Name: Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę rejestracji wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach siatkówki myszy przy użyciu techniki patch clamp. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary elektrofizjologiczne w warunkach adaptacji do ciemności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund i granty RPB.

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Wayne.
1. Przygotowanie eksperymentalnego roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór preparacyjny od 1 dnia do 1 tygodnia przed właściwym eksperymentem. Do rozwarstwienia siatkówki należy użyć roztworu buforowego HEPES ze względu na jego silną zdolność buforowania w niższych temperaturach16. Wymieszaj wszystkie chemikalia w następujący sposób (w mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glukozy. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Roztwór należy przechowywać w lodówce do 1 tygodnia.</li>
	<li>Roztworem do nagrywania jest pożywka Amesa, która jest sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) przeznaczonym do preparatów siatkówki17. W dniu eksperymentu odważyć proszek Amesa (4,4 g na 500 ml roztworu) w probówce. Odważyć również NaHCO3 (0,95 g na 500 ml roztworu) i wymieszać z proszkiem Amesa.</li>
	<li>Przygotować roztwór pipety wewnątrzkomórkowej do zapisów z użyciem zacisku krosowego do dnia eksperymentu. Wymieszaj wszystkie chemikalia w następujący sposób (w mM): 111 K-glukonian, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg i 1,0 GTP-Na. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH. Przefiltrować roztwór pipety za pomocą konwencjonalnego filtra strzykawkowego. Przygotuj ~500 μl porcji i przechowuj je w zamrażarce lub głębokiej zamrażarce.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do Dnia Eksperymentu
<ol>
	<li>W noc poprzedzającą eksperyment umieść mysz w klatce (C57BL/6J lub podobne tło, 4-8 tygodni, samiec) w ciemnym pomieszczeniu w celu adaptacji do ciemności O/N.</li>
	<li>Przygotowanie do sekcji:
	<ol>
		<li>Napełnij roztwór preparacyjny (100 - 200 ml) szklaną zlewką, umieść go na lodzie i bąbelkuj tlenem przez co najmniej 10 minut.</li>
		<li>Rozpocznij natlenianie ciemnego pudełka w celu przechowywania preparatu siatkówkowego.</li>
		<li>Przygotuj plastikowe szkiełka nakrywkowe z natłuszczonymi szynami do przygotowania plastrów siatkówki i umieść każde z nich w plastikowym naczyniu o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Przymocuj nową żyletkę do rozdrabniacza (krajalnicy do chusteczek).</li>
		<li>Przetnij membranę filtracyjną na dwie połowy. To jest do krojenia siatkówki.</li>
		<li>Ustaw narzędzia preparacyjne i przenieś pipety w pobliżu mikroskopu preparacyjnego. Obszar roboczy musi być dobrze zorganizowany, aby każde narzędzie było łatwo dostępne w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do nagrań z użyciem zacisków krosowych:
	<ol>
		<li>Rozpuścić proszek Amesa i NaHCO3 w wodzie destylowanej (Ames 4,4 g i NaHCO3 0,95 g/500 ml ddH2O). Bąbelkować pożywkę Amesa zmieszanym tlenem (95%O2 i 5% CO2) przez co najmniej 30 minut, podgrzewając do zarejestrowanego poziomu temperatury (~35 °C). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaHCO3, nadal bulgocząc.</li>
		<li>Rozmrozić roztwór pipety wewnętrznej podczas sekcji. Po rozmrożeniu dodaj 0,01% sulforodaminy B do barwienia wewnątrzkomórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie siatkówki
<ol>
	<li>W ciemnym pokoju poddaj mysz eutanazji za pomocą dwutlenku węgla i obustronnej odmy opłucnowej. Po 2 - 3 minutach stosowania dwutlenku węgla mysz straci przytomność.</li>
	<li>Kiedy mysz nie reaguje już na uszczypnięcie ogona, szybko wyłuszczej oczy i umieść je w zimnym roztworze preparacyjnym w plastikowym naczyniu. Wykonaj obustronną odmę opłucnową, aby zapewnić śmierć zwierzęcia. Szybko przechowuj oko w naczyniu w ciemnym pudełku. Użyj przeglądarki podczerwieni, aby przeprowadzić procedurę w ciemności. 
	UWAGA: Alternatywnie do eutanazji można zastosować izofluran, dekapitację lub zwichnięcie szyjki macicy. Metoda eutanazji powinna być zgodna z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) i/lub Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.</li>
