Name: Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metodę oceny przepuszczalności barier siatkówkowych przy użyciu wirusa AAV w modelach zwierzęcych chorób siatkówki. Technika ta umożliwia badanie integralności wewnętrznej błony granicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy platformie obrazowania Institut de la Vision. Dziękujemy Francuskiemu Stowarzyszeniu Dystrofii Mięśniowej (AFM) za stypendium doktoranckie dla O.V. i Allergan INC. Prace wykonane w ramach projektu LABEX LIFESENSES [nr ref. ANR-10-LABX-65] były wspierane przez francuskie fundusze państwowe zarządzane przez ANR. Dziękujemy Peggy Barbe i Mélissie Desrosiers za pomoc techniczną w przygotowaniach do AAV. Jesteśmy wdzięczni Stéphane'owi Fouquetowi za doskonałą pomoc techniczną w mikroskopii konfokalnej i jego ekspercki wkład w interpretację wyników.

Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu były pod opieką i traktowane zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Produkcja rekombinowanego AAV (rAAV) przez transfekcję przejściową komórek HEK-29317,18
UWAGA: Zobacz McClure C, JoVE (2011)19.
<ol>
	<li>Oczyścić preparat plazmidowy na dużą skalę (co najmniej 1 mg/ml) z plazmidów wektorowych AAV. Użyj 3 plazmidów. Plazmid pomocniczy AAV przenoszący geny replikacji i kapsydu bez odwróconego końca AAV powtarza ITR, kasetę ekspresji transgenu przenoszącą ITR AAV określaną jako plazmid transferowy, oraz plazmid dostarczający geny pomocnicze adenowirusa E2, E4 i geny RNA VA określane jako pHELPER.</li>
	<li>Transfekcja 293 komórek tymi 3 plazmidami za pomocą polietylenoiminy (lub innego odczynnika do transfekcji). Powyżej 80% skuteczności transfekcji jest konieczne dla uzyskania dobrych plonów wirusa.</li>
	<li>Oczyść rekombinowany AAV z 293 lizatów komórkowych na gradiacji jodiksanolu. Do uzyskania gradientu stosuje się 15%, 25%, 40% i 60% jodiksanolu. Zebrać 40% frakcji jodiksanolu zawierającej cząstki AAV, zagęścić frakcję po ultrawirowaniu w 500 000 x g przez 1 godzinę i wymienić bufor z PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) z 0,001% Pluronu.</li>
	<li>Aby określić miano genomowewirusa 20, należy przeprowadzić trawienie DNAzy ProteinaseK, a następnie QPCR. Startery do przodu i do tyłu wzmacniają obszar 62 pz znajdujący się w AAV2 ITR. W przypadku standardu plazmidu sonda jest oznaczona FAM i posiada wygaszacz czarnej (BHQ).</li>
	<li>Przeprowadzić qPCR (ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy) w końcowej objętości 25 μl przy użyciu 340 nM odwróconego startera ITR, 100 nM startera ITR do przodu, sondy 100 nM AAV2 ITR, 0,4 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq i 5 μl matrycy (standard, próbka i bez kontroli szablonu).</li>
	<li>Jako wzorzec należy użyć plazmidu do transfekcji w 7 x 10-krotnych rozcieńczeniach seryjnych (po 5 μl 2 x 109 do 2 x 103 genomów/ml, co daje końcowe stężenie od 1010 do 104 genomów/ml).</li>
	<li>Rozpocząć program od początkowego etapu denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 minut, po którym następuje 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę i wyżarzania/przedłużania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę. Przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -20 °C w przypadku długich okresów przechowywania.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie doszklistkowe AAV
<ol>
	<li>Znieczulij C57BL6J myszy ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) i sprawdź utratę odruchu prostowania, odruch wycofania i reakcję szczypania ogona wskazującą na prawidłowe znieczulenie. Rozszerz źrenice poprzez nałożenie na rogówkę neosynefryny 5% i kropli do oczu mydriaticum 0,5%. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Przełóż ultracienką jednorazową igłę o masie 30 g przez równik i obok rąbka do jamy ciała szklistego (patrz Chiu K, JoVE (2007)21). Wstrzyknąć 1 μl zapasu zawierającego od 1 do 4 x 1011 vp ShH10-GFP lub AAV5-GFP z bezpośrednią obserwacją igły w środku jamy ciała szklistego (ryc. 1). Użyj jednego oka jako kontrolki w eksperymentach ILM. Wstrzyknąć oba oczy do eksperymentów BRB. Zastosuj miejscowe leczenie przeciwzapalne i przeciwbakteryjne na wstrzyknięte oczy.</li>
