwirusowa, opóźniona produkcja szczepionek). Skład szczepionki jest ustalany corocznie przez Światową Organizację Zdrowia dla najbardziej prawdopodobnych patogennych szczepów grypy (po jednym dla H1N1, H3N2 i grypy B) 4. Ponieważ metoda ta opiera się na przewidywanych szczepach grypy, szczepy chorobotwórcze są czasami nieprawidłowo identyfikowane, a skuteczność szczepionki drastycznie spada. Co więcej, pojawienie się nowych szczepów grypy może obejść te programy zapobiegawcze powodujące chorobę pandemiczną 2.
Stworzenie uniwersalnej szczepionki przeciw grypie było nieuchwytne 5. Dlatego należy kontynuować badania nad zrozumieniem patogenezy uszkodzenia płuc. Aby ułatwić badania laboratoryjne, opracowano kilka metod izolacji i namnażania wirusa 6. Wirusy grypy ludzkiej mogą być amplifikowane w różnych substratach komórkowych ssaków. Jednak wytwarzanie wirusów o wysokim mianie w dużych ilościach najlepiej osiąga się w zarodkach jajowych. Poniższy protokół opisuje technikę rozmnażania i przechowywania wirusa grypy A z istniejących zasobów wirusów.

<table><tbody><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>jaja kurze zapłodnione surowicą wolne od patogenów (SPF)&nbsp;</td>Nawilżany inkubator jaj <td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td> Automatyczna obracarka do jaj <td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>świecarka do jaj</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Igła 18G</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20G / 22G</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Etanol>99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>rozcieńczony do 70% za pomocą pistoletu do</td></tr><tr><td>klejenia wody "Ad tech Hi Temp Projekt Pro"</td><td>Technologia reklamowa, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>klej "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MDCK</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Myte czerwone krwinki z indyka, 10%</td> <td>Laboratoria biologiczne Lampire</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Zakażenie grypą jest związane z około 36 000 zgonów i ponad 200 000 hospitalizacji rocznie w Stanach Zjednoczonych. Ciągłe pojawianie się nowych szczepów wirusa grypy w wyniku mutacji i reasortacji komplikuje kontrolę wirusa i wymaga ciągłego opracowywania nowych leków i szczepionek. Laboratoryjne badanie grypy wymaga niezawodnej i opłacalnej metody namnażania wirusa. W tym przypadku zapewniony jest kompleksowy protokół namnażania się wirusa grypy A w płodnych jajach kurzych, co konsekwentnie daje wysokie miano wirusa. Krótko mówiąc, jaja kurze zapłodnione surowicą wolną od patogenów (SPF) inkubuje się w temperaturze 37 °C i wilgotności 55-60% przez 10 – 11 dni. W tym okresie rozwój zarodków można łatwo monitorować za pomocą świecy do jaj. Inokulację wirusa przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie zapasu wirusa do jamy omoczniowej za pomocą igły. Po 2 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C jaja są schładzane przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C. Skorupka jaja nad workiem powietrznym i błona kosmówkowo-omoczniowa są następnie ostrożnie otwierane i pobierany jest płyn omoczniowy zawierający wirusa. Płyn jest usuwany z zanieczyszczeń przez odwirowanie, porcjowany i przenoszony do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Duża ilość (5-10 ml płynu zawierającego wirusa na jajo) i wysokie miano wirusa, które zwykle osiąga się za pomocą tego protokołu, sprawiły, że wykorzystanie jaj do przygotowania wirusa stało się naszą korzystną metodą, w szczególności w badaniach in vitro, które wymagają dużych ilości wirusa, w których potrzebne są wysokie dawki tego samego szczepu wirusa.

Opracowano wiele metod miareczkowania wirusa grypy. Przy wyborze odpowiedniej metody należy wziąć pod uwagę, że niektóre z nich określają całkowitą liczbę cząsteczek niezależnie od ich żywotności (np. test hemaglutyniny), podczas gdy inne opierają się na zakaźności, co pozwala ocenić żywotne wiriony (np. metoda płytkowa) 6. W niniejszej pracy miano wirusa w płynie wsiobowym pobranym z jaj kurzych inokulowanych wirusem grypy zaadaptowanym do myszy (A/PR/8/34) określono za pomocą metody płytkow...

Płodne jaja kurze są powszechnie używane do produkcji dużych ilości ludzkiego wirusa grypy A, ponieważ zapewniają wygodny i opłacalny system do udowodnienia wysokich plonów wirusa.

Namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie dużych ilości wirusa grypy o wysokim mianie w systemie kosztowo efektywnym. Jest to realizowane poprzez najpierw pozyskanie świeżo zapłodnionych jaj kurzych, wolnych od patogenów w surowicy. W drugim kroku jaja są infekowane wirusem grypy poprzez drogę alantoiczną.Przez 48 godzin zbierany jest płyn z jaj Allantoic, który zawiera wirusa, a następnie wirus jest gwałtownie zamrażany w ciekłym azocie. Ostatecznie można przeprowadzić testy plackowe oraz testy hemaglutynacji, aby określić miano wirusa w zebranym płynie allantoicznym. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy zbioru są bardzo delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się z jajami oraz dobrej znajomości ich anatomii.Przed rozpoczęciem procedury należy pozyskać wolne od patogenów, świeżo zapłodnione jaja drobiowe od odpowiedniego dostawcy. Niezwłocznie po dostarczeniu umieścić jaja w inkubatorze z nawilżaczem i automatycznym obracaczem do regularnego obracania jaj w temperaturze 37 °C i wilgotności od 55 do 60% przez 10 do 11 dni. Po siedmiu do ośmiu dniach inkubacji, zakładając rękawice zdezynfekowane 70% etanolem.Przetrzyj świecidełko do jaj etanolem i przenieś jaja z inkubatora do pustych wytłaczanek. Następnie zgaś światła i przykładaj szeroki koniec każdego jaja po kolei do świecidełka. W przypadku zapłodnionych jaj powinny być wyraźnie widoczne cienkie naczynia krwionośne prowadzące do zarodka o kształcie fasoli.Jeśli jajo jest niezapłodnione, widoczna będzie mała plamka krwi wraz z żółtkiem. Należy wówczas odrzucić jaja niezapłodnione, a jaja żywotne zwrócić do inkubatora. Jeśli status jaja nie może zostać potwierdzony, należy je oznaczyć do późniejszej obserwacji w 10. lub 11. dniu po zapłodnieniu, a bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć zapas wirusa grypy A do stężenia 10³ do 10⁴ PFU/ml w sterylnym PBS uzupełnionym o HEPES i umieścić go na lodzie.Następnie ponownie przeprowadź prześwietlanie każdego jaja i odrzuć wszystkie martwe, nieruchome embriony. Następnie wyjmij z inkubatora trzy jaja i umieść je w osobnym uchwycie. Ustawiając jaja komorami powietrznymi do góry, zaznacz ich przestrzeń powietrzną markerem permanentnym.Następnie należy przemyć obszar nad komorą powietrzną 70% ethanolem i przenieść jaja komorą powietrzną do góry do wytłaczanki z jajami wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego klasy BSL 2. Teraz należy użyć sterylnej igły o rozmiarze 18 G, aby wykonać mały otwór w skorupce nad komorą powietrzną każdego jaja. Należy uważać, aby nie wprowadzić igły zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia zarodka lub żółtka.Następnie nabierz rozcieńczonego wirusa grypy do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Załóż igłę o rozmiarze 22 G i ostrożnie wprowadź ją pod kątem 45 stopni do jamniowo-owadni pierwszego jaja. Wstrzyknij 0,2 ml rozcieńczonego wirusa do jaja, a po zaszczepieniu pozostałych dwóch jaj utylizuj strzykawkę z igłą i uszczelnij każdy otwór kroplą kleju z pistoletu do klejenia.Należy upewnić się, że klej nie wyciekł do wnętrza jaja, a następnie umieścić jaja z powrotem w inkubatorze. Po zaszczepieniu wszystkich jaj, inkubować zakażone jaja w temperaturze 37 °C i wilgotności 60% bez obracania przez optymalny czas inkubacji, zależnie od typu wirusa grypy.Po zakończeniu okresu inkubacji schłodzić jaja przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 4 °C, aby zabić zarodek i obkurczyć naczynia krwionośne. Po odpowiednim schłodzeniu jaj przenieść je do komory z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznego) i przymocować w stabilnym uchwycie, a następnie oczyścić powierzchnie jaj 70% ethanol.Następnie za pomocą sterylnych nożyczek należy otworzyć skorupkę pierwszego jaja powyżej komory powietrznej. Usunąć skorupkę wokół komory powietrznej, uważając, aby nie uszkodzić błony chorionallantoicznej.Następnie za pomocą sterylnej pęsety tępokrawędzistej należy otworzyć błonę pozarodową i delikatnie odsunąć zarodek oraz worek żółtkowy za pomocą małej szpatułki lub łyżeczki, uważając, aby nie przerwać worka żółtkowego. Następnie, używając pipety o pojemności 1 ml, należy ostrożnie zebrać płyn pozarodowy, przechylając jajo na bok, aby w razie potrzeby zebrać jak najwięcej płynu. Z każdego jaja podczas zbioru powinno uzyskać się od 5 do 10 ml lekko żółtawego płynu.Zebrać płyn allantoiczny do plastikowych probówek stożkowych o pojemności 50 ml, utrzymując je w lodzie. Po zebraniu całego płynu, odwirować wirusa i przenieść klarowny nadsącz do nowej probówki 50 ml w lodzie. Na koniec zutylizować jaja w pojemniku na odpady BSL 2 i bezzwłocznie przejść do etapu wykorzystania sklarowanego płynu allantoicznego.Następnie gwałtownie zamrozić wirusa w ciekłym azocie, a zamrożone probówki umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C. W przypadku długoterminowego przechowywania, zakażenie wirusem grypy wywołuje efekt cytopatyczny, który objawia się powstaniem kolistych stref uszkodzonych komórek, czyli placków, tworzących się na monowarstwie komórek. W tym doświadczeniu placki zwizualizowano poprzez barwienie komórek fioletem krystalicznym; w dołku z rozcieńczeniem wirusa 1 × 10⁻¹² policzono 65 placków, ponieważ na komórkach hodowano 500 µL rozcieńczonego zapasu wirusa.W tym eksperymencie końcowy miano wyniosło 1,3 × 10¹⁴ PFU/ml. Test hemaglutynacji jest metodą miareczkowania wirusa grypy, opartą na zdolności wirusa do przylegania do powierzchni erytrocytów. Jak zaobserwowano, zawiesina wirusowa powoduje aglutynację erytrocytów, co zapobiega ich sedymentacji z zawiesiny.Wyraźny wynik negatywny zaobserwowano przy rozcieńczeniu wirusa 2⁻¹⁰ w 50 µL. Zatem ostateczny miano wynosi 2,1 × 10⁴ HAU/mL. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak namnażać wirusa grypy poprzez inokulację jaj kurzych oraz jak pozyskiwać płyn allantois zawierający wirusa.

