Name: Metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metody ilościowej analizy składników odżywczych w pierzgi i pyłku pszczelego u dwóch podgatunków pszczoły miodnej. Technika ta pozwala badać wpływ diety na poziom białek w hemolimfie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Monie Chambers, Geoffreyowi Hidalgo i Maurissie Two Two za ich pomoc techniczną. Dziękujemy również dr Earlowi White'owi za analizę aminokwasów, dr Rogerowi Simondsowi za analizę pyłku pod kątem pestycydów oraz dr Stanleyowi S. Schneiderowi, Vanessie Corby-Harris i Kirkowi Andersonowi za ich recenzje i dyskusję na temat wcześniejszych wersji manuskryptu oraz wiele pomocnych sugestii.

1. Pozyskiwanie pierzgi z kolonii AHB i EHB
<ol>
	<li>Umieść pułapki pyłkowe na rodzinach pszczół miodnych i zbieraj pyłek. Zmiel pyłek na drobny proszek (podobny do pyłku zrzucanego z pylników) za pomocą młynka do kawy.</li>
	<li>Założyć po 5 kolonii AHB i EHB w zamkniętym obszarze lotów (EFA), tak aby pszczoły żywiły się wyłącznie dostarczonym pyłkiem. Aby zapobiec przemieszczaniu się robotnic między koloniami EHB i AHB, należy podzielić EFA na oddzielne sekcje, aby pszczoły nie mogły między nimi przechodzić. W każdej sekcji NNKT należy umieścić indywidualne kolonie EHB lub AHB z 3 500-4 000 pszczół robotnic, plastr woskowy z nektarem, miodem, niedojrzałym czerwiem i pustym plastrem. 
	UWAGA: Kolonie nie mają zmagazynowanego pyłku w momencie założenia. Szybkość przechowywania pyłku można zwiększyć, nie uwzględniając królowej niosek w koloniach.</li>
	<li>Nakarmić kolonie zmielonym pyłkiem, umieszczając tackę z pyłkiem w każdej sekcji NNKT. Rozprowadzanie około 60 g pyłku na każdej tacy, aby pszczoły żerujące mogły zbierać go w postaci ładunków cielesnych i przechowywać pyłek w swoich koloniach jako pierzch. Kontynuuj dostarczanie świeżego pyłku na każdą tacę codziennie przez 3 tygodnie.</li>
	<li>Pierzga z kolonii europejskich nazywana jest europejską pierzchą (EBB), a z kolonii afrykańskich nazywana jest pierzchą afrykanizowaną (ABB).</li>
</ol>
2. Karmienie pszczół w klatkach
<ol>
	<li>Umieść ramki z zapieczętowanym czerwiem robotnic z kolonii AHB i EHB w oddzielnych klatkach wyłaniających się w pomieszczeniu środowiskowym ustawionym na 32-34 °C i 40% wilgotności względnej.</li>
	<li>Kiedy robotnice wyjdą na zewnątrz i osiągną wiek około 24 godzin, ustaw 12 klatek do testów biologicznych z pleksiglasu (wymiary = 11,5 x 7,5 x 16,5 cm3) i dodaj do każdej klatki 100 nowo powstałych pszczół robotnic EHB lub 100 nowo wynurzonych pszczół robotnic AHB. Umieść fragment grzebienia ze znaną liczbą komórek EBB lub ABB (24-30 komórek na klatkę) w każdej klatce, aby uzyskać następujące kombinacje traktowania: AHB karmione ABB, EHB karmione ABB, AHB karmione EBB i EHB karmione EBB. (4 zabiegi; 6 klatek na zabieg; łącznie 24 klatki).</li>
	<li>Do każdej klatki dodać fiolki z wodą i 50% roztwór miodu i wody o objętościowym składzie. Napełniaj fiolki z miodem i wodą codziennie przez 11-dniowy okres badania.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek pszczół robotnic i pierzgi oraz szacowanie zużycia
<ol>
	<li>Pobranie próbki od 10 nowo wynurzonych robotnic EHB i AHB przed umieszczeniem ich w klatkach. Odnieś się do nich jako do pszczół dnia 0 i niech służą jako punkt odniesienia dla stężeń białka w hemolimfie.</li>
	<li>Usuń 10 pszczół z każdej klatki po tym, jak karmiły się EBB lub ABB przez 4, 7 i 11 dni.</li>
	<li>Umieść żywe pszczoły w osobnych probówkach do mikrowirówek i umieść na okładach z lodu. Wybierz podpróbkę czterech pszczół do analizy stężenia białka hemolimfy.</li>
	<li>Po pobraniu próbek od pszczół w dniu 11 policz liczbę komórek grzebienia, które nadal zawierają pierzch. Jest to względna miara spożycia pierzgi</li>.
	<li>Usuń pozostałą pierzgę z komórek w każdej klatce i przechowuj w oddzielnych probówkach do mikrowirówek zgodnie z klatką. Próbki pierzgi należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy pod kątem pH, stężenia białka rozpuszczalnego i zawartości aminokwasów.</li>
</ol>
4. Szacowanie pH pyłku i pierzgi
<ol>
	<li>Pobrać sześć losowych próbek pyłku o masie 0,3 g podawanego pszczołom w EFA i rozpuścić go w 300 μl wody destylowanej. Zmierz pH za pomocą wodoodpornej włóczni pH z podwójnym złączem z dokładnością +0,01.</li>
	<li>Pobrać 0,3 g próbki pierzgi, która pozostała po 11-dniowym okresie karmienia w każdej klatce. Rozpuścić pierzgę w 300 μl wody destylowanej i zmierzyć pH zgodnie z opisem dla pyłku (4.1).</li>
</ol>
5. Analiza białek
<ol>
	<li>Z każdej klatki pobrać sześć próbek pyłku oraz próbkę EBB i ABB. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu ich analizy pod kątem stężenia białka rozpuszczalnego.</li>
	<li>Zmieszać 20 mg pyłku lub pierzgi z 1 000 μl 0,1 M roztworu buforowego fosforanu (PBS).</li>
	<li>Mieszać mieszaninę przez 10 sekund i odwirowywać przy 571,2 x g przez 1 min.</li>
	<li>Pobrać 10 μl próbki supernatantu i umieścić w studzienkach 96-dołkowej płaskiej płytki polistyrenowej EIA/RIA. Powtórzyć każdą próbkę w trzech studzienkach.</li>
	<li>Narysuj hemolimfę od pszczół zebranych z każdej klatki, wkładając rurkę kapilarną o pojemności 20 μl (która została podgrzana i pociągnięta do ostrego jak igła punktu) do prawej bocznej części klatki piersiowej w pobliżu punktu przyczepienia skrzydeł. W razie potrzeby zbierz dodatkową hemolimfę, wkładając tę samą rurkę do błony między tergitami brzusznymi.</li>
	<li>Dodać 1 μl hemolimfy do 9 μl 0,1 M PBS. Przechowywać roztwór hemolimfy w temperaturze -20 °C do czasu analizy na obecność białka rozpuszczalnego.</li>
	<li>Określ całkowite stężenie rozpuszczalnego białka w próbkach pyłku, pierzgi pszczelejki i hemolimfy za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania białek Bradford. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Ustalić krzywą wzorcową w celu oszacowania stężenia białka rozpuszczalnego w próbkach, mierząc absorbancję białka ze znanymi stężeniami białka w albuminie surowicy bydlęcej (BSA). Zmierzyć absorbancję białka przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
6. Analiza aminokwasów
<ol>
	<li>Zebrać pojedyncze próbki z komórek grzebieniowych każdej kolonii, aby utworzyć reprezentatywną próbkę EBB i ABB do analizy.</li>
	<li>Pobrać próbkę pyłku lub chleba pszczelego o stężeniu 50 mg zważoną do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek i dodać do niej 1 ml wody destylowanej wraz ze 100 μl roztworu wzorca wewnętrznego o stężeniu 50 ng/μl składającego się z 4-alaniny, kwasu23-laurynowego, 13C6-glukozy i kwasu d39-arachidiaku.</li>
	<li>Zamknąć próbkę i poddać sonikacji przez 5 minut.</li>
	<li>Kondycjonować wkład HLB dodając 1 ml metanolu, równoważąc dodając 1 ml wody destylowanej, a następnie dodając 1 ml próbki chleba pszczelego lub pyłku. Przemyć wkład 1 ml 5,0% MeOH/H2O i wymyć 1 ml 80% MeOH/H2O.</li>
	<li>Odparować próbkę do sucha pod strumieniem azotu. Rozpuścić próbkę w 50 μl pirydyny i 100 μl N,O-Bis (trimetylosililo)trifluoroacetamidu + trimetylochlorosilanu (BSTFA + TMCS).</li>
	<li>Zakryć próbkę i inkubować ją w temperaturze 70 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Pozostawić próbkę do ostygnięcia i przenieść ją do czystej fiolki z automatycznym podajnikiem próbek.</li>
	<li>Nałożyć nakrętkę i umieścić próbkę w selektywnym detektorze masowym połączonym z chromatografem gazowym w celu analizy próbek zarówno pod kątem związków lotnych, jak i kwasów organicznych. Oddzielić cukier i kwasy organiczne po derywatyzacji TMS za pomocą BSTFA + TMCS za pomocą kolumny (średnica wewnętrzna 30 m x 0,25 mm) o grubości warstwy 1,0 μm.</li>
	<li>Ustawić piec kolumnowy na 50 C na 2 minuty, następnie zwiększyć temperaturę liniowo do 290 °C przy 5 C/min i przytrzymać przez 7 minut. Ustawić wtryskiwacz GC i interfejs GC/MS odpowiednio na 250 °C i 290 °C.
	<ol>
		<li>Stosować hel jako nośnik przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min. Ustawić temperaturę źródła MS na 230 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie dostrajaj i kalibruj spektrometr mas za pomocą perfluorotributyloaminy (PFTBA). Użyj wstrzyknięcia 1 μl PFTBA w trybie pełnego skanowania (35-700 amu) jonów dodatnich, aby uzyskać dane na temat obecności i stężeń aminokwasów.</li>
</ol>

