Name: Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę oceny toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans. Technika fluorescencyjna umożliwia szybkie badanie wpływu substancji na rozwój zarodków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować następującym źródłom finansowania: NIH ES020353 oraz nagrodzie Colgate-Palmolive Alternative Research Grant za umożliwienie tej pracy.

1. Przygotowanie bakterii żerujących
UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie bakterii żerujących (szczep E. coli OP50).
<ol>
	<li>Wyizolować pojedynczą kolonię szczepu E. coli OP50 z płytki agarowej bulionu lizogennego (LB) i aseptycznie zaszczepić w 300 ml autoklawowanego bulionu LB.</li>
	<li>Pozostawić zaszczepioną kulturę do wzrostu przez noc w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia nasycenia.</li>
	<li>Przenieś OP50 do 6 sterylnych, wstępnie zważonych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Osadzaj bakterie przez wirowanie przez 5 minut przy 6 000 obr./min (5 000 x g).</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i przemyć bakterie 50 ml sterylnego M9. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Po drugim praniu wyjmij pozostały M9, upewniając się, że w tubie nie pozostał żaden M9.</li>
	<li>Określić masę osadu, ważąc probówkę zawierającą osad bakterii i odejmując wagę probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zawiesić osad w M9 w stężeniu 100 mg/ml.</li>
	<li>Przechowywać roztwór OP50 w temperaturze 4 °C do czasu, gdy zostanie wykorzystany do hodowli robaków.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki Petriego dla nicieni (NGM)
UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie płytek Petriego NGM, które są płytkami, na których robaki C. elegans są rutynowo utrzymywane w laboratorium.
<ol>
	<li>Autoklawować podłoże agarowe NGM.</li>
	<li>Stosując sterylne procedury, dozować 17 ml roztworu agarowego NGM na 6-centymetrowe płytki Petriego za pomocą pompy perystaltycznej. 
	UWAGA: Stała ilość agaru w płytkach zmniejsza potrzebę ponownego ustawiania ostrości mikroskopu podczas przełączania z jednej płytki na drugą.</li>
	<li>Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na 2-3 dni przed użyciem, aby agar zastygł i pozwolił nadmiarowi wilgoci odparować.</li>
	<li>Wysiewaj płytki NGM przy użyciu sterylnej techniki. Nałóż 1-2 krople płynnej kultury OP50 i rozprowadź za pomocą szklanej pałeczki. Upewnij się, że nie rozprzestrzeniasz trawnika bakteryjnego aż do krawędzi talerzy.</li>
	<li>Pozwól trawnikowi OP50 rosnąć przez 1-2 dni w temperaturze pokojowej przed użyciem płytek do hodowli robaków.</li>
</ol>
3. Przygotowanie synchronicznej populacji robaków
UWAGA: Cykl życiowy C. elegans składa się z etapu embrionalnego, czterech stadiów larwalnych (L1-L4) i dorosłości. W tej sekcji opisano przygotowanie populacji robaków synchronicznej z wiekiem. Wszystkie materiały mające kontakt z C.elegans po zabiegu wybielania muszą być sterylne.
