Name: Synteza indoksylglikozydów do wykrywania aktywności glikozydazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj nową metodę syntezy indoksylglikozydów z wykorzystaniem estrów kwasu indoksylowego jako pośredników. Technika ta umożliwia uzyskanie wyższych wydajności w porównaniu do wcześniejszych podejść.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie tej pracy przez Glycom A/S, Kopenhaga, Dania, jest wdzięczne za podziękowania.

Uwagi ogólne:
Wszystkie reakcje zostały przeprowadzone przy użyciu dygestorium i odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej. Wszystkie odczynniki i rozpuszczalniki (cz.d.; zawartość wody dla suchych rozpuszczalników: MeCN <50 ppm; Et2O <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) zostały zakupione ze źródeł komercyjnych i wykorzystane w takim stanie, w jakim zostały otrzymane. TLC wykonano na płytkach z żelem krzemionkowym Merck 60 F254. Związki wykryto za pomocą promieniowania UV i/lub traktowania EtOH/H2SO4 (9:1), a następnie ogrzewania. Chromatografię kolumnową przeprowadzono z użyciem żelu krzemionkowego 60 (230-400 mesh) firmy Merck/Fluka. Filtracje przeprowadzono za pomocą lejka Büchnera i pompy aspiratora. Rozpuszczalniki usuwano za pomocą wyparki obrotowej (40 °C, ~200 rmp). Produkty suszono w wysokiej próżni (rotacyjna pompa łopatkowa). Reakcje wymagające suchych rozpuszczalników prowadzono w atmosferze argonu.
Poniżej opisano syntezę X-Gal (16) z użyciem estru allilowego kwasu 5-bromo-4-chloro-indoksylowego (12). Dla dalszych związków o różnych wzorcach podstawiania, a także estrów metylowych przygotowanych zgodnie z tą syntetyczną sekwencją, patrz ref.17-19.
1. Akceptor: Synteza estru allilowego18 kwasu 5-bromo-4-chloro-indoksylowego (12)
<ol>
	<li>N-acetylacja: synteza N-(4-bromo-3-chloro-2-metylofenylo)-acetamidu (6)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10,0 g (45,7 mmol) 4-bromo-3-chloro-2-metyloaniliny w 30 ml dichlorometanu. 
		Ostrożność! Dichlorometan jest szkodliwy i schładza roztwór w łaźni lodowej.</li>
		<li>Dodawać kroplami 6,50 ml (68,7 mmol) bezwodnika octowego i pozostawić mieszaninę do ogrzania do temperatury pokojowej. Mieszaninę można mieszać przez 8 godzin lub przez noc. Ostrożność! Bezwodnik octowy jest i łatwopalny.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik i dokonać rekrystalizacji z octanu etylu/metanolu w stosunku 9:1 (wydajność: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), bezbarwne ciało stałe). 
		Ostrożność! Octan etylu jest drażniący i łatwopalny. Ostrożność! Metanol jest toksyczny i łatwopalny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utlenianie: Synteza kwasu N-acetylo-5-bromo-6-chloro-antranilowego (7)
	<ol>
		<li>Refluks mieszaniny 2,30 g (8,76 mmol) 6 (produkt otrzymany z kroku 1.1) i 2,10 g (8,52 mmol) MgSO4•7H2O w 40 ml wody w kolbie okrągłodennej z 3 szyjkami wyposażonej w chłodnicę i wkraplacz.</li>
		<li>Dodawać kroplami 50 ml nasyconego roztworu KMnO4 w wodzie do mieszaniny reakcyjnej przez okres 3 godzin. Następnie podgrzewać przez dodatkowe 2 godziny w kąpieli olejowej w temperaturze ok. 135 °C. Ostrożność! Nadmanganian potasu jest szkodliwy i utleniający.</li>
		<li>Schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować piroluzyt (MnO2), który powstaje podczas reakcji. 
		Ostrożność! Piroluzyt jest szkodliwy.</li>
		<li>Dodać kwas solny (37%) do filtratu do pH 1, następnie przefiltrować produkt i wysuszyć w próżni (wydajność: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), bezbarwne ciało stałe). 
		Ostrożność! Kwas solny jest.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deacetylacja: synteza kwasu 5-bromo-6-chloro-antranilowego (8)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 3,90 g (13,3 mmol) 7 (produkt otrzymany z etapu 1.2) w 70 ml 1 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu i ogrzewać w temperaturze ok. 100 °C (kąpiel olejowa) przez 5 godz. 
		Ostrożność! Wodorotlenek sodu jest.</li>
		<li>Schłodzić do temperatury pokojowej i dodać kwas solny (37%) do pH 1, następnie przefiltrować produkt za pomocą lejka Büchnera i wysuszyć w próżni (wydajność: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), bezbarwne ciało stałe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie bezwodnika: Synteza bezwodnika 5-bromo-6-chloro-izatonowego (9)
	<ol>
		<li>Zawiesić 8,17 g (32,6 mmol) 8 (produkt otrzymany z kroku 1.3) w 33 ml suchego acetonitrylu. 
		Ostrożność! Acetonitryl jest szkodliwy i łatwopalny.</li>
		<li>Mieszać w temperaturze pokojowej i dodawać kroplami 5,3 ml i roztwór 3,22 g (10,8 mmol) trifosgenu w 18,5 ml suchego dichlorometanu przez 30 minut. Następnie podgrzewać przez 3 godziny w temperaturze 50 °C (kąpiel olejowa). Ostrożność! Pirydyna jest szkodliwa i łatwopalna. 
		Ostrożność! Trifosgen jest toksyczny i może uwalniać fosgen.</li>
		<li>Usuń około 75% rozpuszczalnika i wygasz reakcję, dodając 100 ml wody destylowanej i przefiltruj produkt. Umyć niewielką ilością zimnego dichlorometanu.</li>
		<li>Wysuszyć produkt w próżni (wydajność: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), bezbarwne ciało stałe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-alkilowanie: Synteza bezwodnika 5-bromo-6-chloro-N-[(metoksykarbonylo)allilo]-izatonowego (10)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 25 g (90 mmol) 9 (produkt otrzymany z kroku 1.4) w 250 ml bezwodnego dimetyloformamidu i schłodzić w łaźni lodowej><.
		Ostrożność! Dimetyloformamid jest szkodliwy i łatwopalny</li>
		<li>Dodać 1,15 ekwiwalentu wodorku sodu (60% w parafinie) porcjami. 
		Ostrożność! Wodorek sodu jest i łatwopalny; Ciężka reakcja z wodą/lodem.</li>
