Name: Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę indukcji glejaków z określonymi mutacjami genetycznymi u noworodków myszy poprzez wstrzyknięcie do komory bocznej. Technika ta umożliwia badanie biologii nowotworów i testowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Johnowi Ohlfestowi i Dr. Stacey Decker13 za hojny dar plazmidów i za szkolenie dostarczone w celu opanowania tej metody. Dziękujemy Marcie Dzaman za pomoc w standaryzacji procedury barwienia Hematoksyliną-Eozyną skrawków zatopionych w parafinie. Dziękujemy również Molly Dahlgren za zapoznanie się z tym manuskryptem i dostarczenie pomocnych sugestii. Praca ta jest wspierana przez granty NIH/NINDS dla MGC i PRL, dotację Leah's Happy Hearts Foundation dla MCG i PRL. Nagroda dla młodego badacza Alex's Lemonade Foundation oraz stypendium St. Baldrick's Foundation dla CK.

<ol><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet.</a> Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).</li>
<li>Dai, C., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Glioma models.</a> Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).</li>
<li>Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+tumor+xenografts+in+nude+mice+as+a+chemotherapy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model.</a> Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice%3A+new+tools+to+tackle+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li>
<li>Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomeruloid+vascular+structures+in+glioblastoma+multiforme%3A+an+immunohistochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study.</a> J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Adult+Gliomas+Using+RCAS%2Ft-va+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology.</a> Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).</li>
<li>Friedmann-Morvinski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+of+neurons+and+astrocytes+by+oncogenes+can+induce+gliomas+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice.</a> Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).</li>
<li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-Induced+High-Grade+Gliomas+in+Rats%3A+The+Effects+of+PDGFB%2C+HRAS-G12V%2C+AKT%2C+and+IDH1-R132H%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutic%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).</li>
<li>Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+brain+tumors+in+mice+using+a+recombinant+platelet-derived+growth+factor+B-chain+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus.</a> Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).</li>
<li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).</li>
<li>Bailey, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+the+Percival+Bailey-Cushing+classification+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas.</a> Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).</li>
<li>Patel, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+highlights+intratumoral+heterogeneity+in+primary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma.</a> Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).</li>
<li>Agnihotri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%2C+a+brief+review+of+history%2C+molecular+genetics%2C+animal+models+and+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li>
<li>Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+domains+and+evolution+of+Tc1-like+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91 (4), 501-510 (1997).</li>
<li>Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposon-mediated+gene+therapy+for+prolonged+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.</a> Adv Genet. 54, 189-232 (2005).</li>
<li>Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon toolbox.</a> Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).</li>
<li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+blockade+suppresses+gliomagenesis+by+inhibiting+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).</li>
<li>Geurts, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+genomes+of+human+cells+by+the+sleeping+beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+Of+The+American+Society+Of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system.</a> Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).</li>
<li>Dickins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+tumor+phenotypes+using+stable+and+regulated+synthetic+microRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors.</a> Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+reveals+tumor+cell+of+origin+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma.</a> Cell. 146 (2), 209-221 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule szczegółowo opisujemy wszechstronną i powtarzalną metodę generowania nowych modeli GBM przy użyciu integracji onkogennego plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozazy SB z komórkami otaczającymi strefę podkomorową noworodków myszy. Przedstawiamy protokół generowania transpozonów plazmidów z nowymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania, ilustrujemy, jak monitorować postęp nowotworów u żywych zwierząt oraz jak scharakteryzować cechy histopatologiczne i immunohistochemiczne tych nowotworów.
<p clas...