<ol>
	<li>Dzień 1 – Przygotowanie populacji robaka gravid
	<ol>
		<li>Używaj płytek NGM, w których większość populacji robaków składa się z wygłodzonych larw L1.</li>
		<li>Zbierz larwy L1 za pomocą wysterylizowanego kilofa do robaków i przenieś je na świeże 6 cm płytki NGM obsiane OP50. Inkubować przez około 65 godzin w temperaturze 20 °C, aż większość dorosłych robaków stanie się ciężarna. Aby uniknąć przepełnienia płytki i umożliwić robakom wzrost bez zubożania bakterii, nie należy przenosić więcej niż jednego lub dwóch skupisk larw L1 na każdą świeżą płytkę NGM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4 – Ustalenie zsynchronizowanej populacji larw L1
	<ol>
		<li>Zebrać grawitacyjne robaki z płytek NGM, przemywając je 1-2 ml M9 i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Pozwól, aby grawitacyjne robaki osiadły na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml przez około 5-10 minut. Usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka.</li>
		<li>Przenieś osad robaka do 2-4 probówek mikrowirówek i dodaj 1 ml roztworu wybielacza/NaOH. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Monitorować postęp reakcji pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że wszystkie robaki są martwe. Nie wybielaj dłużej niż 5 minut, ponieważ zarodki mogą umrzeć.</li>
		<li>Zebrać robaki, wirując przez 1 minutę przy 3 000 obr./min (900 x g). Usunąć supernatant i dodać 1 ml sterylnego M9 w celu zneutralizowania reakcji.</li>
		<li>Umyj robaki dwukrotnie, odwirowując przez 1 minutę przy 3 000 obr./min (900 x g).</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać M9 do objętości 100-200 μl.</li>
		<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura dodać kroplę mieszanki robak/M9 w celu oczyszczenia płytek NGM i inkubować je przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 20 °C, aby umożliwić wyklucie się zarodków. 
		UWAGA: Bez pożywienia wzrost larw zostanie zatrzymany na etapie L1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5 – Ustalenie zsynchronizowanej populacji larw L4
	<ol>
		<li>Zebrać larwy L1 z przezroczystych płytek NGM, przemywając płytki 1-2 ml M9 i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Pozwól, aby martwe dorosłe robaki osiadły na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml przez około 5 minut.</li>
		<li>Zebrać supernatant, w którym znajdują się robaki L1, do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wytrącić robaki przez odwirowanie przez 2 minuty przy 2 600 obr./min (1 000 x g).</li>
		<li>Usunąć supernatant pozostawiając około 500 μl.</li>
		<li>Określić stężenie robaków w roztworze M9, licząc liczbę robaków w kroplach o objętości 10 μl za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Policz co najmniej 5 kropli.</li>
		<li>Dostosuj stężenie robaków do 20-25 robaków/μl i dodaj 50 μl mieszanki robak/M9 do płytek NGM wysianych OP50.</li>
		<li>Inkubować przez 65 godzin w temperaturze 15 °C (do inkubacji do końca weekendu), aby umożliwić wzrost zsynchronizowanej populacji L1 aż do osiągnięcia stadium L4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Narażenie robaków na chemikalia w płytkach 96-dołkowych
UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie reportera transkrypcyjnego Pxol1::gfp zawierającego szczep C. elegans do badania przesiewowego pod kątem indukcji aneuploidii.
<ol>
	<li>Zebrać larwy L4 z przezroczystych płytek NGM, przemywając płytki 1-2 ml M9 i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Pozwól robakom L4 osiąść na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml przez około 5-10 minut. Usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka.</li>
	<li>Dodać 3-5 ml M9 i oznaczyć stężenie robaków w roztworze M9, licząc liczbę robaków w 10 μl kropli za pomocą stereomikroskopu. Odliczyć co najmniej 5 kropli na każdą próbkę.</li>
	<li>Zawiesić robaki w stężeniu 1 000 robaków/ml w M9.</li>
	<li>Rozcieńczyć bakterie OP50 z sekcji 1 10-krotnie za pomocą M9. Upewnij się, że zawieszone bakterie osiągają temperaturę pokojową, ponieważ niższa temperatura wpływa na rozwój robaków.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej najpierw dodaj 100 μl mieszanki robak/M9 (z kroku 4.4), a następnie dodaj 400 μl rozcieńczonych bakterii OP50 (z kroku 4.5) do każdego dołka 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie o głębokości 2 ml. Na koniec każda studnia będzie miała 100 robaków w 500 μl.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl badanej substancji chemicznej lub odpowiedniej kontroli do żądanych studzienek, aby uzyskać sugerowane stężenie końcowe 100 μM, stężenie powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych substancji chemicznych w C. elegans12. Wystawić na działanie kontrolnego rozpuszczalnika etanolowego lub rozpuszczalnika DMSO w końcowym stężeniu 0,1%. 