		<li>Po 30 minutach mieszania w temperaturze 0 °C rozgrzać do temperatury pokojowej i dodawać kroplami 1,2 równoważnika bromooctanu allilu.</li>
		<li>Po mieszaniu przez 5 godzin wygasić reakcję, dodając 500 ml wody destylowanej i przefiltrować produkt.</li>
		<li>Umyć wodą (3 razy po 100 ml) i wysuszyć produkt w próżni (wydajność: 93% (31,5 g, 84,1 mmol), bezbarwne ciało stałe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwarcie bezwodnika: Synteza estru allilowego kwasu 5-bromo-6-chloro-N-(metoksykarbonylilo)-antranilowego (11)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10 g (27 mmol) z 10 (produkt otrzymany z kroku 1.5) w 100 ml alkoholu allilowego. 
		Ostrożność! Alkohol allilowy jest szkodliwy i niebezpieczny dla środowiska.</li>
		<li>Dodaj porcjami 350 mg (8,70 mmol) wodorku sodu (60% w parafinie).</li>
		<li>Po mieszaniu przez 6,5 godziny lub przez noc usuń rozpuszczalnik.</li>
		<li>Poddać surowy produkt chromatografii kolumnowej (kolumna 30 x 6 cm; 240 g krzemionki) eter naftowy/octan etylu w stosunku 2:1; RF = 0,66), (wydajność: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), olej żółty). 
		Ostrożność! Eter naftowy jest łatwopalny, drażniący i niebezpieczny dla środowiska.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kondensacja Dieckmanna: Synteza estru allilowego kwasu 5-bromo-4-chloro-indoksylowego (12)
	<ol>
		<li>Zmieszać 3,0 g (7,7 mmol) 11 (produkt otrzymany z kroku 1.6) i 1,75 g (15,6 mmol) tert-butotlenku potasu w 100 ml suchego eteru dietylowego 
		Ostrożność! Tert-butotlenek potasu jest i łatwopalny. 
		Ostrożność! Eter dietylowy jest szkodliwy i skrajnie łatwopalny.</li>
		<li>Podgrzewać mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny w temperaturze 40-45 °C.</li>
		<li>Usunąć około 75% rozpuszczalnika i dodać rozcieńczony kwas solny (100 ml, 1 M). 
		Ostrożność! Nie suszyć całkowicie, może dojść do rozkładu.</li>
		<li>Przefiltrować produkt i wysuszyć w próżni (wydajność: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), bezbarwne do lekko zielonego ciała stałego).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Glikozyd indoksylowy: Synteza X-Gal17
<ol>
	<li>Glikozylacja z przeniesieniem fazowym: Synteza (estru allilowego kwasu 5-bromo-4-chloro-indoks-3-yrylowego) 2,3,4,6-tetra-O-acetylo-β-ᴅ-galaktopiranozydu (14)
	<ol>
		<li>Zmieszać 400 mg (1,21 mmol) kwasu indoksylowego allilesteru 12 (produkt otrzymany z kroku 1.7), 410 mg (1,21 mmol) wodorosiarczanu tetrabutyloamonu i 500 mg (1,21 mmol) donora bromku 2,3,4,6-tetra-O-acetylo-α-ᴅ-galaktopiranozylu (α-acetobromogalaktozy) w 10 ml dichlorometanu. Ostrożność! Wodorosiarczan tetrabutyloamoniowy jest szkodliwy.</li>
		<li>Dodać 10 ml wodnego roztworu węglanu potasu (1 M). 
		Ostrożność! Węglan potasu jest.</li>
		<li>Mieszać w temperaturze pokojowej aż do całkowitego spożycia donora (TLC: eter naftowy/octan etylu).</li>
		<li>Oddzielić fazę organiczną (rozdzielacz separacyjny), wysuszyć naNa 2SO4 i usunąć rozpuszczalnik.</li>
		<li>Poddać surowy produkt chromatografii kolumnowej (eter naftowy/octan etylu 1:1; RF = 0,33). (Wydajność: 86% (690 mg, 1,04 mmol), bezbarwne ciało stałe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozszczepienie estrów i dekarboksylacja: synteza (N-acetylo-5-bromo-4-chloro-indol-3-ylo) 2,3,4,6-tetra-O-acetylo-β-ᴅ-galaktopiranozydu (15)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 600 mg (0,908 mmol) 14 (produkt otrzymany z kroku 2.1) w 15 ml suchego tetrahydrofuranu. 
		Ostrożność! Tetrahydrofuran jest szkodliwy i łatwopalny.</li>
		<li>Dodać 800 μl morfoliny i 105 mg (9,09 μmol) tetrakis(trifenylofosfiny)palladu(0) i mieszać przez noc w temperaturze pokojowej. 
		Uwaga! Morfolina jest łatwopalna i.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik.</li>
		<li>Dodać 400 mg (2,40 mmol) octanu srebra, 800 mg (5,79 mmol) węglanu potasu i 10 ml bezwodnika octowego. 
		Ostrożność! Octan srebra jest drażniący i niebezpieczny dla środowiska.</li>
		<li>Podgrzewać w temperaturze 90-100 °C przez 20 min.</li>
		<li>Po schłodzeniu do temperatury pokojowej rozcieńczyć dichlorometanem.</li>
		<li>Przemyć mieszaninę dwukrotnie wodą i raz rozcieńczonym roztworem NaHCO3 (10%). 
		Ostrożność! Wodorowęglan sodu jest.</li>
		<li>Wysuszyć fazę organiczną na Na2SO4 (filtr) i usunąć rozpuszczalnik.</li>
		<li>Poddać surowy produkt chromatografii kolumnowej (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (wydajność: 88% (495 mg, 8,00 mmol), bezbarwne ciało stałe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deacetylacja Zemplén: Synteza (5-bromo-4-chloro-indol-3-ylo)-β-ᴅ-galaktopyranozydu (16)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 396 mg (0,436 mmol) 15 (produkt otrzymany z kroku 2.2) w 10 ml metanolu.</li>
		<li>Dodać katalityczną ilość metanolanu sodu i mieszać przez noc w temperaturze pokojowej. 
		Ostrożność! Metanolan sodu jest łatwopalny i.</li>
		<li>Zneutralizować za pomocą Amberlite IR-120 H+ (filtr) i zagęścić. 
		Ostrożność! Amberlite IR-120 H+ działa drażniąco.</li>
		<li>Wysuszyć produkt w próżni (wydajność: 87% (170 mg, 0,416 mmol), bezbarwne ciało stałe).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ilustrowanie eksperymentu modelowego: Dowód aktywności β-galaktozydazy z użyciem X-Gal
<ol>
	<li>Przygotować 0,5 mM roztwór X-Gal w 500 μl buforu (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; 50 mM NaCl, 0,1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy; lub innym odpowiednim buforem dla twojego enzymu) w probówce do mikrowirówki (X-Gal można rozpuścić w kilku μl dimetylosulfotlenku).</li>
