Name: Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji egzosomów z płynów ustrojowych za pomocą mikrocząstek magnetycznych i pól elektrycznych. Technika EFIRM umożliwia szybką analizę RNA i białek egzosomalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Center for Research Resources i National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, poprzez Grant UL1TR000124 (dla FW); Felix & Mildred Yip Endowed Professorship i Barnes Family Fund (dla DTWW), National Institute Of Dental & Craniofacial Research of the National Institutes of Health pod numerem T90DE022734 (dla MT). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

1. Wyodrębnianie egzosomów z wykorzystaniem kulek magnetycznych
<ol>
	<li>Do probówki do mikrocentryfugi pipetuj dobrze wymieszany roztwór 5 µl magnetycznych mikrocząsteczek powlekanych streptawidyną do 495 µl buforu fosforanowo-solnego (PBS), aby resuspendować kuleczki. Trzykrotnie przemyj i resuspenduj kuleczki w 500 µl PBS, używając statywu magnetycznego. Statyw ten stanowi układ magnesów znajdujących się po bokach obudowy, w której można umieścić probówki do mikrocentryfugi z próbkami.
	<ol>
		<li>Podczas każdego płukania pozostaw najpierw probówki na statywie na 1 min, a następnie za pomocą końcówki pipety ostrożnie usuń nadsącz z buforem, nie naruszając kuleczków.</li>
		<li>Umieść probówki na zwykłym statywie bez magnesów bocznych. Dodaj do probówek 500 µl PBS i za pomocą pipety wymieszaj roztwór z kuleczkami. Następnie umieść probówki ponownie na statywie magnetycznym, aby ponownie oddzielić kuleczki od roztworu.</li>
		<li>Powtórz usuwanie buforu poprzez namagnesowanie i resuspensję w PBS łącznie trzy razy. Wykonuje to wstępne przemycie cząsteczek magnetycznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resuspenduj kuleczki w 490 µl buforu PBS, umieściwszy probówkę na nieumagnesowanej części statywu magnetycznego. Do mieszaniny kuleczków pipetuj 5 µl biotynylowanego przeciwciała mysiego przeciwko ludzkiemu CD63 o stężeniu roztworu stokowego 1,0 mg/ml. Za pomocą pipety wymieszaj kuleczki i przeciwciało w roztworze.</li>
	<li>Umieść probówki do mikrocentryfugi z mieszaniną kuleczków i biotynylowanego przeciwciała na rotatorze do próbek. Ustaw parametry rotatora na obrót zwrotny przy nachyleniu 90° przez 5 sec i wibracje przy 5° przez 1 sec. Rotuj probówki z mieszaniną próbek i kuleczków przy tych parametrach przez 30 min w RT.</li>
	<li>Usuń nieprzypisane przeciwciała po koniugacji.
	<ol>
		<li>Po 30 min rotacji w RT umieść probówki ponownie w statywie magnetycznym na 5 min.</li>
		<li>Przeprowadź trzykrotne przemycie kuleczków, usuwając fazę ciekłą za pomocą mikropipety i płucząc w 500 µl PBS. Po trzykrotnym przemyciu resuspenduj kuleczki w 490 µl kazeiny-PBS i umieść je na nieumagnesowanej części statywu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja egzosomów przy użyciu kuleczków powlekanych przeciwciałami.
	<ol>
		<li>Oznacz każdą probówkę odpowiednim identyfikatorem próbki. Do probówki do mikrocentryfugi pipetuj 10 µl próbki surowicy lub śliny. Za pomocą pipety wymieszaj próbkę z kuleczkami magnetycznymi, pipetując kilkakrotnie.</li>
		<li>Umieść probówki z próbką i kuleczkami z przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD63 na rotatorze i rotuj przez 2 hr w RT. Użyj tych samych parametrów rotatora, które opisano w kroku 1.2.</li>
		<li>Po 2 hr rotacji próbki przeprowadź trzykrotne przemycie poprzez namagnesowanie w celu oddzielenia kuleczków od roztworu, usunięcie fazy ciekłej mikropipetą i resuspensję kuleczków w 500 µl buforu Tris-HCl. Otrzymane kuleczki są teraz związane z egzosomami i są gotowe do uwalniania w polu elektrycznym oraz pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyzwalanie zawartości egzosomów indukowane polem elektrycznym i jej pomiar