	UWAGA: Zalecamy stosowanie nokodazolu (100 μM) jako kontroli dodatniej.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę za pomocą folii samoprzylepnej. Pamiętaj, aby dobrze uszczelnić płytę, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między studzienkami.</li>
	<li>Owiń talerz folią aluminiową.</li>
	<li>Przenieść płytkę do wytrząsarki (170-180 obr./min) o odpowiedniej temperaturze na odpowiedni czas (24 lub 65 godzin). Temperatura w pomieszczeniu wpływa na rozwój robaków; utrzymywać temperaturę około 20 °C.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazu robaków grawitacyjnych w płytce 384-dołkowej
UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie mikroskopu o wysokiej zawartości do obrazowania narażonych robaków Pxol1::gfp, aby zobrazować ekspresję GFP w zarodkach w macicy dorosłych hermafrodytów. Do każdej płytki 384-dołkowej, która ma być przesiewana, należy użyć robaków z 4 płytek 96-dołkowych.
<ol>
	<li>Po ekspozycji chemicznej w wytrząsarce pozostaw 96-dołkową płytkę na 10-15 minut, aby dorosłe robaki mogły osiąść na dnie płytki.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej usuń 350 μl M9, bardzo uważając, aby nie naruszyć robaków na dnie płytki.</li>
	<li>Umyć robaki 1 ml M9 i powtórzyć krok 5.1.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej usunąć 1 ml wstrzykiwacza M9, bardzo uważając, aby nie naruszyć robaków znajdujących się na dnie płytki.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej ponownie zawiesić robaki w pozostałym M9 i zebrać 100 μl mieszanki robak/M9 z 96-dołkowych płytek i załadować je do dołków 384-dołkowej płytki o czarnych ściankach/przezroczystym dnie. Powtórz proces, używając robaków z 4 x 96-dołkowych płytek, aż wszystkie dołki płytki 384-dołkowej zostaną załadowane. 
	UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie studzienki miały taką samą objętość, aby zwiększyć wydajność i szybkość autofokusa podczas procesu pozyskiwania obrazu. Każda studzienka powinna zawierać od 80 do 100 robaków.</li>
	<li>Dodać 1 μl lewamizolu (100 μM) do każdej studzienki i pozwolić robakom inkubować przez około 30 minut. 
	UWAGA: Lewaizol działa jako agonista receptora acetylocholiny i unieruchamia robaki.</li>
	<li>Przenieś płytkę do szerokokątnego mikroskopu o wysokiej zawartości, który jest w stanie zapewnić automatyczne obrazowanie.</li>
	<li>Do akwizycji obrazu należy używać oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów o wysokiej zawartości zgodnie z wytycznymi producenta. Wybierz obiektyw 4X, aby uzyskać 1 obraz na dołek.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do akwizycji obrazu należy ustawić parametry obrazowania GFP na 45 ms ekspozycji i rozdzielczość obrazu na 2 160 x 2 160.</li>
	<li>Zbierz dane jako liczbę robaków z dodatnim wynikiem GFP podzieloną przez całkowitą liczbę robaków w odwiercie, przy czym ta ostatnia miara jest stosunkowo spójna między odwiertami.</li>
</ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T">http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T</a> (2009).</li>
<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+in+humans%3A+incidence%2C+origin+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li>
<li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2006%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li>
<li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+mammals%3A+recombination%2C+non-disjunction+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li>
<li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , The National Academies Press. (2007).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda stanowi pierwszą zakrojoną na szeroką skalę strategię identyfikacji substancji toksycznych dla linii rozrodczej. Wymaga to użycia transgenicznego szczepu zawierającego GFP Pxol-1::GFP , który wiernie informuje o indukcji aneuploidii we wczesnych zarodkach, który jest używany jako wskaźnik dysfunkcji linii zarodkowej. Metoda polega na starannej synchronizacji populacji robaków C. elegans i ekspozycji robaków na chemikalia w formacie 96-dołkowym, a następnie obrazowaniu robaków z doda...