	<li>W ciemnym pomieszczeniu wyreguluj mikroskop preparacyjny i oświetlenie w podczerwieni. Pod mikroskopem przenieś oko z naczynia do 10 cm plastikowego naczynia ze schłodzonym roztworem preparacyjnym. Stale bąbelkuj tlen przez rurki umieszczone na dnie plastikowego naczynia. Dostosuj objętość przepływu tak, aby nie była zbyt niska, ale upewnij się, że nie jest wystarczająco wysoka, aby zakłócić rozwarstwienie.</li>
	<li>Usuwanie rogówki i soczewek:
	<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie na górze rogówki za pomocą noża mikrochirurgicznego. Trzymanie nerwu wzrokowego na drugim końcu gałki ocznej zapobiega ruchowi oka. Przedłuż cięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wytnij rogówkę z odrobiną twardówki wokół niej.</li>
		<li>Chwyć obiektyw cienkimi kleszczami i powoli wyciągnij obiektyw. Jeśli ciało szkliste jest zbyt lepkie, aby usunąć soczewkę, odetnij ciało szkliste nożyczkami.</li>
		<li>Po wykonaniu muszli ocznej delikatnie wlej zimny, natleniony roztwór preparacyjny do muszli ocznej za pomocą małej pipety transferowej. 
		UWAGA: Gałka oczna szybko opróżnia się po wykonaniu nacięcia w rogówce. Ważne jest, aby zachować kształt oka, ponieważ deformacja oka podczas tego zabiegu spowoduje uszkodzenie siatkówki i odwarstwienie siatkówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja grzbietowej i brzusznej strony siatkówki: 
	UWAGA: Ze względu na nierównomierny rozkład stożków zielonych i ultrafioletowych (UV)18, identyfikacja określonego obszaru siatkówki jest ważna dla zapisów odpowiedzi na światło.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj linię biegnącą przez muszlę oczną siatkówki przechodzącą w pobliżu głowy nerwu wzrokowego. Linia ta przechodzi głównie przez brzuszną stronę nerwu wzrokowego; Strona obejmująca nerw wzrokowy jest stroną grzbietową, podczas gdy druga jest brzuszna 19. Zobacz ten punkt orientacyjny wyraźnie pod okularami w podczerwieni.</li>
		<li>W zależności od celu eksperymentu wykonaj nacięcie po niepotrzebnej stronie. Będzie to przydatne po odizolowaniu siatkówki od muszli ocznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie ciała szklistego:
	<ol>
		<li>Opcjonalnie inkubować muszlę oczną z hialuronidazą (0,5 mg/ml) przez 15 minut.</li>
		<li>Usuń ciało szkliste za pomocą bardzo drobnych kleszczy. Ciało szkliste jest przymocowane głównie do dolnej i zewnętrznej krawędzi muszli ocznej. Delikatnie usuń go, nie dotykając ani nie szturchając siatkówki. Ponieważ ciało szkliste może być ściśle przylegające do muszli ocznej, należy ją delikatnie wyjąć, aby uniknąć oderwania siatkówki od muszli ocznej. Kontynuuj ciągnięcie, aż nie będzie odczuwalne napięcie. 
		UWAGA: Ten krok jest szczególnie ważny w przypadku preparowania siatkówki myszy; Nie stanowi to jednak problemu dla siatkówki innych gatunków, takich jak szczur czy salamandra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj siatkówkę od muszli ocznej. Chwyć twardówkę i delikatnie oderwij siatkówkę za pomocą tylnej strony kleszczy. 
	UWAGA: Preparaty siatkówki w całości można wykonać z izolowanej siatkówki. Wykonaj trzy do czterech nacięć na krawędziach i spłaszcz siatkówkę lub pokrój siatkówkę na kilka części.</li>
	<li>Przyciąć siatkówkę i wyrzucić niepotrzebną połowę siatkówki (krok 3.5). W tym samym plastikowym naczyniu pokrój pozostałą siatkówkę na dwie części. Dla każdego kawałka siatkówki odetnij krawędzie, aby utworzyć płytę siatkówki i przytnij zagięte krawędzie.</li>
	<li>Przenieś płytę siatkówki na szklaną płytkę za pomocą dużej pipety do przenoszenia (~2 ml). Zassaj nadmiar roztworu małą pipetą, użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby spłaszczyć płytę, a następnie szybko umieść kawałek membrany filtracyjnej na wierzchu tkanki.
	<ol>
		<li>Za pomocą małej pipety transferowej umieść kroplę roztworu preparacyjnego na membranie filtracyjnej. Odczekaj ~15 sekund, aż roztwór rozleje się po membranie. W tym czasie tkanka siatkówki przyklei się do membrany filtracyjnej.</li>
		<li>Wlej więcej zimnego roztworu preparacyjnego pod filtrem i wokół niego. Tkanka siatkówki z membraną filtracyjną będzie unosić się na wodzie. Chwyć membranę filtracyjną za pomocą kleszczyków i umieść ją w komorze krojenia. Na tkankę wlać roztwór preparacyjny i przechowywać preparat w ciemnym pudełku. 
