Name: Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj protokół głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza u szczurów Wistar i analizę zmian ekspresji genów w hipokampie. Metoda obejmuje chirurgię stereotaktyczną, stymulację elektryczną oraz qRT-PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie fundacji NREF.

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury omówione w tym manuskrypcie są zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi badań na zwierzętach (Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych) i są zatwierdzone przez Komitet IACUC Harvard Medical School.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie lub przez oczyszczanie roztworem antyseptycznym i/lub etanolem, jeśli to konieczne. Jeśli to możliwe, używaj sterylnego sprzętu jednorazowego użytku, takiego jak skalpele, igły i strzykawki.</li>
	<li>Przykryj stół warsztatowy obłożeniami chirurgicznymi i upewnij się, że dostępna jest utylizacja odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Zważ szczura i oblicz dawkę znieczulenia. Użyj mieszanki ketaminy i ksylazyny (ketamina 75 mg/kg i ksylazyna 10 mg/kg) do znieczulenia szczurów. 
	UWAGA: Pomiędzy 200-250 g to optymalna waga do prawidłowego zamocowania zwierzęcia w ramie stereotaktycznej, a także do dokładnego namierzenia ATN. Izofluran może być również stosowany jako środek znieczulający.</li>
	<li>Zamontuj i zabezpiecz dwie sterylne elektrody (sterylizowane w autoklawie lub tlenkiem etylenu) na uchwycie elektrody (ryc. 2) stereotaktycznej ramy operacyjnej i za pomocą mikroskopu (powiększenie 10-40X) sprawdź końcówki elektrody pod kątem prawidłowego ustawienia. Zabezpiecz dwie elektrody w odległości 3.0 mm od siebie. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić końcówki elektrody poprzez dotknięcie twardych powierzchni.</li>
</ol>
2. Chirurgia DBS
<ol>
	<li>Wstrzyknąć zwierzęciu mieszaninę ketaminy i ksylazyny dootrzewnowo i upewnić się, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (sprawdzając odruch szczypania palca u nogi, częstość oddechów oraz głębokość i regularność oddechu). Usuń włosy z obszaru skóry głowy, który zostanie nacięty i zdezynfekuj skórę głowy za pomocą 3 naprzemiennych peelingów, z których każdy zawiera betadynę i alkohol lub sterylną sól fizjologiczną. Zabezpiecz i ustaw zwierzę na ramie stereotaktycznej.</li>
	<li>Używaj cyrkulujących ciepłych podkładek wodnych, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na optymalnym poziomie. Nałóż lubrykant do oczu zwierzęcia, aby chronić je przed przesuszeniem. </li>
	<li>Użyj następujących współrzędnych stereotaktycznych do celowania w ATN (jądro przednie wzgórza): przednio-tylne -1,6 mm, przyśrodkowo-boczne 1,5 mm i grzbietowo-brzuszne 5,2 mm1, 
	UWAGA: Współrzędne stereotaktyczne są oparte na atlasie36 mózgu szczura Paxinos and Watson (6th edition).</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w skórze głowy strzałkowo, aby odsłonić czaszkę. Za pomocą pary retraktorów zabezpiecz naciętą skórę głowy, aby odsłonić czaszkę. Użyj sterylnej soli fizjologicznej, aby przepłukać nacięcie. Jeśli nacięcie jest zbyt mokre, użyj sterylnych wacików do wyschnięcia. Zlokalizuj bregmę i zaznacz czarnym markerem. Aby wskazać położenie otworów zadziorów, wykonaj dwa dodatkowe znaki w odległości około 1,5 mm przyśrodkowo po obu stronach od szwu strzałkowego i 1,6 mm za szwem koronalnym.</li>
	<li>Użyj ręcznej wiertarki, aby wykonać otwory na zadziory. Upewnij się, że końcówka otworu na żarna jest sterylna, sterylizując ją etanolem. Podczas wiercenia trzymaj wiertło pod kątem około 45° do powierzchni czaszki. Często przełączaj się między dwoma otworami na zadziory, aby uniknąć nadmiernego ciepła w miejscu dowolnego otworu na zadziory.</li>
	<li>Kontynuuj wiercenie, aż opona twarda zostanie odsłonięta. Za pomocą igły z wygiętą końcówką przypominającą kształt litery "L" usuń wszelkie złamane kawałki kości, które utrudniałyby wprowadzenie elektrody. Należy uważać, aby nie uszkodzić opony twardej i/lub tkanki mózgowej podczas usuwania fragmentów kości za pomocą wygiętej igły. 
	UWAGA: Użycie igły lub cienkich kleszczy jest również opcją.</li>
	<li>Przymocuj zespół podwójnej elektrody do obrotowego uchwytu ramy stereotaktycznej i zamocuj uchwyt pod kątem 90°. Korzystając z regulacji w ramce stereotaktycznej, umieść lewą elektrodę dokładnie nad bregmą.</li>
	<li>Korzystając z regulacji stereotaktycznych do pozycjonowania przyśrodkowo-bocznego, precyzyjnie przesuń lewą elektrodę o 1,5 mm na lewą stronę bregmy, tak aby teraz dwie elektrody były idealnie ustawione wzdłuż szwu koronalnego, ale oddalone od siebie o 1,5 mm przyśrodkowo bocznie od bregmy.</li>
	<li>Korzystając z przednio-tylnej regulacji stereotaktycznej, przesuń elektrody o 1,6 mm do tyłu do szwu koronalnego.</li>
