Opracowanie inhibitorów oddziaływań białko-białko poprzez REPLACE: zastosowanie do projektowania i rozwoju konkurencyjnych inhibitorów CDK niebędących ATP
October 26th, 2015
Opisujemy implementację strategii REPLACE do celowania w interakcje białko-białko. REPLACE to iteracyjna strategia obejmująca podejścia syntetyczne i obliczeniowe w celu przekształcenia zoptymalizowanych inhibitorów peptydowych w cząsteczki podobne do leków.
Ogólnym celem strategii jest wygenerowanie skutecznego małocząsteczkowego środka terapeutycznego podobnego do leku poprzez konwersję inhibitora peptydowego do interakcji białkowej z białkiem. Osiąga się to poprzez ustalenie zależności między strukturą a aktywnością dla pożądanej interakcji białka peptydowego, aby zrozumieć, które części można skutecznie zastąpić w drugim kroku. Chemia obliczeniowa jest wykorzystywana do identyfikacji realnych alternatyw fragmentów dla znanych determinantów peptydów, które można następnie wykorzystać do syntezy biblioteki hybryd peptydów fragmentowych.
Następnie między tymi fragmentami a skróconym peptydem syntetyzuje się bibliotekę hybryd w celu wygenerowania cząsteczek, które można przetestować w teście in vitro w celu zidentyfikowania cząsteczek bardziej podobnych do leku i które podsumowują aktywność natywnego peptydu. Wyniki pokazują, że za pomocą tej metodologii można zidentyfikować więcej związków podobnych do leków, które stanowią skuteczne punkty wyjścia do odkrywania leków w zakresie inhibitorów interakcji białkowo-białkowych. Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe, jest to, że trakcja białek jest niezwykle trudna z punktu widzenia odkrywania leków, a konwencjonalne metody nie działają dobrze.
Strategia wymiany obejmuje podejście iteracyjne krokowe i dlatego może trwać dłużej lub jest bardziej prawdopodobne, że będzie skuteczna w dłuższej perspektywie. Dzisiaj zademonstruję większość procedur sam z niewielką pomocą mojej współpracowniczki, dr Sandry Craig, która ustawi niektóre reakcje i procedury. Rozpocznij tę procedurę od walidacji protokołu dokowania, a następnie przygotowania miejsca wiązania receptora i ligandów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zadokować ligandy w rowku cykliny.
Najpierw wybierz rutynę dopasowania liganda z protokołu interakcji receptor ligand ustawionego w oprogramowaniu, użyj receptora i przygotowanych ligandów jako danych wejściowych dla tego protokołu. W przypadku tych przebiegów wybierz PLP one jako sieć energetyczną. Sieć energetyczna wykorzystywana przez program dokowania jest polem siłowym do generowania oddziaływań receptorów ligandów i potencjalnych pozycji.
Plp jeden to pokojowy potencjał liniowy, który w szczególności nadaje priorytet oddziaływaniom wiązań wodorowych. Określ, że upozy mają być zminimalizowane, a liczba wygenerowanych póz ma być równa 10. W pierwszej kolejności pozostaw wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi.
Wyświetl pozy w programie wizualizatora, a następnie posortuj według malejących wartości jednego wyniku PLP. Użyj funkcji oceniania, takich jak plp, aby oszacować powinowactwo wiązania zadokowanego liganda na podstawie pozycji kandydującego liganda, geometrii i interakcji niekowalencyjnej ze strukturą receptora docelowego. Przeanalizuj wizualnie górne 25% ocenionych póz pod kątem super niemożliwości ze znaną grupą cappingową.
