Name: Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę generowania czystych komórek węzła zatokowego z komórek pluripotentnych myszy poprzez selekcję antybiotykową. Technika ta umożliwia uzyskanie funkcjonalnych komórek rozrusznika serca do badań kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Zalecenia przed rozpoczęciem
<ol>
	<li>Nie należy stosować PSC zanieczyszczonych mykoplazmą, ponieważ nie będą one prawidłowo różnicować się w komórki węzła zatokowego. Test na skażenie mykoplazmą przed rozpoczęciem protokołu. Zrób to za pomocą zestawu PCR do szybkiego, bardzo czułego wykrywania mykoplazm i postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Dla każdej szalki Petriego (etap 2.3.4) pokryć jedną 10 cm2 naczynie do hodowli komórkowych sterylną 7 ml 0,1 % żelatyny ze skóry ryb zimnowodnych przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć żelatynę i pozostawić naczynie do wyschnięcia w sterylnych warunkach na sterylnej ławce.</li>
	<li>Zanim będzie można rozpocząć protokół różnicowania, potrzebny jest podwójnie transfekowany, stabilny klon linii komórkowej ES myszy zawierający następujące cechy: i) Konstytutywna nadekspresja TBX3 przy użyciu wektora ekspresji ssaków. ii) Gen oporności na G418 pod kontrolą promotora Myh65.</li>
	<li>Niezróżnicowane komórki PSC powinny być hodowane wspólnie z napromieniowanymi komórkami zasilającymi w normalnych warunkach, jak opisano w punkcie 1.</li>
</ol>
2. Procedura różnicowania
<ol>
	<li>Dwa dni przed różnicowaniem - Usuń PSC z komórek zasilających.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę, przemyć komórki 10 ml PBS z roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, dodać 7 ml roztworu kolagenazy dożylnej i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Umieścić sterylny filtr 40 μm w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Ostrożnie wypłucz kolonie PSC (unikaj usuwania komórek zasilających), pipetując roztwór kolagenazy 5 razy w górę iw dół.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do filtra 40 μm, przepłukać filtr trzykrotnie 8 ml PBS. Odwróć filtr i umieść go do góry nogami na szalce Petriego. Usunąć kolonie komórek PSC, odpipetowując 10 ml PBS na dno filtra.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Usunąć PBS, zawiesić komórki w 1 ml Accutase i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS, wymieszać roztwór komórkowy, pipetując go 5 razy w górę i w dół, i odwirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Usunąć PBS, zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej i określić liczbę komórek.</li>
		<li>Wysiewaj 15 000 komórek/cm2 na kolbie filtracyjnej o średnicy 75cm2 i hoduj je przez 2 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Po 2 dniach kolba powinna być zlewająca się w 50-70%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 0 - Początek różnicowania
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę i przemyć komórki 10 ml PBS.</li>
		<li>Odessać PBS, dodać 2 ml Accutazy i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Umieścić sterylny filtr 40 μm w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS, przenieść zawiesinę komórek do filtra 40 μm, przepłukać filtr przez dodanie 10 ml PBS i odwirować przepływ przez 5 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 10 ml pożywki różnicującej i określić liczbę komórek.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową pożywką różnicującą do końcowego stężenia 20 000 komórek/ml.</li>
		<li>Odpipetować pipetą 20 ml wody i 5 ml roztworu do zawieszania kropli (HD) na kwadratowej szalce Petriego, aby uniknąć wysuszenia HDs. 
		UWAGA: Dla każdej płytki 24-dołkowej zawierającej iSAB (patrz sekcja 2.8.6.4/2.8.7) należy rozpocząć od 16 szalek Petriego.</li>
		<li>Pipetować do 50 ml zawiesiny komórek w tacy.</li>
		<li>Odwróć pokrywę szalki Petriego. Umieść 180 HD każdy, z których każdy zawiera 20 μl (400 komórek/HD) zawiesiny komórek na pokrywie za pomocą 12-kanałowej pipety.</li>
		<li>Ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na szalce Petriego. 