		UWAGA: Opisana tutaj procedura ma kluczowe znaczenie. Ważne jest, aby wykonać te czynności szybko, aby upewnić się, że tkanka siatkówki przylega do membrany filtracyjnej i nie wysycha.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą siekacza pokrój tkankę siatkówki na plasterki. Grubość około 200 μm jest możliwa do przeprowadzenia w przypadku badań z zaciskiem krosowym.</li>
	<li>Umieść plastikowe szkiełko nakrywkowe z szynami smarowymi w komorze krojenia. Przenieś plaster siatkówki na szyny smarowe na plastikowym szkiełku nakrywkowym. Obróć plasterek o 90°, tak aby przekrój poprzeczny był widoczny. Dociśnij membranę filtracyjną do szkiełka nakrywkowego, a następnie przykryj boki bibuły filtracyjnej smarem.
	<ol>
		<li>Po unieruchomieniu plastra na plastikowym szkiełku nakrywkowym, chwyć szkiełko nakrywkowe i przenieś je do plastikowego naczynia o średnicy 35 mm. Wlać zimny roztwór preparacyjny na preparat siatkówki i zanurzyć preparat. Przechowuj każde naczynie w ciemnym pudełku, które powinno być stale natleniane. 
		UWAGA: Całą procedurę należy wykonać ostrożnie, aby membrana filtra nie uległa deformacji. W przeciwnym razie plaster siatkówki łatwo oddziela się od membrany filtracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nagrania z zacisku krosowego z przygotowania plastrów siatkówki
<ol>
	<li>Przygotowanie nagrania:
	<ol>
		<li>Zagruntować rurki perfuzyjne pożywką Amesa. Pozwól, aby wszystkie pęcherzyki przeszły przez niego podczas napełniania rurki.</li>
		<li>Wykonaj pipety rejestrujące z zaciskiem krosowym za pomocą ściągacza. Aby napełnić pipetę roztworem pipety, zanurz ją w tylnej części pipety na 1 minutę, aż końcówka pipety zostanie wypełniona. Następnie napełnij ~1/3 pipety za pomocą napełniacza do mikropipet. Każdą pipetę należy przechowywać w wilgotnym pudełku na pipety.</li>
		<li>Włącz sprzęt do nagrywania z użyciem zacisku krosowego, w tym komputer, wzmacniacz, kamerę CCD i mikroskop.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyłącz światło w pokoju. Umieść preparat plastra siatkówki w komorze stolika mikroskopu za pomocą wizjera na podczerwień. Po unieruchomieniu rozpocznij ciągłą perfuzję. Ustawić temperaturę perfuzji na 33 do 37 °C.</li>
	<li>Wyświetl powierzchnię przekroju za pomocą kamery CCD. Skoncentruj się na lokalizacji docelowej, w której znajdują się typy komórek docelowych. Wybierz zdrowo wyglądającą komórkę do nagrywania z zaciskiem krosowym (tj. powinna mieć gładką powierzchnię i dobry kształt komórki).</li>
	<li>Umieść pipetę rejestrującą w uchwycie na pipety. Przesunąć pipetę do preparatu plastrów. Gdy znajdzie się w pobliżu miejsca przygotowania plastra (~2 mm powyżej), znajdź końcówkę pipety za pomocą mikroskopu. Gdy końcówka pipety będzie widoczna pod mikroskopem, przesuń końcówkę w dół w kierunku komórki docelowej.</li>
	<li>Ustaw wzmacniacz. Wyreguluj pipetę na 0 mV/0 pA (zerowanie) i rozpocznij ciągły impuls elektryczny o napięciu ~5 mV przy ~10 Hz. Sprawdź rezystancję pipety; idealna rezystancja wynosi od 5 do 10 MΩ dla większości neuronów siatkówki.</li>
	<li>Zacznij wydmuchiwać od końcówki. Użyj ustnika lub strzykawki, aby wywrzeć nadciśnienie, gdy pipeta zanurza się w roztworze do kąpieli. Ciągle wydmuchuj roztwór wewnętrzny, aż końcówka znajdzie się na powierzchni komórki docelowej.
	<ol>
		<li>Gdy nadciśnienie utworzy małe wgłębienie na powierzchni komórki, lekko przesuń końcówkę i przestań wydmuchiwać. Sprawdź rezystancję pipety, która powinna wzrosnąć. Jeśli stale rośnie, pozostaw go i monitoruj rezystancję, aż osiągnie >1 GΩ (gigaseal). Jeśli opór nie wzrasta spontanicznie, delikatnie zastosuj podciśnienie, aż stanie się gigasealem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po osiągnięciu gigaseal zmień potencjał utrzymywania na -70 mV. Następnie należy stosować okresowe podciśnienie, aby rozerwać membranę wewnątrz końcówki pipety. Po wykonaniu konfiguracji całej kuwety rezystancja pipety może wynosić od 500 MΩ do 1 GΩ, a prąd pojemnościowy jest widoczny. Czasami można zaobserwować spontaniczne prądy postsynaptyczne.</li>
	<li>Zapisz zależność I-V od -80 do +40 mV. W zależności od typu ogniwa aktywowane są różne typy kanałów bramkowanych napięciem.</li>
	<li>Rejestruj prądy lub napięcia synaptyczne wywołane światłem.</li>
</ol>

