Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie przepuszczalności bariery krew-siatkówka oraz integralności wewnętrznej błony ograniczającej w modelach zwierzęcych chorób siatkówki. Realizuje się to poprzez wstrzyknięcie cząsteczek AAV zawierających transgen GFP do ciała szklistego lub do krwiobiegu, a następnie pobranie próbek krwi w różnych odstępach czasu po iniekcjach.

Pobieranie krwi uzupełniono o cotygodniowe obrazowanie dna oka in vivo. Ostatnim krokiem jest wykonanie immunohistochemii na preparatach płaskich siatkówki oraz mrożonych przekrojach siatkówki. W końcowym etapie wykorzystano mikroskopię konfokalną oraz PCR, aby wykazać wzorzec transdukcji wskazujący na nienaruszoną strukturę wewnętrznej błony ograniczającej (ILM) oraz wykryć cząsteczki AAV w krwiobiegu, co potwierdza przepuszczalność bariery krew-siatkówka.

Główną zaletą tej techniki, w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami, jest to, że metoda aplikacji pasty AAV dostarcza informacji o przepuszczalności bariery krew-siatkówka, których nie zapewniają inne komórki. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię genową za pomocą AAV, ponieważ pomaga ona upewnić się, że bariera krew-siatkówka jest przepuszczalna dla cząsteczek AAV, co pozwala uniknąć niepożądanych skutków ubocznych. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat integralności wewnętrznej błony ograniczającej w modelach zwierzęcych innych chorób siatkówki, takich jak szczury z cukrzycą.

Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po zaobserwowaniu, że siatkówka naszego modelu myszy z nokautem genu DP 71, wykazująca rozpad bariery krew-siatkówka, była transdukowana efektywniej niż siatkówka typu dzikiego.

Zacznij od znieczulenia myszy C-57 black-six J. Sprawdź zanik trzech odruchów: odruchu prostowania, odruchu wycofania oraz reakcji na ściśnięcie ogona.

Utrata tych odruchów potwierdza wprowadzenie w stan znieczulenia. Następnie należy rozszerzyć źrenice, aplikując na rogówkę z zakraplacza 5% neosynephriny oraz 0,5% mydriatykum. Potem należy użyć maści weterynaryjnej, aby nawilżyć oczy i zapobiec ich nadmiernemu wysychaniu. Teraz należy pobrać do jednorazowej igły o bardzo cienkim przekroju (rozmiar 30 G) roztwór stokowy zawierający od 1 do 4 × 10¹¹ cząsteczek AAV-GFP.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ muszą wykonać bezpieczny zastrzyk dopelengowy, nie dotykając soczewki ani siatkówki. Następnie należy wprowadzić ultracienką jednorazową igłę o rozmiarze 30G przez równik i w pobliżu limbusa do jamy ciała szklistego. Po wprowadzeniu igły do oka należy wstrzyknąć mikrolitr roztworu, obserwując, aby igła znajdowała się w centrum ciała szklistego.

W eksperymentach dotyczących wewnętrznej błony ograniczającej jedno oko należy wykorzystać jako kontrolę, natomiast w eksperymentach dotyczących bariery krew-siatkówka należy wykonać iniekcje w oba oczy. Po iniekcji w każdym z zakłutych oczu należy zastosować miejscową terapię przeciwzapalną i przeciwbakteryjną. Po tygodniu należy rozszerzyć źrenice za pomocą neosynefryny i midrytyku, a następnie przeprowadzić badanie dna oka za pomocą kamery dno-okowej.

Monitoruj ekspresję GFP, wykonując obserwacje w pierwszym tygodniu, drugim tygodniu, pierwszym miesiącu oraz drugim miesiącu po wstrzyknięciu. Po pobraniu oczu od uśpionego zwierzęcia, poddanego procedurze, przeprowadź sekcję oczu w celu usunięcia soczewki i rogówki. Następnie utrwalaj preparat oka metodą imersyjną w 4% paraformaldehydzie przez jedną godzinę. Po godzinie poddaj oczy krioprotekcji w 10% sacharozie przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie namocz oczy w 20% sacharozie przez dwadzieścia minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec pozostawić oczy w 30% roztworze sacharozy na całą noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zatopić i zamrozić fragmenty gałek ocznych w żywicy do zatapiania, takiej jak cryo-matrix. Następnie, używając kriostatu, wykonać sekcje o grubości 10 mikronów i przymocować je do szkiełek przygotowanych dla tkanek zamrożonych.

Następnie przeprowadź permeabilizację przekrojów na preparatach przy użyciu detergentu przez pięć minut. Następnie wykonaj dwa krótkie płukania w PBS. Po tym zablokuj oczy przez godzinę w temperaturze pokojowej.