Istnieje około 87 000 substancji chemicznych zarejestrowanych do handlu w Stanach Zjednoczonych, jednak tylko niewielka liczba z nich została przetestowana pod kątem potencjalnych skutków zdrowotnych1. Spośród tych, które zostały przetestowane, tylko część została oceniona pod kątem wpływu na zdrowie reprodukcyjne, częściowo ze względu na trudności w określeniu zmian we wczesnych zdarzeniach rozrodczych u ssaków, zwłaszcza podczas rozwoju i różnicowania żeńskich komórek rozrodczych. Rzeczywiście, pierwsze zdarzenia mejotyczne mają miejsce we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego u samic ssaków, a zatem są trudno dostępne i zebrane w ilościach odpowiednich do celów przesiewowych.
Linia zarodkowa stanowi kluczowe ogniwo między pokoleniami, a jej właściwa funkcja zależy od precyzyjnego wykonania skomplikowanego programu podziału komórkowego i chromosomowego, zwanego mejozą. Rozregulowanie procesu mejotycznego może skutkować zmniejszoną płodnością oraz produkcją gamet i zarodków z nieprawidłową liczbą chromosomów, stan określany mianem aneuploidii. Błędy segregacji chromosomów w mejozie są bardzo istotne dla zdrowia ludzkiego. Nieprawidłowości chromosomowe są powszechne, z częstością 1 na 150 żywych urodzeń, trisomia 21, 18 i 13, a także błędy chromosomowe X i Y są najbardziej rozpowszechnionymi typami2,3. Co więcej, wrodzone wady rozwojowe, w tym te o podłożu chromosomalnym, są główną przyczyną zgonów niemowląt w USA.4 Pomysł, że wpływy środowiskowe mogą wpływać na segregację chromosomową i zachowanie, nie jest nowy5, ale nadal jest słabo poznany. Dlatego tak ważne jest zbadanie, które z substancji chemicznych wprowadzanych do naszego środowiska zakłócają płodność człowieka, wczesny rozwój i ogólne zdrowie reprodukcyjne.
W świetle tych ograniczeń modeli ssaków, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test przesiewowy do testowania toksyczności reprodukcyjnej glisty C. elegans. Zmobilizowaliśmy kilka ważnych cech oferowanych przez ten powszechnie stosowany system modeli genetycznych, takich jak jego niewielkie rozmiary, niski koszt, krótki cykl reprodukcyjny, wysoki odsetek komórek rozrodczych i łatwość manipulacji6. Robaki mogą być hodowane na 96-dołkowych płytkach lub w dużych ilościach płynnych kultur, a ze względu na ich przezroczystość mogą być bezpośrednio obrazowane na płytkach w celu wykrycia reporterów fluorescencyjnych. Test opisany poniżej wykorzystuje te cechy i wykorzystuje szczep robaka zawierający fluorescencyjny reporter Pxol-1::GFP do wykrywania przerwania linii zarodkowej i indukcji aneuploidii zarodkowej.