	<li>Użyj regulacji grzbietowo-brzusznej, aby opuścić elektrody, aby najpierw sprawdzić, czy otwory na zadziory zostały wykonane we właściwym miejscu, tak aby elektrody można było łatwo włożyć, bez dotykania ostrych krawędzi otworów zadziorów. Jeśli tak, należy umieścić elektrody na głębokości 5,2 mm od powierzchni czaszki.</li>
	<li>Podłączyć elektrody za pomocą przewodów do stymulatora ustawionego na 130 Hz, 2,5 V i szerokość impulsu 90 μs1.</li>
	<li>Dostarczaj stymulację o wysokiej częstotliwości przez godzinę (lub przez żądany okres czasu, zgodnie z konfiguracją eksperymentalną). W trakcie stymulacji należy pamiętać o regularnym zapewnianiu odpowiedniej głębokości znieczulenia, sprawdzając, czy stopa nie wycofuje się w odpowiedzi na uszczypnięcie palca. Uzupełnić znieczulenie około połową dawki początkowej stosowanej do wywołania znieczulenia. Unikaj zanieczyszczenia sterylnych rękawic podczas sprawdzania głębokości znieczulenia i zmieniaj je w razie potrzeby. Wykonaj jednostronną lub obustronną stymulację w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Uwzględnij kontrole, takie jak stymulacja o niskiej częstotliwości (np. 10 Hz) i zwierzęta niestymulowane (wprowadzanie elektrod bez późniejszej stymulacji).</li>
	<li>Po wykonaniu stymulacji należy ostrożnie usunąć elektrody i zszyć nacięcie szwami 3-0 lub sterylnymi zszywkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,05 mg/kg) podawać podskórnie w postaci środka przeciwbólowego. Monitoruj zwierzę, dopóki nie powróci do normalnej aktywności, a następnie zwróć je do pomieszczenia inwentarskiego.</li>
	<li>Po upływie określonego czasu w oparciu o schemat eksperymentalny (np. 0, 3, 6 lub 12 godzin po operacji DBS) należy poddać zwierzę eutanazji z powodu przedawkowania znieczulenia. Po potwierdzeniu braku parametrów życiowych odetnij głowę zwierzęciu.</li>
	<li>Wypreparuj mózg, najpierw usuwając skórę za pomocą nożyczek. Przeciąć kość wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą nożyczek preparacyjnych. Wykonaj jeszcze dwa nacięcia (około cala każde) przez kość po obu bocznych stronach. Za pomocą kleszczy podnieś częściowo odcięty kawałek kości z górnej części czaszki, aby odsłonić mózg.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek lub kleszczy usuń mózg z czaszki i przenieś na szalkę Petriego z zimnym PBS na lodzie. 
	UWAGA: Uważaj, aby uniknąć uszkodzenia mózgu podczas wykonywania nacięć przez kość.</li>
</ol>
3. Izolacja hipokampa
UWAGA: Wykonaj wszystkie kolejne kroki w tej sekcji na lodzie.
<ol>
	<li>Umieść mózg na wstępnie schłodzonej akrylowej matrycy mózgowej na lodzie. Za pomocą żyletki przeciąć mózg w kierunku koronalnym w odległości około 7-8 mm od najbardziej przedniej krawędzi mózgu. Wykonaj drugie cięcie w kierunku koronalnym i za pierwszym cięciem, tak aby można było usunąć plaster mózgu o grubości około 5 mm.</li>
	<li>Przenieś plasterek mózgu na szalkę Petriego z lodowatym PBS. Za pomocą żyletki odetnij dwie półkuliste sekcje i zwróć uwagę, która półkula odpowiada odpowiednio lewej i prawej stronie. Jest to szczególnie ważne podczas wykonywania jednostronnych stymulacji.</li>
	<li>Za pomocą drobnych kleszczy i nożyczek ostrożnie usuń hipokamp.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie tkanki hipokampa na suchym lodzie i przechowywanie w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie gotowe do kolejnych etapów ekstrakcji RNA. 
	UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania zaleca się przechowywanie tkanek w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA i ilościowy PCR
<ol>
	<li>Upewnij się, że tkanka pozostaje zamrożona na suchym lodzie, aż będzie gotowa do homogenizacji.</li>
	<li>UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml odczynnika Tri do tkanki hipokampa w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i homogenizować ją, najpierw pipetując wiele razy, aż tkanka zostanie rozbita na mniejsze kawałki. Dalej homogenizować tkankę, przechodząc przez strzykawkę z igłą 25 G, aż nie będzie widoczna żadna nieuszkodzona tkanka. Etapy homogenizacji należy wykonać na lodzie.</li>
		<li>Po homogenizacji tkanki pozostaw zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby umożliwić lizę komórek. 
		UWAGA: Po tym czasie zawiesinę komórek można szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 0,2 ml chloroformu i mieszać przez wirowanie przez 20 sekund i pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej na 15 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki, nie naruszając trzech oddzielnych warstw, które będą widoczne. 
	UWAGA: Dolna (czerwona) faza zawiera białka, środkowa faza mętna zawiera DNA, a górna faza przezroczysta zawiera RNA.</li>
	<li>Przenieść górną klarowną fazę (RNA) do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (zazwyczaj otrzymuje się 500 μl fazy zawierającej RNA). Do tego dodaj 0,5 ml izopropanolu i wymieszaj przez wirowanie. Do tego dodać 2-3 μl glikogenu (20 mg/ml) jako nośnik RNA. Pozostawić próbkę na stole w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że osad RNA jest widoczny na dnie probówki.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i przemyć osad RNA, dodając 1 ml 75% etanolu (wytworzonego z wody wolnej od nukleaz). Odwrócić próbkę wiele razy, aż osad oderwie się od dna probówki i zacznie unosić się w roztworze. Odwirować roztwór o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Granulat w 75% etanolu można przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych kroków.</li>
