Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wyekstrahowanie egzosomów z biopłynów, wydalenie ładunku egzosomu i szybka analiza ładunku. Osiąga się to poprzez najpierw ekstrakcję egzosomów z płynów biologicznych za pomocą mikrocząstek magnetycznych z markerem egzosomów ukierunkowanymi na przeciwciała, a następnie umieszczenie wyekstrahowanych egzosomów na powierzchni elektrody. Następnie egzosom jest układany za pomocą pola elektrycznego, a ładunek egzosomu jest hybrydyzowany z sondami na powierzchni elektrody.

Cząsteczka reporterowa jest również hybrydyzowana z układem. Ostatnim krokiem jest dodanie roztworu substratu do powierzchni elektrody, a następnie uzyskanie odczytu poprzez pomiar prądu elektrycznego. Ostatecznie elektrochemiczny pomiar prądu służy do pokazania ilości kwasu nukleinowego lub zawartości białka w próbce egzosomu.

Główną przewagą tej technologii nad istniejącą metodą, taką jak ultracentryfikacja i bufor lizynowy, jest to, że jest to prosta, szybka metoda ekstrakcji i testowania zawartości egzosomów. Jesteśmy bardzo podekscytowani tą technologią, ponieważ po raz pierwszy ta technologia efim pozwala nam wykorzystać informacje wydalane przez narządy w chorobie lub w normalności, które są wydalane przez narząd pochodzenia przez naczynia krwionośne i gdy wchodzą do naszej jamy ustnej. Technologia ta pozwala nam uchwycić te informacje i uwolnić zawartość molekularną, którą możemy wykrywać jednocześnie w elastyczny sposób.

To dyskryminujące informacje o chorobie, Ogólnie rzecz biorąc, użytkownicy nowi w tej metodzie mogą mieć problemy, ponieważ użycie mikrocząstek magnetycznych może być trudne, jeśli nie jest się ostrożnym. Co więcej, zastosowanie metod elektrochemicznych w analizie próbek biologicznych może być nowym paradygmatem dla niektórych Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ mikrocząstki magnetyczne i ładowanie elektryczne są trudne do nauczenia. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z mikrocząstkami magnetycznymi i ładować je na elektrolody.

Aby rozpocząć ponowne zawieszanie, roztwór podstawowy zawierający 10 mikrogramów na mililitr mikrocząstek magnetycznych pokrytych streptem adin i dodaj pięć mikrolitrów. Roztwór do mikroprobówki wirówkowej zawierającej 495 mikrolitrów PBS do mycia kulek. Najpierw umieść rurkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę i ostrożnie wyjmij bufor, nie naruszając koralików.

Następnie przenieś rurkę do stojaka niemagnetycznego. Dodaj 500 mikrolitrów PBS i PET, aby umyć koraliki. Zrób to w sumie trzy razy po ostatnim praniu.

Zawieś kulki w 490 mikrolitrach PBS, a następnie dodaj pięć mikrolitrów biotynylowanego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD 63 z jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego. Wymieszać roztwór, pipetując, zaprogramować rotator próbki do obrotu posuwisto-zwrotnego pod kątem 90 stopni przez pięć sekund i wibracji pod kątem pięciu stopni przez jedną sekundę. Umieść rurki w rotatorze i uruchom program na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś probówki na stojak magnetyczny na pięć minut. Umyj koraliki trzykrotnie 500 mikrolitrami PBS, a następnie ponownie zanurz je w 490 mikrolitrach PBS zawierających Caine. Oznaczyć probówkę identyfikacją próbki, a następnie kilkakrotnie dodać 10 mikrolitrów pipety do próbki, aby wymieszać próbkę z kulkami sprzężonymi z przeciwciałami.

Następnie przenieś probówki do rotatora próbek i uruchom ten sam program przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj koralik trzykrotnie 500 mikrolitrami jednomolowego buforu chlorowodorku tris. Za pomocą namagnesowanego stojaka egzosomy są teraz wiązane namagnesowanymi kulkami, aby wstępnie przygotować elektrodę.

Najpierw rozcieńczyć odczynniki podstawowe sondy, chlorek potasu i ole monomer w wodzie destylowanej. Pięć głównych biotynylowanych sond DNA jest specyficznych dla mRNA GA DH. Wymieszaj roztwór sondy monomeru przez wirowanie.