	<li>Rozszerz źrenice za pomocą neosynefryny i kropli do oczu mydriaticum do obrazowania. Wykonaj badania dna oka za pomocą kamery dna oka, aby śledzić ekspresję GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) 1 tydzień, 2 tygodnie, 1 miesiąc i 2 miesiące po wstrzyknięciu do ciała szklistego (ryc. 1). Myszy należy ofiarować przez inhalację CO2 1 do 2 miesięcy po wstrzyknięciu.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia
<ol>
	<li>W przypadku kriosekcji siatkówki (ryc. 1) należy wypreparować wyłuszczone oczy w celu usunięcia soczewki i rogówki, a następnie zanurzyć w 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Cryoprotect wcześniej utrwalone oczy w 10% sacharozie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, 20% sacharozy przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Cryoprotect w 30% roztworze sacharozy, przez noc w temperaturze 4 °C. Zamrozić i zanurzyć muszle oczne w żywicy do zatapiania, takiej jak Cryo-matrix. Wykonaj kriosekcje 10 μm i zamontuj na szkiełkach specjalnie przygotowanych do zamrożonych skrawków tkanek, które poprawiają przyleganie tkanek podczas barwienia.</li>
		<li>Przepuszczalność skrawków z 0,1% Triton X100 w PBS pH 7,4 przez 5 min. Prać 2x w PBS i blokować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w PBS z 1% BSA, 0,1% Tween 20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku płaskich łożysk siatkówki (ryc. 1) utrwalić wyłuszczone oczy w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut, aby ułatwić rozwarstwienie.
	<ol>
		<li>W ciągu 15-30 minut przeprowadź sekcję oczu, aby usunąć rogówkę i soczewkę. Oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i twardówki, przecinając okolice ora serrata i nerwu wzrokowego. Zanurz w 4% paraformaldehydzie na kolejne 30 minut, aby utrwalić siatkówkę i białko fluorescencyjne w transdukowanych komórkach siatkówki (utrwalenie nie może przekraczać 24 godzin). Prać 5 minut w sterylnym PBS o pH 7,4.</li>
		<li>Zmienić PBS na bufor blokujący (PBS z 1% BSA, 2% normalna surowica kozi lub osła, 0,5% Triton X-100) i inkubować w buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować tkanki z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj 3x z PBS. 
	UWAGA: Stosowane przeciwciała są następujące: anty-laminina (1/1,000) znakująca ILM, przeciwciała znakujące klon anty-rodopsyny 4D2 (1/500), klon syntetazy antyglutaminy GS-6 (1/1,500) znakujący komórki Müllera, stożki znakujące PNA Lektyna (1/40).</li>
	<li>Inkubować tkanki z rozcieńczeniem 1:500 sprzężonych z fluorem alexa przeciwciał drugorzędowych w buforze blokującym przez 1 godzinę (kriosekcje) lub 2 godziny (płaskie mocowania) w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem. Umyj 3x PBS.</li>
	<li>Wykonaj odciążające nacięcia siatkówki i zamontuj ją płasko na szklanym szkiełku z fotoreceptorem lub komórką zwojową siatkówki (RGC) skierowaną do góry. Dodać wodne podłoże montażowe, nałożyć szkiełko nakrywkowe i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj mikroskopię konfokalną na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Rejestruj obrazy sekwencyjnie, linia po linii, aby zmniejszyć przesłuchy wzbudzenia i emisji. Zdefiniuj rozmiar kroku zgodnie z twierdzeniem o próbkowaniu Nyquista-Shannona. Użyj ustawień ekspozycji, które minimalizują przesycenie pikseli na końcowych obrazach. Przetwarzaj 12-bitowe obrazy za pomocą FIJI, wyświetlaj przekroje Z na jednej płaszczyźnie przy użyciu maksymalnej intensywności w funkcji Z-project i na koniec konwertuj na 8-bitowy tryb kolorów RGB.</li>
</ol>
4. Analiza PCR próbek krwi myszy
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl bulionu zawierającego od 1 do 4 x10 11 cząstek AAV-GFP do żyły prącia znieczulonych myszy C57BL6J (5% izofluranu do indukcji w zamkniętej komorze i 2,5% izofluranu przez stożek nosowy podczas operacji) za pomocą strzykawki insulinowej z ultracienką igłą 6 mm. Zwierzę to będzie służyć jako pozytywna kontrola krążących cząstek AAV.</li>
	<li>Pobieraj próbki krwi z ogona myszy przed wstrzyknięciem i 3 godzinami, 24 godzinami, 2 dniami i 3 dniami po wstrzyknięciu ShH10 do ciała szklistego lub po wstrzyknięciu do prącia (ryc. 1). Około 10-20 μl gromadzi się w probówkach z heparyną. Uśmiercać myszy przez wdychanie CO2 po zakończeniu procedury.</li>
