Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6
17 lutego 2015
Ten protokół opisuje, jak wytworzyć funkcjonalną tkankę węzłową zatok z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Nadekspresja T-Box3 (TBX3) oraz dobór antybiotyków promotora miozyny o ciężkim łańcuchu (Myh6) prowadzi do wysoce czystych agregatów komórek rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") zawierają ponad 80% komórek rozrusznika serca, wykazują znacznie zwiększoną szybkość bicia i są w stanie nadawać tempo mięśnia sercowego ex vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wysoce czystych komórek węzłowych zatok. Osiąga się to poprzez najpierw indukowanie różnicowania komórek poprzez modyfikację pożywki i tworzenie wiszących kropli, które powodują powstanie ciał embrionalnych o określonej wielkości. Następnie ciała embrionalne umieszcza się na naczyniu pokrytym żelatyną, tak aby tworzyły warstwę komórkową.
Następnie rozpoczyna się selekcja antybiotyków i przeżywają tylko kardiomiocyty. Wreszcie warstwa komórkowa jest dysocjowana w celu uzyskania szybko bijących pojedynczych komórek węzłowych zatok lub małych ciał węzłowych zatok. Ostatecznie obrazowanie żywych komórek służy do pokazania wysokich częstotliwości dudnienia komórek węzłowych zatok
.Główną zaletą tej metody jest to, że można wytwarzać wysoce czyste komórki węzłowe zatok, na przykład do testów narkotykowych. Metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w chorobie węzłów zatokowych, ponieważ komórki dadzą nam wgląd w mechanizmy leżące u podstaw choroby. Technologia zostanie zaprezentowana w laboratorium przez Julię Yung, naszą doktorantkę, która opracowała metodę, zaczynając od linii komórek ES i pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych wspólnie z napromieniowanymi komórkami zasilającymi, jak opisano w protokole tekstowym na dwa dni przed procedurą różnicowania, usuwając PSC z komórek zasilających poprzez pierwsze zasysanie pożywki.
Użyj 10 mililitrów PBS do umycia komórek. Następnie dodaj siedem mililitrów roztworu kolagenazy i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umieść sterylny filtr o średnicy 40 mikrometrów w probówce o pojemności 50 mililitrów.
Następnie ostrożnie wypłucz kolonie PSC, pipetując roztwór kolagenazy pięć razy w górę iw dół. Przenieś zawiesinę komórek do filtra i użyj ośmiu mililitrów PBS do trzykrotnego przepłukania filtra. Następnie odwróć filtr i umieść go do góry nogami na szalce Petriego i odpipetuj 10 mililitrów PBS na dnie filtra.
Aby usunąć kolonie PSC, przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i wiruj przez pięć minut 300 razy. G. Usuń PBS, zawieś komórki w jednym mililitrze Accutane i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji dodaj 10 mililitrów PBS.
Wymieszaj roztwór komórkowy, pipetując w górę iw dół pięć razy i odwiruj przez pięć minut w temperaturze 300 razy G. Po usunięciu PBS użyj 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek, aby ponownie zawiesić komórki i określić liczbę komórek nasiennych. 15 000 komórek na centymetr kwadratowy w kolbie filtracyjnej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych i hoduj je przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, gdy kolba powinna mieć 50 do 70% zlewa. Po pobraniu komórek i zawieszeniu Resus w pożywce różnicującej zgodnie z protokołem tekstowym, odpipetuj 20 mililitrów wody i pięć mililitrów wiszącej kropli lub roztworu HD na kwadratową szalkę Petriego, aby uniknąć wysuszenia hds.
Następnie odpipetuj do 50 mililitrów zawiesiny komórek na tacy. Następnie odwrócić pokrywę szalki Petriego i za pomocą 12-kanałowej pipety umieścić na pokrywie 180 HDS, z których każdy zawiera 20 mikrolitrów zawiesiny komórek. Ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na szalce Petriego.
Po inkubacji przez dwa dni, aby komórki mogły uformować ebs, ostrożnie odwróć pokrywkę kwadratowej szalki Petriego i przenieś EBS pochodzący z dwóch szalek Petriego do 50-mililitrowej probówki. Odczekaj 10 minut, aby EBS osiadł na dnie probówki, a następnie zassaj jak najwięcej pożywki. Użyj 10 mililitrów pożywki różnicującej, aby zawiesić EBS i przenieść zawiesinę na 10-centymetrową szalkę Petriego.