<ol><li>Brodschneider, R., Crailsheim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+and+health+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Nutrition and health in honey bees.</a> Apidologie. 41 (3), 278-294 (2010).</li>
<li>Spivak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+success+of+Africanized+and+European+honey-bees+over+a+range+of+life-zones+in+Costa+Rica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">The relative success of Africanized and European honey-bees over a range of life-zones in Costa Rica.</a> J. Appl. Ecol. 29 (1), 150-162 (1992).</li>
<li>Schneider, S. S., McNally, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+foraging+patterns+and+colony+energy+status+in+the+African+honey+bee+Apis+mellifera+scutellata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Spatial foraging patterns and colony energy status in the African honey bee Apis mellifera scutellata.</a> J. Insect Behav. 6 (2), 195-210 (1993).</li>
<li>Becerra-Guzman, F., Guzman-Novoa, E., Correa-Benitez, A., Zozaya-Rubio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length+of+life%2C+age+at+first+foraging+and+foraging+life+of+Africanized+and+European+honey+bee+%28Apis+mellifera%29+workers%2C+during+conditions+of+resource+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Api.+Res%22%5BJournal%5D)">Length of life, age at first foraging and foraging life of Africanized and European honey bee (Apis mellifera) workers, during conditions of resource abundance.</a> J. Api. Res. 44 (4), 151-156 (2005).</li>
<li>Saltykova, E. S., Lvov, A. V., Ben’kovskaya, G. V., Poskryakov, A. V., Nikolenko, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interracial+differences+in+expression+of+genes+of+antibacterial+peptides%2C+Abaecin%2C+Hymenoptaecin%2C+and+Defensin%2C+in+bees+Apis+mellifera+mellifera+and+Apis+mellifera+caucasica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Evol.+Biochem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Interracial differences in expression of genes of antibacterial peptides, Abaecin, Hymenoptaecin, and Defensin, in bees Apis mellifera mellifera and Apis mellifera caucasica.</a> J. Evol. Biochem. Phys. 41 (5), 506-510 (2005).</li>
<li>Decanini, L. I., Collins, A. M., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+and+heritability+in+immune+gene+expression+by+diseased+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hered%22%5BJournal%5D)">Variation and heritability in immune gene expression by diseased honeybees.</a> J. Hered. 98 (3), 195-201 (2007).</li>
<li>Gilliam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiology+of+pollen+and+beebread%3A+the+genus+Bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Microbiology of pollen and beebread: the genus Bacillus.</a> Apidologie. 10 (3), 269-274 (1979).</li>
<li>Gilliam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiology+of+pollen+and+beebread%3A+the+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Microbiology of pollen and beebread: the yeasts.</a> Apidologie. 10 (3), 43-53 (1979).</li>
<li>Gilliam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+roles+of+non-pathogenic+microflora+associated+with+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification and roles of non-pathogenic microflora associated with honey bees.</a> FEMS Microbiology Letters. 155 (1), 1-10 (1997).</li>
<li>Loper, G. M., Standifer, L. N., Thompson, M. J., Gilliam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+and+microbiology+of+bee-collected+almond+%28Prunus+dulcis%29+pollen+and+beebread.+I.+Fatty+acids%2C+sterols%2C+vitamins%2C+and+minerals%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Biochemistry and microbiology of bee-collected almond (Prunus dulcis) pollen and beebread. I. Fatty acids, sterols, vitamins, and minerals.</a> Apidologie. 11 (1), 63-73 (1980).</li>
<li>Khachatryan, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+role+of+host+genetics+in+controlling+the+composition+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Predominant role of host genetics in controlling the composition of gut microbiota.</a> PLoS ONE. 3 (8), e3064(2008).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., Ley, R. E., Mahowald, M. A., Magrini, V., Mardis, E. R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity+associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li>
<li>Ley, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+alters+gut+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Obesity alters gut microbial ecology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (31), 11070-11075 (2005).</li>
<li>Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+and+evolutionary+forces+shaping+microbial+diversity+in+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine.</a> Cell. 124 (4), 837-848 (2006).</li>
<li>Standifer, L. N., McCaughey, W. F., Dixon, S. E., Gilliam, M., Loper, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+and+microbiology+of+pollen+collected+by+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29+from+almond%2C+Prunisdulcis.+II.+Protein%2C+amino+acids+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Biochemistry and microbiology of pollen collected by honey bees (Apis mellifera L.) from almond, Prunisdulcis. II. Protein, amino acids and enzymes.</a> Apidologie. 11 (2), 163-171 (1980).</li>
<li>Human, H., Nicolson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+content+of+fresh%2C+bee-collected+and+stored+pollen+of+Aloe+greatheadii+var+davyana+%28Asphodelaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem%22%5BJournal%5D)">Nutritional content of fresh, bee-collected and stored pollen of Aloe greatheadii var davyana (Asphodelaceae).</a> Phytochem. 67 (14), 1486-1492 (2006).</li>
<li>Schneider, S. S., DeGrandi-Hoffman, G., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+honeybee%3A+Factors+contributing+to+a+successful+biological+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">The African honeybee: Factors contributing to a successful biological invasion.</a> Ann. Rev. Entomol. 49, 351-376 (2004).</li>
<li>Winston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+management+of+Africanized+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">The biology and management of Africanized honey bees.</a> Annu. Rev. Entomol. 37, 173-193 (1992).</li>
<li>Woyke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brood-rearing+ef%EF%AC%81ciency+and+absconding+in+Indian+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Apic.+Res%22%5BJournal%5D)">Brood-rearing efﬁciency and absconding in Indian honeybees.</a> J. Apic. Res. 15 (3/4), 133-143 (1976).</li>
<li>Fletcher, D. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brood+rearing+and+absconding+of+tropical+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22African+Bees%22%5BJournal%5D)">Brood rearing and absconding of tropical honey bees.</a> African Bees. , Apimondia. Pretoria, South Africa. 96-102 (1977).</li>
<li>Winston, M. L., Otis, G. W., Taylor, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absconding+behavior+of+the+Africanized+honey+bee+in%5BTitle%5D)+AND+%22South+America.+J.+Api.+Res%22%5BJournal%5D)">Absconding behavior of the Africanized honey bee in.</a> South America. J. Api. Res. 18 (2), 85-94 (1979).</li>
<li>Schneider, S. S., McNally, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in%EF%AC%82uencing+seasonal+absconding+in+colonies+of+the+African+honey+bee%2C+Apis+mellifera+scutellata%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Soc%22%5BJournal%5D)">Factors inﬂuencing seasonal absconding in colonies of the African honey bee, Apis mellifera scutellata.</a> Insectes Soc. 39 (4), 402-423 (1992).</li>
<li>Hepburn, H. R., Reece, S. L., Neumann, P., Moritz, R. F. A., Radloff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absconding+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29+in+relation+to+queen+status+and+mode+of+worker+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Soc%22%5BJournal%5D)">Absconding in honeybees (Apis mellifera) in relation to queen status and mode of worker reproduction.</a> Insectes Soc. 46 (4), 323-326 (1999).</li>
