Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem tej procedury jest kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii zarodkowej przy użyciu nicienia C No Haitis elgan. Osiąga się to poprzez synchronizację robaków poprzez dodanie rozcieńczonego roztworu wybielacza do mieszanej populacji robaków szczepu C Elgan PXOL one GFP. Na tym etapie powstaje duża liczba zarodków chronionych przed wybielaczem przez skorupkę jaja.

Drugim krokiem jest wygenerowanie zsynchronizowanej populacji larw L one poprzez umożliwienie zarodkom wyklucia się w płynie bez jedzenia. Następnie robaki dorastają do czwartego stadium larwalnego lub L czterech, po czym są wystawione na działanie interesujących ich substancji chemicznych w płynie przez 65 godzin. Ostatnim etapem jest wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ekspresji reporterów GFP w zarodkach wewnątrz macicy robaków.

Ostatecznie odsetek zarodków z dodatnim wynikiem GFP w porównaniu z kontrolą DMSO odzwierciedla antygenowość badanych związków. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak modele Rodina lub testy hodowli komórkowych, jest to, że możemy ocenić geniczność i toksyczność linii zarodkowej substancji chemicznych w całym modelu zwierzęcym, jednocześnie wykonując test o wysokiej przepustowości podczas wykonywania procedury. Dzisiaj będzie to doktor habilitowany dr Daniella Perotti.

Robaki graficzne do tej procedury zostały wcześniej przygotowane zgodnie z opisem w dołączonym tekście protokołu, należy zebrać robaki GR z pożywki wzrostowej nicieni lub płytek NGM, myjąc je jednym do dwóch mililitrów M nine i przenosząc je do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Pozwól robakowi GR osadzać się na dnie stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów przez około pięć do 10 minut. Następnie usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka.

Przenieś osad robaka do dwóch do czterech mikroprobówek wirówkowych i dodaj jeden mililitr rozcieńczonego roztworu wybielacza do każdej probówki. Inkubować przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej. Monitoruj postęp reakcji pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że wszystkie robaki są martwe.

Nie wybielaj dłużej niż pięć minut, ponieważ zarodki mogą umrzeć. Zbierz robaki przez centryfuzję przez jedną minutę. Przy 3000 obr./min.

Usunąć supernat i dodać jeden mililitr sterylnego M 9 w celu zneutralizowania reakcji. Upewnij się, że wszystkie materiały, które mają kontakt z robakami po zabiegu wybielania, są sterylne. Umyj robaki dwukrotnie za pomocą pożywki M nine.

Usunąć supernatant i dodać M od dziewięciu do 100 do 200 mikrolitrów. Używając szklanej pipety do pastwiska, dodaj kroplę mieszanki robaków M nine, aby oczyścić płytki NGM i inkubować je przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić zarodkom wyklucie się bez jedzenia. Wzrost larw zostanie zatrzymany na etapie L, w dwóch etapach synchronizacji.

Stosuje się wybielanie i głód L, ponieważ kluczowe znaczenie ma osiągnięcie wysoce synchronicznej ciepłej populacji, aby zmaksymalizować liczbę larw L 4, które zostaną wykorzystane do ekspozycji. Jednego dnia po ustaleniu zsynchronizowanej populacji larw L one, należy zebrać larwy L one z przezroczystych płytek NGM. Umyj płytki jednym do dwóch mililitrów M nine i przenieś larwy L one do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Pozwól martwym dorosłym robakom osiąść na dnie stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów przez około pięć minut. Zbierz supernatant w miejscu, w którym znajdują się robaki L one, w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Wytrącić robaki przez centryfuzję przez dwie minuty przy 2 600 obr./min.

Usunąć supernatant pozostawiając około 500 mikrolitrów. Określ stężenie robaków w roztworze M nine, licząc liczbę robaków w kroplach o pojemności 10 mikrolitrów. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego policz co najmniej pięć kropli.

Dostosuj stężenie robaków do 20 do 25 robaków na mikrolitr w M dziewięć, a następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszanki robaka M dziewięć do płytek NGM. Siedząc z OP 50, karmiące się bakterie inkubują przez 65 godzin w temperaturze 15 stopni Celsjusza, aby umożliwić wzrost zsynchronizowanej populacji L one, aż osiągną etap L four. To badanie przesiewowe wykorzystuje CL przeciwko szczepowi, który zawiera fluorescencyjny reporter transkrypcyjny do wykrywania przerwania linii zarodkowej i indukcji aneuploidii zarodkowej.

Zebrać larwy L cztery z przezroczystych płytek NGM, myjąc płytki jednym do dwóch mililitrów M nine i przenosząc je do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Pozwól osadowi robaka L four na dno stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów przez około pięć do 10 minut. Następnie usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka.