	<li>Dodać 1 μl β,1-3-galaktozydazy (EC 3.2.1.23 10 000 j./ml; lub innej odpowiedniej β-galaktozydazy) i wstrząsnąć (600 obr./s) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Śledź reakcję. Barwnik typu indygo powstaje po krótkim czasie.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigo%2C+Woad%2C+and+Tyrian+Purple%3A+Important+Vat+Dyes+from+Antique+to+the+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present.</a> Endeavour. 17, 191-199 (1993).</li>
<li>Hunger, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunger%2C+K+%22Industrial+Dyes%3A+Chemistry%2C+Properties%2C+Applications%22">Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications</a>. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigogenic+Substrates+for+Detection+and+Localization+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechn.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes.</a> Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).</li>
<li>Barnett, R. J., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Esterases+by+Production+of+Indigo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo.</a> Science. 114, 579-582 (1951).</li>
<li>Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Mammalian+Glucosidase+by+Means+of+3-%285-Bromoindolyl%29-%CE%B2-%E1%B4%85-glucopyranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside.</a> Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).</li>
<li>Anderson, F. B., Leaback, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+the+Histochemical+Localization+of+some+Glycosidases%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases.</a> Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).</li>
<li>Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosynthesis+and+Evaluation+of+5-%5B125I%5DIodoindolyl-3-yl-%CE%B2-%E1%B4%85-galactopyranoside+%28%5B125I%5DIBDG%29+as+a+%CE%B2-Galactosidase+Imaging+Radioligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand.</a> Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).</li>
<li>Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Halogen+Substituted+%CE%B2-%E1%B4%85-Glucuronides+and+Their+Hydrolysis+by+Rabbit+Liver+%CE%B2-Glucoronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase.</a> Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).</li>
<li>Horwitz, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstartion+of+Enzyme+Activity+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Eschenfelder, V., Brossmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromo-indol-3-yl+5-Acetamido-3%2C5-dideoxy-%CE%B1-%E1%B4%85-glycero-%E1%B4%85-galactononulopyranosidic+Acid%2C+a+Novel+Chromogenic+Substrate+for+the+Staining+of+Sialidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity.</a> Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).</li>
<li>Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Neu5Ac%3A+A+Novel+Substrate+for+Chromogenic+Assay+of+Neuraminidase+Activity+in+Bacterial+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems.</a> Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).</li>
<li>Berlin, W., Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Color+Detection+of+%CE%B1-%CA%9F-Arabinofuranisodase%2C+a+%26%2334%3BNo-Background%26%2334%3B+Reporter+Gene%2C+with+5-Bromo-3-indolyl-%CE%B1-%CA%9F-arabinofuranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a &#34;No-Background&#34; Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside.</a> Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).</li>
<li>Marmuse, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Chromogenic+Substrates+for+Feruloyl+Esterases%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).</li>
<li>Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+4-Methylumbelliferyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+and+5-Bromo-3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+for+Sensitive+Detection+of+Xylanase+Activity+on+Agar+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).</li>
<li>Robertson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Glucosides.+Part+I.+The+Synthesis+of+Indican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican.</a> Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).</li>
<li>Robertson, A., Waters, R. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthese+of+Glucosides.+Part+VII.+The+Synthesis+of+6-Bromoindican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican.</a> Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoxylic+Acid+Esters+as+Convenient+Intermediates+Towards+Indoxyl+Glycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides.</a> Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).</li>
<li>Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Efficient+Routes+to+Indoxyl+Glycosides+for+Monitoring+Glycosidase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities.</a> Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+Preparation+of+Indoxyl-+and+Nitrophenyl+Glycosides+of+Lactosamine+and+Isolactosamine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine.</a> RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ze względu na niską wydajność i ograniczenia, zwłaszcza w przypadku struktur typu glukozy i bardziej złożonych sacharydów, opracowano nowatorskie podejście do syntezy glikozydów indoksylowych. Estry kwasów indoksylowych okazały się cennymi kluczowymi produktami pośrednimi i uzyskano je w modularnej, skalowalnej ścieżce. Wszystkie etapy są wysokowydajne, a dzięki tanim materiałom wyjściowym i łatwej obróbce możliwe są syntezy wielogramowe. Zaletą podejścia opartego na estrze allilowym jest zablokowanie reaktywnej 2-pozycy...