		UWAGA: Szybkość obracania pokrywy jest bardzo ważna. Jeśli pokrywka jest obracana zbyt wolno lub zbyt szybko, napięcie powierzchniowe zawiesiny komórek nie jest wystarczająco wysokie, aby zatrzymać wiszące krople na pokrywie. Zanim spróbujesz wyprodukować HD po raz pierwszy, poćwicz obracanie pokrywki z 20 μl kropli podłoża.</li>
		<li>Hodować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby mogły utworzyć EBs. 
		UWAGA: Umieść jedną szalkę Petriego wypełnioną wodą na szczycie stosu 5 szalek Petriego. W przeciwnym razie HD w górnej szalce Petriego wyschnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Ostrożnie obrócić pokrywę kwadratowej płytki Petriego i przenieść EB pochodzące z dwóch płytek Petriego (360 EBs) do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odczekaj 10 minut, aby EB osiadły na dnie probówki (nie odwirowuj EBs).</li>
		<li>Odessać jak najwięcej pożywki, zawiesić EB w 10 ml pożywki różnicującej i przenieść zawiesinę na 10-centymetrową szalkę Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2-6 Posiew zawiesiny
	<ol>
		<li>Uprawiać EB w zawiesinie przez 4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmienić podłoże po 2 dniach. 
		UWAGA: Mimo że szalka Petriego nie jest pokryta (w przeciwieństwie do szalki do hodowli komórkowych), EB często przyczepiają się do powierzchni. Codziennie kontroluj szalki Petriego pod kątem dołączonych EB i w razie potrzeby odłącz EB od powierzchni poprzez delikatne pipetowanie. Opcjonalnie: Potrząsaj szalkami Petriego w sposób ciągły w okresie hodowli zawiesiny. Uważaj na prędkość wytrząsarki. EB nie powinny gromadzić się w środku ani unosić się do granicy szalek Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 6
	<ol>
		<li>Przenieść EB z jednej szalki Petriego na jedną pokrytą żelatyną 10 cm2 naczynie do hodowli komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 7-12
	<ol>
		<li>Komórki powinny zacząć bić po 8-12 dniach. Sprawdzaj, czy ogniska bicia komórek są codziennie pod mikroskopem. Komórki zaczynają tworzyć warstwę.</li>
		<li>Zmieniaj medium codziennie. 
		UWAGA: Po zmianie podłoża komórki potrzebują 3-4 godzin, aby się zregenerować i ponownie zacząć bić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 12-15 Selekcja komórek węzłowych zatok.
	<ol>
		<li>Trzy dni po tym, jak komórki zaczną bić (około 12-15 dnia), odessać pożywkę i odpipetować 10 ml świeżej pożywki różnicującej zawierającej 400 μg/ml G418 do komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cztery dni po rozpoczęciu selekcji zdysocjuj warstwę komórki. 
	UWAGA: Możliwe, że warstwa komórkowa jest już oderwana od powierzchni.
	<ol>
		<li>Ostrożnie usunąć pożywkę, nie zasysając warstwy komórek.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS i ostrożnie usunąć PBS bez zasysania warstwy komórek.</li>
		<li>Dodać 10 ml roztworu kolagenazy dożylnej, przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Energicznie wymieszać zawiesinę, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Powinno dojść do zawieszenia małych skupisk. Jeśli pozostały jeszcze duże części warstwy, powtórz krok 2.8.4 jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Dodać 20 ml PBS i wirować przez 10 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Ostrożnie zassać PBS. 
		UWAGA: Jeśli mają zostać wygenerowane iSAB, przejdź do kroku 2.8.7. Jeśli mają zostać wygenerowane pojedyncze komórki węzłowe zatok pochodzące z iSAB, przejdź do kroku 2.9.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 12 ml pożywki różnicującej zawierającej 400 μg/ml G418 i wysiać je w 6 dołkach pokrytych żelatyną w 24 dołkach (2 ml / studzienkę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie pojedynczej komórki węzłowej.