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Rozprzestrzenianie się wirusa grypy w zapłodnionych jajach kurczaka

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Ten film demonstruje technikę generowania wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy. Zawiesina wirusa zneutralizowanego przez przeciwciała jest wstrzykiwana do zarodków jaj kurzych w celu selektywnego rozmnażania wariantów ucieczki. W ten sposób powstaje populacja wirusa składająca się głównie z wariantów ucieczki, potwierdzonych za pomocą testu hemaglutynacji.

Wytwarzanie wariantów ucieczki wirusa grypy przeciwko przeciwciałom neutralizującym

Film prezentuje metodę tworzenia rekombinowanych wirusów grypy dostosowanych do zimna. Polega na transfekcji komórek ludzkich dwukierunkowymi plazmidami, a następnie inkubacji w niższej temperaturze w celu uzyskania wirusów odpowiednich do produkcji szczepionek, charakteryzujących się zmniejszoną replikacją w cieplejszych warunkach.

Wytwarzanie rekombinowanych, żywych, atenuowanych wirusów grypy do szczepionek

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji, oczyszczania i kwantyfikacji rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie. Protokół ten konsekwentnie daje &gt; 6 × 109 jednostek tworzących blaszki miażdżycowe/ml, zapewniając ilości wirusa odpowiednie do badań in vivo na zwierzętach. Opisano dodatkowe testy kontroli jakości w celu zapewnienia bezpieczeństwa in vivo.

Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Metoda ta przedstawia zarodek kurczaka jako prosty i opłacalny model in vivo do przywrócenia patogenu bakteryjnego L. monocytogenes ze stanu żywotnego, ale nienadającego się do hodowli (VBNC) i z potencjalnymi dalszymi zastosowaniami w zrozumieniu mechanizmów spoczynku bakteryjnego.

Zarodek kurczaka jako model in vivo do ożywiania żywotnych, ale nienadających się do hodowli patogenów

Poznaj metodę namnażania wirusa grypy A w zarodkach kurzych jaj z wysokim mianem. Technika ta umożliwia produkcję dużych ilości wirusa do badań wirusologicznych i rozwoju szczepionek.

Namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj

Przeglądaj więcej filmów