<ol>
	<li>Wstępne powlekanie elektrody starterem GAPDH
	<ol>
		<li>Nałóż plastikową płytkę z dołkami na matrycę elektrod, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym poszczególnych elektrod. W tym eksperymencie należy użyć matrycy elektrod z 16 czujnikami, gdzie każda jednostka elektrodowa w matrycy składa się z elektrody roboczej, pomocniczej i referencyjnej wykonanych z czystego złota.</li>
		<li>Przygotuj roztwór stokowy zawierający 100 nM sondy DNA, 0,3 M KCl i 10 mM pirrolu, pipetując odczynniki stokowe do probówki z ultraczystą wodą destylowaną. Wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa. 
		UWAGA: W badaniu tym wybrano sondę DNA odpowiadającą genowi referencyjnemu GAPDH, który występuje w egzosomach. Użyta sekwencja sondy to: 5'-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3'. Użyj tej mieszaniny na wszystkich elektrodach.</li>
		<li>Nanieś pipetą 60 µl mieszaniny monomeru i sondy DNA na powierzchnię każdej złotej elektrody. Sprawdź elektrody, aby upewnić się, że ciecz odpowiednio pokrywa elektrody roboczą, pomocniczą i referencyjną.</li>
		<li>Przeprowadź elektropolimeryzację mieszaniny monomeru i sondy, aby utworzyć warstwę polimeru przewodzącego na powierzchni elektrody, przykładając do jej powierzchni profil pola elektrycznego w postaci cyklicznej fali prostokątnej (CSW). Pole elektryczne to polega na przyłożeniu napięcia +350 mV przez 9 s i natychmiastowym przełączeniu na +950 mV przez 1 s. Zastosuj ten profil cyklicznej fali prostokątnej do elektrody przez 10 cykli, co daje łącznie 100 s działania pola elektrycznego.</li>
		<li>Przepłucz powierzchnię czujnika 3 razy wodą destylowaną i wysusz azotem w celu usunięcia cieczy z powierzchni elektrody. Upewnij się, że ciecz została całkowicie usunięta z elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwalnianie zawartości egzosomów
	<ol>
		<li>Dodaj 5 µl sondy detekcyjnej o stężeniu 1 µM do 495 µl mieszaniny kompleksów koralików i egzosomów i wymieszaj za pomocą pipety. 
		UWAGA: Sonda detekcyjna to sekwencja startera DNA sprzężona z cząsteczką fluoresceiny na końcu 3'. Sekwencja sondy detekcyjnej użyta w tym badaniu odpowiada mRNA GAPDH znajdującemu się w egzosomach. Sekwencja sondy detekcyjnej sprzężonej z fluoresceiną to: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3'.</li>
		<li>Nanieś pipetą 60 µl mieszaniny sondy i kompleksów koralików z egzosomami na powierzchnię złotej elektrody z umieszczoną pod nią matrycą magnesów. Matryca ta składa się z szesnastu magnesów neodymowych o średnicy 2,54 mm, ustawionych zgodnie z pozycją elektrod roboczych czujnika. Rycina 2A ilustruje rozmieszczenie magnesów i roztworu kompleksów koralików z egzosomami.</li>
		<li>Po naniesieniu próbki na powierzchnię elektrody zastosuj 20 cykli pola elektrycznego CSW z napięciem -300 mV przez 9 s i +200 mV przez 1 s (łącznie 200 s). Uwolniona zawartość egzosomów zhybrydyzuje ze starterami na powierzchni elektrody. Jeśli przedmiotem badania są markery powierzchniowe egzosomów, pomiń tę część eksperymentu. Rycina 2B ilustruje ten proces.</li>
		<li>Usuń niezwiązane anality z powierzchni elektrody, trzykrotnie płucząc ją wodą destylowaną. Wysusz elektrodę azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciwciało reporterowe i odczyt
	<ol>
		<li>Dodaj 60 µl przeciwciała anty-fluoresceinowego o stężeniu 150 jednostek/ml sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP w rozcieńczeniu 1:1 000), rozcieńczonego w kazeinie/PBS.</li>
		<li>Użyj sprzęgania napędzanego polem elektrycznym, aby połączyć anty-fluoresceinową HRP z kanapką sondy. Przyłóż do powierzchni elektrody napięcie -200 mV przez 1 s i +500 mV przez 1 s przez 5 cykli. Rycina 2A przedstawia kompleksy sondy wychwytującej i detekcyjnej dla systemu białkowego oraz kwasów nukleinowych.</li>