Użycie tego szczepu reporterowego opiera się na ogólnie rzadkim występowaniu samców w populacji głównie hermafrodytycznych robaków. Ci mężczyźni (<0,2%) naturalnie pochodzą z błędu w segregacji chromosomuX 7. Ponieważ jednak zaburzenie linii zarodkowej często prowadzi do błędów w segregacji autosomów i heterochromosomów, koreluje zarówno z podwyższoną częstością występowania fenotypu męskiego (błędna segregacja X), jak i śmiertelnością zarodka (błędna segregacja autosomów). Aby łatwo wykryć indukcję samców, jednocześnie omijając problem śmiertelności embrionalnej, stosuje się promotor specyficzny dla samców (xol-1) do kierowania ekspresją GFP we wczesnych zarodkach nadal zawartych w macicy robaka. W związku z tym pojawienie się zarodków wykazujących ekspresję GFP jest wykorzystywane jako wskaźnik zastępczy dla obecności zarodków aneuploidalnych. Metoda ta była wcześniej stosowana do identyfikacji genów zaangażowanych w utrzymanie linii zarodkowej i mejozę8,9. Przystosowany do badań przesiewowych chemicznych, szczep ten jest stosowany w przesiewaniu o średniej i wysokiej przepustowości. Co ważne, szczep wiernie oddaje aneugenność substancji chemicznych i dlatego jest istotny dla punktów końcowych rozrodczości ssaków10. Opisany tutaj test będzie szczególnie przydatny dla toksykologów w przemyśle farmaceutycznym i chemicznym, którzy chcą szybko ocenić toksyczność chemikaliów w odniesieniu do punktów końcowych reprodukcji. Co więcej, test ten jest w pełni zgodny z priorytetami rządowymi podkreślonymi w raporcie Toksyczność w XXI wieku 11.

<table><tbody><tr><td>60 mm Wentylowane, ostre krawędzie szalki Petriego</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96-well clear round den, 2 ml polipropylenowa płytka głębinowa</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bactoo-trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Centrum</td><td></td> <td>Genetyki Caenorhabditis<a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 dołki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek lewamizolu</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu bezwodny (MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>Akwizycja i pozyskiwanie obrazów o wysokiej zawartości MetaXpress Oprogramowanie analityczne</td> Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Folie ze sztucznego jedwabiu do hodowli biologicznych</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Mikroskop stereoskopowy</td><td></td> <td>VWR BDH0316</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Ten mikroskop ma całkowite powiększenie od 3,35X do 300X. Sprawdzi się każdy mikroskop o podobnych parametrach.</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter szczep</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identyfikacja toksyczności reprodukcyjnej tysięcy substancji chemicznych obecnych w naszym środowisku była jednym z najbardziej kuszących wyzwań w dziedzinie zdrowia środowiskowego. Wynika to po części z niedostatku systemów modelowych, które mogą (1) dokładnie podsumować kluczowe cechy procesów rozrodczych oraz (2) zrobić to w sposób średnio lub wysokoprzepustowy, bez potrzeby stosowania dużej liczby kręgowców.
Opisujemy tutaj test na nicieniu C. elegans, który pozwala na szybką identyfikację substancji toksycznych dla linii zarodkowej poprzez monitorowanie indukcji aneuploidalnych zarodków. Wykorzystując linię reporterową GFP, błędy w segregacji chromosomów wynikające z przerwania linii zarodkowej są łatwo wizualizowane i określane ilościowo za pomocą automatycznej mikroskopii fluorescencyjnej. W ten sposób badanie przesiewowe określonego zestawu związków pod kątem jego toksyczności można przeprowadzić w formacie płytki od 96 do 384 dołków w ciągu kilku dni. Wtórna analiza dodatnich trafień może być przeprowadzona w celu określenia, czy nieprawidłowości chromosomowe pochodzą z rozerwania mejotycznego, czy z wczesnych błędów segregacji chromosomów embrionalnych. Ogólnie rzecz biorąc, test ten stanowi szybką strategię pierwszego przejścia do szybkiej oceny dysfunkcji linii zarodkowej po ekspozycji chemicznej.

Narażenie szczepu reporterowego Pxol-1::GFP na czynniki chemiczne, takie jak trucizna mikrotubul Nocodazole (Rysunek 1), prowadzi do indukowania wysokiego odsetka embrionów wykazujących ekspresję GFP w macicach narażonych dorosłych hermafrodytów w porównaniu z kontrolą DMSO. Embriony GFP-dodatnie są znacznie jaśniejsze niż słaba fluorescencja tła obserwowana w innych embrionach, a także autofluorescencja obserwowana w jelitach zwierząt. Narażone nicienie są obrazowane bezpośrednio na płytkach 38...