Przez długi czas produkcja indygo była procesem o dużym znaczeniu gospodarczym. Zanim wielkoskalowe syntezy chemiczne zapewniły tani dostęp do indygo, prekursory pozyskiwano ze źródeł naturalnych już od czasów przedchrześcijańskich. Uprawa roślin dostarczających indygo (naturalnego indygo) w Europie stała się nieopłacalna w XVIIth wieku, ponieważ zawartość prekursorów indygo w indygowiec indyjskim (0,2-0,8 %) jest około 30 razy wyższa. Pod koniec XIX wieku synteza chemiczna indygo wyparła tradycyjną uprawę1,2.
Naturalnie występujące w roślinach prekursory indygo obejmują indykan (1), Isatan A (2) i Isatan B (3) (Rysunek 1). Wszystkie one składają się z motywu indoksylu połączonego z resztą glikozylową. Rozszczepienie wiązania glikozydowego, na przykład poprzez hydrolizę enzymatyczną, prowadzi do uwolnienia indoksylu (4). Sam indoksyl jest prawie bezbarwny, ale może zostać szybko utleniony do barwnika indygo (5). Ta czuła reakcja została zaadaptowana w biochemii, histochemii, bakteriologii i biologii molekularnej do monitorowania aktywności enzymów. Możliwe jest przesiewowe badanie aktywności in vivo bez izolacji lub oczyszczania enzymów, a także szybkie testy na płytkach agarowych lub w roztworze (np. selekcja niebiesko-biała, mikrostudzienki). W zależności od reszty (np. estrów, glikozydów, siarczanów) połączonej z częścią indoksylu, opracowano odpowiednie substraty dla różnych klas enzymów (np. esteraz, glikozydaz, sulfataz)3. W dalszej części skupiono się na tworzeniu i zastosowaniu glikozydów indoksylu.
<img alt="Schemat procesu hydrolizy indykanu przedstawiający pochodne indolu i powstawanie barwnika indygo." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Naturalne prekursory indygo i powstawanie barwnika indygo w drodze hydrolizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wzór podstawienia grupy indoksylowej determinuje kolor i właściwości fizyczne otrzymanego barwnika indygowego. Najczęstszymi wzorami podstawienia są 5-bromo-4-chloro (oznaczany jako X; zielono-niebieski), 5-bromo (niebieski) oraz 5-bromo-6-chloro (magenta), ponieważ tworzą one najmniejsze cząsteczki barwnika, nie tworzą granul i wykazują najmniejszą dyfuzję z miejsc hydrolizy. Ta ostatnia właściwość jest szczególnie istotna w eksperymentach in vivo3.
Pierwszy raport dotyczący indigogennej metody wykrywania aktywności esterazy został opublikowany w 1951 roku przez Barrnetta i Seligmana, którzy wykorzystali octan oraz maślan indoksylu4. Około dekadę później zasadę indigogenną zaadaptowano do lokalizacji glukozydazy ssaków5. Do tej pory opracowano kilka glikozydów indoksylu, mimo że ich synteza okazała się trudna. Większość syntez opiera się na zastosowaniu N-acetylowanego indoksylu jako akceptora i odpowiedniego halogenku glikozylowego jako donora6-14. Glikozylację przeprowadza się w acetonie z wodorotlenkiem sodu. W tych warunkach zachodzi szereg reakcji ubocznych, co znacząco obniża wydajność. Szczególnie dla struktur typu glukozowego zgłaszano bardzo niskie wydajności glikozylacji (np. 15% dla (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glukopiranozydu6 oraz 26% dla (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-ksylobiosydu14 w nowszym przykładzie). Dzięki nowatorskiemu podejściu, z wykorzystaniem estrów kwasu indoksylowego, przygotowano znaczną liczbę glikozydów indoksylu z dobrymi wydajnościami (np. (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glukopiranozyd z wydajnością 57%).
Poniższy protokół opisuje prostą syntezę allylowego estru kwasu indoksylowego (5-bromo-4-chloro) oraz opartą na niej syntezę glikozydy indoksylowej (X-Gal). Prosty eksperyment modelowy demonstruje reaktywność enzymatyczną β-galaktozydazy z wykorzystaniem X-Gal.