Obserwuj również, czy pozycja spełnia filtry interakcji, które są ustawione tak, aby zawierały ograniczenia atomów, które wymagają kontaktów międzycząsteczkowych, o których wiadomo, że są krytyczne dla wiązania i/lub są wymagane do umieszczenia potencjalnej grupy zamykającej w odpowiedniej geometrii dla tworzenia wiązania amidowego. Na koniec zbadaj pozy pod kątem komplementarności wizualnej, która jest definiowana jako skuteczne wypełnienie kieszeni wiążącej w sposób zgodny ze znaną aktywnością struktury. Zależności do syntezy grup zamykających końcówki, użyj wszystkich komercyjnych materiałów wyjściowych, rozpuszczalników i odczynników oraz zsyntetyzuj za pomocą konwencjonalnej syntetycznej chemii organicznej.
Przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową lub TLC na żelu krzemionkowym w celu monitorowania reakcji, najpierw rozpuszczając materiał wyjściowy i mieszaninę reakcyjną w fazie ruchomej. Następnie umieść rozpuszczony materiał wyjściowy i mieszaninę reakcyjną na płytce TLC za pomocą kapilarnek rurkowych. Umieścić płytkę TLC w komorze zawierającej fazę ruchomą.
Gdy faza ruchoma osiągnie 90% płytki TLC, wyjmij ją i wysusz na powietrzu. Użyj światła UV, aby wykryć materiał wyjściowy i mieszaniny reakcyjne jako widoczne plamy. Następnie oblicz RF każdego punktu, który jest stosunkiem odległości przebytej przez plamkę do fazy ruchomej.
Następnie umieścić mieszaninę reakcyjną w rozdzielaczu i przemyć ją odpowiednio wodnym roztworem kwasu lub zasady. Zebrać rozpuszczalnik organiczny i odparować go w parowniku obrotowym przed suszeniem. Produkt surowy otrzymany w próżni rozpuścić 500 miligramów produktu surowego w trzech do pięciu mililitrach odpowiedniego rozpuszczalnika i dodać do próbki krzemionki lub RP 18 przed suszeniem pod powietrzem, umieścić próbkę zawierającą produkt surowy w krzemionce, wkładach zatrzaskowych z odwróconą fazą.
Oczyść surowy materiał za pomocą zautomatyzowanej wysokosprawnej chromatografii flash. Wykorzystuje kolumnę zatrzaskową o wadze 100 gramów z gradientem. Uruchamianie na 15 woluminach kolumn.
Oczyszczony produkt zebrany w rozpuszczalniku z chromatografii błyskawicznej wysuszyć za pomocą wyparki obrotowej, odparowując cały rozpuszczalnik do sucha. Następnie należy wysuszyć produkt w próżni, aby usunąć wszystkie pozostałości rozpuszczalników. Przeprowadzić charakterystykę oczyszczonego produktu za pomocą NMR MS i analitycznej HPLC zgodnie z opisem w protokole tekstowym w celu syntezy fragmentu z osłonką końcową, ligowanych peptydów hamujących lub odwrócenia.
Zakończone związki peptyczne za pomocą standardowych metod syntezy w fazie stałej. Aktywuj pięć odpowiedników końcowego aminokwasu C w 4,4 ekwiwalentach HBTU w dwóch mililitrach DIMETYLOFORMAMIDU lub DMF przez pięć minut. Załadować mieszaninę na żywicę lodowiska przy użyciu sześciu odpowiedników diizopropyloetyloaminy przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Usuń grupę ochronną FM z pozostałości końcówki C za pomocą 20% INE w trzech mililitrach DMF przez 10 minut. Na każdym kroku łącz kolejne aminokwasy krok po kroku. Połącz pięć równoważników następnego aminokwasu, używając sześciu równoważników DI izopropylu, etyloaminy i 4,4 równoważników HBTU w dwóch mililitrach DMF przez jedną godzinę.