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym (60%) pierwotnym guzem mózgu u dorosłych, z medianą przeżycia 15-21 miesięcy podczas leczenia chirurgicznego, radioterapii i chemioterapii1. Konieczne są nowatorskie terapie GBM. Terapie eksperymentalne wymagają testowania na modelach zwierzęcych, które odpowiednio odtwarzają istotne cechy choroby u człowieka. Strategie indukcji GBM u gryzoni obejmują mutagenezę chemiczną z czynnikami alkilującymi, zmiany genetyczne w linii zarodkowej lub somatyczne lub przeszczep przy użyciu linii komórkowych glejaka2. Najczęściej stosowane modele wykorzystują implantację linii komórkowych glejaka, ortotopowo, do mózgu lub podskórnie przy użyciu komórek syngenicznych u zwierząt o identycznym genotypie; lub komórki ksenogeniczne, najczęściej ludzkie linie komórkowe GBM, wszczepione myszom z obniżoną odpornością3. Ksenoprzeszczepy oferują wiele korzyści w badaniu guzów wewnątrzczaszkowych: wygodę odtwarzalności, standaryzowane tempo wzrostu, czas zgonu i lokalizację guza. Modele te mają jednak ograniczenia ze względu na sztuczne, inwazyjne podejście chirurgiczne stosowane do implantacji oraz ograniczoną zdolność do dokładnego odtworzenia cech histologicznych charakterystycznych dla ludzkiego GBM (IV stopień wg WHO): martwicę pseudo-pallisadową, atypię jądrową, inwazję rozlaną, proliferację mikronaczyniową i powstawanie nieprawidłowości naczyniowych kłębuszków nerkowych4-7. Indukcja GBM poprzez zmianę genomu komórek somatycznych z onkogennym DNA, albo z wektorami wirusowymi8-12, albo z integracją za pośrednictwem transpozonów13, wierniej odtwarza etiologię choroby człowieka i podsumowuje histutopatologiczne cechy ludzkiego GBM.
Historycznie rzecz biorąc, nowotwory OUN były klasyfikowane na podstawie postrzeganej komórki pochodzenia, która, jak zaobserwowano, byłaby czynnikiem predykcyjnym dla przeżycia14. GBM dzielą się na pierwotne i wtórne. Pojawiające się obecnie dowody wskazują na wysoce niejednorodny charakter glejaka pierwotnego15 . Wtórny GBM (15%), będący wynikiem złośliwej transformacji gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości (stopień I wg WHO) i gwiaździaków anaplazyjnych (stopień II wg WHO), wiąże się z wcześniejszym wystąpieniem choroby, lepszym rokowaniem i "proneuralnym" wzorcem ekspresji genów, podczas gdy pierwotny GBM (85%) wykazuje późny początek, złe rokowanie i wzorce ekspresji glejowej (klasycznej), neuronalnej lub mezenchymalnej. To, czy te wzorce ekspresji genów korelują z rzeczywistą komórką, z której pochodzi guz, jest nadal aktywnie badane. Coraz więcej danych pokazuje, że kombinacja mutacji genetycznych związanych z GBM jest predyktorem przeżycia. Na przykład utrata heterozygotyczności (LOH) chromosomów 1p/19q, mutacje IDH1, amplifikacje PDGFRα są związane z wtórnymi GBM, proneuronalnym wzorcem ekspresji i lepszym rokowaniem, podczas gdy nadekspresja EGFR, aktywacja szlaku Notch i Sonic hedgehog, utrata Nf1 i PTEN oraz mutacje p53 są skorelowane z neuronalnym, klasycznym lub mezenchymalnym pierwotnym GBM i gorszym rokowaniem16,17. Pojawienie się projektów sekwencjonowania na dużą skalę i nagromadzenie wielu próbek pacjentów dostępnych do badań przynosi bogactwo nowych informacji w odniesieniu do mutacji genetycznych i szlaków związanych z patogenezą i progresją GBM oraz możliwości zindywidualizowanej medycyny, w której terapie mogą być specjalnie dostosowane do nieprawidłowości genetycznych pacjenta. Ostatecznie, aby ocenić wartość predykcyjną tych mutacji i szlaków w sposób systematyczny oraz przetestować możliwe metody leczenia w każdym przypadku, potrzebne są modele zwierzęce GBM z wcześniej określonymi zmianami genetycznymi. Integracja genomowego DNA za pośrednictwem transpozonów oferuje wykonalne podejście.
System transpozonów Śpiąca Królewna, należący do klasy transpozonów Tc1/mariner, został "przebudzony" (skonstruowany) w wieloetapowym procesie mutagenezy specyficznej dla miejsca z genu transpozazy łososiowatych, który został uśpiony ponad 10 milionów lat temu18,19. W istocie, transpozony DNA otoczone określonymi sekwencjami (powtórzenia odwrócone/powtórzenia bezpośrednie: IR/DR) mogą być zintegrowane z genomem w sposób "wytnij i wklej" za pomocą aktywności transpozazy Śpiącej Królewny. Transpozaza rozpoznaje końce miejsc IR, wycina transpozon i integruje go losowo z innym miejscem DNA między zasadami T i A, zasadami, które są duplikowane na każdym końcu transpozonu podczas transpozycji (ryc. 1a). Transpozaza Śpiącej Królewny składa się z trzech domen: domeny wiążącej transpozon, sekwencji lokalizacji jądrowej i domeny katalitycznej. Cztery cząsteczki transpozazy są wymagane, aby zbliżyć do siebie dwa końce transpozonu i umożliwić transpozycję, jednak jeśli obecnych jest zbyt wiele cząsteczek transpozazy, mogą one dimeryzować i tetrameryzować, aby zahamować reakcję transpozycji20. Skuteczna reakcja transpozycji wymaga optymalnego stosunku transpozazy do transpozonów. DNA kodujące transpozazę może być dostarczane na tym samym plazmidzie z transpozonem (w cis) lub na innym plazmidzie (w trans). Aby zapewnić optymalny stosunek między transpozazą a transpozonami, można wybrać promotor o odpowiedniej aktywności do ekspresji transpozazy (dla modelu "cis") lub stosunek plazmidów w roztworze do wstrzykiwań może być zoptymalizowany (dla modelu "trans"). System transpozonów Sleeping Beauty może być z powodzeniem stosowany w genomice funkcjonalnej, mutagenezie insercyjnej, transgenezie i somatycznej terapii genowej21. Będąc syntetycznym konstruktem przeprojektowanym na funkcjonalną cząsteczkę z uśpionego wariantu łosmonoidu, transpozaza Śpiącej Królewny nie wiąże się z innymi transpozonami u ludzi lub innychssaków. Od czasu jego odkrycia, inżynieria molekularna zwiększyła skuteczność transpozycji systemu transpozonów SB poprzez zmiany w sekwencjach IR i dodanie dinukleotydów TATA flankujących transpozon, w wyniku czego powstały transpozony pT2. Transpozony te zoptymalizowały wiązanie SB z miejscem IR i zwiększyły skuteczność wycinania. Transpozaza SB również uległa znacznej poprawie; transpozaza stosowana w eksperymentach przedstawionych w niniejszym dokumencie to SB100X, nadpobudliwa transpozaza generowana przez strategię tasowania DNA, a następnie badanie genetyczne na dużą skalę w komórkach ssaków22.
W tym raporcie prezentujemy szybką, wszechstronną i powtarzalną metodę indukowania wewnętrznego GBM u myszy z niewirusową, transpozonową integracją plazmidowego DNA z komórkami strefy podkomorowej noworodkówmyszy 23. Przedstawiamy prosty sposób tworzenia transpozonów z nowymi genami podatnymi na integrację genomiczną przy użyciu transpozazy Śpiącej Królewny i pokazujemy, jak monitorować wychwyt plazmidu i postęp choroby za pomocą bioluminescencji. Charakteryzujemy również cechy histologiczne i immunohistochemiczne GBM odtworzonego za pomocą tego modelu. Ponadto przedstawiamy szybką metodę generowania pierwotnych linii komórkowych GBM z tych nowotworów. Model Śpiącej Królewny, w którym nowotwory są indukowane z komórek pierwotnych do zwierzęcia, pozwala na funkcjonalną ocenę roli genów kandydujących na GBM w indukcji i progresji nowotworów. System ten doskonale nadaje się również do testowania nowatorskich metod leczenia GBM, w tym terapii immunologicznych u myszy immunokompetentnych, bez konieczności inwazyjnych zapalnych zabiegów chirurgicznych, które mogą zmieniać lokalne mikrośrodowisko.