	<li>Pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu, pozostawiając otwarte probówki na 5 minut w temperaturze pokojowej. Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia granulki, ponieważ może to wpłynąć na jej rozpuszczenie w wodzie w kolejnym etapie.</li>
</ol>
5. Usuwanie DNA z preparatu RNA
<ol>
	<li>Dodaj 9 μl wody wolnej od nukleaz do osadu RNA i upewnij się, że osad jest rozpuszczony przed kontynuowaniem, delikatnie wirując probówkę. Do tego dodać 1 μl 10x buforu Dnazy I i 1 μl rekombinowanej DNazy (z zestawu DNazy I), wymieszać, delikatnie przesuwając probówki, krótko obrócić probówki i inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 2 μl odczynnika do inaktywacji DNazy (z zestawu DNazy I) do próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty i często mieszać, delikatnie przesuwając probówkę. Odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut i przenieść około 10 μl klarownego supernatantu do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zmierz stężenie RNA za pomocą nanokropli lub spektrofotometru.</li>
</ol>
6. Tworzenie cDNA z RNA
<ol>
	<li>Dodać wymaganą objętość, która zawiera 1 μg RNA i doprowadzić całkowitą objętość do 8 μl, dodając wodę wolną od nukleaz. Do tego dodaj 1 μl 10 mM mieszanki dNTP i 1 μl losowych heksamerów z zestawu do syntezy pierwszej nici w indeksie górnym. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut w łaźni wodnej lub na zaprogramowanym termocyklerze.</li>
	<li>Sporządzić premiks zawierający następujące odczynniki: 2 μl 10x buforu RT, 4 μl 25 M MgCl2, 2 μl 0,1 M DTT i 1 μl RNAse OUT (40 U/μl). 
	UWAGA: Podane objętości dotyczą reakcji, użytkownik musiałby skalować w górę zgodnie ze swoimi potrzebami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Po usunięciu próbki zawierającej RNA z temperatury 65 °C, należy ustawić probówkę w temperaturze pokojowej na minutę. Dodać 9 μl roztworu premiksu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Dodać 1 μl enzymu odwrotnej transkryptazy indeksu górnego II (50 j./μl), a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 42 °C przez 50 minut, aby nastąpiła odwrotna transkrypcja.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 70 °C przez 15 minut w celu zakończenia reakcji.</li>
	<li>Umieścić próbki na krótko na lodzie, dodać 1 μl RNAseH (2 U/μl) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Krótko odwirować probówki o stężeniu 3 000 x g, aby odwirować płyn kondensatu. 
	UWAGA: Jest to cDNA, które zostanie użyte do ilościowego PCR. cDNA można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu ustawienia PCR. cDNA można również rozcieńczyć wodą wolną od nukleaz przed przystąpieniem do PCR.</li>
</ol>
7. Ilościowy PCR
<ol>
	<li>Sporządzić mieszankę wzorcową zawierającą następujące odczynniki (podane objętości dotyczą każdej reakcji): 6,3 μl 2x Sybr Green Mix, 0,6 μl Forward Primer (10 μM), 0,6 μl Reverse Primer (10 μM) i 0,5 μl wody wolnej od nukleaz. 
	UWAGA: Projekt startera został wykonany przy użyciu opcji "Wybierz startery" na stronie sekwencji nukleotydów NCBI dla interesującego genu.</li>
	<li>Dodaj 10 μl mastermixu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce PCR. Dodać 2,5 μl wytworzonego wcześniej cDNA do studzienki zawierającej mastermix. Upewnij się, że ustawiłeś potrójne reakcje PCR dla każdej próbki.</li>
	<li>Po zakończeniu dodawania mastermixu i cDNA, przykryj płytkę PCR za pomocą optycznego arkusza kleju, aby uszczelnić studzienki. Obracać płytkę krótko przez 5 minut przy 500 x g w wirówce stołowej, aby cały płyn osiadł na dnie studzienki.</li>
	<li>Załaduj płytkę PCR do wstępnie zaprogramowanej maszyny RT-PCR. Należy użyć parametrów PCR podanych w tabeli 1.</li>
	<li>Analiza danych: Do dalszych obliczeń należy użyć wartości Ct z danych wyjściowych qPCR. Wraz z genem testowym ustaw reakcje PCR dla genów kontroli wewnętrznej, 18S rRNA (aby zapewnić równe wejście) i β-aktyny (kontrola ujemna). Obliczyć zmiany zagięcia w oparciu o metodę ΔΔCt 37.</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Po przełomowej pracy Benabida i in. w stosowaniu głębokiej stymulacji mózgu w leczeniu choroby Parkinsona i drżenia samoistnego, technika chirurgiczna DBS była badana z dużym zainteresowaniem w ciągu ostatniej dekady w leczeniu wielu zaburzeń neurologicznych6,10,43. Badania DBS ukierunkowane na różne neuroanatomiczne regiony obwodów mózgowych są obecnie prowadzone przez wiele grup w celu leczenia głównych chorób neuronalnych i są na różnych etapach badań klinicznych. Stymulacja jądra podwzgórzowego (S...

