Name: Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę indukcji glejaków z określonymi mutacjami genetycznymi u noworodków myszy poprzez wstrzyknięcie do komory bocznej. Technika ta umożliwia badanie biologii nowotworów i testowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Johnowi Ohlfestowi i Dr. Stacey Decker13 za hojny dar plazmidów i za szkolenie dostarczone w celu opanowania tej metody. Dziękujemy Marcie Dzaman za pomoc w standaryzacji procedury barwienia Hematoksyliną-Eozyną skrawków zatopionych w parafinie. Dziękujemy również Molly Dahlgren za zapoznanie się z tym manuskryptem i dostarczenie pomocnych sugestii. Praca ta jest wspierana przez granty NIH/NINDS dla MGC i PRL, dotację Leah's Happy Hearts Foundation dla MCG i PRL. Nagroda dla młodego badacza Alex's Lemonade Foundation oraz stypendium St. Baldrick's Foundation dla CK.

<ol><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet.</a> Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).</li>
<li>Dai, C., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Glioma models.</a> Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).</li>
<li>Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+tumor+xenografts+in+nude+mice+as+a+chemotherapy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model.</a> Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice%3A+new+tools+to+tackle+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li>
<li>Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomeruloid+vascular+structures+in+glioblastoma+multiforme%3A+an+immunohistochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study.</a> J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Adult+Gliomas+Using+RCAS%2Ft-va+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology.</a> Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).</li>
<li>Friedmann-Morvinski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+of+neurons+and+astrocytes+by+oncogenes+can+induce+gliomas+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice.</a> Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).</li>
<li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-Induced+High-Grade+Gliomas+in+Rats%3A+The+Effects+of+PDGFB%2C+HRAS-G12V%2C+AKT%2C+and+IDH1-R132H%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutic%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).</li>
<li>Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+brain+tumors+in+mice+using+a+recombinant+platelet-derived+growth+factor+B-chain+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus.</a> Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).</li>
<li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).</li>
<li>Bailey, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+the+Percival+Bailey-Cushing+classification+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas.</a> Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).</li>
<li>Patel, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+highlights+intratumoral+heterogeneity+in+primary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma.</a> Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).</li>
<li>Agnihotri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%2C+a+brief+review+of+history%2C+molecular+genetics%2C+animal+models+and+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li>
<li>Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+domains+and+evolution+of+Tc1-like+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91 (4), 501-510 (1997).</li>
<li>Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposon-mediated+gene+therapy+for+prolonged+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.</a> Adv Genet. 54, 189-232 (2005).</li>
<li>Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon toolbox.</a> Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).</li>
<li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+blockade+suppresses+gliomagenesis+by+inhibiting+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).</li>
<li>Geurts, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+genomes+of+human+cells+by+the+sleeping+beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+Of+The+American+Society+Of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system.</a> Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).</li>
<li>Dickins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+tumor+phenotypes+using+stable+and+regulated+synthetic+microRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors.</a> Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+reveals+tumor+cell+of+origin+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma.</a> Cell. 146 (2), 209-221 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule szczegółowo opisujemy wszechstronną i powtarzalną metodę generowania nowych modeli GBM przy użyciu integracji onkogennego plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozazy SB z komórkami otaczającymi strefę podkomorową noworodków myszy. Przedstawiamy protokół generowania transpozonów plazmidów z nowymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania, ilustrujemy, jak monitorować postęp nowotworów u żywych zwierząt oraz jak scharakteryzować cechy histopatologiczne i immunohistochemiczne tych nowotworów.
<p clas...