	<li>Wyodrębnij genomowe DNA z próbek krwi za pomocą wybranego zestawu do ekstrakcji.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację PCR genomowego DNA. Dla tego protokołu należy użyć następującej pary starterów: GFP, sense 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3', antisense 5'-CATGGACGAGCTGTACAGGGA-3'. Wykonano następujący program PCR: 95 °C 2 min (1 cykl); 95 °C 45 sek., 55 °C 1 min, 72 °C 45 s (30 cykli); 72°C 5 min (1 cykl); Trzymać w 4 °C.</li>
</ol>
5. Opcjonalna metoda Evansa Blue
UWAGA: Określ ilościowo przepuszczalność naczyń krwionośnych, mierząc wyciek albuminy z naczyń krwionośnych do siatkówki za pomocą niebieskiej metody Evansa10.
<ol>
	<li>Barwnik Evans Blue należy przygotować przez rozpuszczenie w zwykłym roztworze soli fizjologicznej (6 mg/ml), sonikację przez 5 minut w myjce ultradźwiękowej i filtrację przez filtr 5 μm.</li>
	<li>Znieczulić myszy C57BL6J (inhalacja izofluranu, patrz krok 4.1), sprawdzić utratę odruchu prostowania, odruch wycofania i reakcję szczypania ogona wskazującą na prawidłowe znieczulenie, a następnie wstrzyknąć błękit Evansa (45 mg / kg) przez żyłę prącia (ryc. 1). Sprawdź, czy łapy, pysk i uszy myszy stają się wyraźnie niebieskie po wstrzyknięciu niebieskiego Evansa, potwierdzając pobieranie i dystrybucję barwnika.</li>
	<li>Znieczulenie C57BL6J myszy należy przeprowadzić 3 godziny po wstrzyknięciu barwnika z ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) i zweryfikować utratę odruchu prostującego wskazującą na prawidłowe znieczulenie. Pobrać śródsercowo około 500 μl krwi w probówkach z heparyną i perfuzjonować myszy przez 2 minuty przez lewą komorę za pomocą buforu cytrynianowego (0,05 M, pH 3,5; rozpuścić 7,8 g kwasu cytrynowego i 3,8 g cytrynianu sodu w 1 l wody destylowanej) wstępnie podgrzanej do 37 °C, aby zapobiec zwężeniu naczyń krwionośnych. Myszy są składane w ofierze poprzez perfuzję.</li>
	<li>Po perfuzji wyłuszczyć i ostrożnie wypreparować oba oczy pod mikroskopem operacyjnym w celu pobrania siatkówki (patrz punkt 3.2). Wysuszyć siatkówki w parowniku odśrodkowym przez noc, zważyć i wyekstrahować niebieski barwnik Evansa, inkubując siatkówki ze 100 μl formamidu przez 18 godzin w temperaturze 65 °C z wytrząsaniem (100 x g). Odwirować próbki siatkówki w 30-karatowych probówkach filtracyjnych omega przy 20 798,5 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C i odwirować próbki krwi w temperaturze 20 798,5 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Do pomiaru absorbancji należy użyć obu supernatantów. Określić absorbancję każdej próbki, odejmując maksimum absorbancji dla błękitu Evansa przy 620 nm do minimum absorbancji przy 740 nm. Obliczać Stężenie błękitu Evansa w osoczu i siatkówce na podstawie krzywej wzorcowej błękitu Evansa w formamidzie. Wyraźna przepuszczalność BRB w mikrolitrach błękitu Evansa na gram suchej siatkówki na godzinę (μl osocza/g suchej siatkówki wt/godz.).</li>
</ol>
6. Opcjonalna angiografia fluoresceinowa
UWAGA: Wyciek z naczyń krwionośnych siatkówki u myszy można uwidocznić poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie fluoresceiny sodu.
<ol>
	<li>Znieczulić C57BL6J myszy (inhalacja izofluranu, patrz krok 4.1) i rozszerzyć źrenice kroplami do oczu (neosynefryna i rozszerzenie źrenic). Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,01-0,02 ml 10% fluoresceiny sodu w 0,1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do angiografii fluoresceinowej.</li>
	<li>Zbierz obrazy obu oczu po wstrzyknięciu za pomocą kamery do badania dna oka. Ofiarować myszy przez wdychanie CO2 po zabiegu. 
	UWAGA: 20 sekund jest konieczne, aby naczynia siatkówki stały się widoczne na angiografii. Obrazy muszą być wykonane w ciągu maksymalnie 3-10 minut po wstrzyknięciu fluoresceiny. Miejsca nieszczelności (jeśli występują) są widoczne po 2,5 minuty. W późniejszych punktach czasowych jakość obrazu jest tracona z powodu dyfuzji fluoresceiny sodu do ciała szklistego, dlatego do analizy wykorzystywane są tylko obrazy uzyskane wkrótce po niej.</li>
</ol>