Użyj układu elektrod z 16 czujnikami, w którym każda elektroda jednostkowa składa się z działających elektrod licznikowych i elektrod odniesienia wykonanych z czystego złota. Umieść plastikową studzienkę na matrycy elektrod, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu elektrod. Przenieś 60 mikrolitrów roztworu sondy monomeru na powierzchnię złotej elektrody tak, aby licznik roboczy i elektrody odniesienia były pokryte cieczą.

Zastosuj cykliczny profil pola elektrycznego fali prostokątnej znany jako pole A-C-S-W-E do elektropolimeryzowanej sondy monomerowej. W ten sposób na powierzchni elektrody tworzy się przewodząca warstwa polimeru. Przepłucz czujnik trzykrotnie wodą destylowaną, a następnie osusz go gazowym azotem, aby usunąć płyn z powierzchni elektrody.

Po wstępnym połączeniu elektrody z sondą wychwytującą, dodaj pięć mikrolitrów jednomikromolowego roztworu sondy detektora do 495 mikrolitrów złożonego roztworu egzosomu kulkowego, a następnie wymieszaj przez pipetowanie. Tu. Sonda jest starterem DNA sprzężonym z trzema pierwszymi fluoresceinami, który jest specyficzny dla GA dh. Umieszczono wstępnie zakodowany układ elektrod nad układem magnetycznym składającym się z 16 magnesów ustawionych w jednej linii z elektrodami roboczymi czujnika.

Następnie przenieś 60 mikrolitrów roztworu egzosomu kulek na powierzchnię elektrody. Nakładaj pole A-C-S-W-E przez 20 cykli. Uwolniony ładunek egzosomalny będzie hybrydyzował z sondą na powierzchni elektrody.

Przepłucz powierzchnię elektrody trzykrotnie wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie niezwiązane anality, a następnie naciągnij elektrodę gazowym azotem. Następnie rozcieńczyć jeden do 1000 przeciwciała sprzężonego z antyfluoresceiną HRP w PBS zawierającym Caine. Następnie dodaj 60 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciała na powierzchnię elektrody.

Zastosuj pole A-C-S-W-E do powierzchni elektrody, aby sprzęgnąć przeciwciało anty fluoresceinowe HRP z sondą detektora. Przepłucz powierzchnię czujnika trzykrotnie wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar przeciwciał, a następnie narysuj elektrodę z gazowym azotem. Następnie załaduj 60 mikrolitrów podłoża TMB na każdą powierzchnię czujnika za pomocą pipety wielokanałowej, używając statystanu potencjałów elektrochemicznych, aby zmierzyć prąd elektrody przy ujemnym napięciu 200 miliwoltów przez 60 sekund.

Aby uzyskać transmisyjny odczyt tric, zastosowano mikroskopię elektronową w celu określenia, czy egzosomy są związane z kulkami magnetycznymi. Granulki o wielkości od 70 do 100 nanometrów przymocowane do kulek są zgodne ze znaną wielkością egzosomów po lizie przez pole elektryczne lub detergent. W pobliżu koralików nie widać egzosomów.

MRNA GA DH w egzosomach wykryto za pomocą odczytu atrycznego. Ilość GA DH obecna w czasie zmniejsza się zgodnie z oczekiwaniami po lizie egzosomu przez pole elektryczne lub detergent, co wskazuje na narażenie na dodatkowe pęcherzykowe środowisko śliny. Efim użyto do pomiaru egzosomalnej zawartości w surowicy i ślinie myszy, którym wstrzyknięto ludzkie komórki raka płuc wytwarzające ludzki marker somalny CD 63 GFP Exo.

Po 20 dniach stwierdzono wyższe poziomy CD 63 GFP zarówno w surowicy, jak i w splocie myszy, którym wstrzyknięto komórki rakowe, ale nie myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać dotykania koralików, aby wydobyć odpowiednią ilość płynu podczas mycia kulek, aby równomiernie umyć powierzchnię elektrody i prawidłowo załadować obszary na elektrodzie. Ta technologia, ta technologia efim, zapewniła tę krytyczną, niezaspokojoną zdolność, w jaki sposób choroba ogólnoustrojowa, dystalny narząd, może zrzucić swoje informacje i obliczyć je w tej jednostce zwanej egzosomami.

W jaki sposób dostają się do śliny, do naszej jamy ustnej i są w stanie wychwycić egzosomy, uwalniają te cele molekularne i pozwalają na jednoczesne wykrycie takich jak groźne choroby, cukrzyca, rak trzustki lub inne zagrażające życiu zaburzenia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko wyodrębnić egzosomy z biopłynu, jak rozładować ładunek egzosomów i jak szybko analizować zawartość egzosomów za pomocą zintegrowanego systemu elektrod.