Metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie składników odżywczych w pyłku i chlebie pszczelim, wytwarzanych przez dwa podgatunki pszczół miodnych oraz zmierzenie spożycia mian białek. Osiąga się to poprzez zapewnienie pszczołom europejskim i afrykańskim tego samego źródła pyłku na zamkniętym obszarze i umożliwienie pszczołom przechowywania pyłku w ich koloniach w postaci chleba pszczelego. Następnie chleb pszczeli jest podawany nowo powstałym pszczołom europejskim i afrykańskim w klatkach.

Następnie po czterech, siedmiu i 11 dniach karmienia pobiera się próbki pszczół w klatkach, a ilość chleba pszczelego pozostałego w każdej klatce mierzy się w celu oszacowania spożycia. Na koniec mierzy się i porównuje stężenie składników odżywczych, w tym białka i aminokwasów w pyłku i chlebie pszczelim wytwarzanym przez pszczoły europejskie i afrykańskie. Wyniki pokazują, że chleb pszczeli różni się od pyłku stężeniem białka i niektórych aminokwasów, a także mianami białek hemolimfy.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad żywieniem pszczół miodnych, takie jak rola źródła pyłku w składnikach odżywczych w chlebie pszczelim oraz w jaki sposób te składniki odżywcze są pozyskiwane przez pszczoły o różnych podgatunkach i genotypach. Techniki demonstruje Emily Watkins de Young, która jest studentką technika w moim laboratorium Aby rozpocząć po umieszczeniu pułapek pyłkowych na koloniach pszczół miodnych, zbierz pyłek, użyj młynka do kawy, aby zmielić pyłek na drobny proszek, załóż pięć rodzin, każdą afrykańskich pszczół miodnych lub HB i europejskich pszczół miodnych lub EHB w zamkniętym obszarze lotów lub EFA, tak, że pszczoły żerują tylko na dostarczonym pyłku, aby zapobiec przemieszczaniu się robotnic między koloniami EHB i A HB. Podzielić NNKT na oddzielne sekcje, tak aby pszczoły nie mogły przejść między nimi do każdej sekcji EFA, umieścić indywidualne rodziny EHB lub HB z 3 500 do 4 000 pszczół robotnic, wosk grzebień z miodem nektarowym, niedojrzałym czerwiem i pustym grzebieniem, karmić zmielony pyłek do kolonii, umieszczając tacę w każdej sekcji EFA i rozprowadzając około 60 gramów pyłku na tacach.

W ten sposób pszczoły kujące mogą zbierać pyłek w postaci ładunków programowych i przechowywać go w swoich koloniach jako chleb pszczeli do karmienia pszczół w klatkach. Umieść ramki zapieczętowanego czerwiu robotnic z kolonii HB i EHB w oddzielnych klatkach wyłaniających się w pomieszczeniu środowiskowym o temperaturze od 32 do 24 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 40%. Kiedy robotnice pojawiają się w naszym około 24-godzinnym pomieszczeniu, zakładają 12 klatek do testów biologicznych z pleksiglasu i dodają do każdej klatki 100 nowo pojawiających się pszczół robotnic EHB lub HB, umieszczają sekcję grzebienia ze znaną liczbą europejskich bbr lub EBB lub afrykańskiego chleba B lub komórek A, B, B w każdej klatce, aby wygenerować następujące warunki leczenia.

A karmione HB A-B-B-E-H-B karmione A B, BAHB Fed EBB i EHB Fed. EBB dodaje do każdej klatki fiolki z wodą i 30% roztworem sacharozy o objętości. Wymieniaj fiolki z syropem cukrowym i wodą codziennie przez 11-dniowy okres badania.

Próbka 10, nowo wyjściowe robotnice EHB i A HB przed umieszczeniem ich w klatkach. Odnieś się do nich jako do B dnia zero i niech posłużą jako punkt odniesienia dla stężeń białka w hemolimfie. Usuń 10 pszczół z każdej klatki po tym, jak żywiły się EBB lub B, B przez cztery, siedem i 11 dni.

Umieść żywe pszczoły na pojedynczych rurkach sokoła i umieść na okładach z lodu. Wybierz podpróbkę czterech pszczół do analizy stężenia białka hemolimfy po pobraniu próbek od pszczół w 11 dniu, policz liczbę komórek plastru, które nadal zawierają chleb pszczeli. Usuń pozostałą pierzgę pszczelą z komórek w każdej klatce i przechowuj w oddzielnych probówkach do mikrowirówek w klatce.

Próbki BBR należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu analizy pod kątem stężenia białka rozpuszczalnego w pH i zawartości aminokwasów. Aby przeprowadzić analizę białka, należy pobrać sześć próbek pyłku oraz próbkę EBB i A BB z każdej klatki. Wymieszać 20 miligramów pyłku lub bbr z jednym mililitrem 0,1 molowego wiru PBS do mieszaniny przez 10 sekund i odwirować przy 571,2 G przez jedną minutę.

Usunąć 25 mikrolitrów próbki supernatantu S i umieścić ją w studzience z 96-dołkową płaską płytką polistyrenową E-I-A-R-I-A. Powtórzyć każdą próbkę w trzech studzienkach. Podgrzej koniec rurki kapilarnej o pojemności 20 mikrolitrów i pociągnij podgrzaną sekcję, aż utworzy się punkt przypominający igłę.

Następnie narysuj hemolimfę od pszczół zebranych z każdej klatki, wkładając rurkę kapilarną do prawej bocznej części klatki piersiowej w pobliżu punktu przyczepienia skrzydła. W razie potrzeby zbierz dodatkową limfę, wkładając tę samą rurkę do błony między prowadnicami brzucha. Dodaj jeden mikrolitr hemolimfy do dziewięciu mikrolitrów 0,1 molowego PBS.

Użyj zestawu do oznaczania białek Bradforda i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić całkowite rozpuszczalne białko. Stężenia przeprowadza się zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano na tych wykresach, zarówno wartość pH, jak i stężenie białka były niższe w bbr niż w pyłku. Zarówno EHB, jak i A HB zużywały więcej A BB niż EBB, jak wykazano tutaj.

Poziomy rozpuszczalnego białka w hemolimfie A HB były znacznie wyższe niż EHB, niezależnie od rodzaju spożywanego bbr. Te różnice w poziomach białka hemolimfy wystąpiły, mimo że EHB i A HB spożywały podobne ilości każdego rodzaju bbr. Spośród 10 aminokwasów, które były niezbędne dla pszczół miodnych, wszystkie oprócz histaminy zostały wykryte w pyłku.

W większości przypadków stężenia aminokwasów mierzone w chlebie pszczelim były wyższe niż w pyłku. Na przykład stężenia leucyny i tioniny były o około 60% wyższe w bbr w porównaniu z pyłkami, a stężenia waliny były o około 25% wyższe. Poziomy glutaminy kwasu asparaginowego były również wyższe w bbr niż w pyłku.

Stężenia aminokwasów nie różniły się znacznie między A, B, B i EBB, z wyjątkiem fenyloalaniny i cystyny. Poziomy fenyloalaniny były około dwa razy wyższe w BB A w porównaniu z EBB lub pyłkiem. Stężenia cystyny były niższe w EBB w porównaniu z A, B, B lub pyłkiem.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać stężenie białka w chlebie pszczelim, pyłku i hemolimfie pszczoły miodnej. Dzięki tym technikom można określić, czy na przechowywanie i konsumpcję żywności oraz stężenie białka w hemolimfie mają wpływ czynniki genetyczne lub środowiskowe.