		<li>Trzykrotnie przemyj powierzchnię czujnika wodą destylowaną i wysusz azotem.</li>
		<li>Po wypłukaniu nadmiaru niezwiązanego przeciwciała anty-fluoresceinowego dodaj 60 µl substratu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB). Nanieś ten substrat na każdą powierzchnię czujnika za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Wykonaj amperometryczny odczyt prądu, mierząc prąd elektrody przy napięciu -200 mV przez 60 s przy użyciu potencjostatu elektrochemicznego zdolnego do jednoczesnego pomiaru z 16 kanałów. Rycina 2C przedstawia przykład profilu prądu podczas odczytu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Wykrywanie egzosomów przy użyciu pól magnetycznych i czujników elektrochemicznych; wykres analizy przedstawia odpowiedź prądową." src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2">
Rysunek 2. Komponenty metody EFIRM. (A) Metoda ekstrahowania egzosomów z płynu biologicznego z wykorzystaniem magnetycznych mikrocząsteczek powlekanych przeciwciałami anty-human CD63, a następnie uwalnianie zawartości egzosomów poprzez zastosowanie cyklicznych fal prostokątnych do kompleksu cząsteczka-egzosom. (B) Schemat biosensora elektrodowego używanego do wykrywania celów RNA/DNA/białek z uwolnionych egzosomów. (C) Reprezentatywny przykład odczytu amperometrycznego z metodologii EFIRM, gdzie większa wartość prądu odpowiada wyższym poziomom biomolekuły. Ten rysunek pochodzi z pracy Wei et al.14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+MicroRNA%3A+A+Diagnostic+Marker+for+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+in+exosomes%3A+a+novel+biomarker+in+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li>
<li>Lau, C. S., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Exosome-like+Microvesicles+and+Salivary+Gland+Cells+Interplay+Alters+Salivary+Gland+Cell-Derived+Exosome-like+Microvesicles+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro.+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In.</a> Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037(2012).</li>
<li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic%2C+drug-induced%2C+and+inflammatory+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatolog%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li>
<li>Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+exosomes%3A+A+reservoir+for+biomarker+discovery+and+potential+mediators+of+intrarenal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).</li>
<li>Lässer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9(2011).</li>
<li>Palanisamy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8577(2010).</li>
<li>Camussi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li>
<li>Lau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pancreatic+cancer-derived+exosomes+in+salivary+biomarker+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Exosomes+from+Cell+Culture+Supernatants+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).</li>
<li>Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA in Saliva.</a> Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2FAbiotic+Interface+Constructed+from+Nanoscale+DNA+Dendrimer+and+Conducting+Polymer+for+Ultrasensitive+Biomolecular+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis.</a> Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Sensor+for+Multiplex+Biomarkers+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection.</a> Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).</li>
<li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+%28EFIRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li>
</ol>