<ol><li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy%2C+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li>
<li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li>
<li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li>
<li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li>
<li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells%2C+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+558+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li>
<li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li>
<li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+524+Pt%22%5BJournal%5D)">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li>
<li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+for+a+binary+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li>
<li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li>
<li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li>
<li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29%2C+GABA%28C%29+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li>
<li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li>
<li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial%2C+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dobre nagrania można osiągnąć tylko dzięki dobrym preparatom siatkówkowym i dobrze zaprojektowanym konfiguracjom patch clamp. Chociaż wszystkie opisane powyżej kroki są ważne, dyskusja podkreśla kilka krytycznych kroków zarówno dla sekcji, jak i nagrań. 
W przypadku sekcji szczególnie ważne są dwie rzeczy: chłodzenie i natlenienie. Po wyłuszczeniu oka szybko wyjmij przednią część oka w komorze preparacyjnej z pęcherzykami tlenu, schłodzonym roztworem preparacyjnym i wlej zimny roztwór do muszl...

Siatkówka jest jedną z unikalnych części układu nerwowego. Jako dostępna część mózgu, jego architektura synaptyczna została dobrze scharakteryzowana. Ponadto funkcje tej sieci neuronowej można badać za pomocą bodźca fizjologicznego: światła. Jeśli tkanka siatkówki zostanie odizolowana w ciemnym pomieszczeniu za pomocą odpowiednich procedur, neurony w tkance będą reagować na światło. Preparat ten został wykorzystany do badania przetwarzania sygnałów wzrokowych i wyjaśnienia różnych mechanizmów synaptycznych i funkcji sieci neuronowych, a także mechanizmów chorobowych. 
Reakcje świetlne w neuronach siatkówki są rejestrowane od dziesięcioleci. We wczesnych badaniach wykorzystano ostre elektrody do wykonywania wewnątrzkomórkowych zapisów z neuronów siatkówki błotnych1. W latach osiemdziesiątych XX wieku wynaleziono technikę zaciskania krosowego2 i wkrótce stała się popularną metodą wśród badaczy wzroku3,4. Zapisy pojedynczych komórek od niższych kręgowców, w tym neuronów siatkówki błotnej i ryb, były popularnymi metodami, które przyczyniły się do wyjaśnienia mechanizmów przetwarzania sygnałów wzrokowych5,6. 
Po opracowaniu technik mutacji genetycznych, siatkówka myszy stała się bardziej popularnym modelem dla badaczy wzroku7-9. Siatkówka ssaków jest bardziej atrakcyjna niż siatkówka niższych kręgowców, ponieważ jest ewolucyjnie bliższa ludzkiej siatkówce i istnieje możliwość wykorzystania modeli chorób. Jednak komórki siatkówki myszy są małe i delikatne10, a przygotowanie siatkówki i przeprowadzanie nagrań patch clamp w ciemnym pomieszczeniu jest wyzwaniem. Wraz z postępem technologii dostępne stały się różne podejścia do badania mechanizmów sygnalizacji wzrokowej, takie jak badania obrazowe11 i elektroretinogram (ERG)12. Niemniej jednak nagrywanie pojedynczych komórek metodą patch clamp jest nadal ważne, ponieważ jest wysoce czułe czasowo i przestrzennie w porównaniu z innymi metodami. W związku z tym stale prowadziliśmy zapisy z użyciem plastrów i ulepszaliśmy nasze metody badania przetwarzania sygnału wzrokowego w preparatach plastrów siatkówki myszy13-15.
W tym filmiku instruktażowym przedstawiono protokoły z ważnymi wskazówkami. Dobre nagrania można osiągnąć tylko przy dobrym przygotowaniu. Ćwiczenie sekcji zwierząt i zbudowanie solidnego zestawu do zacisków punktowych umożliwi większości badaczy osiągnięcie udanych nagrań.