Historia rozwoju Głębokiej Stymulacji Mózgu jako techniki neurochirurgicznej sięga lat siedemdziesiątych XIX wieku, kiedy to zbadano możliwość elektrycznej stymulacji obwodów mózgu2. Stosowanie przewlekłej stymulacji o wysokiej częstotliwości w leczeniu zaburzeń neuronalnych rozpoczęło się w latach sześćdziesiątych XX wieku3. Później, w latach dziewięćdziesiątych, wraz z pojawieniem się przewlekłych elektrod DBS4-6 implantacyjnych, liczba zaburzeń neuronalnych, które były leczone przez DBS, nadal rosła. Głęboka stymulacja mózgu została po raz pierwszy zastosowana w Stanach Zjednoczonych w leczeniu drżenia samoistnego6. Obecnie chirurgia jest szeroko stosowana w leczeniu zaburzeń neuronalnych, które są obecnie nieuleczalne za pomocą interwencji farmakologicznej. DBS jest obecnie stosowany w leczeniu zaburzeń ruchowych choroby Parkinsona i dystonii7-9. Demencja typu Alzheimera, choroba Huntingtona, epilepsja, ból i choroby neuropsychiatryczne, takie jak depresja, OCD, zespół Tourette'a i uzależnienie to tylko niektóre ze schorzeń, które można leczyć za pomocą DBS10-12. Podczas gdy chirurgia DBS jest zatwierdzona przez FDA do leczenia choroby Parkinsona, dystonii i drżenia samoistnego, stosowanie DBS w leczeniu innych wyżej wymienionych schorzeń znajduje się na różnych etapach badań laboratoryjnych i klinicznych, oferując pacjentom wiele nadziei13,14.
Klinicznie, operacja DBS jest wykonywana w dwóch etapach. Pierwszy etap polega na chirurgicznym ustawieniu elektrod DBS w docelowym miejscu anatomicznym przy użyciu kombinacji pozycjonowania radiologicznego, tomografii komputerowej, rezonansu magnetycznego oraz odczytów mikroelektrod w celu zwiększenia precyzji. Drugi etap polega na wszczepieniu generatora impulsów w górnej części klatki piersiowej pacjenta i zainstalowaniu przedłużaczy od skóry głowy do generatora impulsów. W oparciu o stan neurologiczny ustandaryzowano kilka schematów programowania generatora impulsów, które zostaną wykorzystane do dostarczenia żądanego napięcia. Napięcie końcowe jest osiągane w sposób stopniowy, aby uzyskać najlepszą odpowiedź kliniczną przy minimalnym napięciu15. Jednak w naszych badaniach, w przeciwieństwie do przewlekłych implantów DBS stosowanych klinicznie, dla uproszczenia uciekliśmy się do badania jednorazowej stymulacji o wysokiej częstotliwości (przez 1 godzinę) w naszych modelach zwierzęcych.
Część badań naszej grupy skupia się na badaniu zastosowania chirurgii DBS w leczeniu padaczki opornej na leczenie. Stereotaktyczne metody chirurgiczne wykorzystujące stymulację wysokiej częstotliwości były badane przez wielu innych jako skuteczna opcja leczenia padaczki opornej na leczenie, która stanowi około 30% wszystkich przypadków padaczki10,16,17. Stymulacja móżdżku ukierunkowana na powierzchnię kory mózgowej, a także głębokie jądra móżdżku były w przeszłości stosowane jako cele w leczeniu padaczki10,18,19. Ponadto próbowano również stymulacji hipokampa, ale z mieszanymi wynikami20,21. Niektóre z innych badanych celów DBS w padaczce obejmują korę mózgową, wzgórze, jądro podwzgórzowe i nerw błędny8. Jednak zgodnie z wynikami kilku badań przeprowadzonych w ciągu ostatnich kilku lat, jądro przednie wzgórza (ATN) stało się najczęstszym celem DBS w leczeniu padaczki10,22. Opierając się na wiedzy na temat obwodów neuroanatomicznych i wynikach z modeli zwierzęcych, kilka badań koncentrowało się na terapeutycznym wpływie głębokiej stymulacji mózgu ATN w leczeniu padaczki 23-26. ATN jest częścią obwodu limbicznego i znajduje się w obszarze mózgu, który wpływa na częstotliwość napadów. W badaniach przeprowadzonych przez Hamani i wsp. przetestowano skuteczność ATN-DBS w modelu padaczki indukowanej pilokarpiną i stwierdzono, że obustronna stymulacja ATN wydłużała opóźnienia w przypadku napadów wywołanych pilokarpiną i stanu padaczkowego24. Ponadto stwierdzono, że stymulacja ATN o wysokiej częstotliwości zmniejsza częstość napadów w modelu padaczki z pentylenotetrazolem (PTZ)25,27-29. Lee i wsp. stwierdzili średnie zmniejszenie częstości napadów o około 75% po przewlekłej głębokiej stymulacji mózgu ATN w leczeniu opornej na leczenie padaczki częściowej30.
Niedawne badanie kliniczne nad padaczką oporną na leczenie wykazało obiecujące wyniki po operacji DBS ukierunkowanej na jądro przednie wzgórza (ATN)22. Wieloośrodkowe randomizowane badanie kliniczne z udziałem 110 pacjentów poddawanych obustronnemu DBS ATN w leczeniu padaczki opornej na leczenie (badanie SANTE) wykazało spadek częstości napadów o około 40%31. Wyniki tego badania wskazują również na opóźniony optymalny efekt przeciwpadaczkowy obserwowany po 2-3 miesiącach od operacji. Dalsze badania przeprowadzone przez Toda i wsp., potwierdzone tymi odkryciami, wykazały neurogenezę zachodzącą w późniejszym czasie po DBS (dni 3-5) w modelach zwierzęcych1. Ponadto Encinas i wsp. opisali neurogenezę hipokampa w zakręcie zębatym dorosłej myszy po stymulacji ATN32 o wysokiej częstotliwości. Poprzednie badania33-35 wykazały spadek neurogenezy hipokampa w niektórych przypadkach padaczkowych, takich jak przewlekła padaczka skroniowa i związek z deficytami w uczeniu się, upośledzeniem pamięci i spontanicznymi nawracającymi napadami ruchowymi. Ponadto w przewlekle padaczkowym hipokampie w modelach zwierzęcych zaobserwowano zmniejszenie liczby czynników progenitorowych nerwowych komórek macierzystych, takich jak FGF2 i IGF-1. Biorąc to pod uwagę, strategie interwencyjne, takie jak DBS, które wykazują augmentację neurogenezy w zakręcie zębatym, są ekscytującymi ścieżkami badań. Odkrycia te zachęciły nas do dalszego zagłębiania się w mechanizm leżący u podstaw neurogenezy po leczeniu padaczki po DBS. Ukierunkowaliśmy ATN zarówno jednostronnie (dane nie zostały opublikowane), jak i dwustronnie (w reprezentatywnych wynikach) i zaobserwowaliśmy podwyższoną ekspresję neurotrofiny (BDNF) w zakręcie zębatym szczura. Nasza obecna hipoteza jest taka, że ekspresja BDNF inicjuje kaskadę ekspresji genów, która kończy się neurogenezą, która przekłada się na przeciwpadaczkowe działanie operacji DBS. W tym artykule przedstawiamy nasze metody chirurgii DBS ukierunkowane na ATN u szczurów, a następnie analizę ekspresji genów jako atrakcyjne podejście do badania mechanizmu leżącego u podstaw korzyści płynących z DBS.