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kompleksowa ocena chemicznej toksyczności linii zarodkowej z wykorzystaniem nicienia C. elegans. Osiąga się to poprzez wstępną synchronizację robaków za pomocą dodania rozcieńczonego roztworu wybielacza do populacji robaków szczepu C. elegans PXOL1 GFP znajdujących się na różnych etapach rozwoju. Krok ten pozwala na uzyskanie dużej liczby embrionów, które są chronione przed wybielaczem przez skorupkę jajową.Drugim krokiem jest uzyskanie zsynchronizowanej populacji larw w stadium L1 poprzez pozwolenie zarodkom na wyklucie się w cieczy bez pożywki. Następnie nicienie rozwijają się do czwartego stadium larwalnego (L4), po którym są eksponowane na badane substancje chemiczne w cieczy przez 65 godzin. Ostatnim etapem jest wizualizacja ekspresji reporterów GFP w zarodkach znajdujących się w macicy nicieni za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Ostatecznie proporcja zarodków pozytywnych pod kątem GFP w porównaniu z kontrolą DMSO odzwierciedla antygenność testowanych związków. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak modele Rodina czy testy hodowli komórkowych, jest możliwość oceny geniczności i toksyczności dla linii zarodkowej substancji chemicznych w modelu całego organizmu, przy jednoczesnym przeprowadzeniu wysokoprzepustowego testu podczas realizacji procedury. Dzisiejszą prezentację poprowadzi dr Daniella Perotti, pracownik naukowy na stopniu postdoctoral.Robaki grastyczne do tej procedury zostały przygotowane wcześniej zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście protokołu. Należy zebrać robaki GR z podłoża wzrostowego dla nicieni lub płytek NGM, przemywając je jedną lub dwiema mililitrami M9 i przenosząc do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pozostawić robaki GR do osadzenia się na dnie probówki 15 ml przez około 5-10 minut. Następnie usunąć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu z robakami.Przenieś osad z nicieniami do dwóch lub czterech probówek do mikrowirówki i dodaj jeden mililitr rozcieńczonego roztworu wybielacza do każdej probówki. Inkubuj przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej. Monitoruj przebieg reakcji pod stereomikroskopem, aby potwierdzić, że wszystkie nicienie obumarły.Nie należy wybielać przez więcej niż pięć minut, ponieważ embriony mogą obumrzeć. Zebrać nicienie poprzez wirowanie przez jedną minutę przy 3000 RPM.Usunąć nadsącz i dodać jeden mililitr sterylnego podłoża M9, aby zneutralizować reakcję. Należy upewnić się, że wszystkie materiały mające kontakt z nicieniami po obróbce wybielaczem są sterylne. Przemyć nicienie dwukrotnie w podłożu M9.Usunąć nadsącz i dodać od 100 do 200 µL buforu M9. Za pomocą szklanej pipety Pasteura nanieść kroplę mieszaniny nicieni w buforze M9 na czyste płytki NGM i inkubować je przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 20 °C, aby umożliwić wyklucie się embrionów bez dostępu do pożywki. Wzrost larw zostanie zatrzymany na etapie L1. Dwa etapy synchronizacji.Wybielanie i głodzenie w stadium L stosuje się, ponieważ kluczowe jest uzyskanie wysoce zsynchronizowanej populacji w ciepłej temperaturze, aby zmaksymalizować liczbę larw L4 wykorzystywanych do ekspozycji. Jeden dzień po utworzeniu zsynchronizowanej populacji larw L1, należy zebrać larwy L1 z przeźroczystych płytek NGM. Płytki należy przemyć od 1 do 2 ml M9 i przenieść larwy L1 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.Pozostawić martwe dorosłe nicienie do osadzenia się na dnie stożkowej probówki 15 ml przez około pięć minut. Zebrać nadsącz zawierający