	<ol>
		<li>Zawiesić komórki z etapu 2.8.6 w 5 ml Accutazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Energicznie wymieszać zawiesinę, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 20 ml PBS i wirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 12 ml pożywki różnicującej zawierającej 400 μg/ml G418 i wysiać je w 6 dołkach 24 dołków pokrytych żelatyną (2 ml/dołek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2 po dysocjacji odessać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Dodać 1 ml pożywki/dołka różnicującego.</li>
	<li>Dzień 4-8 po dysocjacji zmieniaj pożywkę co 2 dni. W 10 dniu po dysocjacji dostępne są pojedyncze komórki węzłowe zatok iSAB lub pochodzące z iSAB do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).</li>
<li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+drives+vertebrate+cardiovascular+differentiation+through+Dkk-1-mediated+blockade+of+Wnt-signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling.</a> Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).</li>
<li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+programming+of+pluripotent+stem+cells+towards+distinct+cardiovascular+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types.</a> Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).</li>
<li>Hoogaars, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+controls+the+sinoatrial+node+gene+program+and+imposes+pacemaker+function+on+the+atria%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria.</a> Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).</li>
<li>Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+selected+cardiomyocytes+from+differentiating+embronic+stem+cells+form+stable+intracardiac+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts.</a> J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).</li>
<li>Marger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+and+ionic+currents+in+mouse+atrioventricular+node+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells.</a> Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).</li>
<li>Jung, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+and+isolation+of+highly+pure+physiologically+and+pharmacologically+functional+sinus-nodal+bodies+from+pluripotent+stem+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells).</a> Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).</li>
<li>Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+differentiated+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+developmentally+express+cardiac-specific+genes+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents.</a> Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).</li>
<li>He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+develop+into+multiple+types+of+cardiac+myocytes%3A+action+potential+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization.</a> Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).</li>
<li>Yanagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+and+T-type+calcium+channels+confer+automaticity+of+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).</li>
<li>Barbuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+and+functional+properties+of+f-channels+in+murine+embryonic+stem+cell-derived+pacemaker+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li>
<li>David, R., Franz, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pluripotency+to+distinct+cardiomyocyte+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes.</a> Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).</li>
<li>Scavone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+CD166%2B+precursors+develop+into+fully+functional+sinoatrial-like+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells).</a> Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).</li>
<li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation+and+characterization+of+HCN4-positive+pacemaking+cells+derived+from+murine+embryonic+stem+cells+during+cardiac+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pacing+Clin+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation.</a> Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).</li>
<li>Wiese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+sinus+node+head+and+differentiation+of+sinus+node+myocardium+are+independently+regulated+by+Tbx18+and+Tbx3%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3.</a> Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).</li>
<li>Kleger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+calcium-activated+potassium+channels+induces+cardiogenesis+of+pluripotent+stem+cells+and+enrichment+of+pacemaker-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells.</a> Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).</li>
<li>Bakker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+transcription+factor+TBX3+reprogrammes+mature+cardiac+myocytes+into+pacemaker-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells.</a> Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Johns, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+expression+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+vitro+%28rat+cardiac+myocytes%29+and+in+vivo+%28rat+liver%29.+A+novel+strategy+for+modifying+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability.</a> J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).</li>
<li>Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+human+potassium+channel+suppresses+cardiac+hyperexcitability+in+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes.</a> J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdolność do wytwarzania komórek rozrusznika serca pochodzących z komórek macierzystych może pozwolić na odtworzenie prawidłowego rytmu serca w sensie "biologicznych rozruszników serca". Podobnie testowanie narkotyków in vitro skorzysta na ich dostępności. PSC mogą dać początek każdemu typowi komórek w ciele ssaka, w tym kardiomiocytom o właściwościach komórek rozrusznikaserca 8,9,10,11,12,13. Jednak zazwyczaj populacje komórek w "ciałach zarodkowych" są wysoce niejednorodne, co nieuchronnie prowadzi do wymogu ...