<table><tbody><tr><td>Standard laboratoryjny firmy Stoelting z adapterami dla szczurów i myszy</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Inne firmy produkują podobne ramki, odpowiednie są wszystkie z małymi adapterami do myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Wtryski można wykonywać bez niego, ale&nbsp; &nbsp; &nbsp; Automatyczny wtryskiwacz pozwala na zwiększenie powtarzalności i wygody</td></tr><tr><td>10 &mu; l Ręcznie montowana strzykawka MICROLITR serii 700</td><td>Hamilton</td><td>Model 701</td><td>Ten model strzykawki niezawodnie dostarczy od 0,5 do 500 ul roztworu. Inne syrngi (z przykładu 5 ul, Model 75) mogą być również używane</td></tr><tr><td>igły podskórnej o rozmiarze 30 (1,25", 15o besko);</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Ta igła jest idealna do przekłuwania skóry i czaszki noworodka myszy bez konieczności wykonywania innych inwazyjnych zabiegów. Jeśli stanie się matowy (nie wnika łatwo w skórę), należy go wymienić.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>Podwielokrotność w małych objętościach i utrzymywać w temperaturze -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, Sól potasowa</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Inne źródła lucifierazy świetlika są równie odpowiednie</td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Złożona</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62550-01</td><td>Do osadzania mózgów do kriosekcji i immunohistovhemitrii</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12, bez glutaminy</td><td>Życie Technologie</td><td>12634-010</td><td>Do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>B-27&uml; Suplement (50X), bez surowicy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Surowica bez suplementu do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>Suplement N2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Surowica bez suplementu do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Środek antymykoplazmowy do hodowli neurosfer</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Suplement czynnika wzrostu do hodowli&nbsp; neurosfery</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Suplement czynnika wzrostu do hodowli&nbsp; neurosfery</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Odczynnik do odrywania komórek&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Do dysocjacji neurosfer</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Tłuczek do peletek</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Do dysocjacji świeżo wypreparowanych guzów</td></tr><tr><td>Sitka do komórek sokoła rozmiar oczek 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Do generowania zawiesin pojedynczych komórek zdysocjowanych neurosfer</td></tr><tr><td>Ksyleny Stopień histologiczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>Protokół C8H10</td><td></td></tr> Harris <tr><td>Hematoksylina Bez rtęci (zakwaszony)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protokół Eosyn Y roztwór (zintensyfikowany)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