David Wong jest współzałożycielem RNAmeTRIX Inc., firmy zajmującej się diagnostyką molekularną. PeriRx LLC udzieliła sublicencji na własność intelektualną dotyczącą diagnostyki molekularnej od RNAmeTRIX. David Wong jest konsultantem PeriRx.

Jak wskazują wyniki, anty-ludzkie nanocząstki magnetyczne pokryte CD63 są w stanie specyficznie wychwytywać małe cząstki o rozmiarach od 70 do 100 nm. Ta przechwycona cząstka jest zgodna z wcześniej obserwowanym profilem egzosomów. Ponadto wykazano, że użycie niskonapięciowego CSW po wychwyceniu cząstek usuwa je z powierzchni kulki i powoduje profile degradacji DNA podobne do tradycyjnych metod uwalniania ładunku opartych na buforze do lizy. Dane te wskazują, że przepływ pracy uwalniania ładunku egzosomalnego można uproś...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Badania nad egzosomami to rozwijająca się dziedzina nauki, która zajmuje się analizą lipidowych mikropęcherzyków przenoszących ładunek w postaci RNA1, DNA2 oraz białek3. Poprzednie badania nad biologią egzosomów doprowadziły do ich zidentyfikowania w płynach ustrojowych, takich jak krew4, mocz5, mleko kobiece6 oraz ślina7. Wykazano, że egzosomy odgrywają rolę w różnych szlakach komórkowych, pośrednicząc zdalnie w komunikacji między różnymi układami organizmu8. Ze względu na rolę egzosomów w komunikacji międzykomórkowej wysunięto hipotezę, że mogą one pakować biomolekuły docelowe (białka, RNA i DNA) skorelowane ze stanami chorobowymi. Badania in vitro3 oraz na modelach zwierzęcych9 zdają się potwierdzać tę hipotezę. Aby badać zawartość egzosomów w celu odkrywania biomarkerów, konieczne jest opracowanie metodologii selektywnej izolacji egzosomów z płynów ustrojowych, indukowanego uwalniania ładunku z egzosomów oraz kwantyfikacji biomolekuł egzosomalnych. W ramach niniejszej pracy egzosomy będą definiowane jako struktury o średnicy około 70-100 nm posiadające marker powierzchniowy CD63.
Badacze zazwyczaj najpierw oczyszczają egzosomy za pomocą ultrawirowania10, a następnie przetwarzają zawartość egzosomalną przy użyciu zestawów z buforami do lizy. Stosowanie metod z buforami do lizy wymaga czasu inkubacji wynoszącego od kilku minut do kilku godzin. Proces ten może potencjalnie uszkodzić ładunek egzosomów i prowadzić do degradacji próbki. Na przykład RNA z egzosomów ślinowych, uwolnione za pomocą buforu do lizy do otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego, ma okres półtrwania krótszy niż 1 min, co sprawia, że pomiar RNA egzosomalnego po zastosowaniu buforu do lizy jest zadaniem szczególnie trudnym bez dodania reagentów stabilizujących11. Skumulowany efekt dodawania różnych reagentów do lizy i stabilizacji może wprowadzić substancje, które komplikują i utrudniają analizę zawartości egzosomalnej. Alternatywne podejście może być pomocne w szybkim uwalnianiu zawartości egzosomów i bezpiecznym przechowywaniu ładunku w celu jego charakterystyki.
W niniejszej pracy proponujemy zastosowanie niejednorodnego pola elektrycznego do uwalniania zawartości egzosomów. Znane jest, że pola elektryczne posiadają zdolność polaryzacji i rozrywania dwuwarstwy lipidowej tworzącej błony komórkowe. Nasze prace eksperymentalne badają wykorzystanie niejednorodnych cyklicznych fal prostokątnych (CSW) do rozrywania struktury mikropęcherzykowej egzosomów i uwalniania transportowanego ładunku. Metoda ta wykorzystuje napięcia rzędu kilkuset miliwoltów, co oznacza, że większość biomolekuł nie zostanie uszkodzona. Wykazujemy, że zastosowanie cyklicznej fali prostokątnej pozwala na zainicjowanie uwalniania mRNA z egzosomów ślinowych do otaczającego środowiska płynnego. Uwalnianie to jest płynnie zintegrowane z systemem elektrod, który może być wykorzystany do ilościowego oznaczania poziomów ekspresji biomarkerów12,13. Zaproponowana metoda umożliwia szybką, czułą i wolną od buforu lizującego analizę zawartości egzosomów.
<img alt="Schemat przetwarzania egzosomów: ekstrakcja, rozładunek ładunku i detekcja zawartości za pomocą metod biosensorycznych." src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd przepływu pracy EFIRM. .Metoda EFIRM jest podzielona na trzy główne fazy niezbędne do oczyszczania i analizy egzosomów. 
Ta metoda uwalniania i analizy zawartości egzosomów oparta na CSW jest stosowana w połączeniu z magnetycznymi mikrokulkami specyficznymi dla CD63 w celu izolacji egzosomów. Kulki z powinowactwem do CD63 umożliwiają selektywną izolację egzosomów z próbek śliny (oraz innych płynów ustrojowych). Po inkubacji i ekstrakcji egzosomów za pomocą namagnesowanych kulek, są one przenoszone do elektrochemicznego systemu sensorowego w celu przeprowadzenia części eksperymentu dotyczącej uwalniania i analizy zawartości opartej na CSW. Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat przepływu pracy w metodzie EFIRM.