Termin "zespół chorej zatoki" podsumowuje wiele chorób prowadzących do pogorszenia stanu układu rozrusznika serca. Obejmuje patologiczną, objawową bradykardię zatokową, blok zatokowo-przedsionkowy, zatrzymanie zatok, a także zespół tachykardia-bradykardia. W związku z tym "zespołowi chorej zatoki" często towarzyszą ogólne choroby serca, takie jak choroba niedokrwienna serca, kardiomiopatie lub zapalenie mięśnia sercowego. Obecnie podejścia terapeutyczne opierają się na wszczepianiu elektrycznych rozruszników serca. Wiąże się to jednak z szeregiem zagrożeń, takich jak infekcje i awaria baterii. Ogólnie rzecz biorąc, częstość występowania powikłań jest nadal bardzo wysoka u pacjentów, którym wszczepiono sztuczny rozrusznik serca. Ponadto, w przeciwieństwie do endogennego rozrusznika serca, urządzenia te nie reagują na stymulację hormonalną.
Przyszła alternatywa może polegać na dostępności "biologicznych rozruszników serca", dla których PSC mogłyby służyć jako odpowiednie źródło komórkowe i które byłyby również bardzo cenne dla testów leków in vitro. Jednak główny problem polega na bardzo rzadkim pojawianiu się komórek węzłowych zatok w ciałach zarodkowych (EB) - zwykle nie przekracza to ~0,5%1.
Poprzednio wykazano, że "programowanie do przodu" w kierunku określonych podtypów kardiomiocytów jest możliwe poprzez nadekspresję różnych wczesnych czynników transkrypcyjnych układu sercowo-naczyniowego, takich jak Mezoderma-specyficzna dla tylnej części ciała 1 (MesP1) i związana z czynnikiem transkrypcyjnym NK2, locus 5 (Nkx2.5)2,3. Dla prawidłowej wielkości i funkcji węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) kluczowe znaczenie ma czynnik transkrypcyjny T-box Tbx3, który, jak wykazano, inicjuje program genu rozrusznika serca i kontroluje różnicowanie SAN4. Chociaż poprawiło to wygląd funkcjonalnych komórek rozrusznika serca, zawartość nadal nie przekraczała ~ 40% w całej populacji komórek kardiomiocytarnych.
Dlatego też wprowadziliśmy dodatkowy etap5 selekcji antybiotyków oparty na promotorze Myh6. To ostatecznie prowadzi do powstania nieobserwowanych jeszcze agregatów kardiomiocytów ("indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe"; "iSAB"), które wykazują znacznie zwiększoną częstotliwość uderzeń (>400 uderzeń na minutę) in vitro, po raz pierwszy zbliżoną do częstotliwości mysiego serca i porównywalną z hodowanymi in vitro komórkami węzłowymi zatok wyizolowanymi z mysiego serca6. Przy podawaniu izoprenaliny osiąga się nawet częstotliwość dudnienia 550 uderzeń na minutę. Warto zauważyć, że iSAB składają się w ponad 80% z funkcjonalnych komórek węzłowych, jak wynika z obszernych analiz fizjologicznych7. Ostatnio opisano kilka podejść do generowania komórek węzłowych zatok za pomocą bezpośredniego przeprogramowania19, markerów powierzchniowych14 lub leczenia farmakologicznego małymi cząsteczkami16,17. Jednak żadna z tych metod nie doprowadziła do tak wysokiej czystości komórek rozrusznika serca i częstotliwości bicia zbliżonych do mysiego serca, jak obserwowano w iSAB.
Ponadto, w modelu ex vivo hodowanych wycinków komorowych dorosłej myszy, które utraciły swoją spontaniczną aktywność bicia, iSAB są zdolne do integracji z tkanką plastru, pozostając tym samym spontanicznie aktywnymi i silnie pobudzając plastry serca do skurczów7. Szczegółowy protokół generowania tych iSAB jest opisany w tym artykule.

