Name: Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę selekcji zabijającej protony do badania wymienników Na⁺/H⁺ w błonie komórkowej. Technika ta umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowego pH i kinetyki transportu jonów w komórkach ssaczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są głęboko wdzięczni wszystkim członkom społeczności naukowej pracującej nad pH i transportem jonów, którzy zapoczątkowali i udoskonalili opisane tutaj pomiary. Szczególne podziękowania należą się dr Jacques'owi Pouysségurowi, który zapoczątkował zastosowaną tu technikę selekcji zabijającej H+. Wyrażają wdzięczność za wsparcie Uniwersytetowi Nicei-Sophia Antipolis, CNRS, ANR (JCJC SVSE1 NHEint) oraz ICST Labex.

1. Wybór zabijania H+
<ol>
	<li>Linie komórkowe
	<ol>
		<li>Stabilnie transfekowane komórki z niedoborem NHE (np. linia komórkowa16 PS120 pochodząca z CCL39) przy użyciu dowolnej kombinacji wektora ekspresji ssaków i metody transfekcji, która zapewni wydajną wydajność transfekcji i selekcję w linii komórkowej fibroblastów. 
		UWAGA: Przez wiele lat stosowano wytrącanie fosforanu wapnia19 z dobrą wydajnością transfekcji. Został on ostatnio zastąpiony przez komercyjne odczynniki, takie jak Lipofectamine2000, przy czym transfekcje są wykonywane zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązania
	<ol>
		<li>Przygotuj trzy sterylne roztwory opisane poniżej. Wysterylizuj te roztwory przez filtrację (0,22 μm).
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór nasycający NH4+ (pH 7,4) składający się z 50 mM NH4Cl, 70 mM chlorku choliny, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM MOPS o pH 7,4.</li>
			<li>Przygotować roztwór do płukania (pH 7,0) składający się ze 120 mM chlorku choliny, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES o pH 7,0.</li>
			<li>Przygotować roztwór odzysku (pH 7,4) składający się ze 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7.4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed rozpoczęciem selekcji należy zaopatrzyć się w inkubator do hodowli komórkowych, który może być używany w temperaturze 37 °C bez dodatkowego CO2 z zewnętrznego zbiornika (określany jako inkubator "wolny odCO2"), ponieważ 5% CO2 spowoduje buforowanie, które może pogorszyć zakwaszenie. Amplifikuj linię komórkową wyrażającą NHE zainteresowania do około 2 x 108 komórek (zwykle około 20 zlewających się płytek o średnicy 100 mm).</li>
	<li>Procedura uśmiercania H+:
	<ol>
		<li>Inkubować komórki wykazujące ekspresję wewnątrzkomórkowego NHE będącego przedmiotem zainteresowania przez 1 godzinę w roztworze ładującym, w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 .</li>
		<li>Zassać roztwór nasycający, a następnie przepłukać je dwukrotnie w opisanym powyżej roztworze do płukania. Wykonaj ten krok skutecznie, aby wyeliminować resztki zewnątrzkomórkowego NH4Cl, które utrudniałyby tworzenie stromego gradientu NH4 +, który spowoduje zakwaszenie.</li>
		<li>Usunąć pożywkę płuczącą przez aspirację i inkubować komórki przez godzinę w roztworze regeneracyjnym w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 .</li>
		<li>Zastąp pożywkę odzysku zwykłą pożywką hodowlaną (zwykle DMEM z 7,5% FCS) i hoduj komórki w standardowych warunkach hodowli (37 °C w wilgotnej atmosferze o zawartości 5% CO2 i 95 % powietrza).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzaj ten cykl selekcji dwa razy w tygodniu, aż pojawią się stabilne klony. 
	UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na hodowlę komórkową i warunki selekcji. Miesiące pracy mogą zostać zniweczone przez wszelkie zanieczyszczenia, które są bardziej podatne na wystąpienie po długim okresie hodowli i powtarzających się manipulacjach komórkami.
	<ol>
		<li>W tym miejscu należy wybrać, czy chcesz amplifikować klony i charakteryzować je indywidualnie, jak opisano w sekcjach 2-3, czy też połączyć je razem, aby wygenerować populację komórkową przed charakteryzacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosuj okazjonalną selekcję (mniej więcej raz na dwa tygodnie), aby zachować komórki odporne na zakwaszenie, przeciwselekcjonując te, które mogły powrócić do rodzicielskiego fenotypu wrażliwego na kwas (Figura 1B).</li>
</ol>
2. Wewnątrzkomórkowe pomiary pH
2.1) Obrazowanie pH metodą fluorescencji
<ol>
	<li>Należy użyć ratiometrycznego barwnika fluorescencyjnego BCECF / AM wrażliwego na pH, który jest wrażliwy na pH po wzbudzeniu przy 490 nm i ma punkt izobestowy 445 nm, zgodnie z protokołami producenta.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można użyć innych sond wrażliwych na pH, zgodnie z protokołami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj zestawu do obrazowania składającego się z odwróconego mikroskopu sprzężonego z kamerą wideo o wysokiej czułości. Wyposaż ten zestaw w wąskopasmowe filtry interferencyjne 450 nm i 490 nm w połączeniu z odpowiednimi kwarcowymi filtrami o neutralnej gęstości do wzbudzenia.
	<ol>
		<li>Jeśli to możliwe, należy użyć odpowiedniego zestawu filtrów i warunków oświetlenia, aby ustawić porównywalne wartości fluorescencji dla λ1 i λ2, tak aby stosunek zbliżył się do 1. Należy również unikać podstawowych wartości fluorescencji, które są albo nasycone, albo zbyt niskie, zarówno dla λ1, jak i λ2. Może to przynieść ważne artefakty, ponieważ wtedy stosunek może nie być wykrywalny, chociaż zmienia się pH wewnątrzkomórkowe. 
		UWAGA: System ten musi umożliwiać szybką perfuzję, wzbudzenie poklatkowe na dwóch wyżej wymienionych długościach fal oraz akwizycję na odpowiedniej długości fali emisyjnej (535 nm dla BCECF). Wyposaż system w oprogramowanie umożliwiające automatyczną akwizycję i przechowywanie danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.2) Pomiar aktywności NHE do przodu (wytłaczanie protonów z cytozolu)
<ol>
	<li>Zakwasić komórki przez 1-godzinną inkubację w roztworze ładującym NH4+ (patrz krok 1.4) pod nieobecność CO2 .</li>
	<li>Dodaj BCECF-AM (stężenie końcowe 5 μM) do roztworu przez ostatnie pięć minut, a następnie przepłucz go roztworem ładującym NH4+, aby wyeliminować sondę zewnątrzkomórkową.</li>
	<li>Zamontuj komórki na mikroskopie i zrób kilka zdjęć, aby zarejestrować stabilną linię bazową. Ukrwić roztwór do płukania (patrz wyżej). Powoduje to spadek fluorescencji odpowiadający zakwaszeniu.</li>
	<li>Po ustabilizowaniu pH należy przeprowadzić perfuzję dowolnego z poniższych roztworów, aby zmierzyć wskaźniki odzyskiwania pH, w których pośredniczy wymiana Li+/H+, Na+/H+ lub K+/H+. Każde rozwiązanie zawiera kation sprzęgający potencjał, który ma być testowany pod kątem wymiany H+. Jeśli jeden z nich zostanie przetransportowany, spowoduje to wzrost fluorescencji przy 495 nm, co będzie odpowiadało wzrostowi wewnątrzkomórkowego pH: 
	120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4 
	120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4 
	125 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4</li>
</ol>
2.3) Pomiar odwróconej aktywności NHE
UWAGA: Zasada polega na odwróceniu transbłonowych gradientów jonowych.
<ol>
	<li>Przed pomiarem załaduj komórki interesującym je kationem wewnątrzkomórkowym (patrz poniżej).</li>
	<li>Inkubować je przez 5 minut za pomocą BCECF/AM (patrz krok 2.2.2); opłukać je i zamontować na mikroskopie wideo.</li>
	<li>Wykonaj fuzję roztworu ładującego i zrób kilka zdjęć, aby zarejestrować stabilną linię bazową.</li>
	<li>Po ustabilizowaniu linii podstawowej zobrazuj zmiany pH, gdy komórki są perfundowane zewnątrzkomórkowym środowiskiem kwaśnym zawierającym 120 mM chlorku choliny, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM MES przy pH 6,5.</li>
	<li>W celu obciążenia LiCl inkubuj komórki przez 2 godziny w roztworze złożonym ze 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4. Wewnątrzkomórkowy lit mierzony za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej daje wartość około 60 mM.</li>
	<li>W przypadku obciążenia Na+ inkubować komórki przez dwie godziny w roztworze złożonym ze 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4 w obecności 1 mM ouabainy w celu zablokowania ATPazy Na/K. W tych warunkach wewnątrzkomórkowe stężenie Na+ mieści się w zakresie 40 mM. 
	UWAGA: Obciążenie K+ nie jest konieczne, ponieważ stężenie cytozolowego K+ mieści się w zakresie 140 mM, a zatem gradient K+ skierowany na zewnątrz jest łatwy do osiągnięcia.</li>
</ol>
2.4) Przetwarzanie i kalibracja danych:
UWAGA: Ten krok dotyczy zarówno pomiarów do przodu, jak i do tyłu.
<ol>
	<li>Pod koniec każdego eksperymentu perfekcja komórek roztworem 140 mM KCl, 20 mM HEPES i 5 μM nigerycyny dostosowana do wartości pH między 6,5 a 7,4.</li>
	<li>Zbierz dane jako pomiary fluorescencji z obrazów (poziomy szarości reprezentują poziomy intensywności) i wyeksportuj w formacie tekstowym i potraktuj jak wyjaśniono poniżej za pomocą programu arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Oblicz wewnątrzkomórkowe wartości pH dla każdej pojedynczej komórki lub obszaru zainteresowania, korzystając z następującego równania: 
	pH = pKa + (Log (R-Rmin)/(Rmax-R))x Fmin(λ2)/Fmax(λ2)</li>
	<li>Użyj stosunku Fmin(λ2)/Fmax(λ2), jeśli występuje bielenie lub wyciek sondy, co powoduje spadek fluorescencji 450 nm podczas eksperymentów. Jest to jednak bardzo rzadko obserwowane w warunkach stosowanych w opisywanych eksperymentach.</li>
	<li>Ponieważ dane kalibracyjne znajdują się na końcu każdego pomiaru pH, należy sprawdzić, czy odpowiednie obliczone wartości różnią się od wartości pH użytych do kalibracji. W takim przypadku należy dostosować wszystkie wyznaczone doświadczalnie wartości pH do kalibracji, stosując następującą procedurę:
	<ol>
		<li>Oblicz następujący iloraz (Q, różnica między zmierzonymi wartościami/różnica między wartościami kalibracyjnymi). Pomnóż cały zestaw danych przez Q. Dokonaj ostatecznej korekty przez dodawanie lub odejmowanie, tak aby obliczone wartości były równe odpowiednim wartościom kalibracji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiary początkowych wskaźników NHE7 przez szybki wychwyt Li+
<ol>
	<li>Komórki nasienne na płytkach wielodołkowych (od 6 do 24 dołków) i zakwaszać je przy użyciu techniki ładowania NH4 + opisanej powyżej lub alternatywnie zakwaszenia nigerycyną / albuminą surowicy bydlęcej (BSA) opisanego w20.</li>
	<li>Przepłukać płytki dwa razy szybko, używając wyżej opisanego roztworu do płukania, a następnie inkubować komórki w roztworach wychwytowych zawierających 1-10 mM litu (nieco poniżej wartości Km) i pożądane stężenia kationów i/lub inhibitorów będących przedmiotem zainteresowania przez żądany okres czasu.</li>
	<li>Utrzymuj krótkie i stałe czasy absorpcji (zwykle jedną minutę lub mniej), aby zapewnić funkcjonowanie transportu w warunkach początkowych stawek. Upewnij się również, że wszystkie roztwory używane do wychwytu są izotoniczne.</li>
	<li>Pod koniec czasu wchłaniania ostrożnie wyeliminuj pożywkę wychwytową i czterokrotnie przemyj komórki lodowato zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wykonuj te mycia tak szybko, jak to możliwe (mniej niż 10 sekund dla czterech z nich jest idealne), aby zapobiec wyciekowi litu.</li>
	<li>Lizuj komórki w 25% kwasie azotowym. Nałożyć 250 μl na studzienkę 25% kwasu azotowego i pozostawić na co najmniej 1 godzinę, a następnie zeskrobać każdą studzienkę końcem końcówki pipety i przenieść całą zawiesinę studzienki do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Przenieś lizat do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, odwiruj je przez 5 minut w temperaturze 15 000 x g (temperatura pokojowa), aby usunąć resztki komórkowe.</li>
	<li>Zmierzyć zawartość litu w supernatantach za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej21. 
	UWAGA: Różne firmy dostarczają spektrometry absorpcji atomowej, które muszą być wyposażone w litową lampę z pustą katodą. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, ponieważ te maszyny są bardzo precyzyjne, ale też dość delikatne.</li>
</ol>

<ol><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-type+H%2B-ATPase+in+vesicular+trafficking%3A+targeting%2C+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li>
<li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway%3A+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li>
<li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li>
<li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li>
<li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li>
<li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li>
<li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation%2C+microcephaly%2C+epilepsy%2C+and+ataxia%2C+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li>
<li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li>
<li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li>
<li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+B+Neuropsychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li>
<li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+studies+in+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li>
<li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer%27s+disease+in+the+ADNI+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li>
<li>Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+primary+structure%2C+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Na%2B%2FH%2B+Exchanger+NHE7+effects+a+Na%2B+coupled%2C+but+not+K%2B+coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li>
<li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li>
<li>Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na%2FH+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenomic+Effects+of+Cisplatin%3A+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li>
<li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2%2C+NH3%2C+and+metabolic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-H%2B+exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped%2C+fluorescent+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li>
<li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBG+and+RhCG%2C+the+putative+ammonia+transporters%2C+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li>
<li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B%3A+a+new+gas+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób selekcjonować komórki wykazujące ekspresję wewnątrzkomórkowych wymienników Na+/H+ w błonie plazmatycznej bez zmiany ich pierwotnej sekwencji przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce. Wymienniki te można teraz scharakteryzować.
Metoda ta opiera się na toksyczności komórkowej wewnątrzkomórkowych protonów w celu wybrania linii komórkowych, które będą eksprymować pęcherzykowe wymienniki Na+/H+ w błonie plazmatycznej. ...

Większość przedziałów wewnątrzkomórkowych ma kwaśne pH światła, które jest kluczowym parametrem dla dojrzewania, transportu, recyklingu białek lub hormonów i ładowania neuroprzekaźników. Wykazano, że gradient pH między cytozolem a zawartością pęcherzykową jest generowany przez wakuolarne ATPazy H+ 1, sprzężone z pęcherzykowymi transporterami chlorku ClC2. Zarówno u myszy z nokautem (KO), jak i u ludzi, znaczenie tych transporterów zostało podkreślone przez ciężkie fenotypy spowodowane mutacjami w ich genach3-6.
Wykazano, że członkowie rodziny wymienników sodowo-wodorowych SLC9A, nazywanych również NHE dla wymienników Na+/H+, są kluczowymi efektorami w wewnątrzkomórkowej regulacji pH i objętości komórek, a także w wektorowym transporcie równoważników kwasowo-zasadowych przez nabłonek. Oprócz NHE błony komórkowej, trzy wysoce konserwatywne wymienniki Na+/H+, NHE 6, 7 i 9 ulegają ekspresji w sieci trans-Golgiego i we wczesnych endosomach7. Mutacje w ich genach zostały powiązane z zespołami Angelmana lub Christiansona8-9, autyzmem rodzinnym10 i zespołem nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi11-12. Wymienniki te były również zaangażowane w problemy neurodegeneracyjne, takie jak podatność na chorobę Alzheimera13 i zespoły sąsiadujących genów upośledzenia umysłowego sprzężonego z chromosomem X14. Podsumowując, badania te podkreślają znaczenie tych wewnątrzkomórkowych NHE w rozwoju i/lub funkcjonowaniu mózgu.
Wewnątrzkomórkowa lokalizacja tych wymienników uniemożliwia dokładne pomiary ich selektywności jonowej, kierunku transportu, parametrów kinetycznych i regulacji. Podobnie jak w przypadku wszystkich transporterów ulegających ekspresji w przedziałach wewnątrzkomórkowych, niezwykle trudno jest ocenić ich aktywność biochemiczną, a tym samym w pełni zrozumieć ich role fizjologiczne i mechanizmy leżące u podstaw ich patologicznych implikacji. Opierając się na wysokim stężeniu cytozolowego K+, najpowszechniej akceptowaną hipotezą było to, że działały one jako transportery wypływu protonów sprzężonych z K+. Wysunięto hipotezę o istnieniu takiego wycieku protonów, ponieważ może on równoważyć pompowanie protonów przez V-ATPazy w celu utrzymania pH pęcherzyków w stanie ustalonym. Celem tego artykułu wizualnego jest (i) zademonstrowanie metody pozwalającej na selekcję genetyczną linii komórkowych, które wyrażają takie transportery pęcherzykowe na ich błonie plazmatycznej, oraz (ii) pokazanie dwóch niezależnych podejść do pomiaru funkcji tych transporterów.
Trzy dekady temu, Pouysségur i Franchi zapoczątkowali podejście genetyczne, które umożliwiło klonowanie molekularne i charakterystykę członków rodziny NHE15. Opierało się to na toksyczności protonów wewnątrzkomórkowych jako metody przesiewowej. Pierwszym krokiem było uzyskanie linii komórkowych z niedoborem jakiejkolwiek wymiany Na+/H+ ulegającej ekspresji w błonie plazmatycznej, z wykorzystaniem odwracalności tego transportera. Fibroblasty (linia komórkowa CCL39) zostały wstępnie załadowane Na+ lub Li+, a następnie umieszczone w kwaśnym środowisku zewnątrzkomórkowym (pH 6,5) na 2 godziny. Doprowadziło to do śmierci komórek wykazujących ekspresję funkcjonalnej wymiany Na+/H+ oraz do selekcji komórek z niedoborem antyportera (linia komórkowa PS120)16. Hodowane w podłożu wolnym od wodorowęglanów komórki te są bardzo wrażliwe na ostre zakwaszenie wewnątrzkomórkowe. W związku z tym ekspresja jakiegokolwiek funkcjonalnego mechanizmu wypływu protonów na błonie plazmatycznej będzie pozytywnie wybrana (patrz17), jeśli takie komórki zostaną poddane ostremu zakwaszeniu wewnątrzkomórkowemu. Takie techniki zakwaszania mogą być stosowane do izolowania linii komórkowych z defektami transportu, umożliwiającymi wymuszoną ekspresję wewnątrzkomórkowych NHE WT w błonie komórkowej.
Ponieważ eukariotyczne wymienniki Na+/H+ są elektroneutralne, nie można ich zmierzyć za pomocą metod elektrofizjologicznych, które były stosowane z dużym powodzeniem do pomiaru kanałów. W związku z tym w niniejszym manuskrypcie pokazano, w jaki sposób można zmierzyć aktywność tego wymiennika za pomocą wewnątrzkomórkowych pomiarów pH i szybkiej kinetyki wychwytu litu. Ponieważ podstawowe koncepcje są takie same, warto zauważyć, że wiele procesów opracowanych dla sekcji wyboru jest również wykorzystywanych bezpośrednio do pomiarów funkcjonalnych.
Co ciekawe, zaobserwowaliśmy, że defekt transportu obecny w liniach komórkowych wybranych za pomocą podejścia opisanego w tym manuskrypcie prowadzi do większej ekspresji innych białek pęcherzykowych na błonie plazmatycznej, takich jak pęcherzykowy kanał potasowy TWIK118. Wskazuje to na wybór ogólnego mechanizmu defektu retencji dla pęcherzykowych białek transbłonowych. W związku z tym ta procedura selekcji i generowane przez nią komórki mogą stanowić obiecujące narzędzie dla społeczności naukowej zajmującej się białkami błonowymi przedziałów wewnątrzkomórkowych. Przedstawione tu techniki pomiarowe mogą mieć również zastosowanie do badania innych transporterów nieelektrogenicznych.

<table><tbody><tr><td>Standardowe wyposażenie</td><td></td><td></td> do hodowli komórkowych <td>Służy do selekcji zabijania H+ składa się z wielu urządzeń o różnych numerach katalogowych</td></tr><tr><td>Inkubator z CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator bez CO2</td><td>Heraeus</td><td>instrument BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym PSM1200NF</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicyna/streptomycyna</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr absorpcji atomowej z systemem pieca Zeeman</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Kwas azotowy</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wideomikroskopii fluorescencyjnej</td><td>Leica</td><td></td><td>Składa się z wielu urządzeń o różnych numerach katalogowych</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop automatyczny</td><td>Statyw do mikroskopu Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incydent fluorescencji</td><td>Leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>Wspornik silnika</td><td>Leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234 11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>Światło transmisyjne LED&nbsp;</td><td>Leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowaną płytą</td><td>Leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11888424</tr><tr><td>Wyjście kamery</td><td>Leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do akwizycji/analizy obrazów</td><td>Leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optyka</td><td>Leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjna lampa ksenonowa</td><td>Aparat Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie</td><td></td> metafluor/Mmfluor <td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>sonda czuła pH, BCECF-AM</td><td>technologie życiowe</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka funkcjonalna wymienników na+/h+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Zakwaszenie endosomalne jest kluczowe dla szerokiego zakresu procesów, takich jak recykling i degradacja białek, desensytyzacja receptorów i ładowanie neuroprzekaźników w pęcherzykach synaptycznych. Opisuje się, że w tym zakwaszeniu pośredniczą ATPazy protonowe, sprzężone z transporterami chlorków ClC. Wysoce konserwatywne transportery protonów elektroneutralnych, wymienniki Na+/H+ (NHE) 6, 7 i 9 są również wyrażane w tych przedziałach. Mutacje w ich genach zostały powiązane z ludzkimi chorobami poznawczymi i neurodegeneracyjnymi. Paradoksalnie, ich rola pozostaje nieuchwytna, ponieważ ich wewnątrzkomórkowa lokalizacja uniemożliwiła szczegółową charakterystykę funkcjonalną. Niniejszy manuskrypt przedstawia metodę rozwiązania tego problemu. Polega to na selekcji zmutowanych linii komórkowych, zdolnych do przetrwania ostrego zakwaszenia cytozolowego poprzez zatrzymanie wewnątrzkomórkowych NHE w błonie plazmatycznej. Następnie przedstawiono dwa uzupełniające się protokoły pomiaru selektywności jonowej i aktywności tych wymienników: (i) jeden oparty na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii wideo oraz (ii) jeden oparty na szybkiej kinetyce wychwytu litu. Takie protokoły można ekstrapolować w celu pomiaru innych transporterów nieelektrogenicznych. Co więcej, przedstawiona tutaj procedura selekcji generuje komórki z fenotypem z wadą retencji wewnątrzkomórkowej. Dlatego komórki te będą również wyrażać inne białka błony pęcherzykowej na błonie plazmatycznej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna może zatem stanowić potencjalnie potężne narzędzie do badania innych białek wewnątrzkomórkowych, które będą następnie ulegać ekspresji w błonie komórkowej wraz z pęcherzykowymi wymiennikami Na+/H+ użytymi do selekcji.

Wybór:
Selekcja przez zabijanie H+ opiera się na dyfuzji słabej zasady amonowej, jak przedstawiono na Rysunku 1A. Wpływ dyfuzji słabych zasad i kwasów na pH wewnątrzkomórkowe został opisany pioniersko przez Waltera Borona i współpracowników22. Elegancka koncepcja wykorzystania tego zjawiska do wywołania letalnego zakwaszenia w celu pozytywnej selekcji genetycznej została następnie opracowana przez Jacquesa Pouysségura17. W ramach takiego protok...

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest pomiar aktywności wewnątrzkomórkowo ekspresowanych wymienników sodowo-protonowych. Osiąga się to poprzez wstępną selekcję komórek wykazujących ekspresję wewnątrzkomórkowych wymienników sodowo-protonowych w błonie plazmatycznej za pomocą selekcji metodą proton killing. W drugim kroku wyselekcjonowane komórki są zakwaszane, a następnie mierzy się powrót pH wewnątrzkomórkowego do wartości początkowej, aby potwierdzić aktywność wymienników sodowo-protonowych w tych komórkach.Następnie mierzy się szybką kinetykę transportu jonów w celu określenia stałych powinowactwa dla transportowanego kationu oraz inhibitorów. Ostatecznie monitorowanie zmian pH wewnątrzkomórkowego oraz szybkiej kinetyki wybranych komórek somatycznych pozwala na charakteryzację funkcjonalną wewnątrzkomórkowej wymiany białek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja transporterów zmutowanych lub wykorzystanie komórek per, jest umożliwienie ekspresji wewnątrzkomórkowych transporterów typu dzikiego w błonie plazmatycznej, co pozwala na bezpośredni pomiar ich funkcji.Procedurę zaprezentuje dr Mallory Poet, naukowiec z mojego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę wygaszania protonów, najpierw należy inkubować komórki wykazujące zainteresowanie wewnątrzkomórkowym wymiennikiem sodowo-protonowym w roztworze ładującym w temperaturze 37°C w inkubatorze wolnym od dwutlenku węgla przez jedną godzinę. Następnie należy odessać roztwór ładujący i dwukrotnie przemyć komórki świeżą pożywką.Po drugim przemyciu odessać medium i inkubować komórki w roztworze regeneracyjnym w inkubatorze bez dwutlenku węgla. Po kolejnej godzinie zastąpić medium regeneracyjne zwykłym medium hodowlanym i hodować komórki w standardowych warunkach hodowli. Powtarzać ten cykl selekcji dwa razy w tygodniu, aż pojawią się stabilne klony do obrazowania wewnątrzkomórkowej fluorescencji pH komórek.W pierwszej kolejności przygotowano zestaw do obrazowania składający się z mikroskopu odwróconego połączonego z wysokoczułą kamerą wideo, z wąskopasmowymi filtrami interferencyjnymi o długości 450 nm i 490 nm, zestawionymi z odpowiednimi kwarcowymi filtrami neutralnymi do wzbudzenia. Jeśli to możliwe, należy zastosować odpowiedni zestaw filtrów i warunki oświetlenia, aby ustawić porównywalne wartości fluorescencji dla kanałów pierwszego i drugiego, tak aby stosunek zbliżał się do jedności w celu pomiaru aktywności w przód wymiennika sodowo-protonowego. Następnie zakwaszono komórki poprzez jednogodzinną inkubację w roztworze ładującym amonem.W przypadku braku dwutlenku węgla podczas ostatnich pięciu minut inkubacji, zabarw komórki ratiometrycznym barwnikiem fluorescencyjnym wrażliwym na pH. Po zakończeniu okresu inkubacji wypłucz komórki roztworem ładującym amonowy, aby usunąć sondę pozakomórkową, a następnie umieść zabarwione komórki pod mikroskopem. Wybierz odpowiednie obszary zainteresowania (ROI), w których mierzone będą wartości fluorescencji.Następnie zarejestruj kilka obrazów w celu ustalenia poziomu bazowego i przemyj komórki roztworem RIN, aby zainicjować spadek fluorescencji. Po ustabilizowaniu się pH, przemyj komórki badanym roztworem, aby zmierzyć szybkość regeneracji pH pośredniczoną przez wymianę wodorową z litem, sodem lub potasem. Teraz przemyj komórki roztworem HEPES uzupełnionym o chlorek potasu i gerin.Następnie odczytaj pomiary fluorescencji z obrazów i wyeksportuj dane do programu arkusza kalkulacyjnego w formacie tekstowym, aby zmierzyć szybkość początkową wymiennika sodowo-protonowego. Siedem, poprzez szybkie pobieranie litu, zakwaś komórki i płytki wielodołkowe, stosując technikę ładowania Imodium, tak jak przed chwilą zademonstrowano. Następnie dwukrotnie i szybko przepłucz płytki w sposób przedstawiony powyżej.Następnie inkubuj komórki w roztworach do pobierania zawierających od 1 do 10 µM litu oraz pożądane stężenia kationu lub interesujących inhibitorów przez około jedną minutę lub krócej. Po zakończeniu okresu pobierania ostrożnie usuń medium i szybko przemyj komórki czterokrotnie lodowatym PBS w czasie nieprzekraczającym łącznie 10 sekund, aby zapobiec odpływowi litu, a następnie poddaj komórki lizie w 250 µL 25% kwasu azotowego na studzienkę przez co najmniej jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji zeskrob zawartość każdej studzienki końcem końcówki pipety i przenieś zawiesiny z każdej studzienki do nowych probówek do mikrowirowania. Na koniec odwirowuj próbki przez pięć minut przy 15 000 G w temperaturze pokojowej w celu usunięcia resztek komórkowych, a następnie zmierz zawartość litu w nadosadzie za pomocą spektroskopii absorpcyjnej atomowej.Zgodnie z instrukcjami producenta, selekcja oparta na zabijaniu protonowym opiera się na dyfuzji słabej zasady amonowej. Na przykład komórki, które nie wykazują funkcjonalnego wymiennika sodowo-protonowego w błonie komórkowej, nie są w stanie przywrócić neutralnej wartości pH, a w związku z tym wykazują typowy obraz zakwaszenia z płaskim kształtem i ziarnistym cytosolem, co widać na tym reprezentatywnym obrazie po wielokrotnych cyklach selekcji, przeżywają one w pełni i stabilnie. Zakwaszenie jednak prowadzi do powstania pojedynczych klonów komórkowych, jak widać tutaj; wykazano, że aktywność i selektywność jonową wewnątrzkomórkowych wymienników sodowo-protonowych wykazujących ekspresję w błonie komórkowej można scharakteryzować poprzez pomiar zmian wewnątrzkomórkowego pH indukowanych w różnych warunkach eksperymentalnych, co zaobserwowano na tych wykresach po zakwaszeniu wywołanym obciążeniem Imodium.W odniesieniu do kinetyki enzymatycznej, odpowiedź na dawkę dla początkowych szybkości pobierania może być dalej wykorzystana do wyznaczenia wartości stałej powinowactwa dla substratów oraz wartości stałej inhibicji dla inhibitorów. Rzeczywiście, interesującą cechą transporterów jest to, że różne sprzężone kationy będą konkurować o transport, co daje możliwość pomiaru stałej powinowactwa dla sodu poprzez konkurencję z pobieraniem litu, co przedstawiono na tej rycinie po zastosowaniu opisanej procedury. Można przeprowadzić inne eksperymenty, takie jak BioInnovation powierzchni komórkowej w połączeniu z wyciszaniem RNA, aby zweryfikować, czy interesujący nas transporter jest rzeczywiście ekspresowany w błonie plazmatycznej.

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych przy użyciu selekcji zabójstwa protonów w celu ekspresji ich na błonie plazmatycznej

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Nanociała są ważnymi narzędziami w biologii strukturalnej i stanowią ogromny potencjał dla rozwoju terapii. Jednak wybór nanociał o właściwościach hamujących może być wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) do klasyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczne transportery błonowe.

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Poznaj metodę selekcji zabijającej protony do badania wymienników Na⁺/H⁺ w błonie komórkowej. Technika ta umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowego pH i kinetyki transportu jonów w komórkach ssaczych.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na⁺/H⁺ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Przeglądaj więcej filmów