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym (60%) pierwotnym guzem mózgu u dorosłych, z medianą przeżycia 15-21 miesięcy podczas leczenia chirurgicznego, radioterapii i chemioterapii1. Konieczne są nowatorskie terapie GBM. Terapie eksperymentalne wymagają testowania na modelach zwierzęcych, które odpowiednio odtwarzają istotne cechy choroby u człowieka. Strategie indukcji GBM u gryzoni obejmują mutagenezę chemiczną z czynnikami alkilującymi, zmiany genetyczne w linii zarodkowej lub somatyczne lub przeszczep przy użyciu linii komórkowych glejaka2. Najczęściej stosowane modele wykorzystują implantację linii komórkowych glejaka, ortotopowo, do mózgu lub podskórnie przy użyciu komórek syngenicznych u zwierząt o identycznym genotypie; lub komórki ksenogeniczne, najczęściej ludzkie linie komórkowe GBM, wszczepione myszom z obniżoną odpornością3. Ksenoprzeszczepy oferują wiele korzyści w badaniu guzów wewnątrzczaszkowych: wygodę odtwarzalności, standaryzowane tempo wzrostu, czas zgonu i lokalizację guza. Modele te mają jednak ograniczenia ze względu na sztuczne, inwazyjne podejście chirurgiczne stosowane do implantacji oraz ograniczoną zdolność do dokładnego odtworzenia cech histologicznych charakterystycznych dla ludzkiego GBM (IV stopień wg WHO): martwicę pseudo-pallisadową, atypię jądrową, inwazję rozlaną, proliferację mikronaczyniową i powstawanie nieprawidłowości naczyniowych kłębuszków nerkowych4-7. Indukcja GBM poprzez zmianę genomu komórek somatycznych z onkogennym DNA, albo z wektorami wirusowymi8-12, albo z integracją za pośrednictwem transpozonów13, wierniej odtwarza etiologię choroby człowieka i podsumowuje histutopatologiczne cechy ludzkiego GBM.
Historycznie rzecz biorąc, nowotwory OUN były klasyfikowane na podstawie postrzeganej komórki pochodzenia, która, jak zaobserwowano, byłaby czynnikiem predykcyjnym dla przeżycia14. GBM dzielą się na pierwotne i wtórne. Pojawiające się obecnie dowody wskazują na wysoce niejednorodny charakter glejaka pierwotnego15 . Wtórny GBM (15%), będący wynikiem złośliwej transformacji gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości (stopień I wg WHO) i gwiaździaków anaplazyjnych (stopień II wg WHO), wiąże się z wcześniejszym wystąpieniem choroby, lepszym rokowaniem i "proneuralnym" wzorcem ekspresji genów, podczas gdy pierwotny GBM (85%) wykazuje późny początek, złe rokowanie i wzorce ekspresji glejowej (klasycznej), neuronalnej lub mezenchymalnej. To, czy te wzorce ekspresji genów korelują z rzeczywistą komórką, z której pochodzi guz, jest nadal aktywnie badane. Coraz więcej danych pokazuje, że kombinacja mutacji genetycznych związanych z GBM jest predyktorem przeżycia. Na przykład utrata heterozygotyczności (LOH) chromosomów 1p/19q, mutacje IDH1, amplifikacje PDGFRα są związane z wtórnymi GBM, proneuronalnym wzorcem ekspresji i lepszym rokowaniem, podczas gdy nadekspresja EGFR, aktywacja szlaku Notch i Sonic hedgehog, utrata Nf1 i PTEN oraz mutacje p53 są skorelowane z neuronalnym, klasycznym lub mezenchymalnym pierwotnym GBM i gorszym rokowaniem16,17. Pojawienie się projektów sekwencjonowania na dużą skalę i nagromadzenie wielu próbek pacjentów dostępnych do badań przynosi bogactwo nowych informacji w odniesieniu do mutacji genetycznych i szlaków związanych z patogenezą i progresją GBM oraz możliwości zindywidualizowanej medycyny, w której terapie mogą być specjalnie dostosowane do nieprawidłowości genetycznych pacjenta. Ostatecznie, aby ocenić wartość predykcyjną tych mutacji i szlaków w sposób systematyczny oraz przetestować możliwe metody leczenia w każdym przypadku, potrzebne są modele zwierzęce GBM z wcześniej określonymi zmianami genetycznymi. Integracja genomowego DNA za pośrednictwem transpozonów oferuje wykonalne podejście.
System transpozonów Śpiąca Królewna, należący do klasy transpozonów Tc1/mariner, został "przebudzony" (skonstruowany) w wieloetapowym procesie mutagenezy specyficznej dla miejsca z genu transpozazy łososiowatych, który został uśpiony ponad 10 milionów lat temu18,19. W istocie, transpozony DNA otoczone określonymi sekwencjami (powtórzenia odwrócone/powtórzenia bezpośrednie: IR/DR) mogą być zintegrowane z genomem w sposób "wytnij i wklej" za pomocą aktywności transpozazy Śpiącej Królewny. Transpozaza rozpoznaje końce miejsc IR, wycina transpozon i integruje go losowo z innym miejscem DNA między zasadami T i A, zasadami, które są duplikowane na każdym końcu transpozonu podczas transpozycji (ryc. 1a). Transpozaza Śpiącej Królewny składa się z trzech domen: domeny wiążącej transpozon, sekwencji lokalizacji jądrowej i domeny katalitycznej. Cztery cząsteczki transpozazy są wymagane, aby zbliżyć do siebie dwa końce transpozonu i umożliwić transpozycję, jednak jeśli obecnych jest zbyt wiele cząsteczek transpozazy, mogą one dimeryzować i tetrameryzować, aby zahamować reakcję transpozycji20. Skuteczna reakcja transpozycji wymaga optymalnego stosunku transpozazy do transpozonów. DNA kodujące transpozazę może być dostarczane na tym samym plazmidzie z transpozonem (w cis) lub na innym plazmidzie (w trans). Aby zapewnić optymalny stosunek między transpozazą a transpozonami, można wybrać promotor o odpowiedniej aktywności do ekspresji transpozazy (dla modelu "cis") lub stosunek plazmidów w roztworze do wstrzykiwań może być zoptymalizowany (dla modelu "trans"). System transpozonów Sleeping Beauty może być z powodzeniem stosowany w genomice funkcjonalnej, mutagenezie insercyjnej, transgenezie i somatycznej terapii genowej21. Będąc syntetycznym konstruktem przeprojektowanym na funkcjonalną cząsteczkę z uśpionego wariantu łosmonoidu, transpozaza Śpiącej Królewny nie wiąże się z innymi transpozonami u ludzi lub innychssaków. Od czasu jego odkrycia, inżynieria molekularna zwiększyła skuteczność transpozycji systemu transpozonów SB poprzez zmiany w sekwencjach IR i dodanie dinukleotydów TATA flankujących transpozon, w wyniku czego powstały transpozony pT2. Transpozony te zoptymalizowały wiązanie SB z miejscem IR i zwiększyły skuteczność wycinania. Transpozaza SB również uległa znacznej poprawie; transpozaza stosowana w eksperymentach przedstawionych w niniejszym dokumencie to SB100X, nadpobudliwa transpozaza generowana przez strategię tasowania DNA, a następnie badanie genetyczne na dużą skalę w komórkach ssaków22.
W tym raporcie prezentujemy szybką, wszechstronną i powtarzalną metodę indukowania wewnętrznego GBM u myszy z niewirusową, transpozonową integracją plazmidowego DNA z komórkami strefy podkomorowej noworodkówmyszy 23. Przedstawiamy prosty sposób tworzenia transpozonów z nowymi genami podatnymi na integrację genomiczną przy użyciu transpozazy Śpiącej Królewny i pokazujemy, jak monitorować wychwyt plazmidu i postęp choroby za pomocą bioluminescencji. Charakteryzujemy również cechy histologiczne i immunohistochemiczne GBM odtworzonego za pomocą tego modelu. Ponadto przedstawiamy szybką metodę generowania pierwotnych linii komórkowych GBM z tych nowotworów. Model Śpiącej Królewny, w którym nowotwory są indukowane z komórek pierwotnych do zwierzęcia, pozwala na funkcjonalną ocenę roli genów kandydujących na GBM w indukcji i progresji nowotworów. System ten doskonale nadaje się również do testowania nowatorskich metod leczenia GBM, w tym terapii immunologicznych u myszy immunokompetentnych, bez konieczności inwazyjnych zapalnych zabiegów chirurgicznych, które mogą zmieniać lokalne mikrośrodowisko.