<li>Harrison, J. F., Fewell, J. H., Anderson, K. E., Loper, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+physiology+of+the+invasion+of+the+Americas+by+Africanized+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmental physiology of the invasion of the Americas by Africanized honeybees.</a> Integr. Comp. Biol. 46 (6), 1110-1122 (2006).</li>
<li>DeGrandi-Hoffman, G., Eckholm, B. J., Huang, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+bee+bread+made+by+Africaized+and+European+honey+bees+%28Apis+mellifera%29+and+its+effects+on+hemolymph+protein+titers%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">A comparison of bee bread made by Africaized and European honey bees (Apis mellifera) and its effects on hemolymph protein titers.</a> Apidologie. 44 (1), 52-63 (2013).</li>
<li>Cappelari, F. A., Turcatto, A. P., Morais, M. M., DeJong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Africanized+honey+bees+more+efficiently+convert+protein+diets+into+hemolymph+protein+than+do+Carniolan+bee+%28Apis+melliferacarnica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Mol.+Res%22%5BJournal%5D)">Africanized honey bees more efficiently convert protein diets into hemolymph protein than do Carniolan bee (Apis melliferacarnica).</a> Genet. Mol. Res. 8 (4), 1245-1249 (2009).</li>
<li>Human, H., Nicolson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+content+of+fresh%2C+bee-collected+and+stored+pollen+of+Aloe+greatheadii+var+davyana+%28Asphodelaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem%22%5BJournal%5D)">Nutritional content of fresh, bee-collected and stored pollen of Aloe greatheadii var davyana (Asphodelaceae).</a> Phytochem. 67, 1486-1492 (2006).</li>
<li>Bonvehi, J. S., Jorda, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+composition+and+microbiological+quality+of+honeybee-collected+pollen+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Nutrient composition and microbiological quality of honeybee-collected pollen in Spain.</a> J. Agric. Food Chem. 45 (3), 725-732 (1997).</li>
<li>Anderson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology+of+the+hive+and+pollination+landscape%3A+Bacterial+associates+from+floral+nectar%2C+the+alimentary+tract+and+stored+food+of+honey+bees+%28Apismellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology of the hive and pollination landscape: Bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apismellifera).</a> PLoS ONE. 8 (12), e83125(2013).</li>
<li>Southwick, E. E., Roubik, D. W., Williams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+energy+balance+in+groups+of+Africanized+and+European+honey+bees%3A+ecological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Comparative energy balance in groups of Africanized and European honey bees: ecological implications.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. 97 (1), 1-7 (1990).</li>
<li>Spivak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+success+of+Africanized+and+European+honey-bees+over+a+range+of+life-zones+in+Costa+Rica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">The relative success of Africanized and European honey-bees over a range of life-zones in Costa Rica.</a> J. Appl. Ecol. 29 (1), 150-162 (1992).</li>
<li>Francoy, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+and+genetic+changes+in+a+population+of+Apis+mellifera+after+34+years+of+Africanization%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Mol.+Res%22%5BJournal%5D)">Morphometric and genetic changes in a population of Apis mellifera after 34 years of Africanization.</a> Genet. Mol. Res. 8 (2), 709-717 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z metod opisanych powyżej, stwierdziliśmy, że pierzga wytwarzana przez AHB była spożywana w większych ilościach zarówno przez AHB, jak i EHB. Chociaż EHB i AHB spożywały podobne ilości każdego rodzaju pierzchy, AHB miało wyższe miana białka w hemolimfie. Wyniki oparte na naszych metodach były podobne do poprzednich doniesień, w których poziomy białka hemolimfy w AHB były wyższe niż w EHB, chociaż obie były karmione tymi samymi dietami 26 . Mierząc spożycie EBB i ABB, które były spożywane w różnym tempie zarówno przez EHB, jak i AHB, ustalono, że stężenie białka hemolimfy w każdym podgatunku nie może zostać zwiększone przez zwiększenie spożycia żywności. Wydaje się, że stężenie białka hemolimfy u robotnic w wieku pszczół pielęgniarskich utrzymuje się na stałym poziomie, a wartość zadana dla tego poziomu jest wyższa w przypadku AHB niż EHB.
Istnieje kilka ważnych warunków do zakładania rodzin pszczelich do produkcji pierzgi, które zoptymalizują tempo przechowywania pyłku. Po pierwsze, rodziny potrzebują ramek z otwartym czerwiem. Bez otwartego czerwiu do karmienia robotnice nie zbiorą dużo pyłku. Po drugie, rodzina musi być pozbawiona królowej, aby nie wytwarzać dodatkowego czerwiu. Odchów czerwiu wymaga dużych ilości pyłku, a magazynowany jest tylko nadmiar pyłku. W małych koloniach założonych w NNKT byłoby niewiele pyłku do przechowywania w postaci pierzgi, gdyby obszary lęgowe się powiększały, więc rodziny muszą być pozbawione królowej. Wreszcie, aby wyprodukować pierzchlę, pyłek musi być zbierany w postaci ładunków sercowych i przechowywany w komórkach grzebieniowych. Jeśli pyłek jest zbierany w pułapkach pyłkowych, należy go zmielić na drobny proszek przed przedstawieniem go pszczołom, aby mogły zebrać go w postaci ładunków korpusowych.
Metody pomiaru spożycia pierzgi pszczelej pozwoliły na uzyskanie szacunków jakościowych, a nie bezwzględnych. Jedyne spożycie, które zostało policzone, miało miejsce, gdy komórki zostały całkowicie opróżnione z chleba pszczelego. Dokładniejsze oszacowanie całkowitego spożycia chleba pszczelego można uzyskać, usuwając chleb pszczeli z komórek i przekształcając go w kotlet, który można zważyć przed i po okresie badania. Chcieliśmy jednak zatrzymać chleb pszczeli w komórkach, aby pszczoły mogły się nim żywić tak, jak w kolonii i być może kontynuować jego przetwarzanie w okresie badania. Różnica w wadze odcinków plastra przed i po badaniu nie została wykorzystana jako oszacowanie spożycia, ponieważ waga mogła wzrosnąć, ponieważ pszczoły umieszczały w niektórych komórkach rozcieńczony miód, którym je karmiono.
Robotnicy mogli również dodać trochę rozcieńczonego miodu do chleba pszczelego. Z tych powodów policzono komórki zawierające w przybliżeniu równe ilości chleba pszczelego przed i po okresie karmienia i wygenerowano pomiar jakościowy. Mimo to istniała uderzająca różnica między tymi dwoma rodzajami pierzgi w liczbie zliczonych pustych komórek ABB w porównaniu z EBB po 11 dniach.
Określenie, kiedy przechowywany pyłek staje się chlebem pszczelim, może być trudne, ponieważ pszczoły stale dodają pyłek do komórek. Kolonie używane do produkcji pierzgi były zakładane z ramkami z otwartym czerwiem, aby pszczoły zbierały pyłek. Jednak kolonie były pozbawione królowych, więc larwy były do karmienia tylko przez około 9 dni po założeniu kolonii. Przez pozostałą część 3-tygodniowego okresu, kiedy rodziny pszczele znajdowały się w NNKT, pyłek zebrany przez pszczoły był przechowywany i przekształcany w pierzchę. Przetrzymywanie zmagazynowanego pyłku w komórkach plastra przez dodatkowe 11 dni podczas karmienia nim pszczół w klatkach mogło również kontynuować przetwarzanie pyłku na pierzoś. Przemiana pyłku w pierzgę trwa około 7 dni 8. Pierzga podawana EHB i AHB miała niższe pH i obniżone stężenie białka w porównaniu z pierzgą podawaną pyłkiem. Podobne wyniki zmian w pylku po konwersji pszczeli podaje inni 7,10,27. Nasze wyniki różniły się jednak od poprzednich doniesień tym, że istniały różnice w stężeniach niektórych aminokwasów między pierzchą a pyłkiem. Zmiany zarówno w stężeniach białek, jak i aminokwasów mogą być spowodowane aktywnością enzymów proteolitycznych, których źródłem mogą być same pszczoły lub społeczności mikrobiologiczne zadomowione w pierzgu 7,8,28,29 .
Metody stosowane do pomiaru stężenia białka były podobne do tych wcześniej opisanych w celu określenia wpływu białka pokarmowego na pszczoły afrykańskie i europejskie26. Jako rozszerzenie metod, byliśmy w stanie oszacować zawartość rozpuszczalnego białka w pyłku i pierzch. Metody te przyniosły podobne wyniki jak w poprzednich raportach 7,10,27. Nasze odkrycia dostarczają dodatkowych dowodów na to, że AHB skuteczniej przyswaja białko w diecie niż EHB i że może to być kluczowy czynnik w ekologicznej dominacji AHB w większości regionów, w których wyemigrował i zadomowił się w wieku 30-32 lat.

