Opracowanie inhibitorów oddziaływań białko-białko poprzez REPLACE: zastosowanie do projektowania i rozwoju konkurencyjnych inhibitorów CDK niebędących ATP

Ogólnym celem strategii jest wygenerowanie skutecznego małocząsteczkowego środka terapeutycznego podobnego do leku poprzez konwersję inhibitora peptydowego do interakcji białkowej z białkiem. Osiąga się to poprzez ustalenie zależności między strukturą a aktywnością dla pożądanej interakcji białka peptydowego, aby zrozumieć, które części można skutecznie zastąpić w drugim kroku. Chemia obliczeniowa jest wykorzystywana do identyfikacji realnych alternatyw fragmentów dla znanych determinantów peptydów, które można następnie wykorzystać do syntezy biblioteki hybryd peptydów fragmentowych.

Następnie między tymi fragmentami a skróconym peptydem syntetyzuje się bibliotekę hybryd w celu wygenerowania cząsteczek, które można przetestować w teście in vitro w celu zidentyfikowania cząsteczek bardziej podobnych do leku i które podsumowują aktywność natywnego peptydu. Wyniki pokazują, że za pomocą tej metodologii można zidentyfikować więcej związków podobnych do leków, które stanowią skuteczne punkty wyjścia do odkrywania leków w zakresie inhibitorów interakcji białkowo-białkowych. Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe, jest to, że trakcja białek jest niezwykle trudna z punktu widzenia odkrywania leków, a konwencjonalne metody nie działają dobrze.

Strategia wymiany obejmuje podejście iteracyjne krokowe i dlatego może trwać dłużej lub jest bardziej prawdopodobne, że będzie skuteczna w dłuższej perspektywie. Dzisiaj zademonstruję większość procedur sam z niewielką pomocą mojej współpracowniczki, dr Sandry Craig, która ustawi niektóre reakcje i procedury. Rozpocznij tę procedurę od walidacji protokołu dokowania, a następnie przygotowania miejsca wiązania receptora i ligandów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zadokować ligandy w rowku cykliny.

Najpierw wybierz rutynę dopasowania liganda z protokołu interakcji receptor ligand ustawionego w oprogramowaniu, użyj receptora i przygotowanych ligandów jako danych wejściowych dla tego protokołu. W przypadku tych przebiegów wybierz PLP one jako sieć energetyczną. Sieć energetyczna wykorzystywana przez program dokowania jest polem siłowym do generowania oddziaływań receptorów ligandów i potencjalnych pozycji.

Plp jeden to pokojowy potencjał liniowy, który w szczególności nadaje priorytet oddziaływaniom wiązań wodorowych. Określ, że upozy mają być zminimalizowane, a liczba wygenerowanych póz ma być równa 10. W pierwszej kolejności pozostaw wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi.

Wyświetl pozy w programie wizualizatora, a następnie posortuj według malejących wartości jednego wyniku PLP. Użyj funkcji oceniania, takich jak plp, aby oszacować powinowactwo wiązania zadokowanego liganda na podstawie pozycji kandydującego liganda, geometrii i interakcji niekowalencyjnej ze strukturą receptora docelowego. Przeanalizuj wizualnie górne 25% ocenionych póz pod kątem super niemożliwości ze znaną grupą cappingową.

Obserwuj również, czy pozycja spełnia filtry interakcji, które są ustawione tak, aby zawierały ograniczenia atomów, które wymagają kontaktów międzycząsteczkowych, o których wiadomo, że są krytyczne dla wiązania i/lub są wymagane do umieszczenia potencjalnej grupy zamykającej w odpowiedniej geometrii dla tworzenia wiązania amidowego. Na koniec zbadaj pozy pod kątem komplementarności wizualnej, która jest definiowana jako skuteczne wypełnienie kieszeni wiążącej w sposób zgodny ze znaną aktywnością struktury. Zależności do syntezy grup zamykających końcówki, użyj wszystkich komercyjnych materiałów wyjściowych, rozpuszczalników i odczynników oraz zsyntetyzuj za pomocą konwencjonalnej syntetycznej chemii organicznej.

Przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową lub TLC na żelu krzemionkowym w celu monitorowania reakcji, najpierw rozpuszczając materiał wyjściowy i mieszaninę reakcyjną w fazie ruchomej. Następnie umieść rozpuszczony materiał wyjściowy i mieszaninę reakcyjną na płytce TLC za pomocą kapilarnek rurkowych. Umieścić płytkę TLC w komorze zawierającej fazę ruchomą.

Gdy faza ruchoma osiągnie 90% płytki TLC, wyjmij ją i wysusz na powietrzu. Użyj światła UV, aby wykryć materiał wyjściowy i mieszaniny reakcyjne jako widoczne plamy. Następnie oblicz RF każdego punktu, który jest stosunkiem odległości przebytej przez plamkę do fazy ruchomej.