<table><tbody><tr><td>Standard laboratoryjny firmy Stoelting z adapterami dla szczurów i myszy</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Inne firmy produkują podobne ramki, odpowiednie są wszystkie z małymi adapterami do myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Wtryski można wykonywać bez niego, ale&nbsp; &nbsp; &nbsp; Automatyczny wtryskiwacz pozwala na zwiększenie powtarzalności i wygody</td></tr><tr><td>10 &mu; l Ręcznie montowana strzykawka MICROLITR serii 700</td><td>Hamilton</td><td>Model 701</td><td>Ten model strzykawki niezawodnie dostarczy od 0,5 do 500 ul roztworu. Inne syrngi (z przykładu 5 ul, Model 75) mogą być również używane</td></tr><tr><td>igły podskórnej o rozmiarze 30 (1,25", 15o besko);</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Ta igła jest idealna do przekłuwania skóry i czaszki noworodka myszy bez konieczności wykonywania innych inwazyjnych zabiegów. Jeśli stanie się matowy (nie wnika łatwo w skórę), należy go wymienić.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>Podwielokrotność w małych objętościach i utrzymywać w temperaturze -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, Sól potasowa</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Inne źródła lucifierazy świetlika są równie odpowiednie</td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Złożona</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62550-01</td><td>Do osadzania mózgów do kriosekcji i immunohistovhemitrii</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12, bez glutaminy</td><td>Życie Technologie</td><td>12634-010</td><td>Do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>B-27&uml; Suplement (50X), bez surowicy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Surowica bez suplementu do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>Suplement N2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Surowica bez suplementu do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Środek antymykoplazmowy do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Suplement czynnika wzrostu do hodowli&nbsp; neurosfery</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Suplement czynnika wzrostu do hodowli&nbsp; neurosfery</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Odczynnik do odrywania komórek&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Do dysocjacji neurosfer</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Tłuczek do peletek</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Do dysocjacji świeżo wypreparowanych guzów</td></tr><tr><td>Sitka do komórek sokoła rozmiar oczek 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Do generowania zawiesin pojedynczych komórek zdysocjowanych neurosfer</td></tr><tr><td>Ksyleny Stopień histologiczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>Protokół C8H10</td><td></td></tr> Harris <tr><td>Hematoksylina Bez rtęci (zakwaszony)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protokół Eosyn Y roztwór (zintensyfikowany)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