Odżywianie odgrywa fundamentalną rolę w zdrowiu i żywotności kolonii pszczół miodnych oraz w ich tworzeniu populacji. Składniki odżywcze z pożywienia dostarczają energii i składników biochemicznych potrzebnych do odchowu czerwiu, termoregulacji, żerowania i odpowiedzi immunologicznej. W przypadku rodzin pszczelich miodnych składniki odżywcze potrzebne do wzrostu populacji pszczół miodnych i utrzymania ich zdrowia pochodzą z nektaru i pyłku. Nektar dostarcza węglowodanów, a pyłek zaspokaja pozostałe zapotrzebowanie żywieniowe, takie jak białko, lipidy, witaminy i minerały 1.
Podgatunki pszczół miodnych mogą różnić się parametrami na poziomie kolonii zależnymi od odżywiania, takimi jak długowieczność robotnic, odchów czerwiu i mechanizmy odporności społecznej 2-6. Różnice te mogą być związane ze sposobem, w jaki żywność, w szczególności pyłek, jest przetwarzana przez kolonię i trawiona przez osobniki. Pyłek jest przechowywany w komórkach grzebieniowych i poprzez fermentację kwasu mlekowego za pośrednictwem mikroorganizmów jest chemicznie zmieniany 7-10. Sfermentowany pyłek nazywany jest pierzchą. Mogą istnieć różnice genotypowe między podgatunkami w ich zdolności do pozyskiwania składników odżywczych z pyłku, który zbierają i przechowują, co może wpływać na wzrost i przetrwanie kolonii. Wpływ genotypów na przetwarzanie żywności i pozyskiwanie składników odżywczych został udokumentowany w innych organizmach, powodując, że niektóre osoby uzyskują więcej składników odżywczych i kalorii niż inne podczas spożywania tych samych pokarmów.
Tutaj opisujemy metody używane do porównywania składu i konsumpcji pierzgi pszczelej wytwarzanej przez różne podgatunki pszczół miodnych. Opisano również metody pomiaru uzyskanych mian białek hemolimfy u pszczół robotnic. Wcześniejsze badania nad składem odżywczym pierzgi przeprowadzono na europejskich pszczołach miodnych (EHB) 10,15,16. Mogą jednak występować różnice w pierzgach wytwarzanych przez pszczoły różnych podgatunków, nawet jeśli żywią się tym samym pyłkiem. EHB i AHB porównano, ponieważ te podgatunki mają wyraźne różnice behawioralne i fizjologiczne, które mogą być związane z przetwarzaniem żywności i pozyskiwaniem składników odżywczych 17. Niektóre z najbardziej zauważalnych różnic polegają na tym, że AHB zbiera i spożywa więcej pyłku niż EHB i wydaje się, że łatwiej przekształca go w czerw 18. Kolonie AHB mają wyższe wskaźniki rojenia niż EHB i uciekają, gdy zasoby żywności stają się ograniczone 19-23. Ucieczka jest rzadkością w EHB. AHB mają również wyższe tempo przemiany materii niż EHB 24. Podstawy odżywcze różnic na poziomie kolonii między EHB i AHB mogą być związane z szybkością zbierania pyłku, a także z zawartością składników odżywczych (np. aminokwasów i białka) po przekształceniu go w pierzgę. Spożycie pierzgi pszczelej i wynikające z tego pozyskiwanie białka również mogą odgrywać rolę w różnicach na poziomie kolonii między EHB i AHB. Korzystając z opracowanych metod, EHB i AHB wyprodukowały pierzgę z tego samego źródła pyłku. Pierzga była następnie podawana z powrotem pszczołom każdego podgatunku i mogła określić, czy pszczoły pozyskują białko z chleba pszczelego w sposób charakterystyczny dla ich podgatunku lub dla źródła chleba pszczelego.