<ol><li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+retinal+basal+lamina+during+early+embryonic+development+leads+to+a+retraction+of+vitreal+end+feet%2C+an+increased+number+of+ganglion+cells%2C+and+aberrant+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth.</a> J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).</li>
<li>Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+disruption+of+the+retinal+basal+lamina+and+its+effect+on+retinal+histogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis.</a> Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).</li>
<li>Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane-dependent+survival+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).</li>
<li>Abdelkader, E., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+limiting+membrane+peeling+in+vitreo-retinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery.</a> Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+limiting+membrane+barriers+to+AAV-mediated+retinal+transduction+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous.</a> Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Muller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+release+by+retinal+glia+depends+on+both+oxygen+and+glucose+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply.</a> Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).</li>
<li>Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier+in+hypoxic+ischaemic+conditions%3A+basic+concepts%2C+clinical+features+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).</li>
<li>Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+response+of+neurons+and+glial+cells+to+hypoxia+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).</li>
<li>Yang, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-mediated+transduction+of+murine+retina+with+adeno-associated+virus%3A+effects+of+viral+capsid+and+genome+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size.</a> J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+following+subretinal+AAV5+vector+delivery+is+not+affected+by+a+previous+intravitreal+AAV5+vector+administration+in+the+partner+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye.</a> Mol Vis. 15, 267-275 (2009).</li>
<li>Koerber, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+adeno-associated+virus+for+enhanced+glial+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery.</a> Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).</li>
<li>Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adeno-associated+viral+variant+for+efficient+and+selective+intravitreal+transduction+of+rat+Muller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells.</a> PLoS One. 4 (10), e7467(2009).</li>
<li>Vacca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+delivery+in+Dp71-null+mouse+model+with+compromised+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use.</a> Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> J Vis Exp. (8), 313(2007).</li>
<li>Kolstad, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.</a> Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).</li>
<li>Sene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implication+of+Dp71+in+osmoregulation+and+vascular+permeability+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina.</a> PLoS One. 4 (10), e7329(2009).</li>
<li>Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

