Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza i zbadanie zmian ekspresji genów w hipokampie szczura. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie zwierzęcia. Następnie zwierzę jest przygotowywane do operacji.

Wykonuje się nacięcie w skórze głowy i odsłania czaszkę. Następnie we właściwej pozycji względem bgma wykonuje się otwory na wiertła. Wprowadza się elektrody DBS i przeprowadza się stymulację.

Na koniec zwierzę zostaje poddane eutanazji, a mózg poddany sekcji. Aby usunąć hipokamp, tkanka jest przetwarzana w celu ekstrakcji RNA i przeprowadza się przygotowanie CDNA oraz QPCR. Ostatecznie wyniki pokazują, że głęboka stymulacja mózgu wpływa na ekspresję genów w hipokampie szczura.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w chirurgii głębokiej stymulacji mózgu, takie jak: Jakie są mechanizmy molekularne leżące u podstaw efektu terapeutycznego operacji głębokiej stymulacji mózgu? Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię nie tylko padaczki, ale także innych schorzeń neuronalnych, takich jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i dystonia. Ponieważ DPS pojawia się jako chirurgiczne podejście do leczenia wielu zaburzeń neuronów Aby przygotować się do operacji, użyj podkładek chirurgicznych do przykrycia stołu warsztatowego i upewnij się, że dostępna jest utylizacja odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.

Zważ szczura i oblicz dawkę znieczulenia zgodnie z protokołem tekstowym zamontuj i zabezpiecz dwie elektrody na uchwycie elektrody stereotaktycznej ramy operacyjnej i za pomocą mikroskopu sprawdź końcówki elektrody pod kątem prawidłowego ustawienia. Zabezpiecz elektrody w odległości trzech milimetrów od siebie, uważając, aby nie dotknąć końcówki elektrody o twarde powierzchnie. Wstrzyknąć ketaminę ksylazynę.

Wymieszaj dootrzewnowo zwierzęciu i potwierdź, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, sprawdzając odruch szczypania palca u nogi, częstość oddechów oraz głębokość i regularność oddechu. Zabezpiecz i ustaw zwierzę na ramie stereotaktycznej. Nałóż smar do oczu zwierzęcia, aby chronić je przed nadmiernym wysuszeniem i zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi peelingami, każdy z Betadine i alkoholu lub sterylnej soli fizjologicznej.

Umieść zwierzę na karmie z krążącą ciepłą wodą lub użyj lamp grzewczych, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na optymalnym poziomie. Opierając się na atlasie mózgu szczura Paxos i Watson, użyj następujących współrzędnych stereotaktycznych do celowania w przednie jądro wzgórza lub NT przednie tylne ujemne 1,6 milimetra. Media boczne 1,5 milimetra i grzbietowe brzuszne 5,2 milimetra.

Następnie wykonaj nacięcie strzałkowe skóry głowy, aby odsłonić czaszkę Za pomocą pary retraktorów zabezpiecz naciętą skórę głowy, aby odsłonić czaszkę. Następnie sterylnymi wacikami zamoczonymi w etanolu oczyść nacięty obszar, aby wyraźnie odsłonić szwy. Zlokalizuj bgma i użyj czarnego markera do rynku, aby wskazać położenie otworów na wiertła.

Zrób jeszcze dwa znaki w odległości około 1,5 milimetra. Pośrodku bocznie po obu stronach od szwu strzałkowego i 1,6 milimetra za szwem koronalnym. Teraz, aby wykonać dwa otwory na wiertła, użyj etanolu do dezynfekcji końcówki wiertła.

Używając wiertła trzymanego pod kątem 45 stopni, często wierc otwory na wiertła, przełączając się między dwoma otworami, aby uniknąć nadmiernego ciepła w środku każdego otworu na wiertło. Kontynuuj wiercenie, aż opona twarda zostanie odsłonięta. Za pomocą igły z końcówką wygiętą w kształcie litery L usuń wszelkie złamane kawałki kości, które utrudniałyby wprowadzenie elektrody.

Uważaj, aby nie uszkodzić leżącej pod spodem opony twardej i/lub tkanki mózgowej podczas usuwania fragmentów kości. Przymocuj zespół podwójnej elektrody do obrotowego uchwytu ramy stereotaktycznej i zamocuj uchwyt pod kątem 90 stopni. Korzystając z regulacji w ramie stereotaktycznej, ustaw lewą elektrodę dokładnie nad bgma.