<table><tbody><tr><td>wodoodporne podwójne złącze pH spear&nbsp;</td><td>Młynek do kawy Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mr. Coffee&nbsp;</td><td>model 1DS77</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Dulbecco</td><td>Emd-millipore</td><td>BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>EIA/RIA płytka polistyrenowa</td><td>Sigma-Aldrich-Corning</td><td>CLS3590-100EA</td><td></td></tr><tr><td>pipety mikrokapilarne</td><td>Kimble Glass Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szybki start Zestaw do oznaczania białek Bradford 2&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>#500-0202</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Biotek Synergy HT&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masowy detektor selektywny&nbsp;</td><td>Chromatograf</td> gazowy z nabojem <td></td> Agilent 5973N <td></td></tr><tr><td>HLB</td>&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>6930</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kolumna chromatografii gazowej&nbsp;</td><td>A J& W Naukowy&nbsp;</td><td>DB-1701</td><td></td></tr><tr><td>d4-alanina&nbsp;</td><td>Kwas d<Aldrich</td><td>488917</td><td></td></tr><tr><td>dsub>23-laurynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451401</td><td></td></tr><tr><td>13C6-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis (trimetylosililo)trifluoroacetamid +&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimetylochlorosilan (BSTFA + TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33148</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorotributyloamina (PFTBA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442747-U</td><td></td></tr><tr><td>d39-arachidiak Izotop</td><td>Cambridge&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Pszczoły miodne otrzymują składniki odżywcze z pyłku, który zbierają i przechowują w ulu jako pierzga. Opracowaliśmy metody kontrolowania źródła pyłku, które pszczoły zbierają i przekształcają w pierzch, umieszczając kolonie w specjalnie skonstruowanym zamkniętym obszarze lotu. Opracowano metody analizy składu białkowego i aminokwasowego pyłku i pierzgi. Opisujemy również, w jaki sposób mierzono spożycie pierzgi i metody stosowane do określania miana białka hemolimfy u dorosłych robotnic pszczół po karmieniu się pierzką przez 4, 7 i 11 dni po wzejściu. Zastosowano metody w celu określenia, czy genotyp wpływa na przemianę pyłku w pierzgę oraz tempo, w jakim pszczoły spożywają i pozyskują z niego białko. Dwa podgatunki (pszczoły miodne europejskie i zafrykanizowane; EHB i AHB) podawano to samo źródło pyłku. Na podstawie opracowanych metod stwierdzono, że pierzga wytwarzana przez oba podgatunki miała niższe stężenie białka i wartości pH niż pyłek. Ogólnie rzecz biorąc, stężenia aminokwasów w pierzgi wytwarzanej przez EHB lub AHB były podobne i występowały na wyższych poziomach w chlebie pszczelim niż w pyłku. Zarówno AHB, jak i EHB spożywały znacznie więcej pierzgi wytwarzanej przez AHB niż przez EHB. Chociaż EHB i AHB spożywały podobne ilości każdego rodzaju pierzgi, stężenie białka w hemolimfie w AHB było wyższe niż w EHB. Różnice w pozyskiwaniu białka między AHB i EHB mogą odzwierciedlać adaptacje środowiskowe związane z regionem geograficznym, w którym wyewoluował każdy podgatunek. Różnice te mogą przyczynić się do pomyślnego osiedlenia się populacji AHB w Nowym Świecie ze względu na wpływ na odchów czerwiu i wzrost kolonii.

