Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajne wyizolowanie egzosomów z płynów biologicznych, uwolnienie zawartości egzosomów oraz szybka analiza tej zawartości. Jest to realizowane poprzez najpierw wyizolowanie egzosomów z płynów biologicznych za pomocą magnetycznych mikrocząsteczek z przeciwciałami skierowanymi przeciwko markerom egzosomów, a następnie naniesienie wyizolowanych egzosomów na powierzchnię elektrody. W kolejnym kroku egzosomy są lizowane za pomocą pola elektrycznego, a zawartość egzosomów ulega hybrydyzacji z sondami znajdującymi się na powierzchni elektrody.

Do układu hybrydyzowana jest również cząsteczka reporterowa. Ostatnim krokiem jest dodanie roztworu substratu na powierzchnię elektrody, a następnie uzyskanie odczytu poprzez pomiar natężenia prądu elektrycznego. Ostatecznie pomiar elektrochemiczny natężenia prądu jest wykorzystywany do określenia ilości kwasów nukleinowych lub zawartości białek w próbce egzosomów.

Główną zaletą tej technologii w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ultrawirowanie i bufor lizynowy, jest fakt, że stanowi ona prostą i szybką metodę izolacji oraz badania zawartości egzosomów. Jesteśmy bardzo entuzjastycznie nastawieni do tej technologii, ponieważ po raz pierwszy ta technologia efim pozwala nam wykorzystać informacje uwalniane przez organy w stanie chorobowym lub prawidłowym, które są transportowane z organu pochodzenia poprzez układ naczyniowy i trafiają do jamy ustnej. Technologia ta pozwala nam przechwycić te informacje i uwolnić zawartość molekularną, którą możemy wykrywać jednocześnie w sposób elastyczny.

Informacje o różnicowaniu tej choroby. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ stosowanie mikrocząsteczek magnetycznych wymaga dużej staranności. Co więcej, wykorzystanie metod elektrochemicznych w analizie próbek biologicznych może być nowym podejściem dla niektórych użytkowników. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ opanowanie pracy z mikrocząsteczkami magnetycznymi oraz ich nakładaniem na elektrody jest trudne. Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania mikrocząsteczkami magnetycznymi i ich osadzania na elektrodach.

Aby rozpocząć, resuspendować roztwór stokowy zawierający 10 µg/mL magnetycznych mikrocząstek powlekanych streptawidyną i dodać pięć µL roztworu do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 495 µL PBS w celu przemycia kulek. Następnie umieścić probówkę na statywie magnetycznym na jedną minutę i ostrożnie usunąć bufor, nie naruszając kulek.

Następnie przenieś probówkę do statywu niemagnetycznego. Dodaj 500 µL PBS i wypłucz kuleczki za pomocą PET. Powtórz tę czynność łącznie trzy razy, po czym po ostatnim płukaniu ponownie zawieszone kuleczki.

Zawiesić kuleczki w 490 µL PBS, a następnie dodać 5 µL biotynilowanego przeciwciała mysiego przeciwludzkiego CD 63 z roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/mL. Wymieszać roztwór poprzez pipetowanie, zaprogramować rotator do próbek na ruchy odwrotne pod kątem 90° przez 5 s oraz wibracje pod kątem 5° przez 1 s. Umieścić probówki w rotatorze i uruchomić program na 30 min w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś probówki na statyw magnetyczny na pięć minut. Przemyj kuleczki trzykrotnie 500 µL PBS, a następnie resuspenderuj je w 490 µL PBS zawierającego Caine. Oznacz probówkę identyfikatorem próbki, a następnie dodaj 10 µL próbki, pipetując kilka razy, aby zmieszać próbkę z kuleczkami koniugowanymi z przeciwciałem.

Następnie przenieś probówki do rotatora do próbek i uruchom ten sam program na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj koraliki trzykrotnie 500 µL jednego molarnego buforu tris-chlorowodorkowego. Za pomocą statywu magnetycznego egzosomy są teraz związane z magnetycznymi koralikami w celu przygotowania elektrody.

W pierwszej kolejności należy rozcieńczyć roztwory zapasowe sondy, chlorku potasu oraz monomeru ole w wodzie destylowanej. Pięcioprymowa biotynilowana sonda DNA jest specyficzna dla mRNA GA DH. Roztwór monomeru i sondy należy wymieszać za pomocą wortexa.

Należy użyć macierzy 16 elektrod z czujnikami, w której każda jednostka elektrod składa się z elektrody roboczej, pomocniczej i referencyjnej wykonanych z czystego złota. Na macierzy elektrod należy umieścić plastikową studzienkę, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym elektrod. Na powierzchnię złotej elektrody należy nanieść 60 µL roztworu sondy monomerowej w taki sposób, aby elektrody robocza, pomocnicza i referencyjna zostały pokryte cieczą.

