Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Ogólnym celem tej procedury jest sprzężenie pojedynczego polimeru z końcówką wspornikową A FM w celu przeprowadzenia czterech spektroskopowych eksperymentów desorpcji powierzchni z jedną w tych samych cząsteczkach wiele razy. Osiąga się to poprzez aktywację powierzchni końcówki przez pierwszą plazmę w celu utworzenia grup hydroksylowych w drugim etapie. Końcówka wspornika jest silosowana aminami przez roztwór testowy w górę, który tworzy grupy aminowe na powierzchni końcówki.

Trzecim krokiem jest sprzężenie cząsteczek glikolu polietylenowego z grupami aminowymi. Zapobiegają one niespecyficznym interakcjom między końcówką a podłożem i służą jako cząsteczki łącznikowe dla polimerów. Na koniec polimery są sprzężone z cząsteczkami glikolu polietylenowego w celu utworzenia sondy.

Pomiary sugerują, że ta procedura rzeczywiście umożliwia użycie jednej i tej samej polimerowej sondy siły do kompletnego zestawu eksperymentalnego lub podobnie wielu setek krzywych odległości siły. Główną zaletą eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami w porównaniu z metodami zespołowymi jest to, że można badać rzadkie potwierdzenia i rzadkie stany, które w przeciwnym razie byłyby ukryte w uśrednianiu zespołów. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, eksperymenty te można bezpośrednio porównać do symulacji dynamiki molekularnej.

Pierwszym krokiem jest kowalencyjne przymocowanie cząsteczek sondy do końcówki wspornika. Zacznij od świeżego azotku krzemu. Chipy wspornikowe, wykorzystują wióry o stałej sprężystości od 10 do 100 niutonów piko na nanometr.

Użyj pęsety, aby umieścić je na czystym szkiełku podstawowym lub szalce Petriego. Następnie umieść szkiełko z chipami w 100-watowej komorze plazmowej po opróżnieniu komory i przepłukaniu jej tlenem działającym pod ciśnieniem 0,25 milibara i 20 watów przez 15 minut. W kolejnych krokach należy użyć okapu, aby uniknąć wdychania oparów organicznych podczas obróbki plazmowej.

Przygotować do silosowania aminokwasów wsporników na szklanej szalce Petriego, umieścić 2,5 mililitra roztworu testowego. Ponadto napraw naczynie zawierające aceton. Wsporniki należy pobrać natychmiast po zakończeniu obróbki plazmowej.

Zanurz każdy wspornik w acetonie na jedną sekundę, a następnie umieść go w roztworze Optus. Przed kontynuowaniem inkubuj wsporniki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W trakcie inkubacji wsporników należy rozpocząć przygotowania do pegylacji, aby zminimalizować wpływ wody i powietrza na składniki.

Zacznij od wcześniej przygotowanych probówek eph, z których jedna zawiera kołek m, NHS, a drugi barwnik. NHS Peg. Określ wagę zawartości każdej probówki.

Następnie pracuj z probówką zawierającą EG NHS i przygotuj się do dodania chloroformu. Wlać chloroform, aby osiągnąć końcowe stężenie 25 milimolowe i roztwór wystarczający do pokrycia wsporników w kolejnych etapach. Umieść probówkę na mieszalniku wirowym, aby upewnić się, że proszek się rozpuści.

Odłóż rurkę z EG NHS na bok, aby pracować z dietą. Kołek NHS. Dodaj chloroform, aby osiągnął końcowe stężenie 0,25 milimola.

Użyj miksera wirowego, aby upewnić się, że proszek się rozpuścił. Następnie wymieszaj roztwory, aby dostosować stosunek między cząsteczkami NHS peg diety a cząsteczkami NHS peg metylowym. Ten stosunek wynosi zwykle jeden do 500.

Zaopatrz się w małą szklaną szalkę Petriego z pokrywką ograniczającą parowanie i napełnij ją mieszaniną jako wsporniki. Zakończ inkubację. W roztworze testowym APT przygotuj dwa pojemniki z około 10 mililitrami acetonu i jeden z chloroformem do ich przepłukania.

Zanurz każdy z nich w acetonie dwa razy i raz w chloroformie i umieść je w roztworze glikolu polietylenowego. Przykryj naczynie i trzymaj wsporniki w roztworze. Przez godzinę przygotuj się do kowalencyjnego sprzężenia cząsteczki sondy, w tym przypadku poliaminokwasu poli de tyrozyny.

Zacznij od objętości jednego molowego wodorotlenku sodu rozpuść się w tym, cząsteczce sondy do stężenia jednego miligrama na mililitr. W przypadku tyrozyny poli D należy wymienić wodorotlenek sodu na otwór sodowy o pH od ośmiu do 8,5. Osiem bezpośrednio przed funkcjonalizacją.

Gdy wsporniki zakończą inkubację w roztworze glikolu polietylenowego, przygotuj trzy pojemniki do ich płukania oraz pojemnik z otworem polityrozynowy. Osiem roztworów buforowych do płukania to pięć mililitrów chloroformu, pięć mililitrów etanolu, pięć mililitrów buforu wiertniczego. Użyj około 300 mikrolitrów roztworu buforowego z polityrozyny.

Wyjmij wsporniki i zanurz każdy z nich najpierw w chloroformie, następnie w etanolu, a następnie w buforze z ósemką. Przed umieszczeniem ich w polityrozynie należy wywiercić osiem roztworów buforowych. Pozwól wiórom wspornikowym inkubować przez godzinę po jednej godzinie gotowości, około pięciu mililitrów buforu bate w jednym pojemniku i pięć mililitrów ultraczystej wody w innym do płukania wsporników ma również 20 mililitrów ultraczystej wody do ich przechowywania.

Weź wsporniki i zanurz każdy z nich w buforze Boite, a następnie w ultraczystej wodzie do płukania. Następnie zanurz go w ultraczystej wodzie do przechowywania. Wsporniki mogą być teraz używane do pozyskiwania danych.

Po funkcjonalnym wyposażeniu końcówki A FM oraz przygotowaniu i zamontowaniu powierzchni rozpocznij kroki w celu akwizycji danych FM. Najpierw umieść funkcjonalizowany wspornik w uchwycie wspornikowym A FM, który jest odpowiedni do pomiaru w cieczach. Następnie podłącz uchwyt wspornikowy do głowicy A FM.

Kontynuuj, wlewając wodę do komórki płynu, aby zanurzyć wspornik i powierzchnię. Następnie opuść głowicę A FM na ogniwo cieczowe. Pozwól systemowi zrównoważyć się przez co najmniej pół godziny.

Po równowadze. Umieść wspornik daleko od powierzchni, a następnie zarejestruj widma szumu termicznego Wymagane jest 10 lub więcej widm, aby uzyskać wystarczający stosunek sygnału do szumu w celu wykluczenia efektów tłumienia powierzchni. Następnie ostrożnie zbliż się do powierzchni, aby dokonać pomiaru odwrotnej czułości dźwigni optycznej.

Polega to na dociśnięciu końcówki wspornika do twardej powierzchni, aby zarejestrować siłę w stosunku do odległości ruchu pizo. Zmierz nachylenie podczas kontaktu i odwróć je, aby określić odwrotną czułość dźwigni optycznej. Następnie pracuj, odwrotna czułość dźwigni optycznej i widma szumu termicznego Określ stałą sprężystości wspornika, dopasowując oscylator harmoniczny do widma szumu termicznego.

Teraz ustaw odpowiednie parametry do zbierania danych. Zapisz wiele krzywych wymuszonej odległości dla każdego warunku eksperymentalnego na końcu zbierania danych. Ponownie określ czułość i stałą sprężystości, aby sprawdzić spójność i stabilność systemu.

Ten przykład wymuszonego śladu odległości w kolorze czerwonym pochodzi z retrakcji polityrozyny z metylowej, samoorganizującej się jednowarstwowej zanieczyszczonej wody. Pojedynczy skokowy spadek siły do zera wskazuje na oderwanie pojedynczej cząsteczki. Dopasowanie sigmoidalne jest pokazane w kolorze czarnym.

Wyodrębniona długość plateau i siła plateau są oznaczone strzałkami. Prędkość chowania wysuwu wspornika wynosiła 0,5 mikrona na sekundę, a czas przebywania na powierzchni wynosił jedną sekundę. Różne środowiska ciekłe do pomiaru powodowały zmiany w ekstrahowanej sile plateau.

Histogramy te odzwierciedlają wyodrębnioną siłę plateau dla pomiarów w czystej wodzie i pomiarów w wodzie. Mieszaniny etanolu zarejestrowano co najmniej 300 śladów siły odległości dla każdego roztworu z jednym w tym samym pojedynczym polimerze. Tutaj analogiczne histogramy są pokazane dla wyodrębnionej długości plateau dla czystej wody i mieszanin wodno-etanolowych.

Dodatek etanolu osłabia hydrofobowe oddziaływanie między polityrozyną a powierzchnią, prowadząc do mniejszej siły plateau i zmniejszenia długości plateau. Jest to podsumowane w tej płycie o szczytowej długości plateau w funkcji szczytowej siły plateau. Po opanowaniu protokół funkcjonalizacji można wykonać w ciągu około czterech godzin po opracowaniu.

Technika ta utorowała naukowcom z dziedziny fizyki i chemii możliwość zbadania adhezji polimerów naruszających się na granicy faz.