W temperaturze pokojowej stosować cykle prania po sprzężeniu aminokwasów i stopniach ochrony przed FM D po złożeniu peptydów. Para grup zamykających N przy użyciu sześciu równoważników DI izopropylu, etyloaminy i 4,4 równoważników HBTU w dwóch mililitrach DMF przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po zakończeniu składania peptydów. Potraktuj mieszaninę reakcyjną dwoma mililitrami mieszaniny rozszczepienia przez noc, aby usunąć grupy chroniące łańcuch boczny, a Cleve odwraca z żywicy trytryranian powstałego produktu zimnym eterem datylowym w celu wytrącenia i, jeśli to konieczne, skoncentrować w wyparce obrotowej, przefiltrować powstałe ciało stałe i wysuszyć w próżni lub liofilizować za pomocą liofilizatora.
W tym momencie przejdź do testu wiązania polaryzacji fluorescencyjnej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym w celu określenia wiązania konkurencyjnego. Pokazano modelową strukturę H-A-K-R-R-L-I-F połączonego z rowkiem wiążącym cyklon. Rowek rowerowy składa się z dwóch kieszeni hydrofobowych, większej kieszeni pierwotnej i mniejszej kieszeni wtórnej, które są mostkowane przez kwasowe pozostałości pokazane na czerwono.
Inne ważne oddziaływania obejmują kontakty wiązań wodorowych szkieletu peptydu i oddziaływania parowania jonów trzech podstawowych reszt peptydu, pokazano tutaj tryb wiązania trzech pięciu D-C-P-T-R-L-I-F, pokazany z oddziaływaniami wiązań wodorowych z atomami łańcucha bocznego tryptofanu dwa 17 i glutamina 2 54 zadokowane. Przedstawiono pozy trzech grup reprezentatywnych i zamykających, przy czym każdy z tych związków posiada wiązania wodorowe z oddziaływaniem atomów filtrujących tryptofanu dwa 17 i glutaminę 2, 54. Jak pokazano za pomocą zielonych przerywanych linii, koper włoski wchodzi w interakcje ściany Vandera z wtórną kieszenią hydrofobową.
Po obejrzeniu tego filmu będziesz lepiej wiedział, jak wykonać i zastosować strategię zastępowania, przekształcając znany inhibitor peptydów w cząsteczkę bardziej podobną do leku, która hamuje trakcję białka białkowego i jest punktem wyjścia do rozwoju terapeutycznego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje strategię REPLACE dotyczącą kierowania interakcji białko-białko, mającą na celu przekształcenie inhibitorów peptydowych w cząsteczki podobne do leków. Metodologia łączy podejścia syntetyczne i obliczeniowe w celu zwiększenia odkrywania leków.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Odkrywanie leków
- Interakcje białko-białko
- Chemia obliczeniowa
Tło
- Interakcje białko-białko są wyzwaniem dla odkrywania leków.
- Konwencjonalne metody, takie jak przesiewowe badania wysokoprędkowe, często nie powiodą się w tej dziedzinie.
- Inhibitory peptydowe mogą służyć jako punkty wyjścia do opracowywania małych cząsteczek terapeutycznych.
- Strategia REPLACE ma na celu poprawę właściwości przypominających leki tych inhibitorów.
Cel badania
- Generowanie skutecznych małych cząsteczek leków z inhibitorów peptydowych.
- Ustanowienie relacji struktura-aktywność dla interakcji peptyd-białko.
- Identyfikacja opłacalnych alternatyw fragmentów dla znanych determinantów peptydowych.
Stosowane metody
- Ustanowienie relacji struktura-aktywność.
- Chemia obliczeniowa do identyfikacji fragmentów.
- Synteza biblioteki hybryd peptydów fragmentów.
- Testy in vitro do sprawdzania właściwości przypominających leki syntetyzowanych cząsteczek.
Główne wyniki
- Za pomocą metodologii REPLACE zidentyfikowano więcej związków przypominających leki.
- Te związki reprezentują skuteczne punkty wyjścia do odkrywania leków.
- Podejście to pozwala na przezwyciężenie ograniczeń konwencjonalnych metod przesiewowych wysokoprędkowych.