larwy L1 do nowej stożkowej probówki 15 ml. Osadzić nicienie poprzez wirowanie przez dwie minuty przy 2 600 RPM.Usunąć supernatant, pozostawiając około 500 µL. Określić stężenie nicieni w roztworze M9 poprzez policzenie liczby nicieni w kroplach o objętości 10 µL. Używając mikroskopu stereoskopowego, przeliczyć co najmniej pięć kropli.Dostosuj stężenie nicieni do 20–25 osobników na µL w podłożu M9, a następnie nanieś 50 µL mieszaniny nicieni w M9 na płytki NGM. Zasiając je z bakteriami pokarmowymi OP 50, inkubuj przez 65 godzin w temperaturze 15 °C, aby zsynchronizowana populacja w stadium L1 mogła wzrosnąć do stadium L4. W tym przesiewie wykorzystuje się szczep kontrolny zawierający fluorescencyjny reporter transkrypcyjny do wykrywania zaburzeń linii zarodkowej oraz indukcji aneuploidii embrionalnej.Zebrać larwy w stadium L4 z przeźroczystych płytek NGM, przemywając płytki od jednym do dwóch mililitrów M9 i przenosząc je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pozostawić nicienie L4 do osadzenia się na dnie probówki 15 ml przez około 5 do 10 minut. Następnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu z nicieni.Dodać od trzech do pięciu mililitrów M9 i określić stężenie nicieni w roztworze M9, licząc liczbę nicieni w kroplach o objętości 10 µL. Używając stereomikroskopu, przeliczyć co najmniej pięć kropli dla każdej próbki. Resuspendować nicienie w M9 do stężenia jeden nicień na mililitr.Rozcieńcz wcześniej przygotowane bakterie OP 50 dziesięciokrotnie w pożywce M9. Upewnij się, że resuspenderowane bakterie osiągnęły temperaturę pokojową, ponieważ niższe temperatury wpływają na rozwój nicieni. Używając najpierw pipety wielokanałowej, dodaj 100 µL mieszaniny M9 dla nicieni do każdego dołka 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem o pojemności 2 ml. Następnie, na koniec dodaj do każdego dołka 400 µL rozcieńczonych bakterii OP 50.Każda studzienka będzie zawierać 100 nicieni w 500 µL. Do wybranych studni należy dodać 0,5 µL badanego związku chemicznego, aby uzyskać stężenie końcowe 100 µM. Jest to stężenie powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych w CL elgan; jako kontrolę pozytywną należy zastosować kontrole rozpuszczalnika (etanol lub DMSO) w stężeniu końcowym 0,1%.Użyć stężenia 100 µM bez kosolwentu. Uszczelnić płytkę za pomocą folii przylepnej. Należy upewnić się, że płytka jest szczelnie zamknięta, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej między studzienkami.Owiń płytkę folią aluminiową. Przenieś płytkę do inkubatora z wytrząsaniem o odpowiedniej temperaturze na odpowiedni czas. Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu na poziomie około 20 °C, ponieważ temperatura wpływa na wzrost nicieni po zakończeniu ekspozycji chemicznej w inkubatorze.Pozostawić płytki 96-dołkowe na 10 do 15 minut, aby dorosłe nicienie osiadły na dnie płytki, używając pipety wielokanałowej. Usunąć 350 µL medium M9 z każdego dołka, uważając, aby nie poruszyć nicieni znajdujących się na dnie płytki. Przemyć nicienie 1 mL medium M9 i ponownie pozostawić płytkę na 10 do 15 minut, aby dorosłe nicienie osiadły na dnie.Usuń jeden mililitr pożywki M9 z każdej studni, uważając, aby nie zakłócić rozmieszczenia nicieni na dnie płytki. Resuspenduj nicienie w pozostałej pożywce M9. Pobierz 100 µL mieszaniny nicieni z pożywką M9 z płytki 96-dołkowej i nanieś ją do studni czarnej płytki 384-dołkowej z przezroczystym dnem.Powtórz proces, używając nicieni z 4 płytek 96-dołkowych, aż wszystkie dołki płytki 384-dołkowej zostaną wypełnione. Ważne jest, aby we wszystkich dołkach znajdowała się taka