Następnie umieścić mieszaninę reakcyjną w rozdzielaczu i przemyć ją odpowiednio wodnym roztworem kwasu lub zasady. Zebrać rozpuszczalnik organiczny i odparować go w parowniku obrotowym przed suszeniem. Produkt surowy otrzymany w próżni rozpuścić 500 miligramów produktu surowego w trzech do pięciu mililitrach odpowiedniego rozpuszczalnika i dodać do próbki krzemionki lub RP 18 przed suszeniem pod powietrzem, umieścić próbkę zawierającą produkt surowy w krzemionce, wkładach zatrzaskowych z odwróconą fazą.

Oczyść surowy materiał za pomocą zautomatyzowanej wysokosprawnej chromatografii flash. Wykorzystuje kolumnę zatrzaskową o wadze 100 gramów z gradientem. Uruchamianie na 15 woluminach kolumn.

Oczyszczony produkt zebrany w rozpuszczalniku z chromatografii błyskawicznej wysuszyć za pomocą wyparki obrotowej, odparowując cały rozpuszczalnik do sucha. Następnie należy wysuszyć produkt w próżni, aby usunąć wszystkie pozostałości rozpuszczalników. Przeprowadzić charakterystykę oczyszczonego produktu za pomocą NMR MS i analitycznej HPLC zgodnie z opisem w protokole tekstowym w celu syntezy fragmentu z osłonką końcową, ligowanych peptydów hamujących lub odwrócenia.

Zakończone związki peptyczne za pomocą standardowych metod syntezy w fazie stałej. Aktywuj pięć odpowiedników końcowego aminokwasu C w 4,4 ekwiwalentach HBTU w dwóch mililitrach DIMETYLOFORMAMIDU lub DMF przez pięć minut. Załadować mieszaninę na żywicę lodowiska przy użyciu sześciu odpowiedników diizopropyloetyloaminy przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Usuń grupę ochronną FM z pozostałości końcówki C za pomocą 20% INE w trzech mililitrach DMF przez 10 minut. Na każdym kroku łącz kolejne aminokwasy krok po kroku. Połącz pięć równoważników następnego aminokwasu, używając sześciu równoważników DI izopropylu, etyloaminy i 4,4 równoważników HBTU w dwóch mililitrach DMF przez jedną godzinę.

W temperaturze pokojowej stosować cykle prania po sprzężeniu aminokwasów i stopniach ochrony przed FM D po złożeniu peptydów. Para grup zamykających N przy użyciu sześciu równoważników DI izopropylu, etyloaminy i 4,4 równoważników HBTU w dwóch mililitrach DMF przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po zakończeniu składania peptydów. Potraktuj mieszaninę reakcyjną dwoma mililitrami mieszaniny rozszczepienia przez noc, aby usunąć grupy chroniące łańcuch boczny, a Cleve odwraca z żywicy trytryranian powstałego produktu zimnym eterem datylowym w celu wytrącenia i, jeśli to konieczne, skoncentrować w wyparce obrotowej, przefiltrować powstałe ciało stałe i wysuszyć w próżni lub liofilizować za pomocą liofilizatora.

W tym momencie przejdź do testu wiązania polaryzacji fluorescencyjnej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym w celu określenia wiązania konkurencyjnego. Pokazano modelową strukturę H-A-K-R-R-L-I-F połączonego z rowkiem wiążącym cyklon. Rowek rowerowy składa się z dwóch kieszeni hydrofobowych, większej kieszeni pierwotnej i mniejszej kieszeni wtórnej, które są mostkowane przez kwasowe pozostałości pokazane na czerwono.

Inne ważne oddziaływania obejmują kontakty wiązań wodorowych szkieletu peptydu i oddziaływania parowania jonów trzech podstawowych reszt peptydu, pokazano tutaj tryb wiązania trzech pięciu D-C-P-T-R-L-I-F, pokazany z oddziaływaniami wiązań wodorowych z atomami łańcucha bocznego tryptofanu dwa 17 i glutamina 2 54 zadokowane. Przedstawiono pozy trzech grup reprezentatywnych i zamykających, przy czym każdy z tych związków posiada wiązania wodorowe z oddziaływaniem atomów filtrujących tryptofanu dwa 17 i glutaminę 2, 54. Jak pokazano za pomocą zielonych przerywanych linii, koper włoski wchodzi w interakcje ściany Vandera z wtórną kieszenią hydrofobową.

Po obejrzeniu tego filmu będziesz lepiej wiedział, jak wykonać i zastosować strategię zastępowania, przekształcając znany inhibitor peptydów w cząsteczkę bardziej podobną do leku, która hamuje trakcję białka białkowego i jest punktem wyjścia do rozwoju terapeutycznego.