BRB reguluje wymianę cząsteczek między krwią a siatkówką. Jego rozpad wiąże się z różnymi chorobami, takimi jak retinopatia cukrzycowa lub zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Niedawno wykazaliśmy, że u myszy z nokautem dystrofiny, która wykazuje przepuszczalny BRB, siatkówka staje się bardziej podatna na dostarczanie genów, w którym pośredniczą wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV). Jednak pomimo przepuszczalności BRB, cząsteczki AAV wstrzykiwane dogałkowo pozostają ograniczone do przedziału ocz...

Komórki Müllera są głównym glejowym składnikiem siatkówki. Morfologicznie obejmują siatkówkę promieniście, a ich stopy końcowe, w kontakcie z ciałem szklistym, są skierowane w stronę ILM i tajemnych elementów tego ostatniego. ILM jest błoną podstawną składającą się z około dziesięciu różnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (laminina, agryna, perlekan, nidogen, kolagen i kilka proteoglikanów siarczanu heparyny). Podczas rozwoju jego obecność jest niezbędna do histogenezy siatkówki, nawigacji aksonów wzrokowych i przeżycia komórek zwojowych1-3. Jednak ILM nie jest niezbędny w dorosłej siatkówce i może być usunięty chirurgicznie w niektórych patologiach bez powodowania uszkodzenia siatkówki4. W terapii genowej błona ta staje się fizyczną barierą dla efektywnej transdukcji siatkówki za pomocą AAV przez wstrzyknięcie do ciała szklistego5.
Poprzez rozległą arboryzację swoich procesów, komórki Müllera zapewniają wsparcie odżywcze i regulacyjne zarówno neuronom siatkówki, jak i komórkom naczyniowym. Komórki Müllera biorą również udział w regulacji homeostazy siatkówki, w tworzeniu i utrzymywaniu BRB6. Ścisłe połączenia między komórkami śródbłonka naczyń włosowatych siatkówki, komórkami Müllera, astrocytami i perycytami tworzą BRB. BRB zapobiega przedostawaniu się niektórych substancji do siatkówki. W wielu chorobach, takich jak retinopatia cukrzycowa, niedrożność żył siatkówki i choroby układu oddechowego, niedotlenienie siatkówki powoduje przeciek przez BRB7-9. Pęknięcie to wiąże się ze wzrostem przepuszczalności naczyń krwionośnych, co prowadzi do obrzęku naczyniopochodnego, odwarstwienia siatkówki i uszkodzenia siatkówki.
Komórki Müllera są ściśle związane z naczyniami krwionośnymi i błoną podstawną, odgrywając ważną rolę zarówno w integralności BRB, jak i ILM. W związku z tym znakowanie komórek glejowych Müllera jest szczególnie istotne dla badania stanu fizycznego tych barier siatkówkowych.
Klasycznie, przepuszczalność BRB jest mierzona za pomocą testu niebieskiego Evansa, polegającego na ogólnoustrojowym wstrzykiwaniu niebieskiego barwnika Evansa, który wiąże się niekowalencyjnie z albuminą osocza. Test ten mierzy wyciek albuminy (białko o średniej wielkości, ~66 kDa) z naczyń krwionośnych do siatkówki (patrz sekcja 5 protokołów)10. Alternatywnie, przeciek naczyniowy można uwidocznić za pomocą angiografii siatkówki fluorescencyjnej potwierdzającej wyciek fluoresceiny (mała cząsteczka, ~359 Da; patrz sekcja 6 protokołów)11. Niemniej jednak obie metody pozwalają na ocenę przepuszczalności BRB dla małych cząsteczek i białek, ale nie dostarczają informacji na temat integralności ILM.
Stąd, aby zbadać przepuszczalność BRB, użyliśmy metody opartej na AAV, która dostarcza informacji na temat przepuszczalności BRB dla większych cząsteczek (np. cząstek AAV, średnica 25 nm). Rzeczywiście, nasza metoda może wykryć obecność transgenu AAV we krwi, co sugerowałoby, że cząsteczki o średnicy ~25 nm byłyby w stanie przeniknąć do krwiobiegu. Metoda ta dostarcza również informacji na temat struktury białek ILM i macierzy zewnątrzkomórkowej w warunkach patologicznych. Do takich badań przydatne są dwa warianty AAV: AAV5 i ShH10. Podsiatkówkowo wstrzykiwany AAV5 ma naturalny tropizm dla fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki12, ale nie może przedostać się do zewnętrznej siatkówki, gdy jest podawany do ciała szklistego w siatkówkach typu dzikiego z nienaruszonym ILM5,13. ShH10 to wariant AAV, który został zaprojektowany tak, aby celować w komórki glejowe nad neuronami14,15. ShH10 selektywnie znakuje komórki Müllera zarówno w zdrowych, jak i chorych siatkówkach ze zwiększoną wydajnością w siatkówkach z naruszonymi barierami16. Te narzędzia wirusowe w połączeniu z immuhistochemią i analizą krwi DNA dostarczają informacji na temat stanu barier siatkówkowych i ich udziału w chorobie (ryc. 1).

