Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Ogólnym celem tego eksperymentu jest uzyskanie zapisów reakcji na światło z ciemnych zaadaptowanych neuronów siatkówki. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie oka myszy. Drugim krokiem jest wyizolowanie siatkówki i pocięcie jej w celu przygotowania plastrów.

Następnie preparat siatkówki jest montowany i oglądany pod mikroskopem w celu znalezienia komórki docelowej do nagrań z zaciskiem krosowym. Po ustaleniu konfiguracji zacisku krosowego całej komórki, w pobliżu komórki stosuje się bodziec świetlny. Wreszcie, jako jednoczesną reakcję elektrofizjologiczną można zaobserwować za pomocą oprogramowania akwizycyjnego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie KRC, jest to, że czułość zapisu jest wysoka, a rejestrujące komórki można zidentyfikować morfologicznie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ praca w całkowitej ciemności może być trudna i dezorientująca dla tych, którzy nie są do tego przyzwyczajeni. Aby rozpocząć zakres, narzędzia preparacyjne i pipety przenoszenia w pobliżu mikroskopu preparacyjnego.

Obszar roboczy będzie dobrze zorganizowany, aby każde narzędzie było łatwo dostępne w ciemności. Gdy będziesz gotowy, Świt przeglądarka podczerwieni, aby przeprowadzić procedurę w ciemności. Po eutanazji szybko zanużować oczy i umieścić je w naczyniu z zimnym roztworem preparacyjnym, przechowywanym w ciemnym pudełku działającym pod mikroskopem.

Przenieś oko do naczynia z chłodnym roztworem preparacyjnym. Ciągle bąbelkuje tlenem. Aby usunąć rogówkę i soczewkę, przytrzymaj nerw wzrokowy na drugim końcu gałki ocznej, aby się nie poruszał i wykonaj nacięcie na górze rogówki za pomocą noża mikrochirurgicznego.

Przedłuż cięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych i usuń rogówkę, pozostawiając wokół niej trochę twardówki. Następnie chwyć obiektyw cienkimi kleszczami i powoli go wyciągnij. Po wykonaniu muszli ocznej delikatnie wlej zimny natleniony roztwór preparacyjny do muszli ocznej za pomocą małej pipety transferowej.

Pracuj szybko, aby utrzymać kształt siatkówki i delikatnie naciskaj, aby zidentyfikować grzbietową i brzuszną stronę siatkówki. Użyj okularów podczerwieni, aby zidentyfikować linię biegnącą przez muszlę oczną siatkówki, przechodzącą w pobliżu głowy nerwu wzrokowego. Linia ta przechodzi głównie przez brzuszną stronę nerwu wzrokowego, a strona, w tym nerw wzrokowy, jest stroną grzbietową.

W zależności od eksperymentu wykonaj nacięcie po stronie brzusznej lub grzbietowej. To oznacza niepotrzebną stronę i jest użytecznym znacznikiem posuwania się naprzód. Następnie delikatnie usuń ciało szkliste za pomocą bardzo cienkich kleszczyków, nie dotykając siatkówki.

Ciało szkliste jest przymocowane głównie do dolnej i zewnętrznej krawędzi muszli ocznej. Ponieważ ciało szkliste może być ściśle przylegające do muszli ocznej, należy delikatnie usunąć odwarstwienie siatkówki. Kontynuuj ciągnięcie, aż nie będzie odczuwalne napięcie.

Po wyizolowaniu siatkówki chwyć twardówkę i delikatnie oderwij siatkówkę. Używając tylnej strony kleszczy, przytnij siatkówkę i wyrzuć niepotrzebną połowę do tego samego plastikowego naczynia. Pokrój pozostałą siatkówkę na dwie części na każdy kawałek.

Odetnij krawędzie, aby zrobić płytę siatkówki i przytnij zagięte krawędzie. Następnie za pomocą dużej pipety transferowej przenieś płytę siatkówki na szklaną płytkę. Odessać nadmiar roztworu małą pipetą i użyć kawałka bibuły filtracyjnej, aby spłaszczyć płytę.

Delikatnie umieść kawałek membrany filtracyjnej na chusteczce za pomocą małej pipety transferowej. Umieść kroplę roztworu preparacyjnego na membranie filtracyjnej. Odczekaj około 15 sekund, aż roztwór rozprowadzi się i przyklei tkankę siatkówki do membrany filtracyjnej.

Po sklejeniu wlej więcej zimnego roztworu preparacyjnego pod filtr i wokół niego, aż membrana zacznie unosić się na wodzie. Następnie umieść membranę filtracyjną w komorze krojenia i przykryj roztworem preparacyjnym. Pracując szybko, aby upewnić się, że błona nie wysycha, użyj rozdrabniacza, aby pokroić tkankę siatkówki na plasterki.