integracja plazmidowego dna za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Istnieje pilna potrzeba przetestowania udziału nowych genów w patogenezie i progresji ludzkich glejaków (GBM), najczęstszego pierwotnego guza mózgu u dorosłych z ponurymi rokowaniami. Szybko pojawiają się nowe potencjalne terapie, które wymagają systematycznego testowania na modelach eksperymentalnych, które ściśle odwzorowują istotne cechy choroby ludzkiej. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę indukowania nowych modeli GBM z transpozonową integracją plazmidowego DNA z komórkami strefy podkomorowej noworodków myszy. Przedstawiamy prosty sposób klonowania nowych transpozonów nadających się do integracji genomowej za pomocą systemu transpozonów Sleeping Beauty oraz ilustrujemy, jak monitorować wychwyt plazmidu i postęp choroby za pomocą bioluminescencji, histologii i immunohistochemii. Opisujemy również metodę tworzenia nowych pierwotnych linii komórkowych GBM. Idealnie byłoby, gdyby raport ten umożliwił dalsze rozpowszechnianie systemu transpozonów Sleeping Beauty wśród badaczy nowotworów mózgu, prowadząc do dogłębnego zrozumienia patogenezy i progresji GBM oraz do terminowego projektowania i testowania skutecznych terapii dla pacjentów.

Aby scharakteryzować cechy histopatologiczne glejaków indukowanych przez SB, noworodkom myszy C57/BL6 w 1. dobie po urodzeniu (P1) wstrzyknięto plazmid kodujący lucyferazę (pT2/SB100x-Luc) w połączeniu z plazmidami kodującymi transpozony z onkogenicznym DNA, t.j., NRAS (pT/CAGGS-NRASV12) oraz SV40 LgT (pT/CMVSV40-LgT) (Rycina 3c) lub plazmid kodujący krótką napinkę p53 z PDGFβ i reporterem GFP (pT2shp53/GFP4/mPDGFβ) w połączeniu z NRAS (Rysunek 3d). Bioluminescencję zwierząt mon...