Chleb pszczeli przechowywano w temperaturze -80 °C przez mniej niż miesiąc przed analizą pH i stężenia białek oraz przez około 4 miesiące przed analizą aminokwasów. Chleb pszczeli różnił się od pyłku pod względem pH i stężenia białek (Rysunek 1). pH chleba pszczelnego było niższe niż w przypadku pyłku, podobnie jak stężenie białek. Zarówno EHB, jak i AHB spożywały więcej ABB niż EBB (Rysunek 2).
Poziomy białek rozpuszczalnych w hemolimfie pszczół AHB były znacząco wyższe niż u pszczół EHB, niezależnie od rodzaju spożywanego pierłogę (Rycina 3). Różnice te w poziomach białek w hemolimfie wystąpiły mimo że pszczoły EHB i AHB spożywały podobne ilości każdego rodzaju pierłogi. Wiek pszczół w momencie pobierania próbek miał istotny wpływ na stężenia białek rozpuszczalnych w hemolimfie. Stężenia białek były znacząco niższe u pszczół w 4. dniu w porównaniu z pszczołami w 7. lub 11. dniu, których poziomy nie różniły się między sobą.
Z 10 aminokwasów niezbędnych dla pszczół miodnych, w pyłku wykryto wszystkie poza histydyną. W większości przypadków stężenia aminokwasów zmierzone w pierzdze były wyższe niż w pyłku (Rysunek 4). Na przykład stężenia leucyny i treoniny były o około 60% wyższe w pierzdze w porównaniu z pyłkiem, a stężenia waliny były o około 25% wyższe. Poziomy alaniny, kwasu asparaginyowego, glutaminy i metioniny były również wyższe w pierzdze niż w pyłku. Stężenia aminokwasów nie różniły się znacząco między ABB a EBB, z wyjątkiem fenyloalaniny i cysteiny. Poziomy fenyloalaniny były około dwukrotnie wyższe w ABB w porównaniu z EBB lub pyłkiem. Stężenia cysteiny były niższe w EBB w porównaniu z ABB lub pyłkiem. Tryptofan był jedynym aminokwasem występującym w wyższych stężeniach w pyłku niż w EBB lub ABB. Stężenia proliny w pyłku i ABB były wyższe niż w EBB.
<img alt="Wykresy słupkowe pH i stężenia białek: porównanie pyłku z chlebem pszczelim-EHB i chlebem pszczelim-AHB." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Porównanie pH (A) i stężeń białek rozpuszczalnych (B) w pyłku oraz chlebie pszczelim wytworzonym przez pszczoły miodne europejskie (EHB) lub afrykanizowane (AHB). pH pyłku było istotnie wyższe niż w chlebie pszczelim, co ustalono za pomocą analizy wariancji (F2,12 = 3725, p &lt;0.0001), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Stężenie białek w pyłku było istotnie wyższe niż w chlebie pszczelim wytworzonym przez EHB (EBB) lub AHB (ABB) (F2,27 = 16.49; p &lt;0.0001). Średnie oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie na poziomie 0.05.
<img alt="Wykres słupkowy spożycia chlebca pszczół; porównuje poziomy procentowe EHB i AHB, EBB i ABB." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Średni procent komórek zawierających chlebiec, które zostały całkowicie spożyte w ciągu 11 dni przez pszczoły w klatkach. Chlebiec był wytwarzany przez pszczoły europejskie (EHB) lub zafrykanizowane (AHB) przy użyciu tego samego źródła pyłku. Średnie oszacowano dla pięciu klatek dla każdej grupy badawczej; wartości oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie na poziomie 0,05, co określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (F3,16 = 7.3, p = 0.003) oraz testu Tukeya. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie źródła 25.
<img alt="Wykres słupkowy średniego stężenia białka (µg/ml) w ciągu trzech dni dla różnych układów eksperymentalnych." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Średnie stężenie białka w hemolimfie pszczół miodnych europejskich (EHB) lub zafrykanizowanych (AHB) karmionych pierzgią produkowaną przez pszczoły europejskie (EBB) lub zafrykanizowane (ABB) przez 4, 7 i 11 dni. Analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami wykazała istotne różnice pomiędzy 4 grupami badawczymi (F3,20 = 19.7, p &lt;0.001). Poziomy białek rozpuszczalnych u AHB karmionych ABB były istotnie wyższe niż u EHB karmionych ABB (p = 0.008) lub EBB (p = 0.018). Wiek pszczół w momencie poboru próbek istotnie wpływał na stężenia białek rozpuszczalnych w hemolimfie. Poziomy były istotnie niższe u pszczół w 4. dniu w porównaniu z 7. dniem (p &lt;0.0001) lub 11. dniem (p = 0.001). Pszczoły w 7. i 11. dniu nie wykazywały różnic (p = 0.149). Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła 25 .
<img alt="Porównanie aminokwasów niezbędnych i niezbędnych, wykresy słupkowe dla pyłku, EBB i ABB w badaniu naukowym." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Stężenia aminokwasów (µg na gram pyłku lub perłogi) w pyłku lub wytworzonej z niego perłędze. EBB to perłoga wytworzona przez pszczoły europejskie, a ABB przez pszczoły afrykanizowane. Tryptofan, cysteinę, fenyloalaninę i prolinę przedstawiono na osobnych wykresach w celu zwiększenia przejrzystości prezentacji ich ilości. Rysunek zmodyfikowano na podstawie źródła 25.