<table><tbody><tr><td>Płynna pożywka Iscove ze stabilną glutaminą</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0465</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka płynna DMEM bez na-pirogronianu, ze stabilną glutaminą</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0435</td><td></td></tr><tr><td>CLS typ IV, CLS IV</td><td>Biochrom AG</td><td>C4-22</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Biochrom AG</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Biochrom AG</td><td>L 0473</td><td></td></tr><tr><td>G 418-BC płyn (roztwór gotowy do użycia), sterylny</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2912</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynnik PP f. wielokanałowa pipe. 60ml, sterylny</td><td>Marka</td><td>703409</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience,Inc.</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, pipeta elektroniczna</td><td>Eppendorf</td><td>4861000155</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 &micro; m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Greiner BioOne</td><td>663102</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez Ca i Mg</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>Phoenix Europe GmbH</td><td>LIF-250</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe szalki Petriego</td><td>Roth</td><td>PX67.1</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych</td><td>SigmaAldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>SigmaAldrich</td><td>M3148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglycerol</td><td>SigmaAldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do badania kultur tkankowych (24 dołki)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek es w połączeniu z selekcją promotora myh6

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Leczenie "zespołu chorej zatoki" opiera się na sztucznych rozrusznikach serca. Niosą one ze sobą zagrożenia, takie jak awaria baterii i infekcje. Co więcej, brakuje im reakcji hormonalnej, a cała procedura jest kosztowna. "Biologiczne rozruszniki serca" generowane z PSC mogą stać się alternatywą, jednak typowa zawartość komórek rozrusznika serca w ciałach embrionalnych (EB) jest niezwykle niska. Opisany protokół łączy "programowanie do przodu" mysich PSC za pośrednictwem induktora węzła zatokowego TBX3 z selekcją antybiotyków opartą na promotorze Myh6. W ten sposób uzyskuje się agregaty kardiomiocytów zgodne z >80% fizjologicznie funkcjonalnymi komórkami rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") spontanicznie kurczą się z jeszcze nieosiągniętymi częstotliwościami (400-500 uderzeń na minutę) odpowiadającymi komórkom węzłowym wyizolowanym z serc myszy i są w stanie nadawać tempo mysiemu mięśniowi sercowemu ex vivo. Za pomocą opisanego protokołu można wygenerować pojedyncze komórki węzłów zatokowych o wysokiej czystości, które można np. wykorzystać do testów narkotykowych in vitro. Co więcej, iSAB wygenerowane zgodnie z tym protokołem mogą stać się kluczowym krokiem w kierunku inżynierii tkankowej serca.

Opisany protokół umożliwia generowanie iSAB z PSC (pokazane na filmie) o częstotliwości skurczów wynoszącej około 450 bpm, co jest wartością zbliżoną do częstotliwości bicia serca myszy. Po dysocjacji iSAB (krok 2.8.8) zaobserwowane pojedyncze komórki wykazują typowy kształt komórek węzła zatokowego (komórki wrzecionowate i pająkowate), jak pokazano na Rysunku 1. Komórki te wykazują wysoką ekspresję białek uznanych za niezbędne dla funkcji węzła zatokowego, takich jak hiperpolaryzacyjnie aktywowany cykli...

Ten protokół opisuje, jak wytworzyć funkcjonalną tkankę węzłową zatok z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Nadekspresja T-Box3 (TBX3) oraz dobór antybiotyków promotora miozyny o ciężkim łańcuchu (Myh6) prowadzi do wysoce czystych agregatów komórek rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") zawierają ponad 80% komórek rozrusznika serca, wykazują znacznie zwiększoną szybkość bicia i są w stanie nadawać tempo mięśnia sercowego ex vivo.

Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wysoce czystych komórek węzła zatokowego. Osiąga się to poprzez uprzednią indukcję różnicowania komórek poprzez modyfikację pożywki oraz przygotowanie wiszących kropel, co prowadzi do powstania ciał embrionalnych o określonej wielkości. Następnie ciała embrionalne osadza się na płytce powlekanej żelatyną, aby utworzyły warstwę komórkową.Następnie rozpoczyna się selekcję antybiotykową, w wyniku której przeżywają jedynie kardiomiocyty. Na koniec warstwa komórkowa zostaje rozdzielona, aby uzyskać szybko bijące pojedyncze komórki węzła zatokowego lub małe skupiska komórek węzła zatokowego. Ostatecznie wykorzystuje się obrazowanie żywych komórek, aby wykazać wysoką częstotliwość skurczów komórek węzła zatokowego.Główną zaletą tej metody jest możliwość uzyskania wysoce czystych komórek węzła zatokowego, na przykład do badań nad lekami. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób węzła zatokowego, ponieważ komórki te dostarczą wiedzy na temat leżących u ich podstaw mechanizmów. Technologię tę zaprezentuje w laboratorium Julia Yung, nasza doktorantka, która opracowała tę metodę. Rozpoczynając od linii komórek ES i pluripotencjalnych komórek macierzystych współhodowanych z napromieniowanymi komórkami karmionymi, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dwa dni przed procedurą różnicowania oddzielono PSC od komórek karmionych, najpierw odsysając pożywkę.Do przemycia komórek należy użyć 10 ml PBS. Następnie dodać 7 ml roztworu kolagenazy IV i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. W kolejnym kroku umieścić sterylny filtr 40 µm w probówce o pojemności 50 ml.Następnie ostrożnie wypłucz kolonie PSC, pipetując roztwór kolagenazy pięć razy w górę i w dół. Przenieś zawiesinę komórkową na filtr i użyj ośmiu mililitrów PBS, aby trzykrotnie wypłukać filtr. Następnie odwróć filtr, umieść go do góry dnem w szalce Petriego i nanieś pipetą 10 mililitrów PBS na spód filtra.Aby usunąć kolonie PSC, przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przez pięć minut przy 300 ×g. Usuń PBS, resuspenduj komórki w 1 ml Accutane i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po inkubacji dodaj 10 ml PBS.Wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując ją pięciokrotnie w górę i w dół, a następnie odwirować przez pięć minut przy 300 ×g. Po usunięciu PBS użyć 10 ml pożywki hodowlanej w celu resuspensji komórek i określić liczbę komórek do wysiewu. Wysiać 15 000 komórek na cm² do kolby filtracyjnej o powierzchni 75 cm² i inkubować przez dwa dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aż kolba osiągnie 50–70% konfluencji. Po zebraniu komórek i ich resuspensji w pożywce różnicującej zgodnie z protokołem tekstowym, nanieść 20 ml wody oraz 5 ml roztworu do metody kropli wiszącej (HD) do kwadratowej szalki Petriego, aby zapobiec wysychaniu kropel HD.Następnie pipetuj do kuwety do 50 ml zawiesiny komórkowej. Odwróć pokrywkę szalki Petriego i za pomocą pipety 12-kanałowej nanieś na nią 180 HDS, z których każdy zawiera 20 µl zawiesiny komórkowej. Ostrożnie odwróć pokrywkę i nałóż ją na szalkę Petriego.Po dwudniowej inkubacji, aby umożliwić komórkom utworzenie ciał embroidalnych (EBS), ostrożnie odwróć pokrywkę kwadratowej szalki Petriego i przenieś EBS z dwóch szalek do probówki o pojemności 50 ml. Odczekaj 10 minut, aż EBS osiądą na dnie probówki, a następnie odessij jak największą ilość medium. Użyj 10 ml medium różnicującego do resuspensji EBS, a następnie przenieś zawiesinę do szalki Petriego o średnicy 10 cm.Po czterodniowej hodowli komórek w zawiesinie, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś EBS do jednej szalki hodowlanej o powierzchni 10 cm² powlekanej żelatyną i inkubuj przez kolejne dwa do sześciu dni; pod mikroskopem sprawdzaj obecność bijących ognisk, a trzy dni po rozpoczęciu bicia komórek odessij pożywkę i dodaj do komórek 10 ml świeżej pożywki różnicującej zawierającej 