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

Celem niniejszej procedury jest stworzenie nowych modeli glejaków wielopostaciowych i w konsekwencji opracowanie nowatorskich metod terapeutycznych poprzez indukowanie powstawania glejaków wielopostaciowych z konkretnymi mutacjami genetycznymi u myszy. Osiąga się to poprzez przygotowanie plazmidów transpozonicznych kodujących specyficzne geny będące przedmiotem badania. Kolejnymi krokami są przygotowanie plazmidów z odczynnikiem do transfekcji oraz ich wstrzyknięcie do komory bocznej noworodków myszy.Wchłanianie w procesie progresji guza jest następnie monitorowane za pomocą luminescencji. Po wzroście liczebności zwierząt są one uśmiercane w celu przeprowadzenia analizy histologicznej i immunohistochemicznej. W ten sposób w organizmach typu dzikiego lub na tle genetycznym z celowaną modyfikacją indukowane są nowe glejaki o specyficznych zmianach genetycznych.Guzy te można badać in vivo lub wykorzystać in vitro do generowania nowych linii komórkowych nadających się do analiz biochemicznych i eksperymentów nad cytotoksycznością z użyciem agentów chemioterapeutycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak na przykład ortotopowe wstrzyknięcia linii komórkowej glejaka wielopostaciowego, jest to, że guzy są indukowane poprzez złośliwą transformację komórek endogennych jednego zwierzęcia immunokompetentnego przy użyciu bardzo specyficznie dobranych zmian genetycznych. Proces ten dokładniej odtwarza etiologię ludzkiej choroby i odzwierciedla istotne cechy histopatologiczne ludzkiego GBM.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuroonkologii, takie jak to, jakie mutacje sterujące odpowiadają za indukcję różnych typów glejaka wielopostaciowego – klasycznego, przedneuronalnego czy neuronalnego u dorosłych lub w guzach dziecięcych. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię GBM, ponieważ nowe środki chemioterapeutyczne, radioterapie, immunoterapie lub ich kombinacje mogą być stosunkowo szybko testowane in vivo lub in vitro przy użyciu tego modelu.Pomysł na tę metodę pojawił się po dyskusji z moim kolegą, dr. Johnem z University of Minnesota, który opracował wstępny model guza mózgu z wykorzystaniem integracji onkogenów oraz inhibitorów genów supresorowych do genomowego DNA gospodarza, za pośrednictwem transpozazy sleeping beauty. Uznałem, że ta metodologia będzie niezwykle skutecznym narzędziem do badania wpływu nowych mutacji na progresję nowotworu oraz pomoże w opracowywaniu terapii celowanych w raka mózgu. Na trzy do czterech tygodni przed eksperymentem przygotuj klatkę hodowlaną dla myszy z jednym samcem i jedną samicą, umieszczając w niej kolorowy plastikowy schron (igloo) w celu wzbogacenia środowiska i zwiększenia szans na kopulację. Usuń samca po potwierdzeniu ciąży, a 18 dni po dniu kopulacji rozpocznij monitorowanie samicy pod kątem porodu.Należy upewnić się, że w czasie porodu dostępna jest matka zastępcza. W pierwszej dobie po urodzeniu należy wykonać wstrzyknięcia do komór mózgu. Roztwór do wstrzyknięcia przygotowuje się poprzez odmierzenie 20 µL mieszaniny DNA zawierającej transpozazę na plazmidach w stężeniu końcowym 0,5 µg DNA/µL.Następnie dodaj 20 µL alikwotu roztworu PEI do roztworu DNA i inkubuj je w temperaturze pokojowej od 20 minut do jednej godziny, po czym mieszaninę należy przechowywać w lodzie. W celu przygotowania igły do wstrzykiwania, połącz strzykawkę o pojemności 10 µL z igłą hipodermiczną o rozmiarze 30 G, ściętą pod kątem 12,5 stopnia. Następnie podłącz strzykawkę do mikropompy z automatycznym wtryskiem.Przetestuj układ, używając 10 µL wody, i upewnij się, że strzykawka jest pusta. Następnie schłodź neonatalną platformę stereotaksyczną za pomocą zawiesiny z suchego lodu i alkoholu. Gdy temperatura spadnie do poziomu między 2 a 8 °C, przystąp do iniekcji.W pierwszej kolejności znieczul szczenię, umieszczając je na lodzie przez dwie minuty. Podczas gdy szczenię znajduje się na lodzie, nabierz do strzykawki roztwór do wstrzyknięcia. Po znieczuleniu przenieś szczenię do ramki i unieruchom jego głowę pomiędzy pokrytymi gazą prętami usznymi.Upewnij się, że grzbietowa strona czaszki jest w poziomie i równolegle do powierzchni ramy. Ponadto szwy czaszkowe powinny być wyraźnie widoczne. Jeśli głowa szczenięcia nie zostanie wystarczająco mocno unieruchomiona, będzie się poruszać podczas wstrzykiwania.W przypadku zbyt mocnego ściśnięcia między ramionami uchwytu, lambda nie będzie widoczna, a ciśnienie wewnątrz głowy spowoduje wyciek wstrzykniętego roztworu. Po stabilnym zamocowaniu pupila w uchwycie, przetrzyj głowę 70% ethanolem, następnie opuść igłę i dostosuj jej położenie tak, aby stykała się z lambdą. Następnie podnieś igłę i przesuń ją o 0,8 milimetra bocznie oraz o 1,5 milimetra wzdłuż osi. Ponownie opuść igłę, aż lekko wgniecie skórę.Zapisz