Oto metody ilościowego określania składników odżywczych w pyłku przed i po jego przemianie w pierzgę przez dwa podgatunki pszczół miodnych. Opisujemy techniki pomiaru spożycia pierzgi pszczelej i wynikających z niej mian białek w obu podgatunkach.

Metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe oznaczenie składników odżywczych w pyłku i pierłce zgromadzonych przez dwie podgatunki pszczół miodnych oraz pomiar spożycia mian białek. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez udostępnienie pszczołom europejskim i afrykańskim tego samego źródła pyłku na ograniczonym obszarze i umożliwienie im zmagazynowania pyłku w koloniach w formie pierłki. Następnie pierłka ta jest podawana jako pokarm nowo wyklutym pszczołom europejskim i afrykańskim w klatkach.Następnie pobiera się próbki pszczół z klatek po czterech, siedmiu i 11 dniach karmienia, a następnie mierzy się ilość pozostałego w każdej klatce pierzgi w celu oszacowania spożycia. Na koniec mierzy się i porównuje między rasami pszczół stężenie składników odżywczych, w tym białek i aminokwasów, w pyłku oraz pierzdze wytworzonej przez pszczoły europejskie i zafrykanizowane. Wyniki wskazują, że pierzga różni się od pyłku stężeniem białek i niektórych aminokwasów, a także mianem białek w hemolimfie.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad żywieniem pszczół miodnych, takich jak rola źródła pyłku w kontekście składników odżywczych w pierzance oraz sposób, w jaki składniki te są przyswajane przez pszczoły różnych ras i genotypów. Technikę tę demonstruje Emily Watkins de Young, studentka pracująca jako technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć, po umieszczeniu pułapek pyłkowych w koloniach pszczół miodnych, należy zebrać pyłek i za pomocą młynka do kawy zmielić go na drobny proszek. Należy utworzyć pięć kolonii, każda składająca się z afrykańskich pszczół miodnych (AHB) lub europejskich pszczół miodnych (EHB), w zamkniętym obszarze lotów (EFA), tak aby pszczoły zbierały pokarm wyłącznie z dostarczonego pyłku, co zapobiegnie przemieszczaniu się robotnic między koloniami EHB a AHB. Obszar EFA należy podzielić na oddzielne sekcje, aby pszczoły nie mogły się między nimi przemieszczać. W każdej sekcji EFA należy umieścić poszczególne kolonie EHB lub AHB z 3 500 do 4 000 pszczół robotnic, woskowym plastrem z nektarem, miodem, młodym czerwiem i pustym plastrem. Należy podawać zmielony pyłek koloniom, umieszczając tacę w każdej sekcji EFA i rozsypując na nich około 60 g pyłku.W ten sposób pszczoły zbieraczki mogą gromadzić pyłek jako zapasy i przechowywać go w koloniach w postaci pierzgi do karmienia pszczół w klatkach. Ramki z zapieczętowanym czerwiem robotnicami z kolonii HB i EHB należy umieścić w oddzielnych klatkach wylęgowych w pomieszczeniu klimatycznym z temperaturą ustawioną od 32 do 24 stopni Celsjusza i wilgotnością względną 40%. Gdy robotnice wyklują się i będą miały około 24 godzin, należy przygotować 12 pleksiglasowych klatek do bioassay i dodać do każdej klatki 100 nowo wyklutych pszczół robotnic EHB lub HB, a następnie umieścić w każdej klatce fragment plastra z określoną liczbą komórek z pierzgą EBB lub BBR (europejską) bądź pierzgą AB lub BB (zaafrykanizowaną), aby stworzyć następujące warunki doświadczalne.Grupa HB otrzymała A-B-B-E-H-B, grupa A otrzymała B, grupa BAHB otrzymała EBB, a grupa EHB otrzymała Fed. Do każdej klatki grupy EBB dodano fiolki z wodą oraz 30% roztworem sacharozy przygotowanym objętościowo. Fiolki z syropem cukrowym i wodą wymieniano codziennie przez 11-dniowy okres badania.Pobierz próbkę 10 świeżo wyklutych pszczół EHB oraz robotnic A HB przed umieszczeniem ich w klatkach. Oznacz je jako pszczoły z dnia zerowego i traktuj jako punkt odniesienia dla stężeń białek w hemolimfie. Usuń 10 pszczół z każdej klatki po tym, jak żywiły się EBB lub B, B przez cztery, siedem i 11 dni.Umieść żywe pszczoły w oddzielnych probówkach typu Falcon i postaw je na wkładach chłodzących. Po pobraniu próbek od pszczół w 11. dniu, wybierz podpróbkę czterech pszczół do analizy stężenia białek w hemolimfie oraz policz liczbę komórek plastra, które wciąż zawierają pierzga. Usuń pozostały pierzga z komórek w każdej klatce i przechowuj go w oddzielnych probówkach do wirówki mikrocentryfugowej, osobno dla każdej klatki.Próbki BBR należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu analizy stężenia białek rozpuszczalnych w pH oraz zawartości aminokwasów. W celu przeprowadzenia analizy białek należy pobrać sześć próbek pyłku oraz próbkę EBB i A BB z każdej klatki. 20 mg pyłku lub BBR należy zmieszać z 1 ml 0,1 M PBS, wymieszać na wirówce vortex przez 10 s, a następnie wirować przy 571,2 ×g przez jedną minutę.Pobierz 25 µL próbki supernatantu S i przenieś ją do dołka 96-dołkowej polistyrenowej płyty EIA o płaskim dnie. Każdą próbkę powtórz w trzech dołkach. Podgrzej końcówkę kapilary o objętości 20 µL i wyciągnij podgrzaną sekcję, aż powstanie ostry, igłopodobny punkt.Następnie należy pobrać hemolimfę od pszczół zebranej z każdej klatki, wprowadzając rurkę kapilarną do prawej bocznej części tułowia w pobliżu miejsca przyczepu skrzydła. W razie potrzeby można pobrać dodatkową limfę, wprowadzając tę samą rurkę do błony między segmentami odwłoka. Należy dodać 1 µL hemolimfy do 9 µL 0,1 M PBS.Należy użyć zestawu do oznaczania białek metodą Bradforda i postępować zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić całkowitą zawartość białek rozpuszczalnych. W celu oznaczenia stężeń należy przeprowadzić analizę aminokwasów zgodnie z protokołem tekstowym; jak pokazano na tych wykresach, zarówno wartość pH, jak i stężenie białka były niższe w bbr niż w pyłku. Zarówno EHB, jak i A HB zużyły więcej A BB niż EBB, co zostało tutaj wykazane.Poziomy białek rozpuszczalnych w hemolimfie A HB były znacznie wyższe niż w przypadku EHB, niezależnie od rodzaju spożytego bbr. Różnice te w poziomach białek hemolimfy wystąpiły pomimo tego, że EHB i A HB spożyły podobne ilości każdego rodzaju bbr. Z 10 aminokwasów niezbędnych dla pszczół miodnych, w pyłku wykryto wszystkie poza histaminą.W większości przypadków stężenia aminokwasów zmierzone w chlebku pszczelim były wyższe niż w pyłku. Na przykład stężenia leucyny i tioniny w chlebku pszczelim były o około 60% wyższe w porównaniu z pyłkiem, a stężenia waliny były o około 25% wyższe. Poziomy alaniny, kwasu asparaginowego i glutaminy były również wyższe w chlebku pszczelim niż w pyłku.Stężenia aminokwasów nie różniły się znacząco pomiędzy A B, B i EBB, z wyjątkiem fenyloalaniny i cystyny. Poziomy fenyloalaniny były około dwukrotnie wyższe w A BB w porównaniu z EBB lub pyłkiem. Stężenia cystyny były niższe w EBB w porównaniu z A, B, B lub pyłkiem.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat oceny stężeń białek w chlebku pszczelim, pyłku oraz hemolimfie pszczoły miodnej. Dzięki tym technikom można określić, czy magazynowanie i spożycie pokarmu oraz stężenia białek w hemolimfie są uwarunkowane czynnikami genetycznymi lub środowiskowymi.