<table><tbody><tr><td>16-kanałowy system czytników Helios z interfejsem chipowym&nbsp;</td><td>Genefluidics, Stany Zjednoczone&</td><td>nbsp; RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x Sensor Chip, gołe złoto, zestaw 5 chipów</td><td>Genefluidics, USA</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało anty-ludzkie CD63</td><td>Ancell, USA</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptawidin T1</td><td>Invitrogen, USA</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Magnesy neodymowe (średnica 1/10" x grubość 1/32") K</td><td>& J Magnetics, Stany Zjednoczone</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toldeo 3 M KCl Solution</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td><td>Roche, Niemcy</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>Substrat 3,3&prime;,5,5&prime;-tetramethylbenzidine (TMB/H2O2, niska aktywność)</td><td>Neogen, USA</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Roztwor soli fizjologicznej buforowany fosforanem</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina/PBS</td><td>Fisher Scientific, Stany Zjednoczone</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (efirm)

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Egzosomy to struktury mikropęcherzykowe, które odgrywają rolę pośredniczącą w komunikacji międzykomórkowej. Interesujące jest zbadanie wewnętrznego ładunku egzosomów w celu ustalenia, czy przenoszą one biomarkery dyskryminujące chorobę. Do przeprowadzenia analizy egzosomalnej konieczne jest opracowanie metody ekstrakcji i analizy egzosomów z docelowych płynów biologicznych bez uszkadzania zawartości wewnętrznej.
Uwalnianie i pomiar wywołane polem elektrycznym (EFIRM) to metoda specyficznego wydobywania egzosomów z biopłynów, rozładowywania ich ładunku i testowania ich wewnętrznej zawartości RNA/białka. Za pomocą mikrocząstki magnetycznej przeciwciała specyficznego dla przeciwciała anty-ludzkiego, egzosomy są najpierw wytrącane z płynów biologicznych. Po ekstrakcji stosuje się niskonapięciowe elektryczne cykliczne fale prostokątne (CSW) w celu przerwania błony pęcherzykowej i spowodowania rozładunku ładunku. Zawartość egzosomu jest hybrydyzowana ze starterami DNA lub przeciwciałami unieruchomionymi na powierzchni elektrody w celu ilościowego określenia zawartości molekularnej.
Metoda EFIRM jest korzystna do ekstrakcji egzosomów i rozładunku ładunku do analizy bez buforu do lizy. Metoda ta jest w stanie przeprowadzić specyficzne wykrywanie zarówno RNA, jak i docelowych biomarkerów białkowych w egzosomie. EFIRM ekstrahuje egzosomy specjalnie na podstawie ich markerów powierzchniowych, w przeciwieństwie do technik opartych na rozmiarze.
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i test demonstrują funkcjonalność metody wychwytywania i analizy egzosomów. Metodę EFIRM zastosowano do analizy egzosomalnej 9 myszy, którym wstrzyknięto ludzkie komórki H640 raka płuc (linia komórkowa transfekowana w celu ekspresji markera egzosomu ludzkiego CD63-GFP) w celu przetestowania ich profilu egzosomu w porównaniu z 11 myszami otrzymującymi kontrolę soli fizjologicznej. Podwyższone poziomy biomarkerów egzosomalnych (gen referencyjny GAPDH i marker powierzchniowy białka ludzkiego CD63-GFP) stwierdzono u myszy, którym wstrzyknięto H640 zarówno w próbkach surowicy, jak i śliny. Ponadto wykazano, że próbki śliny i surowicy mają liniowość (R = 0,79). Wyniki te sugerują żywotność biomarkerów egzosomów śliny do wykrywania chorób dystalnych.