Zastosuj profil cyklicznego prostokątnego pola elektrycznego, znany jako pole A-C-S-W-E, aby przeprowadzić electropolimeryzację sondy monomerowej. Pozwala to na utworzenie przewodzącej warstwy polimeru na powierzchni elektrody. Przepłucz sensor trzy razy wodą destylowaną, a następnie osusz go azotem, aby usunąć ciecz z powierzchni elektrody.

Po funkcjonalizacji elektrody sondą wychwytującą, należy dodać 5 µL roztworu sondy detekcyjnej o stężeniu 1 µM do 495 µL roztworu kompleksu kulek z egzosomami, a następnie wymieszać za pomocą pipety. Sonda ta jest koniugowanym z fluoresceiną starterem DNA z końcem 3', specyficznym dla GA dh. Umieszczono funkcjonalizowaną macierz elektrod nad macierzą magnesów składającą się z 16 magnesów dopasowanych do elektrod roboczych czujnika.

Następnie przenieś 60 µL roztworu egzosomów związanych z koralikami na powierzchnię elektrody. Zastosuj pole A-C-S-W-E przez 20 cykli. Uwolniony ładunek egzosomalny zhybrydyzuje z sondą na powierzchni elektrody.

Przepłucz powierzchnię elektrody trzykrotnie wodą destylowaną, aby usunąć niezwiązane anality, a następnie osusz elektrodę strumieniem azotu. Następnie przygotuj rozcieńczenie od 1 do 1000 przeciwciała antyfluoresceinowego sprzężonego z HRP w PBS zawierającym kazeinę. Po tym dodaj 60 µL rozcieńczenia przeciwciała na powierzchnię elektrody.

Przyłoż pole A-C-S-W-E do powierzchni elektrody, aby sprzęgnąć przeciwciało antyfluoresceinowe HRP z sondą detekcyjną. Przepłucz powierzchnię czujnika trzy razy wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał, a następnie osusz elektrodę strumieniem azotu. Następnie nanieś 60 µL substratu TMB na powierzchnię każdego czujnika za pomocą pipety wielokanałowej i za pomocą potencjostatu elektrochemicznego zmierz prąd elektrody przy napięciu -200 mV przez 60 s.

W celu uzyskania odczytu TRIC wykorzystano transmisyjną mikroskopię elektronową, aby ustalić, czy egzosomy przyłączyły się do kulek magnetycznych. Ziarna o rozmiarach od 70 do 100 nanometrów przytwierdzone do kulek są zgodne ze znaną wielkością egzosomów po lizie wywołanej polem elektrycznym lub detergentem. W pobliżu kulek nie stwierdzono obecności egzosomów.

mRNA GA DH w egzosomach wykryto za pomocą odczytu atrycznego. Ilość obecnego GA DH zmniejsza się w czasie, zgodnie z oczekiwaniami, po lizie egzosomów za pomocą pola elektrycznego lub detergentu, co wskazuje na ekspozycję na pozapęcherzykowe środowisko śliny. Efim wykorzystano do pomiaru zawartości egzosomalnej w surowicy i ślinie myszy, którym wstrzyknięto ludzkie komórki raka płuca produkujące ludzki marker egzosomalny CD 63 GFP.

Po 20 dniach w surowicy i ślinie myszy wstrzykniętych komórkami nowotworowymi stwierdzono wyższe poziomy CD 63 GFP, czego nie zaobserwowano u myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dotykać kulek, aby odessać odpowiednią ilość płynu podczas ich przemywania w celu równomiernego oczyszczenia powierzchni elektrody, oraz aby prawidłowo załadować regiony na elektrodę. Ta technologia, ta technologia efim, zapewniła krytyczną, nieosiąganą wcześniej możliwość zbadania, w jaki sposób choroba systemowa w odległym narządzie może przekazywać informacje i obliczać je w strukturach zwanych egzosomami.

W jaki sposób przedostają się one do śliny, do naszej jamy ustnej, jak można wychwycić egzosomy, uwolnić te cele molekularne i umożliwić ich jednoczesne wykrywanie w przypadku chorób zagrażających życiu, takich jak cukrzyca, rak trzustki czy inne niebezpieczne schorzenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko wyizolować egzosomy z płynu biologicznego, jak uwolnić zawartość egzosomów oraz jak szybko przeanalizować ich treść przy użyciu zintegrowanego systemu elektrod.