<table><tbody><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10298</td><td>, łatwopalny</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>Szkodliwy, łatwopalny</td></tr><tr><td>alkohol allilowy</td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Szkodliwy, niebezpieczny dla środowiska</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>kwas bromooctowy</td><td>Merck</td><td>802260</td><td>, toksyczny, niebezpieczny dla środowiska</td></tr><tr><td>4-Bromo-3-chloro-2-metylanilina</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>ACROS</td><td>326850010</td><td>Szkodliwy</td></tr><tr><td>eter dietylowy</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10274</td><td>Szkodliwy, skrajnie łatwopalny</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>ACROS</td><td>348430010</td><td>Szkodliwy, łatwopalny</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Drażniący, łatwopalny</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Substancja drażniąca</td></tr><tr><td>&beta; 1,3-galaktozydaza, rekombinowana, E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>hydrat siarczanu magnezu</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Toksyczny, łatwopalny</td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>, łatwopalne</td></tr><tr><td>Eter naftowy</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>Łatwopalny, drażniący, niebezpieczny dla środowiska</td></tr><tr><td>Węglan potasu</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12005</td><td></td></tr><tr><td>nadmanganian potasu</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12056</td><td>Szkodliwy, utleniający</td></tr><tr><td>Tert-butatlenek potasu</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>, łatwopalny</td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>Szkodliwy, łatwopalny</td></tr><tr><td>Octan srebra</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Drażniący, niebezpieczny dla środowiska</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12144</td><td></td></tr><tr><td>wodorek sodu</td><td>Merck</td><td>814552</td><td>, łatwopalny</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Riedel-de H&auml; en</td><td>S181200</td><td></td></tr><tr><td>metanolan sodu</td><td>Merck</td><td>806538</td><td>, łatwopalny</td></tr><tr><td>siarczan sodu</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Wodorosiarczan tetrabutyloamonu</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td>Szkodliwy</td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>Szkodliwy, łatwopalny</td></tr><tr><td>Tetrakis (trifenylofosfina)pallad(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Trifosgen</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>tris (hydroksymetylo)aminometan chlorowodorek</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Drażniący</td></tr></tbody></table>