sama objętość, co pozwoli zwiększyć wydajność i szybkość autofokusu podczas procesu akwizycji obrazów. Następnie dodaj jeden µL lale do każdego dołka i inkubuj nicienie przez około 30 minut.Lale działa jako agonista receptorów acetylocholiny i unieruchamia nicienie; przenieś płytkę do szerokopolowego mikroskopu wysokoprzepustowego (high content microscope) umożliwiającego zautomatyzowane obrazowanie. Skorzystaj z oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów wysokoprzepustowych zgodnie z wytycznymi producenta. Wybierz obiektyw 4x, aby pozyskać jeden obraz na każdą próbkę.Parametry obrazowania GFP należy ustawić na czas ekspozycji 45 ms oraz rozdzielczość obrazu 2160 na 2160. Rozpocznij akwizycję obrazów; eksponowane nicienie są obrazowane bezpośrednio na płytkach 384-dołkowych. Dla każdego dołka zlicza się liczbę nicieni zawierających co najmniej jeden zarodek dodatni pod kątem GFP, a następnie normalizuje ją przez całkowitą liczbę nicieni w tym dołku, jak pokazano tutaj.Ekspozycja na środki chemiczne, takie jak trucizna mikrotubul no-code AOL, prowadzi do indukowania wysokiego odsetka embrionów wykazujących ekspresję GFP w porównaniu z kontrolą DMSO. Embriony dodatnie pod kątem GFP są znacznie jaśniejsze niż słaba fluorescencja tła obserwowana w innych embrionach, a także autofluorescencja widoczna w jelitach zwierząt. Czerwona strzałka wskazuje embriony dodatnie pod kątem GFP, wyraźnie widoczne w macicy nicienia traktowanego no-code AOL.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak barwienie DNA nicieni, aby dokładniej przyjrzeć się wpływowi substancji chemicznych na linię zarodkową. Technika ta pozwala badaczom z zakresu toksykologii na szybką ocenę toksyczności rozrodczej oraz toksyczności wobec linii zarodkowej substancji chemicznych.

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kompleksowa ocena toksyczności chemikaliów dla linii komórkowych za pomocą nicienia Caenorhabditis elegans

Ten film przedstawia test krótkoterminowego przeżycia, który testuje leczenie ostrej toksyczności lub testuje szczep genetyczny pod kątem odporności na stan toksyczny. Przykładowy protokół pokazuje przykładowy test przeżycia, w którym robaki są testowane pod kątem ich odporności na stres oksydacyjny wywołany przez parakmet (PQ).

C. elegans (C. elegans) Test przeżycia: test toksyczności krótkoterminowej

Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.

A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe może poważnie wpłynąć na rozwój z długoterminowymi skutkami. Przedstawiono szczegółowe protokoły ilustrujące strategię wykorzystującą skuteczny model laboratoryjny do badania wpływu wczesnej ekspozycji embrionalnej na bisfenol A. Zapewniamy testy płodności i behawioralne w celu monitorowania skuteczności naszych testów biologicznych narażenia na toksyny.

Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Młode dorosłe nicienie Caenorhabditis elegans są narażone na różne stężenia komercyjnych pestycydów lub innych substancji toksycznych przez 2-24 godziny. Następnie można wizualizować różne neurony za pomocą szczepów wykazujących ekspresję fluorescencyjną. W artykule pokazano, w jaki sposób można wystawić nicienie na działanie pestycydów i ocenić uszkodzenia neuronów.

Badanie wpływu pestycydów na neurony Caenorhabditis elegans

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Poznaj metodę oceny toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans. Technika fluorescencyjna umożliwia szybkie badanie wpływu substancji na rozwój zarodków.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów