Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej
30 marca 2015
Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar aktywności wewnątrzkomórkowych wymieniaczy protonowych sodu. Osiąga się to poprzez pierwszą selekcję komórek, które wyrażają wewnątrzkomórkowe wymieniacze protonowe sodu na błonie plazmatycznej poprzez selekcję zabijania protonów. W drugim etapie wybrane komórki są zakwaszane, a następnie mierzy się wewnątrzkomórkowe odzyskanie pH, aby potwierdzić aktywność komórek w zakresie wymiany protonów sodu.
Szybka kinetyka transportu jonów jest następnie mierzona w celu określenia stałych powinowactwa dla transportowanych kationów i inhibitorów. Ostatecznie monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego pH i szybkiej kinetyki wybranych komórek somatycznych pozwala na funkcjonalną charakterystykę wewnątrzkomórkowej wymiany białek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja zmutowanych transporterów lub stosowanie per komórki, jest to, że umożliwia ekspresję transporterów wewnątrzkomórkowych typu białego na błonie plazmatycznej, co umożliwia bezpośredni pomiar ich funkcji.
Procedurę zademonstruje dr Mallory poeta, naukowiec z mojego laboratorium, aby rozpocząć procedurę zabijania protonów. Najpierw inkubuj komórki wyrażające wewnątrzkomórkowy wymiennik protonów sodowych w roztworze ładującym o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubatorze wolnym od dwutlenku węgla przez jedną godzinę. Następnie odessać roztwór ładujący i dwukrotnie przemyć komórki świeżą pożywką.
Po drugim płukaniu odessać pożywkę i inkubować komórki w roztworze regeneracyjnym w inkubatorze bez dwutlenku węgla. Po kolejnej godzinie zastąp pożywkę regeneracyjną zwykłą pożywką hodowlaną i hoduj komórki w standardowych warunkach hodowli. Powtarzanie tego cyklu selekcji dwa razy w tygodniu, aż pojawią się stabilne klony, aby zobrazować wewnątrzkomórkowe fluorescencyjne pH komórek.
Najpierw wyposażono zestaw obrazowania składający się z odwróconego mikroskopu sprzężonego z kamerą wideo o wysokiej czułości z wąskopasmowymi filtrami interferencyjnymi 450 nanometrów i 490 nanometrów w połączeniu z odpowiednimi kwarcowymi filtrami o neutralnej gęstości do wzbudzenia. Jeśli to możliwe, użyj odpowiedniego zestawu filtrów i warunków oświetlenia, aby ustawić porównywalne wartości fluorescencji dla kanału pierwszego i drugiego, tak aby stosunek zbliżył się do jednego do pomiaru aktywności do przodu sodowego wymiennika protonowego. Następnie zakwasić komórki przez godzinną inkubację w roztworze amonowym.
W przypadku braku dwutlenku węgla w ciągu ostatnich pięciu minut inkubacji, zabarwić komórki za pomocą proporcjonalnej metrycznej matrycy fluorescencyjnej wrażliwej na pH. Pod koniec okresu inkubacji przetrzyj komórki roztworem amonowym, aby wyeliminować sondę zewnątrzkomórkową i zamontuj barwione komórki pod mikroskopem. Wybierz odpowiednio obszary zainteresowania, w których będą mierzone wartości fluorescencji.
Następnie zarejestruj kilka obrazów, aby ustalić linię bazową i perfuzjuj komórki roztworem RIN, aby zainicjować spadek fluorescencji. Po ustabilizowaniu się pH należy zapoznać komórki z roztworem, który Cię interesuje, aby zmierzyć tempo odzyskiwania pH za pośrednictwem wymiany wodoru litowego, wodoru sodowego lub wodoru potasu. Teraz przejrzyj komórki roztworem hipisów uzupełnionym chlorkiem potasu i geryną.
Następnie zbierz pomiary fluorescencji z obrazów i wyeksportuj dane do programu arkusza kalkulacyjnego w formacie tekstowym, aby zmierzyć początkową szybkość wymiennika protonów sodowych. Siedem, poprzez szybki absorpcję litu, zakwasza komórki i płytki wielodołkowe za pomocą techniki ładowania Imodium, jak właśnie pokazano. Następnie szybko opłucz płytki dwa razy, jak pokazano powyżej.
Następnie inkubować komórki w roztworach wychwytowych zawierających od jednego do 10 mikromolowych litów i pożądane stężenia kationu lub inhibitorów przez około minutę lub krócej pod koniec okresu absorpcji, ostrożnie usunąć pożywkę wychwytową i szybko przemyć komórki czterokrotnie lodowatym PBS w czasie krótszym niż 10 sekund, aby zapobiec wypływowi litu, a następnie umieścić komórki w 250 mikrolitrach 25% kwasu azotowego na dobrze przez co najmniej godzinę. Skrobanie każdej studzienki końcem końcówki pipety pod koniec inkubacji i przeniesienie zawiesin z każdej studzienki do nowych probówek do mikrowirówek. Na koniec odwiruj próbki przez pięć minut w temperaturze 15 000 G w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki komórkowe, a następnie zmierz zawartość litu w snat za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej.
Zgodnie z instrukcjami producenta, selekcja zabijania protonów opiera się na dyfuzji słabej zasady amonowej. Na przykład komórki, które nie wykazują ekspresji funkcjonalnego wymieniacza protonowego sodu na błonie plazmatycznej, nie mogą odzyskać neutralnej wartości pH i dlatego wykazują typowy zakwaszony aspekt o płaskim kształcie i ziarnistym cytozolu, jak widać na tym reprezentatywnym obrazie po wielokrotnych cyklach selekcji, komórki, które w pełni i stabilnie przeżywają. Zakwaszenie jednak tworzy pojedyncze klony komórkowe, jak widać tutaj, jak wykazano, aktywność i selektywność jonową wewnątrzkomórkowych wymienników protonowych sodu wyrażoną na błonie plazmatycznej można scharakteryzować poprzez pomiar zmian wewnątrzkomórkowego pH indukowanych w różnych warunkach eksperymentalnych, jak zaobserwowano na tych wykresach po zakwaszeniu ładunku Imodium.
Jeśli chodzi o kinetykę enzymu, odpowiedź na dawkę dla początkowych szybkości wychwytu może być dalej wykorzystana do wyprowadzenia wartości stałych powinowactwa dla substratów i dla wartości stałych inhibicji inhibitorów. Rzeczywiście, interesującą cechą transporterów jest to, że różne kationy sprzęgające będą konkurować o transport, co daje możliwość pomiaru stałej powinowactwa do sodu poprzez konkurencję z wychwytem litu, jak pokazano na tym rysunku Po tej procedurze. Inne eksperymenty, takie jak BioInnovation na powierzchni komórki w połączeniu z wyciszaniem RNA, można przeprowadzić w celu sprawdzenia, czy transporter będący przedmiotem zainteresowania jest rzeczywiście wyrażany w błonie plazmatycznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje metodę selekcji zmutowanych linii komórkowych wykazujących ekspresję wewnątrzkomórkowych wymienników Na+/H+ w błonie komórkowej. Przedstawiono w nim również protokoły pomiaru pH wewnątrzkomórkowego oraz szybkiego poboru jonów w celu oceny selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Mechanizmy transportu jonów
Wprowadzenie
- Zrozumienie działania wymienników sodowo-protonowych jest kluczowe dla regulacji pH wewnątrzkomórkowego.
- Istniejące metody często opierają się na ekspresji mutantów transporterów, co może ograniczać analizę funkcjonalną.
- Bezpośredni pomiar aktywności transporterów typu dzikiego w błonie plazmatycznej zwiększa dokładność eksperymentów.
- Szybki pobór jonów oraz powrót pH do wartości wyjściowej są kluczowymi wskaźnikami aktywności wymiennika.
Cel badania
- Pomiar aktywności wewnątrzkomórkowo ekspresowanych wymienników sodowo-protonowych.
- Potwierdzenie funkcjonalności wybranych linii komórkowych poprzez pomiary powrotu pH.
- Wyznaczenie parametrów kinetycznych i stałych powinowactwa dla transportu jonów.
Zastosowane metody
- Selekcja komórek wykazujących ekspresję wymienników sodowo-protonowych za pomocą selekcji przez zabijanie protonami (proton killing selection).
- Zakwaszanie wyselekcjonowanych komórek w celu zainicjowania wymiany sodowo-protonowej.
- Pomiar regeneracji pH wewnątrzkomórkowego w celu oceny aktywności wymiennika.
- Analiza szybkiej kinetyki w celu określenia stałych powinowactwa dla kationów i inhibitorów.
Główne wyniki
- Pomyślna selekcja linii komórek mutantów wykazujących ekspresję pożądanych wymienników.
- Potwierdzenie aktywności wymiany sodowo-protonowej poprzez powrót pH do wartości wyjściowej.
- Wyznaczenie parametrów kinetycznych charakteryzujących proces transportu.
- Głębsze zrozumienie funkcjonalnej roli transporterów wewnątrzkomórkowych.
Wnioski
- Opisane metody stanowią niezawodne podejście do badania wymienników sodowo-protonowych.
- Bezpośredni pomiar w błonie komórkowej oferuje zalety w stosunku do metod tradycyjnych.
- Wyniki te przyczyniają się do szerszego zrozumienia mechanizmów transportu jonów w komórkach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia charakterystyka funkcjonalna wewnątrzkomórkowych wymienników Na+/H+ w błonie plazmatycznej eliminuje krytyczne wąskie gardło w walidacji celów dla transporterów jonowych zaangażowanych w zaburzenia neurologiczne. Podejście to umożliwia ilościową ocenę aktywności i selektywności transportera, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania oraz redukuje ryzyko w badaniach mechanistycznych. Metoda ta usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfolio poprzez dostarczenie rzetelnych i powtarzalnych danych na temat funkcji transportera istotnych dla biologii choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji transporterów, która była wcześniej niedostępna ze względu na ich lokalizację wewnątrzkomórkową.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określenie selektywności jonowej i aktywności w kontrolowanym systemie.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla transporterów powiązanych z chorobami neurodegeneracyjnymi i poznawczymi.
- Dostarcza wyników ilościowych dla selekcji projektów w portfolio w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Umożliwia generowanie zwalidowanych linii komórkowych wykazujących ekspresję transporterów w błonie plazmatycznej do dalszych analiz.
- Zapewnia zestandaryzowane i powtarzalne pomiary pH oraz poboru jonów na potrzeby rozwoju testów.
- Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie modulatorów transporterów z wykorzystaniem ilościowych odczytów kinetycznych.
- Wspiera skalowalność platformy oraz jej ponowne wykorzystanie w badaniach nad innymi białkami błon pęcherzykowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie pomiarów aktywności transporterów z fenotypami komórkowymi istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji programów ukierunkowanych na transportery.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i funkcjonalne dane dotyczące transporterów.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie funkcji transporterów z efektami komórkowymi.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając bezpośrednią analizę funkcjonalną transporterów wewnątrzkomórkowych, co wspiera zarówno procesy walidacji celów terapeutycznych, jak i opracowywanie testów analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa aktywność i selektywność transporterów, wyjaśniając ich role mechanistyczne w regulacji pH komórkowego.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe testy poboru jonów i pH do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza pomiarów kinetyki i powinowactwa w celu porównania wariantów transporterów oraz efektów inhibitorów.
- Badania translacyjne: Powiąże funkcję transportera z fenotypami komórkowymi istotnymi dla chorób, o ile system na to pozwala.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę do analizy funkcjonalnej innych białek pęcherzykowych ekspresowanych w błonie plazmatycznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w biologii transporterów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy funkcjonalne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności pomiędzy zespołami.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go i poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesną redukcję ryzyka związanego z celami w postaci transporterów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów celujących w transportery z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne dane funkcjonalne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie inżynierii linii komórkowych oraz pomiaru pH opartego na fluorescencji.
- Wymagany jest dostęp do wideo mikroskopii o wysokiej czułości oraz spektroskopii absorpcyjnej atomów w celu uzyskania ilościowych odczytów.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów selekcji i analizy pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych rodzin transporterów lub modeli komórkowych.
- Ograniczenia obejmują zależność od prawidłowej ekspresji w błonie plazmatycznej oraz czułości analizy.