synteza indoksylglikozydów do wykrywania aktywności glikozydazy

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Glikozydy indoksylowe okazały się cennymi i wszechstronnymi narzędziami do monitorowania aktywności glikozydazy. Indoksyle są uwalniane w procesie hydrolizy enzymatycznej i są szybko utleniane, na przykład przez tlen atmosferyczny, do barwników typu indygo. Reakcja ta umożliwia szybkie i łatwe badania przesiewowe in vivo bez izolacji lub oczyszczania enzymów, a także szybkie testy na płytkach agarowych lub w roztworze (np. przesiewanie niebiesko-białe, mikrodołki) i jest stosowana w biochemii, histochemii, bakteriologii i biologii molekularnej. Niestety, synteza takich substratów okazała się trudna, ze względu na różne reakcje uboczne i niską reaktywność indoksylowej funkcji hydroksylowej. Szczególnie w przypadku struktur typu glukoza zaobserwowano niskie plony. Nasze nowatorskie podejście wykorzystuje ester kwasu indoksylowego jako kluczowe produkty pośrednie. Estry kwasów indoksylowych o zróżnicowanych wzorcach substytucji przygotowano na skalowalnych ścieżkach. Glikozylacje z przeniesieniem fazowym z tymi akceptorami i peracetylowanymi halogenkami glikozylu można przeprowadzać w typowych warunkach z wysoką wydajnością. Rozszczepienie estrów, a następnie łagodna glikozylacja za pośrednictwem srebra daje peracetylowane glikozydy indoksylowe z wysoką wydajnością. Wreszcie deprotekcja jest wykonywana według Zempléna.

Pierwsze syntezy indicanu oraz 5-bromo-indikanu zostały opublikowane przez Robertsona już w 1927 i 1929 roku15,16. Dzięki zastosowaniu estru metylowego kwasu indoksylowego jako akceptora, zablokowano reaktywną pozycję 2, co częściowo ograniczyło reakcje uboczne. Glikozylacja w acetonie/wodorotlenku sodu, po deprectyzacji i dekarboksylacji (160 °C, bezwodnik octowy, 1 godz.) oraz końcowej deacylacji, doprowadziła do otrzymania indicanu i 5-bromo-indikanu. W oparciu o tę koncepcję opracowaliśmy udoskonaloną synt...

Glikozydy indoksylowe są dobrze znanymi i szeroko stosowanymi narzędziami do badań przesiewowych enzymów i monitorowania aktywności enzymów. Zwłaszcza w przypadku struktur typu glukozy poprzednie syntezy okazały się trudne i mało wydajne. Nasze nowatorskie podejście wykorzystuje estry kwasów indoksylowych jako cenne produkty pośrednie, aby uzyskać znaczną liczbę glikozydów indoksylowych z dobrą wydajnością.

