Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Celem tej procedury jest stworzenie nowych modeli glejaków i ostatecznie opracowanie nowych podejść terapeutycznych poprzez indukowanie powstawania glejaków zawierających określone mutacje genetyczne u myszy. Osiąga się to poprzez stworzenie najpierw plazmidów transpozonowych, kodujących określone geny będące przedmiotem zainteresowania. Kolejnym krokiem jest przygotowanie plazmidów za pomocą odczynnika do transfekcji i wstrzyknięcie ich do komory bocznej nowonarodzonych myszy.

Wychwyt w progresji guza jest następnie monitorowany za pomocą luminescencji. Kiedy zwierzęta stają się liczniejsze, są poświęcane do analizy histologicznej i immunohistochemicznej. W ten sposób nowe glejaki ze specyficznymi zmianami genetycznymi są indukowane w typie dzikim lub docelowym tle genetycznym.

Guzy te mogą być badane in vivo lub wykorzystywane in vitro do generowania nowych linii komórkowych podatnych na analizę biochemiczną i eksperymenty cytotoksyczności przy użyciu chemioterapeutyków. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak na przykład ortotopowe iniekcje linii komórkowej glejaka, jest to, że nowotwory są indukowane przez złośliwą transformację komórek endogennych do jednego immunokompetentnego zwierzęcia przy użyciu zmian genetycznych, które są bardzo specyficznie wybrane. Proces ten wierniej odtwarza etiologię choroby człowieka i podsumowuje istotne cechy histopatologiczne ludzkiego GBM.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroonkologii, takie jak to, jakie są mutacje odpowiedzialne za indukowanie różnych typów glejaka wielopostaciowego, klasycznego, przednerwowego, nerwowego u dorosłych lub w nowotworach dziecięcych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię GPM od czasu nowych chemioterapeutyków. Radioterapie immunologiczne lub ich kombinacja mogą być stosunkowo szybko testowane in vivo lub in vitro przy użyciu tego modelu.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy rozmawiałem z moim kolegą, dr Johnem z University of Minnesota, który opracował wstępny model guza mózgu przy użyciu śpiącej królewny transponowanej przez integrację onkogenów, inhibitora genów supresorowych nowotworów do genomowego DNA gospodarza. Pomyślałem, że ta metodologia będzie bardzo skuteczna w badaniu wpływu nowych mutacji na progresję guza i pomoże w opracowaniu celowanych terapii raka mózgu Trzy do czterech tygodni przed eksperymentem, ustaw klatkę hodowlaną myszy z jednym samcem i jedną samicą, dołącz kolorowe plastikowe igloo, aby wzbogacić środowisko i zwiększyć szanse na krycie. Usuń samca, gdy ciąża zostanie potwierdzona, a 18 dni po dniu krycia zacznij monitorować samicę pod kątem porodu.

Upewnij się, że matka zastępcza jest dostępna w czasie porodu. W pierwszej dobie po urodzeniu należy wykonać iniekcje dokomorowe. Przygotować roztwór do wstrzykiwań przez pierwszy Ali, cytując 20 mikrolitrów mieszanki DNA zawierającej transpozycję na plazmidy w końcowym stężeniu 0,5 mikrograma DNA na mikrolitr.

Następnie w 20 mikrolitrach podwielokrotności roztworu PEI do roztworu DNA i pozostawić je do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut do godziny, po czym mieszaninę należy przechowywać na lodzie. W przypadku igły do wstrzykiwań należy przymocować strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów do igły podskórnej o rozmiarze 30, pod kątem 12,5 stopnia. Następnie podłączyć strzykawkę do mikropompy z automatycznym wstrzykiwaniem.

Przetestuj konfigurację z 10 mikrolitrami wody i pamiętaj o opróżnieniu strzykawki. Teraz schłodzić stadium stereotaktyczne noworodka zawiesiną suchego lodu i alkoholu. Gdy schłodzi się do temperatury od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, przystąp do wstrzykiwań.

Najpierw znieczul szczeniaka, umieszczając go na lodzie na dwie minuty. Gdy szczenię znajduje się na lodzie, naładować strzykawkę roztworem do wstrzykiwań. Po znieczuleniu przenieś szczeniaka do ramy i unieruchamij jego głowę między nausznikami pokrytymi gazą.

Sprawdź, czy grzbietowa strona czaszki jest pozioma i równoległa do powierzchni ramy. Również szwy czaszkowe powinny być wyraźnie widoczne. Jeśli głowa szczeniaka nie jest wystarczająco mocno unieruchomiona, będzie się poruszać podczas wstrzyknięcia.

Natomiast jeśli zostanie zbyt mocno ściśnięty między nausznikami ramy, lambda nie będzie widoczna, a ciśnienie w głowie wymusi wyciek wstrzykniętego roztworu Gdy szczenię jest mocno uchwycone przez ramę, wytrzyj głowę 70% etanolem, a następnie opuść igłę i dostosuj jej położenie tak, aby stykała się z lambdą. Następnie podnieś igłę i przesuń ją o 0,8 milimetra w bok i 1,5 milimetra w dół. Następnie opuść go ponownie, aż lekko wgłębi się w skórę.

Zapisz współrzędne tej pozycji. Następnie opuść igłę, 1,5 milimetra przez skórę i czaszkę do kory w komorze bocznej. Wstrzyknij 0,75 mikrolitra w ciągu 90 sekund i odczekaj minutę, aby roztwór rozproszył się podczas oczekiwania.