współrzędne tej pozycji. Następnie wprowadź igłę o 1,5 milimetra głębiej, przechodząc przez skórę i czaszkę, aż do kory w obrębie komory bocznej. Wstrzyknij 0,75 µL w czasie 90 sekund, a następnie odczekaj minutę, aby roztwór mógł się rozprzestrzenić.Następne młode do zastrzyku można poddać znieczuleniu. Po zważeniu powoli wyciągnij igłę, a następnie przenieś młode do miejsca rekonwalescencji pod lampę grzewczą. Czas od znieczulenia do ogrzania musi być krótszy niż 10 minut.Należy jak najszybciej monitorować oddech szczeniaka i w razie potrzeby delikatnie masować kończyny, aby pobudzić oddychanie. Gdy szczeniak się ogrzeje, nabierze różowego koloru i jego oddech stanie się miarowy, należy zwrócić go matce. Zazwyczaj trwa to od pięciu do siedmiu minut od momentu wstrzyknięcia.Jeśli wstrzyknięto preparat kilku szczeniętom, wszystkie powinny zostać odzyskane przed oddaniem jakiegokolwiek z nich matce. Jeśli po pół godzinie nie wszystkie szczenięta są gotowe, należy oddać matce połowę z nich, a resztę zwrócić później, po zakończeniu procedury, monitorując samicę. Po oddaniu szczeniąt.Jeśli matka nie reaguje na młode, należy umieścić w klatce matkę zastępczą. Od 24 do 72 godzin po iniekcji monitoruj pobieranie plazmidu, a następnie przenieś wszystkie młode do sześciodołkowych naczyń hodowlanych, umieszczając po jednym młodym w każdym dołku. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem Lucifer w soli fizjologicznej lub PBS w stężeniu 30 mg/ml i załóż igłę hipodermiczną o rozmiarze 30 G.Wstrzyknij 30 µL roztworu podskórnie między łopatki każdego szczenięcia; aby uniknąć zranienia zwierzęcia, wstrzyknij roztwór pod niewielki fałd skóry. Natychmiast przenieś szczenięta do systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. Skonfiguruj sekwencję w celu wykonania czterech kolejnych obrazów w odstępach jednominutowych z automatyczną ekspozycją, dużym binningiem i przysłoną wynoszącą jeden.Po około 17 dniach u zwierząt mogą zacząć rozwijać się guzy makroskopowe, możliwe do wykrycia za pomocą bioluminescencji i histologii. Monitorowanie guzów może potrwać do sześciu tygodni. Wstrzyknij 100 µL roztworu lucyferazy do jamy otrzewnej za pomocą igły 26G.Po trzech minutach znieczul zwierzęta w komorze do narkozy izofluranem i tlenem, a następnie umieść je w komorze obrazującej wyposażonej w stożki rozpraszające izofluran. Wykonaj serię sześciu obrazów w odstępach dwuminutowych, stosując automatyczny czas ekspozycji, średnie binowanie oraz otwartą przysłonę o wartości f/1. Obszar zainteresowania (ROI) to zazwyczaj owal obejmujący głowę; zmierz intensywność luminescencji u każdego zwierzęcia przy użyciu tych samych ustawień, aby scharakteryzować cechy histopatologiczne glejaków wywołanych przez SB.Noworodkom myszy szczepu C57BL/6 w pierwszym dniu po urodzeniu (P1) wstrzyknięto plazmid kodujący lucyferazę w połączeniu z plazmidami NRAS i SV40 large T, wykorzystując transpozony Inod z onkogennym DNA. Alternatywnie, w połączeniu z NRAS wstrzyknięto plazmid kodujący krótką zapinkę (shRNA) przeciwko p53 wraz z PDGF-beta oraz reporterem GFP. Odnotowano obecność pseudo-palisadowatej martwicy, jak również nacieków okołonaczyniowych i rozlanych w obrębie mózgu.Glioblastoma miąższowe monitorowano również za pomocą bioluminescencji. Zwierzęta zazwyczaj ginęły w wyniku obciążenia nowotworowego, gdy luminescencja osiągała natężenie od 10⁷ do 10⁹ jednostek kalibrowanych.Mediana przeżycia zwierząt była przewidywalnie zależna od kombinacji transpozonów onkogennych wstrzykniętych do mózgu noworodka. Najbardziej agresywne guzy indukowano za pomocą NRS, a guzy SV 40 large T antigen de novo charakteryzowały się ekspresją specyficznych cząsteczek. Początkowe guzy wykazujące ekspresję GFP indukowane przez SHP 53 i nras wykazywały ekspresję markera komórek macierzystych neuronów neston, a niektóre z nich wykazywały również ekspresję gliofibrilarnego białka kwasowego.Po 56 dniach stwierdzono obecność guza otoczonego przez liczne astrocyty wykazujące pozytywną reakcję na GFAP. Komórki nowotworowe tych guzów wykazywały ekspresję nein, ale nie GFAP. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować tworzenie się glejaków wielopostaciowych z określonymi mutacjami genetycznymi poprzez wstrzyknięcia dokomorowe u noworodków myszy oraz jak monitorować postęp choroby za pomocą bioluminescencji.W artykule znajdują się szczegółowe informacje na temat tego, jak łatwo klonować nowy plazmid trans pro kodujący interesujące nas geny, a także jak monitorować guzy i analizować je za pomocą histologii i immunohistochemii. Ponadto opisano szczegółową metodę generowania nowych linii komórkowych glejaka z organizmów zwierzęcych z genetycznie zmodyfikowanymi guzami. Mamy nadzieję, że artykuł ten przyczyni się do przyspieszenia odkrywania nowych terapii tej wyniszczającej ludzką organizację choroby.