Dodaj od trzech do pięciu mililitrów M nine i określ stężenie robaków w roztworze M nine, licząc liczbę robaków w 10 mikrolitrowych kroplach. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego policz co najmniej pięć kropli na każdą próbkę. Ponownie zawiesić robaki w stężeniu jednego robaka na mililitr w M dziewięć.

Przygotowane wcześniej bakterie OP 50 rozcieńczyć dziesięciokrotnie M nine. Upewnij się, że zawieszone bakterie osiągają temperaturę pokojową, ponieważ niższe temperatury wpływają na rozwój robaków, używając pipety wielokanałowej, najpierw dodaj 100 mikrolitrów mieszanki robaków M nine do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o głębokości dwóch mililitrów z okrągłym dnem. Następnie na końcu dodaj 400 mikrolitrów rozcieńczonych bakterii OP 50 do każdej studzienki.

Każda studnia będzie miała 100 robaków w 500 mikrolitrach. Dodać 0,5 mikrolitra badanej substancji chemicznej do żądanych studzienek, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 mikromolowych. Stężenie powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych chemicznych w CL elgan wystawia kontrole etanolu lub rozpuszczalnika DMSO przy końcowym stężeniu 0,1% jako kontrolę dodatnią.

Użyj 100 mikromolów bez kozolu. Uszczelnij płytkę za pomocą folii samoprzylepnej. Pamiętaj, aby dobrze uszczelnić płytę, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między studzienkami.

Owiń talerz folią aluminiową. Przenieść płytkę do wytrząsarki o odpowiedniej temperaturze na odpowiedni okres czasu. Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu około 20 stopni Celsjusza, ponieważ temperatura wpływa na wzrost robaków po zakończeniu ekspozycji chemicznej w wytrząsarce.

Pozostaw 96-dołkowe płytki na 10 do 15 minut, aby dorosłe robaki mogły osiąść na dnie płytki za pomocą wielokanałowej pipety. Usuń 350 mikrolitrów M nine z każdej studzienki, uważając, aby nie przeszkadzać robakom na dnie płytki. Umyj robaki jednym mililitrem M nine i pozwól talerzowi ponownie odpocząć przez 10 do 15 minut, aby dorosłe robaki mogły osiąść na dnie.

Usuń jeden mililitr M nine z każdej studzienki, bardzo uważając, aby nie przeszkadzać robakom na dnie płytki. Resus, zawieś robaki w pozostałym M dziewięciu. Zbierz 100 mikrolitrów mieszanki robaków M nine z płytki 96-dołkowej i załaduj ją do dołków czarnej płytki z przezroczystym dnem 384 dołków.

Powtórz proces, używając robaków z 4 96-dołkowych płytek, aż wszystkie dołki 384-dołkowej płytki zostaną załadowane. Ważne jest, aby wszystkie studzienki miały taką samą objętość, aby zwiększyć wydajność i szybkość autofokusa podczas procesu akwizycji obrazu. Następnie dodaj jeden mikrolitr lale do każdej studzienki i pozwól robakom inkubować przez około 30 minut.

Lale działa jako agonista receptora acetylocholiny i unieruchamia robaki, przenosi płytkę do mikroskopu o szerokim polu widzenia o wysokiej zawartości, zdolnego do automatycznego obrazowania. Korzystaj z oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów o wysokiej zawartości zgodnie z wytycznymi producenta. Wybierz cztery obiektywy x, aby uzyskać jeden obraz na.

Dobrze dostosuj parametry obrazowania GFP do 45 milisekund ekspozycji i rozdzielczość obrazu do 2160 na 2160. Rozpocznij akwizycję obrazu, narażone robaki są obrazowane bezpośrednio na płytkach 384-dołkowych. Liczba robaków zawierających co najmniej jeden zarodek z dodatnim wynikiem GFP jest liczona dla każdej studzienki i normalizowana przez całkowitą liczbę robaków w tej studni, jak pokazano tutaj.

Narażenie na czynniki chemiczne, takie jak trucizna mikrotubul AOL bez kodu, prowadzi do indukcji wysokiego odsetka zarodków wykazujących ekspresję GFP w porównaniu z kontrolą DMSO. Zarodki GFP dodatnie są znacznie jaśniejsze niż słaba fluorescencja tła obserwowana w innych zarodkach, a także autofluorescencja obserwowana w jelitach zwierząt. Czerwona strzałka wskazuje zarodki z dodatnim wynikiem GFP wyraźnie widoczne w macicy robaka leczonego AOL bez kodu.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie DNA robaków, aby uzyskać bardziej szczegółowe spojrzenie na wpływ substancji chemicznych na linię zarodkową. Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się toksykologią szybko ocenić szkodliwy wpływ substancji chemicznych na rozrodczość i linię zarodkową.