Następne szczenię, które ma zostać wstrzyknięte, może zostać znieczulone. Po zważeniu powoli podnieś igłę, a następnie przenieś szczenię do miejsca rekonwalescencji pod lampą grzewczą. Czas od znieczulenia do ocieplenia musi być krótszy niż 10 minut.

Im szybciej, tym lepiej monitoruj jego oddech, a jeśli to konieczne, delikatnie pocieraj kończyny, aby stymulować oddychanie. Gdy szczenię jest już rozgrzane, ma różowy kolor i spokojny oddech, zwróć je matce. Zwykle trwa to od pięciu do siedmiu minut od wstrzyknięcia.

Jeśli wstrzyknie się kilka młodych, wszystkie powinny zostać odzyskane przed zwróceniem ich matce. Jeśli po pół godzinie wszystkie młode nie są gotowe, zwróć jej połowę z nich, a resztę zwróć później pod koniec zabiegu, monitoruj matkę. Po zwróceniu szczeniąt.

Jeśli nie reaguje na młode, dodaj matkę zastępczą do klatki. 24 do 72 godzin po wstrzyknięciu monitoruj wychwyt plazmidu i przenieś wszystkie młode do sześciu dołków do hodowli tkankowych, po jednym szczenię na studzienkę. Następnie załaduj jednomililitrową strzykawkę z 30 miligramami na mililitr Lucyfera w soli fizjologicznej lub PBS i podłącz igłę podskórną o rozmiarze 30.

Wstrzyknąć 30 mikrolitrów roztworu podskórnie między łopatki każdego szczeniaka, aby uniknąć zranienia szczeniaka, wstrzyknąć roztwór pod mały fałd skóry. Natychmiast przenieś młode do systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. Skonfiguruj sekwencję, aby uzyskać cztery kolejne obrazy w odstępach jednominutowych z automatyczną ekspozycją, dużym wygięciem i przysłoną równą jeden. Później.

Po około 17 dniach zwierzęta mogą zacząć tworzyć makroskopowe guzy wykrywalne przez bioluminescencję i histologię. Monitorowanie guzów może również potrwać do sześciu tygodni. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów roztworu lucyferiańskiego dootrzewnowo za pomocą igły o rozmiarze 26.

Po trzech minutach znieczulić zwierzęta w komorze znieczulenia tlenowego ISO i umieścić zwierzęta w komorze obrazowania wyposażonej w stożki do dyspersji fluoru ISO. Wykonaj serię sześciu zdjęć w dwuminutowych odstępach czasu z automatycznym czasem ekspozycji, średnim binningiem i przysłoną przy otwartej przysłonie wynoszącą jeden stopień przysłony. Obszar zainteresowania to zazwyczaj owal nad głową, mierzony intensywnością luminescencji u każdego zwierzęcia przy użyciu tych samych ustawień w celu scharakteryzowania histopatologicznych cech glejaków wywołanych przez SB.

C 57 czarnym sześciu nowonarodzonym myszom wstrzyknięto w P one plazmid i lucyferazy powlekającej w połączeniu z NRA S i SV 40 dużymi plazmidami T transpozonami Inod z onkogennym DNA. Alternatywnie, plazmid kodujący krótką spinkę do włosów P 53 z PDGF beta i reporterem A GFP wstrzyknięto w połączeniu z NRAS. Widoczna była martwica rzekomej palis, która była okołonaczyniowa i rozlana do mózgu.

Glejaki miąższowe były również monitorowane za pomocą bioluminescencji. Zwierzęta zwykle poddają się obciążeniu nowotworem. Gdy luminescencja osiągnęła intensywność od 10 do siódmej do 10 do dziewiątej skalibrowanej jednostki.

Mediana przeżywalności zwierząt była przewidywalnie zależna od kombinacji onkogennych transpozonów wstrzykiwanych do mózgu noworodka. Najbardziej agresywne nowotwory indukowano za pomocą NRS i SV 40 dużego antygenu T de novo, guzy charakteryzowały się ekspresją charakterystycznych cząsteczek. Powstające guzy wytwarzające ekspresję GFP indukowanego przez SHP 53 i nras wykazywały ekspresję markera nerwowych komórek macierzystych nestonu, a niektóre również wyrażały kwaśne białko fibrylarne gleju.

Po 56 dniach znaleziono guz otoczony licznymi astrocytami GFAP dodatnimi. Te komórki nowotworowe wyrażają neinę, ale nie GFAP. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować powstawanie glejaków, zawierających określone mutacje genetyczne poprzez wstrzyknięcia dokomorowe u noworodków myszy oraz jak monitorować postęp choroby za pomocą bioluminescencji.

W artykule znajdziesz szczegółowe informacje o tym, jak łatwo sklonować nowy plazmid trans pro, kodując interesujące nas geny, a także jak monitorować guzy i analizować je za pomocą histologii i immunohistochemii. Ponadto znajdziesz szczegółową metodę generowania nowych linii komórkowych glejaka od zwierząt z genetycznie modyfikowanymi nowotworami. Mamy nadzieję, że ten artykuł pomoże przyspieszyć odkrycie nowych metod leczenia tej wyniszczającej choroby u ludzi.