<table><tbody><tr>Chirurgia <td></td><td></td><td></td><td>głębokiej stymulacji mózgu</td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło&nbsp;</td><td>Dremmel</td><td>7700, skalpel 7,2 V</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-803-6637</td><td>Harmonogram III Substancja kontrolowana, pozyskiwanie, stosowanie i przechowywanie zgodnie z przepisami instytucjonalnymi</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-850-2280</td><td>Harmonogram III Substancja kontrolowana, pozyskiwanie, stosowanie i przechowywanie zgodnie z zasadami instytucjonalnymi</td></tr><tr><td>Zszywki chirurgiczne</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>Szwy (3-0)&nbsp;</td><td>Aparat Harvarda</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml, 29 1/2 G)</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Sterylna, służy do podawania znieczulenia dootrzewnowo</td></tr><tr><td>Strzykawka (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Sterylna, służy do podawania znieczulenia podskórnie</td></tr><tr><td>Igły</td><td>BD</td><td>305761</td><td>Sterylne, służy do usuwania złamanych kawałków kości z otworów w zadziorach</td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Fisher Naukowe</td><td></td><td>zastosowanie S25309B do ogólnej sterylizacji&nbsp;</td></tr><tr><td>Smar do oczu</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Medtronic</td><td>Model 3628</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody DBS</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td><td>Elektrody to platynowa, koncentryczna i bipolarna</td></tr><tr><td>Betadina (powidon-jod)&nbsp;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>Waciki jednorazowego użytku, służą do sterylizacji skóry głowy przed wykonaniem nacięcia&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Rozwarstwienie mózgu i izolacja</td><td></td><td></td><td></td>tkanki hipokampa</tr><tr><td>Akrylowa matryca mózgu gryzoni</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>175-300</td><td>www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki gilotynowe</td><td>Clauss</td><td>18039</td><td>W celu dekapitacji upewnij się, że te nożyczki są utrzymywane w czystości i sprawnym stanie</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Codman Klasyczny</td><td>34-4098</td><td>Służy do usuwania mózgu z czaszki</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72957-06</td><td>Służy do usuwania mózgu z czaszki i do przenoszenia podczas sekcji</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ekstrakcja RNA i przygotowanie cDNA Tri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Zawsze używaj w dygestoria i noś okulary ochronne podczas obsługi; unikać kontaktu ze skórą</td></tr><tr><td>Strzykawka (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Służy do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>Zawsze używaj w dygestorium i noś okulary ochronne podczas obsługi; unikaj kontaktu z skóra</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny Zestaw do syntezy pierwszej nici</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ilościowy PCR</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zielony zestaw do PCR SYBR</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr> Niestandardowe płytki do PCR <tr><td>Oligos</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>(96 dołków)</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>Optyczne arkusze samoprzylepne</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>Real Maszyna do PCR</td><td>Time PCR Applied Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Operacja głębokiej stymulacji mózgu (DBS), ukierunkowana na różne obszary mózgu, takie jak zwoje podstawy, wzgórze i obszary podwzgórzowe, jest skutecznym sposobem leczenia kilku zaburzeń ruchowych, które nie reagują na leki. Niedawny postęp w dziedzinie chirurgii DBS zaczął rozszerzać zastosowanie tej techniki chirurgicznej na inne stany tak różnorodne, jak chorobliwa otyłość, depresja i zaburzenia obsesyjno-kompulsywne. Pomimo tych rosnących wskazań, niewiele wiadomo na temat podstawowych mechanizmów fizjologicznych, które ułatwiają korzystne efekty operacji DBS. Jednym z podejść do tego pytania jest przeprowadzenie analizy ekspresji genów w neuronach, które otrzymują stymulację elektryczną. Wcześniejsze badania wykazały, że neurogeneza w zakręcie zębatym szczura jest wywoływana w DBS ukierunkowanym na przednie jądro wzgórza1. Chirurgia DBS ukierunkowana na ATN jest szeroko stosowana w leczeniu padaczki opornej na leczenie. W związku z tym bardzo interesujące jest dla nas zbadanie zmian transkrypcyjnych wywołanych przez elektryczną stymulację ATN. W tym manuskrypcie opisujemy nasze metodologie stereotaktycznego zabiegu chirurgicznego DBS ukierunkowanego na ATN u dorosłych samców szczurów rasy Wistar. Omówiono również kolejne etapy preparacji tkanek, izolacji RNA, przygotowania cDNA oraz ilościowego RT-PCR do pomiaru zmian ekspresji genów. Metoda ta może być stosowana i modyfikowana do stymulacji zwojów podstawy mózgu i innych obszarów mózgu, które są powszechnie ukierunkowane klinicznie. Opisane tutaj badanie ekspresji genów zakłada podejście do genu docelowego w celu odkrycia molekularnych graczy, którzy mogą kierować mechanizmem DBS.