integracja plazmidowego dna za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Istnieje pilna potrzeba przetestowania udziału nowych genów w patogenezie i progresji ludzkich glejaków (GBM), najczęstszego pierwotnego guza mózgu u dorosłych z ponurymi rokowaniami. Szybko pojawiają się nowe potencjalne terapie, które wymagają systematycznego testowania na modelach eksperymentalnych, które ściśle odwzorowują istotne cechy choroby ludzkiej. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę indukowania nowych modeli GBM z transpozonową integracją plazmidowego DNA z komórkami strefy podkomorowej noworodków myszy. Przedstawiamy prosty sposób klonowania nowych transpozonów nadających się do integracji genomowej za pomocą systemu transpozonów Sleeping Beauty oraz ilustrujemy, jak monitorować wychwyt plazmidu i postęp choroby za pomocą bioluminescencji, histologii i immunohistochemii. Opisujemy również metodę tworzenia nowych pierwotnych linii komórkowych GBM. Idealnie byłoby, gdyby raport ten umożliwił dalsze rozpowszechnianie systemu transpozonów Sleeping Beauty wśród badaczy nowotworów mózgu, prowadząc do dogłębnego zrozumienia patogenezy i progresji GBM oraz do terminowego projektowania i testowania skutecznych terapii dla pacjentów.