transposon-mediated-integration-plasmid-dna-into-subventricular-zone

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Transpozonowa integracja DNA plazmidowego w strefę podkomorową u noworodków myszy w celu stworzenia nowych modeli glioblastomu

Ten film opisuje skuteczną technikę wywoływania glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o charakterystyce histopatologicznej ludzkiego GBM.

Indukcja glejaka za pomocą transpozycji za pośrednictwem SB: technika generowania nowego modelu myszy przy użyciu integracji plazmidu SB za pośrednictwem transpozonu z mózgiem noworodka myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Sepsis to zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej wynikający z infekcji mikrobiologicznej, który można symulować za pomocą techniki chirurgicznej zwanej podwiązaniem i nakłuciem kątnicy (CLP). W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania modelu zwierzęcego indukowanego CLP do przesiewowego badania ziół leczniczych w celu poszukiwania czynników terapeutycznych.

Wykorzystanie modelu zwierzęcego sepsy do oceny nowych terapii ziołowych

Poznaj metodę indukcji glejaków z określonymi mutacjami genetycznymi u noworodków myszy poprzez wstrzyknięcie do komory bocznej. Technika ta umożliwia badanie biologii nowotworów i testowanie terapii.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka (Wideo) | JoVE Journal

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Przeglądaj więcej filmów