Rycina 1A oraz 1B przedstawiają względną ekspresję BDNF i GABRD w stosunku do genu kontrolnego β-actin. BDNF, będący neurotrofiną, jest często kojarzony z efektami neuroprotekcyjnymi w wielu chorobach neuronalnych38-41. Interesująca jest zatem analiza profilu ekspresji BDNF w odpowiedzi na stymulację ATN, która przynosi korzyści terapeutyczne pacjentom z epilepsją. Na ryc. 1A, która przedstawia profil ekspresji genu BDNF w indicated punktach czasowych po stymu...

Mechanizm leżący u podstaw terapeutycznych efektów operacji Głębokiej Stymulacji Mózgu (DBS) wymaga zbadania. Metody przedstawione w tym manuskrypcie opisują eksperymentalne podejście do badania zdarzeń komórkowych wywoływanych przez DBS poprzez analizę profilu ekspresji genów kandydujących, które mogą ułatwić neurogenezę po operacji DBS.

Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie głębokiej stymulacji jądra przedniego wzgórza oraz zbadanie zmian w ekspresji genów w hipokampie szczura. W pierwszej kolejności zwierzę zostaje poddane znieczuleniu, a następnie przygotowane do zabiegu chirurgicznego.Wykonuje się nacięcie skóry głowy i odsłania czaszkę. Następnie, w odpowiedniej pozycji względem bgma, wykonuje się otwory trepanacyjne. Wprowadza się elektrody DBS i przeprowadza stymulację.Na koniec zwierzę zostaje poddane eutanazji, a mózg poddaje się sekcji. W celu wyodrębnienia hipokampa tkanka jest przetwarzana w celu ekstrakcji RNA, a następnie przeprowadzana jest preparatyka cDNA oraz qPCR. Ostatecznie wyniki wykazują, że głęboka stymulacja mózgu wpływa na ekspresję genów w hipokampie szczura.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chirurgicznej głębokiej stymulacji mózgu, takie jak jakie mechanizmy molekularne leżą u podstaw efektu terapeutycznego chirurgicznej głębokiej stymulacji mózgu? Zastosowania tej techniki wykraczają poza terapię nie tylko epilepsji, ale także innych schorzeń neuronalnych, takich jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i dystonia. Ponieważ DPS wyłania się jako podejście chirurgiczne w leczeniu wielu zaburzeń neuronów, w celu przygotowania do operacji należy użyć podkładów chirurgicznych do przykrycia stołu roboczego i upewnić się, że dostępny jest pojemnik na odpady biologiczne.Zważ szczura i oblicz dawkę znieczulenia zgodnie z protokołem tekstowym, zamontuj i przymocuj dwie elektrody w uchwycie elektrod ramki stereotaktycznej, a następnie pod mikroskopem sprawdź, czy końcówki elektrod są prawidłowo ustawione. Przymocuj elektrody w odległości trzech milimetrów od siebie, dbając o to, aby końcówki elektrod nie stykały się z twardymi powierzchniami. Wstrzyknij ketaminę i ksylazynę.Wstrzyknij preparat doprzewnowlotowo i potwierdź, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, sprawdzając odruch z uciśnięcia palca, częstotliwość oddechów oraz głębokość i regularność oddychania. Unieruchom i ustaw zwierzę w ramie stereotaktycznej. Nałóż do oczu zwierzęcia lubrykant, aby zapobiec ich nadmiernemu wysuszeniu, a skórę głowy zdezynfekuj, wykonując trzy naprzemienne przemycia, za każdym razem używając Betadinu oraz alkoholu lub sterylnej soli fizjologicznej.Umieść zwierzę na krążącej ciepłej podkładce wodnej lub użyj lamp grzewczych, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na optymalnym poziomie. W oparciu o atlas mózgu szczura Paxos i Watsona, użyj następujących współrzędnych stereotaktycznych w celu celowania w jądro przednie wzgórza: przednio-tylne -1,6 mm, przyśrodkowo-boczne 1,5 mm oraz grzbiciowo-brzuszne 5,2 mm.Następnie wykonaj nacięcie skóry głowy w płaszczyźnie strzałkowej, aby odsłonić czaszkę. Używając rozieraków, odsuniętą skórę głowy przymocuj tak, aby odsłonić czaszkę. Następnie, za pomocą sterylnych tamponów nasączonych etanolem, oczyść obszar nacięcia, aby wyraźnie uwidocznić szwy. Zlokalizuj punkt bregma i zaznacz go czarnym markerem, aby wyznaczyć pozycję otworów trepanacyjnych.Wyznacz dwa kolejne punkty w odległości około 1,5 milimetra przyśrodkowo po obu stronach od szwu strzałkowego oraz 1,6 milimetra za szwem czołowym. Przed wykonaniem dwóch otworów trepanacyjnych, zdezynfekuj końcówkę wiertła etanolem.Używając wiertła