Synteza indoksylglikozydów do wykrywania aktywności glikozydazy

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie nowatorskiego podejścia syntetycznego do endoglikozydów, w tym tych o złożonych strukturach węglowodanowych, przy zachowaniu wysokich wydajności. Zostaje to osiągnięte poprzez syntezę akceptora allo-estru kwasu inicowego, rozpoczynając od metylenu. Drugim krokiem jest glikozylacja tego akceptora za pomocą acetylowanego donora glikozylohalogenku.Następnie ester allelowy jest rozszczepiany przez katalizator palladowy, a następnie stosuje się dekarboksylację w obecności srebra, aby otrzymać acylowany glikozyd inox. Ostatnim etapem jest deacetylacja za pomocą zeplanu w celu otrzymania niechronionego glikozydu inox. Ostatecznie przygotowany substrat chromogenny jest wykorzystywany do jakościowego testu aktywności enzymatycznej.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest fakt, że glikozydy o złożonych i labilnych strukturach węglowodanowych mogą być wytwarzane w łatwy sposób. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas lektury publikacji Alexandra Robertsona z 1927 roku, który opracował pierwszą syntezę kwasu inicowego metyloetylowego. Późniejsze metody wykorzystywały akceptory occi inox cell ze względu na lepszą dostępność, lecz obarczone były niską wydajnością i problemami z oczyszczaniem. Aby rozpocząć syntezę, należy przygotować halogenowany lene, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie w trójszyjnej kolbie okrągłodennej pod chłodnicą zwrotną ogrzewać 2,3 g otrzymanego halogenowanego metyloacetamidu w 40 ml wody z 2,1 g siedmiowodnego siarczanu magnezu przez trzy godziny. Kroplami dodać 50 ml nasyconego wodnego roztworu nadmanganianu potasu, a następnie ogrzewać mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez kolejne dwie godziny w temperaturze około 135 °C w łaźni olejowej. Schłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej, a następnie przefiltrować w celu usunięcia produktu ubocznego w postaci pirocytytu; pH roztworu dostosować do wartości 1 za pomocą 37% kwasu solnego.Następnie produkt należy odfiltrować od rozpuszczalnika i wysuszyć w próżni. Po wysuszeniu produktu deci, izoluje się go zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie 8,17 g otrzymanego produktu deci zawiesza się w 33 ml suchego acetonydtrialu przez 30 minut, dodając jednocześnie kroplami 5,3 ml pirydyny oraz roztwór 3,22 g trystyny w 18,5 ml suchego dichlorometanu do roztworu. Następnie reakcję ogrzewa się do 50 °C w łaźni olejowej.Po trzech godzinach odparować około 75% rozpuszczalnika i dodać 100 mililitrów wody destylowanej, aby zatrzymać reakcję. Produkt przefiltrować, a następnie przemyć filtr od pięciu do 10 mililitrów zimnego chlorometanu. Po przemyciu produkt wysuszyć w próżni, przeprowadzić alkilację tego produktu pośredniego, a następnie otworzyć otrzymany bezwodnik zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Wyizoluj otrzymany produkt za pomocą chromatografii kolumnowej. Rozpocznij kondensację Dickmana, mieszając trzy gramy produktu z 1,75 grama tlenku potasu w 100 mililitrach suchego eteru dathylu w mieszaninie refluxowej przez dwie godziny w temperaturze od 40 do 45 °C. Następnie odparuj w próżni około 75% rozpuszczalnika i wytrąc produkt za pomocą 100 mililitrów jednomolowego kwasu solnego.Przefiltruj produkt, a następnie wysusz go w próżni. Aby rozpocząć syntezę XG, zmieszaj 400 miligramów estrów allilowych kwasu indoklicowego z 410 miligramami TBAs oraz 500 miligramami alfa-xto-bromogalaktozy w 10 mililitrach chlorometanu. Następnie do reakcji dodaj 10 mililitrów jednomolarnego wodnego roztworu węglanu potasu.Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez około trzy godziny, monitorując zużycie alpha-acetobromo-galaktozy za pomocą chromatografii cienkowarstwowej w roztworze eteru petroleum i octanu etylu w stosunku jeden do jednego. Po całkowitym zużyciu alpha-acetobromo-galaktozy, oddzielić fazę organiczną roztworu za pomocą rozdzielacza. Następnie osuszyć fazę organiczną nad siarczanem sodu w celu usunięcia pozostałej wody, a potem oczyścić produkt za pomocą chromatografii kolumnowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odszczepić ester allo, rozpuścić 600 mg produktu galaktopurynowego w 15 ml suchego tetrahydrofuranu.Usuń rozpuszczalnik za pomocą próżni. Do produktu dodaj 400 mg octanu srebra, 800 mg węglanu potasu oraz 10 mL bezwodnika octowego, a następnie ogrzewaj mieszaninę reakcyjną do temperatury około 95 °C przez 20 minut. Pozostaw reakcję do ochłonięcia do temperatury pokojowej, a następnie rozcieńcz ją 50 mL dichlorometanu. W celu opracowania produktu, przemyj mieszaninę dwukrotnie wodą i raz 10% roztworem wodorowęglanu sodu.Osusz fazę organiczną nad siarczanem sodu, a następnie zagęść roztwór. W celu oczyszczenia otrzymanego acylowanego łańcucha bocznego galaktopurynowego zastosuj chromatografię kolumnową. Następnie rozpuść 396 mg oczyszczonego materiału w 10 ml metanolu.Dodać niewielką ilość metylanu sodu (wielkości czubka szpatułki), a następnie mieszać mieszaninę reakcyjną przez noc. Użyć żywicy jonowymiennej kationowej w celu zneutralizowania reakcji, a następnie zagęścić roztwór w próżni. Na koniec wysuszyć produkt w próżni, aby otrzymać xal i sprawdzić poprawność zastosowanej drogi syntezy.Najpierw rozpuść xal w kilku mikrolitrach dimetylosulfotlenku. Następnie przygotuj 0,5 milimolarny roztwór stokowy xal w odpowiednim buforze. Kolejno dodaj jeden mikrolitr beta galacto i wstrząsaj mieszaninę z prędkością 600 obrotów na sekundę.W temperaturze 37 °C wizualnie monitoruj reakcję pod kątem powstania intensywnego barwnika indygo. Powstanie niebieskiego barwnika w roztworze jednoznacznie wskazuje na aktywność enzymatyczną w doxylu. Glikozydy są istotne dla monitorowania aktywności enzymów glikozylowych, jednak ich synteza jest trudna.Przedstawione tutaj podejście syntetyczne pozwala na otrzymanie końcowego produktu w postaci endo galakto puryny z całkowitą wydajnością 66%. Stanowi to znaczną poprawę w stosunku do poprzedniej metodologii, w której wydajność wynosiła jedynie 28%. Otrzymane glikozydy doksylowe mogą być wykorzystane do badania aktywności czystych lub nieczystych roztworów enzymów.W tym przykładzie kolor indygo zaobserwowano wyłącznie w dołkach zawierających beta galakto, a został on wywołany przy użyciu XG w stężeniu wynoszącym zaledwie 0,1 millimolar. Po otrzymaniu akceptora indoc cell, ta syntetyczna droga otrzymywania glikozydów indoc cell może zostać zrealizowana w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat syntezy i wykorzystania glikozydów inial. Ta droga syntezy pozwala na otrzymanie tych związków z dobrą wydajnością, pomimo ich złożonej struktury.