W przypadku preparatów płaskich siatkówki ułatwienie sekcji osiąga się poprzez utrwalenie wyjętych gałek ocznych w 4% paraformaldehydzie przez 15 do 30 minut. To utrwalenie oraz utrwalenie po sekcji muszą zostać przeprowadzone prawidłowo, ponieważ jest to kluczowe dla zachowania fluorescencji GFP. W ciągu 15 do 30 minut okresu utrwalania należy przeprowadzić sekcję oczu, usuwając rogówkę i soczewkę.

Oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki oraz od twardówki, przecinając obszar wokół ora serrata i nerwu wzrokowego. Po wycięciu zanurz siatkówki w 4% Paraformaldehydzie na kolejne 30 minut, aby utrwalić tkankę i białko fluorescencyjne w transdukowanych komórkach siatkówki. Po utrwaleniu przemyj preparat przez pięć minut w sterylnym PBS o pH 7.4.

Następnie zamień PBS na bufor blokujący i inkubuj siatkówki przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozpocznij etap znakowania, inkubując próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi w buforze blokującym przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego przemyj tkanki trzykrotnie PBS, a następnie inkubuj tkanki w roztworze przeciwciał koniugowanych z Alexa Fluor w rozcieńczeniu 1:500 w buforze blokującym.

Inkubować przez jedną godzinę w przypadku skrawków mrożonych lub przez dwie godziny w przypadku preparatów płaskich (flat mounts). Czynność tę należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chroniąc preparat przed światłem. Po zastosowaniu przeciwciał wtórnych należy je usunąć, wykonując trzy płukania w PBS, tak jak opisano wcześniej.

Następnie należy wykonać nacięcia odciążające siatkówki, tak aby można było ją płasko zamocować na szkiełku przedmiotowym z fotoreceptorami lub komórkami zwojowymi siatkówki skierowanymi do góry. Należy nałożyć wodne medium montażowe i szkiełko nakrywkę. Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Zacznij od przygotowania kontroli dodatniej dla krążących cząsteczek AAV. Najpierw pobierz próbkę krwi o objętości 10 do 20 µL przed wstrzyknięciem AAV. Następnie, po znieczuleniu, wstrzyknij 100 µL roztworu wirusa z zapasu do krwiobiegu.

Łatwiejszym sposobem wstrzykiwania substancji do krwiobiegu jest wykorzystanie żyły prąciowej. W tym nagraniu wstrzykujemy niebieski barwnik jako wizualną kontrolę iniekcji. Przez kolejne trzy dni należy okresowo pobierać niewielkie próbki krwi, a następnie uśmiercić mysz. Z próbek tkanek należy wyizolować genomowe DNA przy użyciu komercyjnego zestawu, a następnie przeprowadzić amplifikację PCR z zastosowaniem pary starterów do GFP. Należy wykonać 30 cykli z czasem elongacji 45 sekund i temperaturą przyłączania starterów 55 °C. Oczekiwano, że wzorzec transdukcji wektora SHH 10 zwiększy się u myszy null DP 71. Jeśli model zwierzęcy wykazał zaburzenia w strukturze błony ograniczającej wewnętrznej, myszy null DP 71 mają uszkodzone bariery siatkówkowe i stanowią zatem użyteczne porównanie; u myszy null DP 71 dokrwowa iniekcja witreallna SHH 10 skuteczniej celuje w komórki glei Müllera.

Wskazuje to na destabilizację błony ograniczającej wewnętrznej u tej linii myszy transgenicznych w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Iniekcja AAV5-GFP wykazała również przepuszczalność błony ograniczającej wewnętrznej. W przypadku myszy typu dzikiego iniekcja doszklistowata AAV5 była nieskuteczna, jednak stała się wysoce efektywnym sposobem dostarczania genów do fotoreceptorów u myszy z uszkodzonymi barierami siatkówkowymi, jak na przykład u myszy z nokautem DP 71.

Analiza PCR wykazała, że bariera krew-siatkówka u myszy z deficytem DP 71 pozostaje selektywna dla cząsteczek AAV, ponieważ w próbkach krwi po wstrzyknięciu do ciała szklistego nie stwierdzono obecności AAV. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadaćy wiedzę na temat wykorzystania wirusów towarzyszących adenowirusom w celu testowania integralności błony ograniczającej wewnętrznej lub przepuszczalności bariery krew-siatkówka poprzez analizę wzorca transdukcji siatkówki lub obecności cząsteczek AAV w krwiobiegu.