trzymanego pod kątem 45 stopni, wykonaj otwory trepanacyjne, często przełączając się między obiema dziurami, aby uniknąć nadmiernego przegrzania w centrum któregokolwiek z otworów. Kontynuuj wiercenie aż do odsłonięcia opony twardej. Za pomocą igły z końcówką zgiętą w kształt litery L usuń wszelkie odłamki kostne, które mogłyby utrudnić wprowadzenie elektrody.Należy uważać, aby nie uszkodzić znajdującej się pod spodem opony twardej i/lub tkanki mózgowej podczas usuwania fragmentów kości. Przymocuj zespół podwójnych elektrod do obrotnego uchwytu ramy stereotaktycznej i ustaw uchwyt pod kątem 90 stopni. Korzystając z regulacji w ramie stereotaktycznej, umieść lewą elektrodę dokładnie nad bgma.Wykorzystując regulacje stereotaktyczne w płaszczyźnie bocznej, przesunięto precyzyjnie lewą elektrodę o 1,5 mm na lewą stronę od punktu bgma, tak aby obecnie dwie elektrody były idealnie wyrównane wzdłuż szwu czołowego, ale oddalone od siebie o 1,5 mm w kierunku boczno-przyśrodkowym od punktu bgma.Następnie, wykonując stereotaktyczną regulację w płaszczyźnie przednio-tylnej, przesuń elektrody o 1,6 milimetra w kierunku tylnym względem szwu czołowego. Następnie, za pomocą regulacji grzbietowo-brzusznej, obniż elektrody, aby najpierw sprawdzić, czy otwory trepanacyjne zostały wykonane w odpowiednim miejscu, tak aby elektrody można było z łatwością wprowadzić, nie dotykając ostrych krawędzi otworów. Jeśli tak, wprowadź elektrody na głębokość 5,2 milimetra od powierzchni czaszki.Podłącz elektrody za pomocą przewodów do stymulatora ustawionego na 130 hertz, 2,5 volts i szerokość impulsu 90 microsecond. Podawaj stymulację o wysokiej częstotliwości przez pożądany okres czasu. Wykonaj stymulację jednostronną lub obustronną.Po zakończeniu stymulacji ostrożnie usuń elektrody, a następnie za pomocą trzech szwów zerowych lub sterylnych zszywek chirurgicznych zaszyj nacięcie, podaj buprenorfinę podskórnie i monitoruj zwierzę aż do powrotu do normalnej aktywności, po czym przenieś je z powrotem do zwiercaarni. Za pomocą żyletki umieść mózg na schłodzonej wcześniej akrylowej matrycy do mózgu na lodzie. Przetnij mózg w poprzek w odległości około siedmiu do ośmiu milimetrów od najbardziej przedniej krawędzi mózgu.Wykonaj drugie cięcie równolegle i ku tyłowi względem pierwszego, tak aby można było usunąć plaster mózgu o grubości około 5 mm. Przenieś plaster mózgu do szalki Petriego z lodowatym PBS za pomocą żyletki, rozdziel dwie sekcje półkulowe i zwróć uwagę na to, która sekcja odpowiada odpowiednio lewej i prawej stronie. Używając precyzyjnej pęsety i nożyczek, ostrożnie wyizoluj hipokamp, zamroź tkankę na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu rozpoczęcia kolejnych etapów izolacji RNA zgodnie z protokołem tekstowym. Poniżej przedstawiono względne poziomy ekspresji BDNF w porównaniu z genem kontrolnym beta-aktyną w wskazanych punktach czasowych.Po stymulacji DBS. Wzrost regulacji BDNF obserwuje się bezpośrednio po zabiegu DBS, a szczytowa ekspresja występuje trzy godziny po stymulacji. Obserwacja ta sugeruje, że zwiększona ekspresja BDNF i wynikająca z niej neuroprotekcja mogą przyczyniać się do korzyści terapeutycznych DBS u pacjentów z padaczką.Ten panel ilustruje ekspresję receptora GABA, G-A-B-R-D, która wykazuje zwiększenie w zwierzętach stymulowanych w porównaniu z niestymulowaną grupą kontrolną trzy godziny po DBS. Biorąc pod uwagę, że agoniści GABA są stosowani jako skuteczne środki hamujące napady, interesującym spostrzeżeniem jest zwiększona ekspresja G-A-B-R-D po DBS, co sugeruje możliżną rolę GABA w przeciwdrgawkowym działaniu DBS po wykonaniu tej procedury.Można przeprowadzić inne metody, takie jak western blot, immunoprecypitację chromatyny oraz wiele innych standardowych testów biologii molekularnej. Pomaga to w odpowiedzi na pytania dotyczące zmian w ekspresji białek, modyfikacji potranslacyjnych, zajętości czynników transkrypcyjnych w konkretnych regionach promotorowych genów i tak dalej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić operację głębokiej stymulacji mózgu u szczurów.Wyizoluj tkankę hipokampa i przeanalizuj ją pod kątem zmian w ekspresji genów.