Walidacja wychwytu egzosomów przez koraliki za pomocą TEM
Izolację egzosomów ze śliny przy użyciu magnetycznych kuleczek anty-CD63 dla ludzi zwalidowano po protokole ekstrakcji, wykorzystując obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). TEM wykazuje kuleczki magnetyczne z ziarnistościami o wielkości 70-100 nm znajdującymi się bezpośrednio obok nich (patrz Rysunek 3A oraz 3B), co jest zgodne ze znanym profilem egzosomów. Nie zaobserwo...

Egzosomy to mikropęcherzykowe struktury znajdujące się w biopłynach, które potencjalnie przenoszą ważne biomarkery dyskryminujące choroby. W tym przypadku zastosowano nowatorską metodę do specyficznej ekstrakcji egzosomów i szybkiego przetestowania ładunku egzosomalnego dla obu celów RNA/białka po rozerwaniu egzosomów za pomocą niejednorodnych elektrycznych cyklicznych fal prostokątnych.

Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajne wyizolowanie egzosomów z płynów biologicznych, uwolnienie zawartości egzosomów oraz szybka analiza tej zawartości. Jest to realizowane poprzez najpierw wyizolowanie egzosomów z płynów biologicznych za pomocą magnetycznych mikrocząsteczek z przeciwciałami skierowanymi przeciwko markerom egzosomów, a następnie naniesienie wyizolowanych egzosomów na powierzchnię elektrody. W kolejnym kroku egzosomy są lizowane za pomocą pola elektrycznego, a zawartość egzosomów ulega hybrydyzacji z sondami znajdującymi się na powierzchni elektrody.Do układu hybrydyzowana jest również cząsteczka reporterowa. Ostatnim krokiem jest dodanie roztworu substratu na powierzchnię elektrody, a następnie uzyskanie odczytu poprzez pomiar natężenia prądu elektrycznego. Ostatecznie pomiar elektrochemiczny natężenia prądu jest wykorzystywany do określenia ilości kwasów nukleinowych lub zawartości białek w próbce egzosomów.Główną zaletą tej technologii w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ultrawirowanie i bufor lizynowy, jest fakt, że stanowi ona prostą i szybką metodę izolacji oraz badania zawartości egzosomów. Jesteśmy bardzo entuzjastycznie nastawieni do tej technologii, ponieważ po raz pierwszy ta technologia efim pozwala nam wykorzystać informacje uwalniane przez organy w stanie chorobowym lub prawidłowym, które są transportowane z organu pochodzenia poprzez układ naczyniowy i trafiają do jamy ustnej. Technologia ta pozwala nam przechwycić te informacje i uwolnić zawartość molekularną, którą możemy wykrywać jednocześnie w sposób elastyczny.Informacje o różnicowaniu tej choroby. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ stosowanie mikrocząsteczek magnetycznych wymaga dużej staranności. Co więcej, wykorzystanie metod elektrochemicznych w analizie próbek biologicznych może być nowym podejściem dla niektórych użytkowników. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ opanowanie pracy z mikrocząsteczkami magnetycznymi oraz ich nakładaniem na elektrody jest trudne. Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania mikrocząsteczkami magnetycznymi i ich osadzania na elektrodach.Aby rozpocząć, resuspendować roztwór stokowy zawierający 10 µg/mL magnetycznych mikrocząstek powlekanych streptawidyną i dodać pięć µL roztworu do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 495 µL PBS w celu przemycia kulek. Następnie umieścić probówkę na statywie magnetycznym na jedną minutę i ostrożnie usunąć bufor, nie naruszając kulek.Następnie przenieś probówkę do statywu niemagnetycznego. Dodaj 500 µL PBS i wypłucz kuleczki za pomocą PET. Powtórz tę czynność łącznie trzy razy, po czym po ostatnim płukaniu ponownie zawieszone kuleczki.Zawiesić kuleczki w 490 µL PBS, a następnie dodać 5 µL biotynilowanego przeciwciała mysiego przeciwludzkiego CD 63 z roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/mL. Wymieszać roztwór poprzez pipetowanie, zaprogramować rotator do próbek na ruchy odwrotne pod kątem 90° przez 5 s oraz wibracje pod kątem 5° przez 1 s. Umieścić probówki w rotatorze i uruchomić program na 30 min w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś probówki na statyw magnetyczny na pięć minut. Przemyj kuleczki trzykrotnie 500 µL PBS, a następnie resuspenderuj je w 490 µL PBS zawierającego Caine. Oznacz probówkę identyfikatorem próbki, a następnie dodaj 10 µL próbki, pipetując kilka razy, aby zmieszać próbkę z kuleczkami koniugowanymi z przeciwciałem.Następnie przenieś probówki do rotatora do próbek i uruchom ten sam program na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj koraliki trzykrotnie 500 µL jednego molarnego buforu tris-chlorowodorkowego. Za