Umieść plastikowe szkiełko nakrywkowe z szynami smarowymi w komorze krojenia. Przenieś plaster siatkówki na szyny smarowe i obróć plasterek o 90 stopni, tak aby widoczny był przekrój poprzeczny. Dociśnij membranę filtracyjną do szkiełka nakrywkowego przed pokryciem boków bibuły filtracyjnej smarem.

Po unieruchomieniu plastrów na plastikowym szkiełku nakrywkowym przenieś je do 33-milimetrowego plastikowego naczynia. Zanurz preparat w roztworze do preparowania węgla i przechowuj każde naczynie w ciemnym pudełku, które jest stale natleniane. Do nagrań z zaciskiem krosowym.

Zagruntować probówki z profuzją pożywką celowniczą i pozwolić, aby wszystkie pęcherzyki przeszły z rurki. Po wykonaniu zapisu pipet ze szklaną biegunówką, napełnij końcówkę roztworem pipety. Następnie użyj napełniacza do mikropipet, aby napełnić około jednej trzeciej pipety po napełnieniu, przechowuj każdą pipetę w wilgotnym pudełku na pipety.

Następnie włącz sprzęt do nagrań roślin łaty, w tym wzmacniacz komputerowy, kamerę CCD i mikroskop pracujący w ciemnych warunkach. Umieścić preparat z plastrem siatkówki na stoliku mikroskopowym za pomocą wizjera na podczerwień. Po unieruchomieniu rozpocznij ciągłą perfuzję.

Ustaw temperaturę perfuzji na 33 do 37 stopni Celsjusza. Wyświetl powierzchnię przekroju za pomocą kamery CCD. Skoncentruj się na lokalizacji docelowej.

Gdy znajdują się docelowe typy komórek, wybierz zdrowo wyglądającą komórkę, aby nagrać łaskę. Po zidentyfikowaniu zdrowej komórki umieść pipetę rejestrującą w uchwycie na pipety i przesuń pipetę do preparatu plastrów. Gdy znajdzie się w pobliżu miejsca przygotowania plastrów, znajdź końcówkę pipety pod mikroskopem.

Gdy końcówka pipety będzie widoczna pod mikroskopem, przesuń końcówkę w dół w kierunku komórki docelowej. Następnie ustaw wzmacniacz i wyreguluj pipetę na pika amp. Pięć woltów na wzmacniacz Nana.

Uruchom ciągły impuls elektryczny o napięciu około pięciu miliwoltów i około 10 hercach i sprawdź rezystancję pipety. Idealna rezystancja wynosi od pięciu do 12 megaomów. Dla większości neuronów siatkówki.

Gdy będziesz gotowy, użyj ustnika lub strzykawki, aby wydmuchać roztwór wewnętrzny, aż końcówka pipety znajdzie się na powierzchni komórki docelowej. Gdy nadciśnienie utworzy małe wgłębienie na powierzchni komórki, lekko przesuń końcówkę i przestań wydmuchiwać. Jeśli rezystancja pipety stale rośnie, pozostaw ją i monitoruj rezystancję, aż osiągnie wartość większą niż jeden gigaom.

Jeśli opór nie wzrasta spontanicznie, delikatnie zastosuj podciśnienie, aż stanie się giga uszczelnieniem. Po uzyskaniu giga uszczelnienia zmień potencjał utrzymywania na minus 70 miliwoltów, a następnie okresowo stosuj podciśnienie, aby rozerwać membranę wewnątrz końcówki pipety. Po wykonaniu całej konfiguracji ogniw rezystancja pipety może wynosić od 500 megaomów do jednego gigaoma, a prąd pojemnościowy jest zauważalny.

Zapisz zależność dożylną od minus 80 do 40 miliwoltów. W zależności od typu ogniwa aktywowane będą różne typy kanałów bramkowanych napięciem. Na koniec nagraj światło wywołujące prądy synaptyczne lub napięcia.

Ten preparat plasterkowy oglądany z prędkością 10 x pokazuje zarówno fotoreceptory, jak i komórki zwojowe bez oderwania od bibuły filtracyjnej. Kiedy ten preparat jest oglądany przez obiektyw 60x, każda warstwa komórek jest wyraźnie obserwowana. Światło wywołane pobudzającymi potencjałami postsynaptycznymi z neuronów siatkówki zostało wywołane w odpowiedzi na światło schodkowe.

Amplituda piku i czas zaniku różnią się w zależności od typu i podtypu komórki. Typ komórki i jej podtyp morfologiczny ujawniono przez znakowanie siarką po zapisach fizjologicznych Po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami siatkówki do badania funkcji naturalnej sygnalizacji wzrokowej, a także wkładu mechanizmów synaptycznych.