<table><tbody><tr><td>C57BL6J myszy szczep</td><td>myszy JANVIER LABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>znieczulenie</td></tr><tr><td>Ksylazyna Rompun 2%</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>środek znieczulający</td></tr><tr><td>Neosynefryna 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>rozszerzający</td></tr><tr><td>rozszerzenie Mydriaticum 0,5%</td> <td>Rozszerzacz Thea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>przeciwzapalna</td></tr><tr><td>żywica do zatapiania Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice adhezyjne Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>prowadnice</td></tr><tr><td>anty-lamininowe</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-rodopsyny klon 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-syntetazy glutaminy klon GS-6</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>Antyglejowe fibrylarne białko kwasowe</td><td>Przeciwciało Dako</td><td>334</td><td></td></tr><tr><td>PNA Lektyna</td><td>Sonda Invitrogen</td><td>L32459</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorem Alexa</td><td>Przeciwciało Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Fluorsave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>podłoża montażowego</td></tr><tr><td>QIAmp DNA Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA GoTaq</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evans Niebieski barwnik</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>barwnik</td></tr><tr><td>5 i mikro; m filtr</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometria formamidu</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>barwnik</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research Labs</td><td></td><td>System mikroskopowy oparty na kolorowej kamerze 3 CCD, frame grabberze i gotowym oprogramowaniu umożliwia naukowcom obrazowanie siatkówki myszy.</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 i mikro; l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>Igła RN G33, 25 mm, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>Iniekcje doszklistkowe</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Wszechstronny wtryskiwacz wykorzystuje mikrostrzykawki do dostarczania objętości pikolitrów</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (jeden) z kontrolerem SYS-Micro4</td><td>UMP3-1</td><td>Sterownik</td><td></td> cyfrowy</tr><tr><td>Lupa lornetkowa SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>Zoom 0,66 x 5 x diody LED ze stojakiem epi i dia / Rozwarstwienie siatkówki</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe proste - 8,5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>Zakrzywione</td></tr><tr><td>nożyczki do</td> wycinania siatkówki <td>Vanna 15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Technologie życia</td><td>4375786</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Materiały laboratoryjne</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>probówki omega Nanosep 30k</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>TECAN</td><td>infinite M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Komórki Müllera są głównymi komórkami glejowymi siatkówki. Ich stopy końcowe tworzą granice siatkówki na zewnętrznej i wewnętrznej błonie granicznej (ILM), a w połączeniu z astrocytami, perycytami i komórkami śródbłonka tworzą barierę krew-siatkówka (BRB). BRB ogranicza transport materiału między krwiobiegiem a siatkówką, podczas gdy ILM działa jak błona podstawna, która histologicznie określa granicę między siatkówką a jamą ciała szklistego. Znakowanie komórek Müllera jest szczególnie istotne dla badania stanu fizycznego barier siatkówkowych, ponieważ komórki te są integralną częścią BRB i ILM. Zarówno BRB, jak i ILM są często zmienione w chorobie siatkówki i są odpowiedzialne za objawy chorobowe.
Istnieje kilka sprawdzonych metod badania integralności BRB, takich jak test niebieski Evansa czy angiografia fluoresceinowa. Metody te nie dostarczają jednak informacji na temat zakresu przepuszczalności BRB dla większych cząsteczek, w zakresie nanometrów. Ponadto nie dostarczają one informacji na temat stanu innych barier siatkówkowych, takich jak ILM. Aby zbadać przepuszczalność BRB wraz z ILM siatkówki, zastosowaliśmy metodę opartą na AAV, która dostarcza informacji na temat przepuszczalności BRB dla większych cząsteczek, wskazując jednocześnie stan ILM i białek macierzy zewnątrzkomórkowej w stanach chorobowych. Do takich badań przydatne są dwa warianty AAV: AAV5 i ShH10. AAV5 ma naturalny tropizm dla fotoreceptorów, ale nie może przedostać się do zewnętrznej siatkówki, gdy jest podawany do ciała szklistego, gdy ILM jest nienaruszony (tj. w siatkówkach typu dzikiego). ShH10 ma silny tropizm w stosunku do komórek glejowych i selektywnie oznacza glej Müllera zarówno w zdrowych, jak i chorych siatkówkach. ShH10 zapewnia bardziej efektywne dostarczanie genów do siatkówki, w której ILM jest upośledzony. Te wirusowe narzędzia w połączeniu z immunohistochemią i analizą DNA krwi rzucają światło na stan barier siatkówkowych w chorobie.