<table><tbody><tr><td>Myszy (28-60 dni, samiec)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr> szczep <tr><td>Ames' medium</td> powder <td>Sigma</td><td>A1420</td><td>doskonały</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>doskonały</td></tr><tr><td>Narzędzie preparacyjne: kleszcze</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>doskonałe</td></tr><tr><td>Narzędzie preparacyjne: nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>doskonały</td></tr><tr><td>Narzędzie preparacyjne: nóż chirurgiczny</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>doskonała</td></tr><tr><td>żyletka (do rozdrabniacza)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>doskonała</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>ręcznie robiony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeglądarka na podczerwień</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>Pokazuje jasny widok. Ustawianie ostrości na małych obiektach jest problemem.</td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>doskonały; produkuje pipety o jednakowych rozmiarach.</td></tr><tr><td>Ciemne pudełko</td><td>Pelikan</td><td>ciemne pudełko</td><td>doskonałe</td></tr><tr><td>System zacisków krosowych</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Doskonała konfiguracja. Większość kluczowych komponentów znajduje się w jednym pakiecie. Mikromanipulatory są doskonałe.</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Doskonała i łatwa kontrola.</td></tr><tr><td>Nabywanie oprogramowania</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Oprogramowanie pClamp</td><td>Doskonała i łatwa kontrola.</td></tr><tr><td>Źródło światła (LED)</td><td>Fajny</td><td>4-kanałowy system LED pE-2</td><td>Doskonała</td></tr><tr><td>kamera CCD</td><td>Obrazowanie Q</td><td>Retiga 2000</td><td>Doskonała</td></tr><tr><td>klatka Faradaya</td><td>ręcznie robiona</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Siatkówka jest bramą do układu wzrokowego. Aby zrozumieć mechanizmy przetwarzania sygnałów wzrokowych, badamy funkcje sieci neuronowych siatkówki. Neurony siatkówki w sieci składają się z wielu podtypów. W badaniach morfologicznych zidentyfikowano ponad 10 podtypów komórek dwubiegunowych, komórek zwojowych i komórek amakrynowych. Uważa się, że wiele podtypów neuronów siatkówki koduje różne cechy sygnalizacji wizualnej, takie jak ruch i kolor, oraz tworzą wiele ścieżek neuronalnych. Jednak funkcjonalne role każdego neuronu w przetwarzaniu sygnałów wzrokowych nie są w pełni poznane. Metoda zacisku krosowego jest przydatna do odpowiedzi na to podstawowe pytanie. W tym miejscu przedstawiono protokół rejestrowania wywołanych światłem odpowiedzi synaptycznych w neuronach siatkówki myszy za pomocą nagrań patch clamp w warunkach dostosowanych do ciemności. Oczy myszy są przystosowane do ciemności O/N, a preparaty z plastrów siatkówki są preparowane w ciemnym pomieszczeniu przy użyciu oświetlenia podczerwonego i widzów. Światło podczerwone nie aktywuje fotoreceptorów myszy, a tym samym zachowuje ich wrażliwość na światło. Patch clamp służy do rejestrowania odpowiedzi wywołanych światłem w neuronach siatkówki. Barwnik fluorescencyjny jest wstrzykiwany podczas nagrań w celu scharakteryzowania podtypów morfologicznych neuronów. Procedura ta pozwala nam określić fizjologiczne funkcje każdego neuronu w siatkówce myszy.