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgowej przedniej części ciała migdałowatego

Źródło: Casquero-Veiga, M. et al. Pozytonowa tomografia emisyjna in vivo w celu ujawnienia wzorców aktywności indukowanej głęboką stymulacją mózgu u szczurów. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje metaboliczne efekty głębokiej stymulacji mózgu (DBS) przy użyciu obrazowania FDG-PET w modelu szczurzym. Przedstawiono w nim etapy związane z podawaniem FDG, aplikacją DBS i obrazowaniem PET/CT w celu zmapowania regionów mózgu o zwiększonej lub stłumionej aktywności metabolicznej.

Ocena neuromodulacji metabolicznej indukowanej ostrą głęboką stymulacją mózgu u szczurów przy użyciu in vivo FDG-PET

Źródło: Selvakumar, T., et al., Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę wszczepiania elektrod do mózgu szczura w celu zastosowania głębokiej stymulacji mózgu (DBS), która moduluje aktywność neuronalną i poprawia komunikację z hipokampem, wspierając przeżycie neuronów i neurogenezę.

Wpływ głębokiej stymulacji mózgu na aktywność neuronalną hipokampa w modelu szczurzym

Ten film demonstruje wykrywanie syntezy RNA receptora serotoninowego za pomocą sond oligonukleotydowych w tkance mózgowej szczura dotkniętej zespołem serotoninowym. Protokół obejmuje wstępną obróbkę tkanek, hybrydyzację sondy i detekcję enzymatyczną w celu wizualizacji i ilościowego określenia ekspresji RNA receptora serotoninowego pod mikroskopem.

Hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych do badania ekspresji RNA w skrawkach mózgu szczura

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Ten protokół opisuje standardową metodę jednoczesnego funkcjonalnego obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i głębokiej stymulacji mózgu u gryzonia. Połączone wykorzystanie tych narzędzi eksperymentalnych pozwala na badanie globalnej aktywności w odpowiedzi na stymulację elektryczną w praktycznie każdym miejscu w mózgu.

Głęboka stymulacja mózgu z jednoczesnym fMRI u gryzoni

Opisano metodę wszczepiania elektrod do jądra podwzgórzowego (STN) szczurów. Lepsza lokalizacja STN została osiągnięta dzięki zastosowaniu systemu mikrozapisu. Ponadto przedstawiono konfigurację stymulacji, która charakteryzuje się długotrwałymi połączeniami między głową zwierzęcia a stymulatorem.

Implantacja elektrod pod kontrolą mikroelektrod do jądra podwzgórzowego szczurów w celu długotrwałej głębokiej stymulacji mózgu

Głęboka stymulacja mózgu (DBS) jest skuteczną opcją leczenia choroby Parkinsona. Opracowaliśmy projekt badania w celu zbadania nowych paradygmatów stymulacji u szczurów. Protokół opisuje zastosowanie testu schodowego i testu cylindra do oceny wyników motorycznych u szczurów z hemiparkinsonem leczonych DBS.

Nowatorskie podejście do oceny wyników motorycznych efektów głębokiej stymulacji mózgu u szczura z połowiczaną półparkinsonem: test schodowy i cylindryczny

Zastosowaliśmy powtarzalną przezczaszkową stymulację magnetyczną (rTMS) do jednostronnej półkuli mózgu szczura, umieszczając 25-milimetrową cewkę cyfry 8 1 cm bocznie do wierzchołka na linii dwuusznej i kątując cewkę o 45°. Własny system chłodzenia wodą był używany w rTMS przez ponad 20 minut.

Powtarzająca się przezczaszkowa stymulacja magnetyczna jednostronnej półkuli mózgu szczura

Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować niezawodną metodę HFS u myszy. Neurony w zakręcie zębatym hipokampa są stymulowane elektrycznie przez HFS bezpośrednio i pośrednio in vivo. Aktywność neuronalną i sygnalizację molekularną bada się odpowiednio za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1; Neurogenezę określa się ilościowo za pomocą testu znakowania bromodeoksyurydyny.

Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

Przezczaszkowa stymulacja prądem stałym (tDCS) jest techniką terapeutyczną proponowaną do leczenia chorób psychicznych. Model zwierzęcy jest niezbędny do zrozumienia konkretnych zmian biologicznych wywoływanych przez tDCS. Ten protokół opisuje model myszy tDCS, który wykorzystuje przewlekle wszczepioną elektrodę.

Przezczaszkowa stymulacja prądem stałym (tDCS) u myszy

Opisujemy przedkliniczną eksperymentalną metodę oceny neuromodulacji metabolicznej wywołanej przez ostrą głęboką stymulację mózgu za pomocą in vivo FDG-PET. Manuskrypt ten obejmuje wszystkie etapy eksperymentalne, od chirurgii stereotaktycznej po zastosowanie leczenia stymulacją oraz pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę obrazów PET.

In vivo (in vivo) Pozytonowa tomografia emisyjna w celu ujawnienia wzorców aktywności wywołanych głęboką stymulacją mózgu u szczurów

Poznaj protokół głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza u szczurów Wistar i analizę zmian ekspresji genów w hipokampie. Metoda obejmuje chirurgię stereotaktyczną, stymulację elektryczną oraz qRT-PCR.

Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza

Przeglądaj więcej filmów