Przewidujemy zwiększoną transdukcję siatkówkową komórek glejowych Müllera przy użyciu ShH10, jeżeli model zwierzęcy wykazuje zaburzenia w strukturze wewnętrznej błony ograniczającej (ILM) (Rysunek 2A-B). Wykazaliśmy na przykład, że przy braku Dp71 ShH10 celuje specyficznie, lecz bardziej efektywnie w komórki glejowe Müllera po wstrzyknięciu domacicznym, co wskazuje na zwiększoną przepuszczalność ILM w tej linii myszy w porównaniu z myszami typu dzikiego16 (Rysunek 2C</...

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie przepuszczalności bariery krew-siatkówka oraz integralności wewnętrznej błony ograniczającej w modelach zwierzęcych chorób siatkówki. Realizuje się to poprzez wstrzyknięcie cząsteczek AAV zawierających transgen GFP do ciała szklistego lub do krwiobiegu, a następnie pobranie próbek krwi w różnych odstępach czasu po iniekcjach.Pobieranie krwi uzupełniono o cotygodniowe obrazowanie dna oka in vivo. Ostatnim krokiem jest wykonanie immunohistochemii na preparatach płaskich siatkówki oraz mrożonych przekrojach siatkówki. W końcowym etapie wykorzystano mikroskopię konfokalną oraz PCR, aby wykazać wzorzec transdukcji wskazujący na nienaruszoną strukturę wewnętrznej błony ograniczającej (ILM) oraz wykryć cząsteczki AAV w krwiobiegu, co potwierdza przepuszczalność bariery krew-siatkówka.Główną zaletą tej techniki, w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami, jest to, że metoda aplikacji pasty AAV dostarcza informacji o przepuszczalności bariery krew-siatkówka, których nie zapewniają inne komórki. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię genową za pomocą AAV, ponieważ pomaga ona upewnić się, że bariera krew-siatkówka jest przepuszczal

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie wirusa Adeno-związanego z wirusem jako narzędzia do badania barier siatkówki w chorobie

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)W tym filmie zaprezentowano szczegółową procedurę przygotowywania kriosiekcji siatkówki myszy w celu wizualizacji przepuszczalności wirusa towarzyszącego adenowirusom przez uszkodzone bariery siatkówkowe.

Przygotowanie kriosiekcji siatkówki myszy w celu oceny przepuszczalności siatkówki dla wirusa towarzyszącego adenowirusom

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).W niniejszym filmie zaprezentowano metodę dostarczania genów za pomocą AAV do siatkówki transgenicznej myszy, a następnie sekcję tkanek i barwienie w celu oceny integralności wewnętrznej błony ograniczającej.

Dostarczanie genów za pomocą AAV w celu wizualizacji zaburzeń integralności błony siatkówki

Ten film pokazuje infekowanie pierwotnych neuronów śródmózgowia myszy wirusami związanymi z adenowirusami przenoszącymi fluorescencyjny wskaźnik wapnia. Fluorescencja wskaźnika potwierdza udaną infekcję i umożliwia monitorowanie infekcji neuronalnej w czasie rzeczywistym.

Infekowanie pierwotnych neuronów śródmózgowia myszy zmodyfikowanymi wirusami związanymi z adenowirusami

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Poznaj metodę oceny przepuszczalności barier siatkówkowych przy użyciu wirusa AAV w modelach zwierzęcych chorób siatkówki. Technika ta umożliwia badanie integralności wewnętrznej błony granicznej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Przeglądaj więcej filmów