400 µg/ml G418. Cztery dni później ostrożnie usuń pożywkę, uważając, aby nie odessać warstwy komórek.Następnie dodaj 10 ml PBS, aby przemyć komórki. Po ostrożnym usunięciu PBS dodaj 10 ml roztworu kolagenazy IV i przenieś komórki do probówki o pojemności 50 ml. Następnie, po inkubacji w temperaturze 37 °C przez pięć minut, energicznie wymieszaj zawiesinę, pipetując ją w górę i w dół 10 razy, i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne pięć minut.Powinna powstać zawiesina małych skupisk. Następnie należy dodać 20 ml PBS i wirować przez 10 minut przy 300 ×g, ostrożnie odessać PBS, a w przypadku generowania indukowanych ciał węzła zatokowo-przedsionkowego (sabs), użyć 12 ml pożywki różnicującej zawierającej 400 µg/ml G418, aby resuspendować komórki i rozdzielić po 2 ml do sześciu studzienek 24-dołkowej płytki pokrytej żelatyną w celu uzyskania pojedynczych komórek węzłowych zamiast dodawania pożywki różnicującej.Po usunięciu PBS użyj pięciu mililitrów Accutane w celu resuspensji komórek i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez pięć minut energicznie wymieszaj zawiesinę, pipetując ją w górę i w dół.Dodać 20 ml PBS i wirować przez pięć minut przy 300 ×g, a następnie dodać 12 ml pożywki różnicującej zawierającej G four 18. Zawiesić komórki i przenieść po 2 ml do sześciu studzienek 24-dołkowej płytki hodowlanej powlekanej żelatyną, a następnie przeprowadzić analizę komórek zgodnie z protokołem tekstowym.Stosując protokół zaprezentowany w tym filmie, można wygenerować isab S z pluripotencjalnych komórek macierzystych o częstotliwości skurczów wynoszącej około 450 uderzeń na minutę, co widać tutaj po dysocjacji isab S. Obserwowane pojedyncze komórki wykazują typowe kształty komórek węzła zatokowego, w tym komórki wrzecionowate i pajęczynowate. Komórki te wykazują wysoki poziom ekspresji białek niezbędnych do funkcjonowania węzła zatokowego, takich jak hiperpolaryzacyjnie aktywowany cyklicznoprzepuszczalny kanał kationowy HCN4, koneksyna 45, koneksyna 30.2 oraz MYH6.Po podaniu blokera kanałów ZD 7 2 88 lub agonisty receptorów muskarynowych caracol, komórki pochodne isab wykazują znacząco zmniejszoną częstotliwość skurczów. Z kolei isoprene, będący agonistą beta-receptorów adrenergicznych, prowadzi do zwiększenia częstotliwości skurczów. Ogólnie rzecz biorąc, nasza technika utoruje drogę do lepszego zrozumienia funkcjonalności i chorób rozrusznika serca.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, w jaki sposób generować w pełni funkcjonalne komórki węzła zatokowego z pluripotencjalnych komórek macierzystych.

generation-murine-cardiac-pacemaker-cell-aggregates-based-on-es-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Generowanie szczurowych skupień komórek stymulujących serce na podstawie programowania komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy tutaj protokół generowania iCM za pomocą retrowirusowego dostarczania Gata4, Tbx5 i Mef2c w konstrukcji policistronicznej. Protokół ten daje stosunkowo jednorodną populację przeprogramowanych komórek o zwiększonej wydajności i jakości, co jest cenne dla przyszłych badań nad przeprogramowaniem iCM.

Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych.  Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Celem tej metody jest generowanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca w celu zbadania specyfikacji komórek progenitorowych i właściwości funkcjonalnych, a także generowanie komórek serca specyficznych dla komory do modelowania chorób serca.

Wytwarzanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Poznaj metodę generowania czystych komórek węzła zatokowego z komórek pluripotentnych myszy poprzez selekcję antybiotykową. Technika ta umożliwia uzyskanie funkcjonalnych komórek rozrusznika serca do badań kardiologicznych.

Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6 (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6

Przeglądaj więcej filmów