Wnioski
- Strategia REPLACE zwiększa potencjał opracowywania inhibitorów interakcji białko-białko.
- Ta metoda zapewnia systematyczne podejście do odkrywania leków.
- Przyszłe badania mogą budować na tych odkryciach, aby dalece poprawić opcje terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The REPLACE strategy addresses a critical bottleneck in oncology drug discovery by enabling the conversion of peptide-based protein-protein interaction inhibitors into drug-like small molecules. This approach expands the targetable space for cyclin-dependent kinases (CDKs), which are frequently deregulated in cancer and represent high-value therapeutic targets. By improving the drug-like properties of peptide inhibitors targeting the cyclin binding groove, the method supports early-stage target validation and lead identification efforts in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating the cyclin binding groove as a druggable site for selective CDK inhibition.
- Operational Value: Provides a systematic workflow for structure-activity relationship mapping to identify key residues amenable to replacement with fragment-like moieties.
- Predictive Value: Generates starting compounds with improved drug-likeness that recapitulate peptide inhibitor activity, supporting preclinical de-risking of CDK2/cyclin A interactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces fragment peptide hybrid libraries suitable for in vitro fluorescence polarization binding assays to quantify competitive binding at the cyclin binding groove.
- Operational Value: Establishes a reproducible synthesis and purification protocol using standard organic chemistry techniques, enabling scalable generation of analogs.
- Assay Readiness: Delivers compounds with defined binding poses and interaction filters that can be used to establish robust, quantitative screening assays for downstream hit-to-lead campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports progression from biochemical inhibition to cellular context by yielding compounds that inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes, linking target engagement to phenotypic outcomes.
- Preclinical Alignment: Focuses on non-ATP competitive inhibition, offering a mechanistic avenue to avoid kinase domain selectivity challenges associated with ATP-competitive CDK inhibitors.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of binding mode conservation and interaction fingerprints, reducing uncertainty in target engagement prior to cellular efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
The REPLACE strategy fits within the early discovery continuum, bridging peptide-based target validation and small molecule lead generation for oncology targets like CDKs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein-protein interfaces by converting peptide inhibitors into synthetically tractable, drug-like molecules.
- Screening: Enables assay-ready compound libraries with measurable binding affinity and defined structure-activity relationships for hit identification.
- Analytics: Relies on docking scores, interaction filters, and visual complementarity assessments to prioritize compounds with favorable binding geometry and non-covalent interactions.
- Translational Research: Connects biochemical binding data to functional inhibition of CDK/cyclin complexes, supporting alignment with cell-based readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, iterative framework applicable to other protein-protein interactions beyond CDKs, promoting platform-like utilization across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling structure-guided optimization of protein-protein interaction inhibitors with defined binding modes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized computational docking, fragment library synthesis, and purification protocols.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in early-stage projects by reducing reliance on empirical screening for challenging targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of CDK inhibitors by providing early chemical matter with validated target engagement and improved drug-like properties.
Implementation Considerations
- Requires expertise in computational chemistry for docking protocol validation and pose analysis using energy minimization and scoring functions.
- Depends on access to standard synthetic organic chemistry infrastructure for peptide assembly, fragment ligation, and purification via flash chromatography.
- Necessitates cross-team alignment between modeling, synthesis, and assay teams to ensure consistency in fragment selection and hybrid library design.
- Involves adaptation considerations when applying the strategy to different protein-protein interfaces, particularly in defining interaction filters and capping group geometries.
- Practical limitations include the iterative nature of the approach, which may require multiple cycles of design, synthesis, and testing to achieve optimal drug-like properties.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Computational Identification of Potential Small Molecule Capping Groups
4:03
Synthesis of Potential N-capping Groups
6:25
Solid Phase Synthesis for the Generation of FLIPs
8:45
Results: Identification of More Drug-like Inhibitors of CDK2 through the Cyclin Groove
9:59
Conclusion