pomocą statywu magnetycznego egzosomy są teraz związane z magnetycznymi koralikami w celu przygotowania elektrody.W pierwszej kolejności należy rozcieńczyć roztwory zapasowe sondy, chlorku potasu oraz monomeru ole w wodzie destylowanej. Pięcioprymowa biotynilowana sonda DNA jest specyficzna dla mRNA GA DH. Roztwór monomeru i sondy należy wymieszać za pomocą wortexa.Należy użyć macierzy 16 elektrod z czujnikami, w której każda jednostka elektrod składa się z elektrody roboczej, pomocniczej i referencyjnej wykonanych z czystego złota. Na macierzy elektrod należy umieścić plastikową studzienkę, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym elektrod. Na powierzchnię złotej elektrody należy nanieść 60 µL roztworu sondy monomerowej w taki sposób, aby elektrody robocza, pomocnicza i referencyjna zostały pokryte cieczą.Zastosuj profil cyklicznego prostokątnego pola elektrycznego, znany jako pole A-C-S-W-E, aby przeprowadzić electropolimeryzację sondy monomerowej. Pozwala to na utworzenie przewodzącej warstwy polimeru na powierzchni elektrody. Przepłucz sensor trzy razy wodą destylowaną, a następnie osusz go azotem, aby usunąć ciecz z powierzchni elektrody.Po funkcjonalizacji elektrody sondą wychwytującą, należy dodać 5 µL roztworu sondy detekcyjnej o stężeniu 1 µM do 495 µL roztworu kompleksu kulek z egzosomami, a następnie wymieszać za pomocą pipety. Sonda ta jest koniugowanym z fluoresceiną starterem DNA z końcem 3', specyficznym dla GA dh. Umieszczono funkcjonalizowaną macierz elektrod nad macierzą magnesów składającą się z 16 magnesów dopasowanych do elektrod roboczych czujnika.Następnie przenieś 60 µL roztworu egzosomów związanych z koralikami na powierzchnię elektrody. Zastosuj pole A-C-S-W-E przez 20 cykli. Uwolniony ładunek egzosomalny zhybrydyzuje z sondą na powierzchni elektrody.Przepłucz powierzchnię elektrody trzykrotnie wodą destylowaną, aby usunąć niezwiązane anality, a następnie osusz elektrodę strumieniem azotu. Następnie przygotuj rozcieńczenie od 1 do 1000 przeciwciała antyfluoresceinowego sprzężonego z HRP w PBS zawierającym kazeinę. Po tym dodaj 60 µL rozcieńczenia przeciwciała na powierzchnię elektrody.Przyłoż pole A-C-S-W-E do powierzchni elektrody, aby sprzęgnąć przeciwciało antyfluoresceinowe HRP z sondą detekcyjną. Przepłucz powierzchnię czujnika trzy razy wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał, a następnie osusz elektrodę strumieniem azotu. Następnie nanieś 60 µL substratu TMB na powierzchnię każdego czujnika za pomocą pipety wielokanałowej i za pomocą potencjostatu elektrochemicznego zmierz prąd elektrody przy napięciu -200 mV przez 60 s.W celu uzyskania odczytu TRIC wykorzystano transmisyjną mikroskopię elektronową, aby ustalić, czy egzosomy przyłączyły się do kulek magnetycznych. Ziarna o rozmiarach od 70 do 100 nanometrów przytwierdzone do kulek są zgodne ze znaną wielkością egzosomów po lizie wywołanej polem elektrycznym lub detergentem. W pobliżu kulek nie stwierdzono obecności egzosomów.mRNA GA DH w egzosomach wykryto za pomocą odczytu atrycznego. Ilość obecnego GA DH zmniejsza się w czasie, zgodnie z oczekiwaniami, po lizie egzosomów za pomocą pola elektrycznego lub detergentu, co wskazuje na ekspozycję na pozapęcherzykowe środowisko śliny. Efim wykorzystano do pomiaru zawartości egzosomalnej w surowicy i ślinie myszy, którym wstrzyknięto ludzkie komórki raka płuca produkujące ludzki marker egzosomalny CD 63 GFP.Po 20 dniach w surowicy i ślinie myszy wstrzykniętych komórkami nowotworowymi stwierdzono wyższe poziomy CD 63 GFP, czego nie zaobserwowano u myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dotykać kulek, aby odessać odpowiednią ilość płynu podczas ich przemywania w celu równomiernego oczyszczenia powierzchni elektrody, oraz aby prawidłowo załadować regiony na elektrodę. Ta technologia, ta technologia efim, zapewniła krytyczną, nieosiąganą wcześniej możliwość zbadania, w jaki sposób choroba systemowa w odległym narządzie może przekazywać informacje i obliczać je w strukturach zwanych egzosomami.W jaki sposób przedostają się one do śliny, do naszej jamy ustnej, jak można wychwycić egzosomy, uwolnić te cele molekularne i umożliwić ich jednoczesne wykrywanie w przypadku chorób zagrażających życiu, takich jak cukrzyca, rak trzustki czy inne niebezpieczne schorzenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko wyizolować egzosomy z płynu biologicznego, jak uwolnić zawartość egzosomów oraz jak szybko przeanalizować ich treść przy użyciu zintegrowanego systemu elektrod.