Aby scharakteryzować cechy histopatologiczne glejaków indukowanych przez SB, noworodkom myszy C57/BL6 w 1. dobie po urodzeniu (P1) wstrzyknięto plazmid kodujący lucyferazę (pT2/SB100x-Luc) w połączeniu z plazmidami kodującymi transpozony z onkogenicznym DNA, t.j., NRAS (pT/CAGGS-NRASV12) oraz SV40 LgT (pT/CMVSV40-LgT) (Rycina 3c) lub plazmid kodujący krótką napinkę p53 z PDGFβ i reporterem GFP (pT2shp53/GFP4/mPDGFβ) w połączeniu z NRAS (Rysunek 3d). Bioluminescencję zwierząt mon...

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

Celem niniejszej procedury jest stworzenie nowych modeli glejaków wielopostaciowych i w konsekwencji opracowanie nowatorskich metod terapeutycznych poprzez indukowanie powstawania glejaków wielopostaciowych z konkretnymi mutacjami genetycznymi u myszy. Osiąga się to poprzez przygotowanie plazmidów transpozonicznych kodujących specyficzne geny będące przedmiotem badania. Kolejnymi krokami są przygotowanie plazmidów z odczynnikiem do transfekcji oraz ich wstrzyknięcie do komory bocznej noworodków myszy.Wchłanianie w procesie progresji guza jest następnie monitorowane za pomocą luminescencji. Po wzroście liczebności zwierząt są one uśmiercane w celu przeprowadzenia analizy histologicznej i immunohistochemicznej. W ten sposób w organizmach typu dzikiego lub na tle genetycznym z celowaną modyfikacją indukowane są nowe glejaki o specyficznych zmianach genetycznych.Guzy te można badać in vivo lub wykorzystać in vitro do generowania nowych linii komórkowych nadających się do analiz biochemicznych i eksperymentów nad cytotoksycznością z użyciem agentów chemioterapeutycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak na przykład ortotopowe wstrzyknięcia linii komó

transposon-mediated-integration-plasmid-dna-into-subventricular-zone

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Transpozonowa integracja DNA plazmidowego w strefę podkomorową u noworodków myszy w celu stworzenia nowych modeli glioblastomu

Ten film opisuje skuteczną technikę wywoływania glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o charakterystyce histopatologicznej ludzkiego GBM.

Indukcja glejaka za pomocą transpozycji za pośrednictwem SB: technika generowania nowego modelu myszy przy użyciu integracji plazmidu SB za pośrednictwem transpozonu z mózgiem noworodka myszy

Prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę określaną jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka. Technika ta polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA do bocznych komór nowonarodzonych młodych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu dostarczenia i genetycznej manipulacji nerwowych komórek...

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Sepsis to zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej wynikający z infekcji mikrobiologicznej, który można symulować za pomocą techniki chirurgicznej zwanej podwiązaniem i nakłuciem kątnicy (CLP). W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania modelu zwierzęcego indukowanego CLP do przesiewowego badania ziół leczniczych w celu poszukiwania czynników terapeutycznych.

Wykorzystanie modelu zwierzęcego sepsy do oceny nowych terapii ziołowych

Poznaj metodę indukcji glejaków z określonymi mutacjami genetycznymi u noworodków myszy poprzez wstrzyknięcie do komory bocznej. Technika ta umożliwia badanie biologii nowotworów i testowanie terapii.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka (Wideo) | JoVE Journal

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Przeglądaj więcej filmów