Reprezentatywny preparat przekroju przedstawiono na Rysunku 1. Preparat przekroju znajduje się w pozycji poziomej, ukazując fotoreceptory oraz komórki zwojowe na płaskiej powierzchni, bez odwarstwienia od papieru filtracyjnego. Jeśli przekrój jest przechylony, tylko część preparatu znajduje się w ogniskowej, co utrudnia zidentyfikowanie odpowiedniej komórki do rejestracji metodą patch-clamp. Podczas rejestracji istotne jest wybranie odpowiedniego somy, która zazwyczaj posiada błyszczącą powierzchnię, reg...

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest uzyskanie zapisów odpowiedzi świetlnej z neuronów siatkówki zaadaptowanych do ciemności. W tym celu w pierwszej kolejności pobiera się oko myszy. W drugim kroku izoluje się siatkówkę i przecina ją w celu przygotowania preparatów skrawkowych.Następnie preparat siatkówki zostaje zamocowany i obejrzany pod mikroskopem w celu znalezienia komórki docelowej do rejestracji metodą patch clamp. Po ustanowieniu konfiguracji whole-cell patch clamp, w sąsiedztwie komórki stosuje się stymulację świetlną. Na koniec, równoczesną odpowiedź elektrofizjologiczną można zaobserwować za pomocą oprogramowania akwizycyjnego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie KRC, jest wysoka czułość rejestracji oraz możliwość morfologicznej identyfikacji rejestrowanych komórek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ praca w całkowitej ciemności może być uciążliwa i dezorientująca dla osób nieprzyzwyczajonych do takich warunków. Aby rozpocząć przygotowania, należy umieścić narzędzia sekcyjne i pipety transferowe w pobliżu mikroskopu sekcyjnego.Obszar roboczy powinien być dobrze zorganiz

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie światło-wywołanych odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w ciemno-przystosowanych preparatach kromek siatkówki myszy przy użyciu technik zaciskania plastra

W niniejszym filmie przedstawiono proces rejestracji metodą voltage clamp w całej komórce (whole-cell) w skrawku siatkówki wodnego salamandry tygrysiej. Demonstrujemy przygotowanie skrawka oraz sposób przeprowadzania rejestracji metodą patch clamp podczas stymulacji wizualnej siatkówki.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Film demonstruje protokół do badania interakcji synaptycznych i odpowiedzi neuronalnych w transfekowanym wycinku mózgu hipokampa myszy. Polega na oświetlaniu neuronów czuciowych dalekiego zasięgu w celu wyzwolenia potencjałów czynnościowych i rejestrowaniu powstałych pobudzających potencjałów postsynaptycznych w zarejestrowanym neuronie za pomocą techniki patch-clamp dla całej komórki.

Fotostymulacja i zapisy klamer całokomórkowych neuronów w wycinkach hipokampa myszy

Ten film demonstruje rejestrację wywołanych światłem reakcji postsynaptycznych w dostosowanym do ciemności preparacie tkanki siatkówki myszy. Wycinek siatkówki umieszcza się w komorze rejestrującej, a pipeta rejestrująca służy do ustalenia ciągłości elektrycznej z komórką zwojową siatkówki. Impulsy świetlne są stosowane do generowania pobudzających potencjałów postsynaptycznych w komórkach zwojowych, które są rejestrowane przez pipetę.

Wywołane światłem reakcje postsynaptyczne w neuronach wycinków siatkówki myszy

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Poznaj metodę rejestracji wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach siatkówki myszy przy użyciu techniki patch clamp. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary elektrofizjologiczne w warunkach adaptacji do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp (Wideo) | JoVE Journal

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Przeglądaj więcej filmów