Korzystanie z regulacji stereotaktycznych dla multimediów. Pozycjonowanie boczne precyzyjnie przesunęło lewą elektrodę o 1,5 milimetra na lewą stronę bgma, tak że teraz dwie elektrody są idealnie ustawione wzdłuż szwu koronalnego, ale oddalone od siebie. 1,5 milimetra nośnika z boku od BGMA.

Następnie, po regulacji stereotaktycznej przedniego tylnego, przesuń elektrody o 1,6 milimetra w tył do szwu koronalnego. Następnie, po dostosowaniu grzbietowo-brzusznej, opuść elektrody, aby najpierw sprawdzić, czy otwory na wiertło zostały wykonane we właściwym miejscu, tak aby elektrody można było łatwo włożyć bez dotykania ostrych krawędzi otworów wiertła. Jeśli tak, włóż elektrody na głębokość 5,2 milimetra od powierzchni czaszki.

Podłącz elektrody za pomocą przewodów do stymulatora ustawionego na 130 Hz, 2,5 V i szerokość impulsu 90 mikrosekund. Dostarczaj stymulację o wysokiej częstotliwości przez pożądany okres czasu. Wykonywanie stymulacji jednostronnej lub obustronnej.

Po wykonaniu stymulacji ostrożnie usuń elektrody i za pomocą trzech szwów zerowych lub sterylnych zszywek chirurgicznych zszyj nacięcie, podaj buprenorfinę podskórnie i monitoruj zwierzę, aż powróci do normalnej aktywności, a następnie zwróć je do obiektu inwentarskiego. Umieść mózg na wstępnie chłodnej akrylowej matrycy mózgu na lodzie za pomocą żyletki. Przetnij mózg w odległości około siedmiu do ośmiu milimetrów od najbardziej przedniej krawędzi mózgu.

Wykonaj drugie cięcie dokładnie i z tyłu do pierwszego, aby można było usunąć plasterek mózgu o grubości około pięciu milimetrów. Przenieś plasterek mózgu na szalkę Petriego z lodowatym PBS za pomocą żyletki, odetnij dwie półkuliste sekcje i zwróć uwagę, aby zanotować, która sekcja odpowiada odpowiednio lewej i prawej stronie. Za pomocą cienkich kleszczyków i nożyczek ostrożnie usuń błysk hipokampa, zamroź tkankę na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do kolejnych etapów RNA przeprowadzanych zgodnie z protokołem tekstowym pokazanym tutaj jest względny poziom ekspresji BDNF w porównaniu z genem kontrolnym beta aktyna we wskazanych punktach czasowych.

Stymulacja po DBS. Regulację w górę BDNF obserwuje się natychmiast po operacji DBS, wraz ze szczytową ekspresją po trzech godzinach od stymulacji. Obserwacja ta sugeruje, że zwiększona ekspresja BDNF i wynikająca z niej neuroprotekcja mogą przyczynić się do korzyści terapeutycznych DBS dla pacjentów z padaczką.

Panel ten ilustruje ekspresję receptora GABA, G-A-B-R-D, który wykazuje zwiększoną ekspresję u stymulowanych zwierząt w porównaniu z niestymulowanymi kontrolami po trzech godzinach od DBS. Biorąc pod uwagę, że agoniści GABA są stosowane jako skuteczne supresory napadów, interesujące jest obserwowanie zwiększonej ekspresji G-A-B-R-D po DBS, co sugeruje możliwą rolę GABA i przeciwpadaczkowe działanie DBS. Postępując zgodnie z tą procedurą.

Można wykonać inne metody, takie jak blok zachodni, immunoprecypitacja chromatyny i wiele innych standardowych testów biologii molekularnej. Pomaga to odpowiedzieć na pytania związane ze zmianami w ekspresji białek, modyfikacjami potranslacyjnymi, zajęciem czynników transkrypcyjnych w określonych regionach promotora genów i tak dalej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić operację głębokiej stymulacji mózgu u szczurów.

Wyizoluj tkankę hipokampa i przeanalizuj ją pod kątem zmian ekspresji genów.