Po wyhodowaniu komórek w zawiesinie przez cztery dni, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieść EBS do jednej pokrytej żelatyną płytki do hodowli komórek o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych i inkubować przez następne dwa do sześciu dni pod mikroskopem, sprawdzić komórki pod kątem ognisk bicia i tworzenia się warstwy komórkowej trzy dni po rozpoczęciu bicia komórek, Odessać pożywkę i dodać 10 mililitrów świeżego dyferencjału. Pożywka zawierająca 400 mikrogramów na mililitr G cztery 18 do komórek cztery dni później. Ostrożnie usunąć pożywkę bez zasysania warstwy komórek.
Następnie dodaj 10 mililitrów PBS, aby umyć komórki. Po ostrożnym usunięciu PBS dodaj 10 mililitrów roztworu kolagenazy cztery i przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki. Następnie, po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, energicznie wymieszaj zawiesinę, pipetując w górę iw dół 10 razy, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe pięć minut.
Powinna być obecna zawiesina małych skupisk. Następnie dodaj 20 mililitrów PBS i wiruj przez 10 minut 300 razy. G, ostrożnie odessać PBS, a jeśli wytwarzasz indukowane ciała przedsionkowe lub sab, użyj 12 mililitrów pożywki różnicującej zawierającej 400 mikrogramów na mililitr G four 18 do Resus, zawiesić komórki i zobaczyć po dwa mililitry na sześciu dołkach 24-dołkowej płytki pokrytej żelatyną, aby wygenerować pojedyncze komórki węzłowe, zamiast dodawać pożywkę różnicującą.
Po usunięciu PBS użyj pięciu mililitrów Accutane do zawieszenia komórek i inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Pipetować w górę i w dół, aż energicznie. Mieszać zawiesinę po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Dodać 20 mililitrów PBS i wirować przez pięć minut w temperaturze 300 razy G z 12 mililitrami różnicowania. Pożywka zawierająca G four 18. Zawieś komórki i umieść po dwa mililitry w sześciu dołkach 24-dołkowej kultury płytkowej pokrytej żelatyną i przeprowadź analizę komórek zgodnie z protokołem tekstowym.
Korzystając z protokołu pokazanego w tym filmie, isab S może być generowany z pluripotencjalnych komórek macierzystych z częstotliwością dudnień około 450 uderzeń na minutę, jak widać tutaj po dysocjacji isab S. Obserwowane pojedyncze komórki wykazują typowe kształty komórek węzła zatokowego, który obejmuje komórki wrzecionowate i pająkowe. Komórki te wykazują wysoki poziom ekspresji białek niezbędnych do funkcjonowania węzła zatokowego, takich jak hiperpolaryzacja aktywowana cyklicznym kationem bramkowanym nukleotydami. Kanał czwarty, HCN czwarty, koneksyjny czwarty, piąty, koneksyjny 30.2 i MYH szósty.
Po leczeniu blokerem kanałów ZD 7 2 88 lub agonistą receptora muskarynowego karakolem, komórki pochodzące z izabu wykazują znacznie zmniejszoną częstotliwość dudnienia. Z drugiej strony agonista receptora beta nadnerczy, izopren, prowadzi do podwyższonej częstotliwości dudnienia. Ogólnie rzecz biorąc, nasza technika utoruje drogę do lepszego zrozumienia funkcji i chorób rozrusznika serca.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować w pełni funkcjonalne komórki węzłowe zatok z silnych komórek macierzystych PLU.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje generowanie wysoko czystych komórek węzła zatokowego z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Proces obejmuje indukcję różnicowania, tworzenie ciałek embrionalnych oraz selekcję kardiomiocytów poprzez zastosowanie antybiotykoterapii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia serca
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Różnicowanie komórek
Wprowadzenie
- Tkanka węzła zatokowego jest kluczowa dla regulacji rytmu serca.
- Pluripotentne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Selekcja antybiotykowa może zwiększyć czystość pożądanych typów komórek.
- Obrazowanie żywych komórek jest niezbędne do oceny funkcjonalności komórkowej.
Cel badania
- Wytworzenie funkcjonalnej tkanki węzła zatokowego z PSC.
- Uzyskanie wysokiej czystości komórek rozrusznikowych.
- Wykazanie zdolności tych komórek do stymulacji mięśnia sercowego ex vivo.
Zastosowane metody
- Indukcja różnicowania komórek poprzez modyfikację pożywki.
- Tworzenie ciał embrionalnych metodą wiszących kropel.
- Osadzanie ciał embrionalnych na naczyniach pokrytych żelatyną.
- Selekcja antybiotyczna w celu wyizolowania kardiomiocytów.
Główne wyniki
- Generowanie „indukowanych ciałów przedsionkowo-komorowych” (iSABs) zawierających ponad 80% komórek rozrusznikowych.