methods-for-comparing-nutrients-beebread-made-africanized-european

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metody porównywania składników odżywczych w pitwie pszczelej wyprodukowanej przez afrykańskie i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na stężenie białek w hemolimfie

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Opisano nowy test behawioralny do badania krótkoterminowych reakcji smakowych swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris) na składniki odżywcze i toksyny w roztworze.

Nowatorski test behawioralny do badania reakcji smakowych osobników, swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris)

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Niniejszym przedstawiamy metodę karmienia skażoną pestycydami żywnością zarówno pojedynczej pszczoły miodnej, jak i kolonii ula. Procedura ocenia wpływ pestycydów na poszczególne pszczoły miodne poprzez dokarmianie in vivo podstawową dietą larw, a także na naturalny stan rodziny pszczelej.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

Subletalne dawki pestycydów mogą wpływać na kolonie w sposób, który jest trudny do wykrycia przy użyciu tylko metod okresowych lub wizualnych. Podano metody pomiaru całkowitej masy dorosłych pszczół, czerwiu i zasobów pokarmowych poprzez ważenie uli i części ula, fotografowanie ramek i instalowanie czujników. Poruszana jest również kwestia analizy danych.

Monitorowanie wpływu narażenia na subletalne pestycydy na pszczoły miodne na poziomie kolonii

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Wielkość acinus gruczołów gardłowych jest miarą odżywiania pszczół miodnych pielęgniarek. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół preparowania, barwienia, obrazowania i pomiaru gruczołów dolnych pszczół pielęgniarek.

Pomiar wielkości gruczołu podgardłowego acinus u pracowników pszczół miodnych (Apis mellifera)

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Poznaj metody ilościowej analizy składników odżywczych w pierzgi i pyłku pszczelego u dwóch podgatunków pszczoły miodnej. Technika ta pozwala badać wpływ diety na poziom białek w hemolimfie.

Metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy (Wideo) | JoVE Journal

Metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy

Przeglądaj więcej filmów