synthesis-indoxyl-glycosides-for-detection-glycosidase

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Synteza glikozydów indoksylowych w celu wykrycia aktywności glikozydaz

Użycie specyficznych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE, jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanowych w próbkach białek i stanowi dobry wybór do wstępnych badań z zakresu glikobiologii. Zmiany występujące po deglikozylacji można wykryć jako przesunięcia w mobilności w żelu lub poprzez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Ten film opisuje test spektrofotometryczny do szacowania aktywności syntazy glikogenu. Metoda polega na zmniejszaniu się absorbancji NADH w czasie i wskazuje na aktywność syntazy glikogenu.

Test spektrofotometryczny w celu określenia aktywności syntazy glikogenu

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Immunoglobulina G (IgG) N-glikan jest scharakteryzowany za pomocą hydrofilowej chromatografii oddziaływań UPLC. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do tej metody eksperymentalnej, tak aby mogła być szeroko stosowana w warunkach badawczych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda oznaczania aktywności glikozylazy uracylo-DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF do bezpośredniej analizy produktu zawierającego miejsce apurinowe/apirymidynowe. Test okazał się dość prosty, specyficzny, szybki i łatwy w użyciu do pomiaru glikozylazy DNA.

Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera to spektrofotometryczna technika enzymatyczna używana głównie do testów klinicznych, które dokładnie i czule mierzą ilość glukozy. W niniejszym artykule przedstawiono protokół stosowania tej metody do próbek mikrobiologicznych.

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

To badanie ustanawia zestaw standardowych procedur operacyjnych (SOP) do skutecznego badania przesiewowego i izolowania bakterii jelitowych zdolnych do rozszczepiania C-glikozydów.

Badania przesiewowe i izolacja bakterii jelitowych rozszczepiających glikozydy C

Ostatnie badania podkreślają rolę enzymów mikroflory jelitowej człowieka w metabolizowaniu glikozydów C. W tym miejscu przedstawiamy kompleksową metodologię integrującą techniki chemii analitycznej (LC-MS/MS i NMR) z podejściami biologii strukturalnej w celu systematycznego charakteryzowania strukturalnych i enzymatycznych łańcuchów reakcji tych enzymów metabolizujących glikozydy C.

Podejścia biologii strukturalnej i chemii analitycznej do charakteryzowania enzymów metabolicznych glikozydu C w mikrobiocie jelitowej człowieka

Protokół ten opisuje metodę kolorymetryczną umożliwiającą wiarygodną ocenę wpływu chemikaliów na aktywność dejodynazy 1 (DIO1) w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandell-Kolthoffa. Zawiera ona z góry określone kryteria akceptacji oraz statystyczne wskaźniki wydajności oraz wspiera dalsze działania na rzecz włączenia wytycznych testowych OECD.

Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa

Poznaj nową metodę syntezy indoksylglikozydów z wykorzystaniem estrów kwasu indoksylowego jako pośredników. Technika ta umożliwia uzyskanie wyższych wydajności w porównaniu do wcześniejszych podejść.

Synteza indoksylglikozydów do wykrywania aktywności glikozydazy

Przeglądaj więcej filmów