- Zaobserwowany wzrost częstotliwości skurczów w generowanych komórkach.
- Potwierdzenie zdolności iSABs do stymulacji mięśnia sercowego ex vivo.
Wnioski
- Protokół pozwala na skuteczne otrzymanie czystych komórek węzła zatokowego.
- Wysoka czystość i funkcjonalność komórek są kluczowe dla badań kardiologicznych.
- Metoda ta może przyczynić się do rozwoju badań nad inżynierią tkankową serca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Generowanie wysoce czystych agregatów mysich komórek rozrusznikowych rozwiązuje krytyczny problem w modelowaniu chorób serca i badaniach bezpieczeństwa leków. Protokół ten umożliwia skalowalną produkcję funkcjonalnych komórek węzła zatokowego o fizjologicznych częstotliwościach skurczów, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku modulatorów kanałów jonowych i autonomicznych. Pozycjonuje to tę metodę jako narzędzie translacyjne do przedklinicznej walidacji celów terapeutycznych i optymalizacji związków wiodących w procesach odkrywania leków sercowo-naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie kanałów jonowych i szlaków sygnałowych specyficznych dla komórek rozsądzacza w kontrolowanych warunkach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odnawialne źródło komórek węzła zatokowego o czystości >80% do spójnych testów angażowania celu.
- Wartość predykcyjna: Wspiera walidację funkcjonalną kandydatów na leki w oparciu o aktywność rozsądzacza zbliżoną do natywnej ex vivo.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje elektrycznie aktywne agregaty komórkowe, które odtwarzają automatyzm węzła zatokowo-przedsionkowego oraz reakcję na leki.
- Wartość operacyjna: Pozwala na uzyskanie komórek wykazujących reakcję na środki chronotropowe (np. izoprenalinę, karbachol) w celu profilowania zależności dawka-odpowiedź.
- Gotowość do analizy: Umożliwia odczyt częstotliwości skurczów na podstawie obrazowania żywych komórek jako ilościowego, funkcjonalnego parametru w czasie rzeczywistym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy generowanie rozrusznika z komórek macierzystych z stymulacją mięśnia sercowego ex vivo, potwierdzając istotność fizjologiczną.
- Użyteczność modelu przedklinicznego: Wspiera modelowanie chorób związanych z dysfunkcją węzła zatokowego oraz ocenę strategii terapeutycznych opartych na genach lub komórkach.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na ocenę potencjału proarytmicznego poprzez wyzwania autonomiczne i adrenergiczne w systemie zastępczym istotnym dla człowieka.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, umożliwiając walidację celu oraz identyfikację wiodących związków poprzez funkcjonalne testy komórek rozrusznika przed przejściem do etapu badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących regulacji genów specyficznych dla węzła zatokowego oraz mechanizmów elektrofizjologicznych.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowane, powtarzalne preparaty komórkowe do profilowania modulatorów kanałów jonowych i GPCR.
- Analityka: Zapewnia częstotliwość skurczów jako dynamiczny odczyt w czasie rzeczywistym do oceny chronotropii związków oraz modulacji autonomicznej.
- Badania translacyjne: Wykazuje zdolność do stymulacji mięśnia sercowego ex vivo, wspierając ekstrapolację do funkcji na poziomie tkankowym.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną platformę opartą na różnicowaniu komórek do prowadzenia ciągłych kampanii przesiewowych w zakresie bezpieczeństwa i skuteczności kardiologicznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w funkcji komórek rozrusznikowych poprzez zapewnienie modelu o wysokiej czystości i istotności fizjologicznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki określonym etapom różnicowania i selekcji, co umożliwia standaryzację między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, oferując wczesny wgląd funkcjonalny w związki modulujące rytm serca.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację leadów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile bezpieczeństwa i skuteczności w węźle zatokowym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, formowaniu ciałek zarodkowych oraz selekcji z użyciem antybiotyków.
- Zależy od zastosowania powierzchni powlekanych żelatyną, systemów wiszących kropel oraz infrastruktury do obrazowania żywych komórek.
- Wymaga standaryzacji pożywki do różnicowania, stężenia G418 oraz czasu trwania procesu w celu uzyskania powtarzalnej liczby komórek rozrusznikowych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przenoszeniu protokołów mysich na ludzkie modele komórek macierzystych.
- Jest ograniczone koniecznością walidacji ex vivo w celu potwierdzenia zdolności stymulacyjnych na poziomie tkankowym, wykraczającej poza fenotypy pojedynczych komórek.