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykrywanie biomarkerów eksosomalnych przez indukcję polem elektrycznym uwolnienia i pomiaru (EFIRM)

W tym filmie demonstrujemy procedurę izolowania egzosomów od docelowych płynów biologicznych za pomocą mikrokulek magnetycznych. Procedura umożliwia szybkie wychwytywanie egzosomów, które można wykorzystać do dalszej analizy.

Ekstrakcja egzosomów na bazie kulek magnetycznych: technika izolowania określonych egzosomów z biopłynów

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają ważną rolę w procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w krzepnięciu, reakcjach immunologicznych i raku, lub jako potencjalne środki terapeutyczne w dostarczaniu leków lub medycynie regeneracyjnej. Protokół ten przedstawia metody kwantyfikacji i charakterystyki wielkości izolowanych i nieizolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w różnych płynach przy użyciu przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów.

Kwantyfikacja i profilowanie wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Pokazujemy, jak używać nowatorskiego instrumentu do analizy śledzenia nanocząstek, aby oszacować rozkład wielkości i całkowite stężenie cząstek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołokomórkowej i ludzkiego osocza.

Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj opisujemy prosty protokół, który umożliwia in vitro ocenę obfitości znakowanych fluorescencyjnie mikroRNA w celu zbadania dynamiki pakowania mikroRNA i eksportu do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Śledzenie uwalniania miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.

Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii

Poznaj metodę ekstrakcji egzosomów z płynów ustrojowych za pomocą mikrocząstek magnetycznych i pól elektrycznych. Technika EFIRM umożliwia szybką analizę RNA i białek egzosomalnych.

Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Przeglądaj więcej filmów