Name: Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Odkryj trójwymiarową metodę kokultury komórek raka płuca i fibroblastów związanych z rakiem w żelu kolagenowym. Technika ta umożliwia badanie inwazji nowotworowej i interakcji guz-zręb w fizjologicznie relewantnym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 i 25460137).

UWAGA: To badanie zostało zatwierdzone przez odpowiednie Komisje Bioetyczne.
1. Pierwotna hodowla ludzkich fibroblastów płuc
<ol>
	<li>Pobieranie tkanki płucnej:
	<ol>
		<li>Próbki ludzkiej tkanki płucnej należy pobierać bezpośrednio z sali operacyjnej. Zbierz około 1 cm3 bloki z rakowej i nienowotworowej tkanki płucnej, przy czym próbka nienowotworowa jest pobierana jak najdalej od guza.</li>
		<li>Zawiesić próbki w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej o 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B (pożywka wolna od surowicy). Zawieszone próbki należy przechowywać w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml i przenieść do laboratorium. 
		UWAGA: Fibroblasty są silnie migrujące i proliferacyjne w porównaniu z innymi typami komórek, takimi jak komórki nabłonka, śródbłonka i mięśni gładkich. Metoda wzrostu wykorzystuje te cechy fibroblastów, a wyrastające komórki z wycinków tkanek są obfite w fibroblasty. Po kilku pasażach komórkowych inne typy komórek nie przeżywają i nie rozmnażają się w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), co skutkuje oczyszczonymi hodowlami komórek fibroblastów. Komórki można wykorzystać przez 3-7 pasaży po hodowli pierwotnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla eksplantatów i kondycjonowanie w celu wzrostu komórek:
	<ol>
		<li>Wykonaj pierwotną hodowlę fibroblastów przy użyciu wcześniej opisanego protokołu z modyfikacjami5.</li>
		<li>W laboratorium umieść próbkę tkanki na 10 cm naczyniu do hodowli tkankowych bez pożywki hodowlanej i pokrój na małe sekcje o wielkości ~2-3 mm za pomocą sterylnych kleszczyków i skalpela. Podczas tego procesu należy unikać wysuszania sekcji, w przeciwnym razie wydajność wzrostu komórek jest osłabiona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielenie warstwy komórek nabłonka i tkanki łącznej:
	<ol>
		<li>Namoczyć pocięte skrawki tkanek w pożywce zawierającej 2 000 PU/ml dypazy I i hodować przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś skrawki tkanki do naczynia i oddziel warstwę komórek nabłonka od sąsiedniej tkanki łącznej. Przetwarzaj sekcje w czystym stole, aby uniknąć zanieczyszczenia mikroorganizmami. 
		UWAGA: Jeśli potrzebna jest podstawowa hodowla komórek nabłonkowych, wykonaj krok 1.3. Jeśli mają być wyizolowane tylko fibroblasty, pomiń krok 1.3, ponieważ późniejsza hodowla eksplantatów i pasaże komórkowe są niekorzystne dla komórek nabłonkowych, które dają oczyszczone populacje fibroblastów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocowanie skrawków tkanki:
	<ol>
		<li>Zmiel tkanki na kawałki o średnicy 1 mm za pomocą dwóch skalpeli. Jeśli kawałki nie są wystarczająco małe, łatwiej odrywają się od naczynia, a komórki nie wyrosną na powierzchni naczynia.</li>
		<li>Umieść małe odcinki tkanki płucnej oddzielnie od siebie, aby zachować pusty obszar otaczający każdy element. Wykonaj rysy na powierzchni naczynia do hodowli tkankowej za pomocą ostrza skalpela, aby ułatwić mocowanie skrawków tkanki. 
		UWAGA: Wydaje się również, że drapanie ułatwia wzrost komórek, zapewniając ścieżki, wzdłuż których komórki mogą migrować.
		<ol>
			<li>Alternatywnie, umieść kawałki tkanki mielonej pojedynczo w każdym dołku płytki 6-dołkowej i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do powierzchni płyty za pomocą smaru silikonowego.</li>
			<li>Umieść smar silikonowy w dwóch punktach oddalonych od siebie o 1,5 cm w każdym dołku za pomocą sterylnej szpilki. Pokrycie fragmentów tkanek zwiększa skuteczność wzrostu komórek i rozmnażania komórek po kilku pasażach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Późniejsza hodowla eksplantatów:
	<ol>
		<li>Delikatnie dodaj pożywkę hodowlaną do naczynia, zanim skrawki tkanki wyschną, ponieważ w większości przypadków wydajny wzrost komórek jest tracony, jeśli próbki wyschną. Nie nalewaj pożywki zbyt szybko, ponieważ skrawki tkanki mogą się oderwać.</li>
		<li>Komórki hodowlane w DMEM z 10% FBS. Użyj wystarczającej ilości podłoża, aby tylko przykryć tkankę, ale nie za dużo, aby pozwalało na unoszenie się na wodzie, ponieważ dodatkowa wyporność sprzyja oderwaniu się od naczynia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasaż komórkowy:
	<ol>
		<li>Z pożywką hodowlaną należy obchodzić się przez cały czas ostrożnie, ponieważ powtarzające się ruchy szalki hodowlanej mogą prowadzić do oderwania skrawków tkanki.</li>
		<li>Umieścić szalki hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5-7 dni. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień i minimalnie obchodź się z naczyniami hodowlanymi podczas zmian pożywki. Fibroblasty wyrastają z krawędzi skrawków tkanek w ciągu następnych kilku tygodni. 
		UWAGA: Po ~2-3 tygodniach wyrastające fibroblasty prawie osiągają konfluencję, w zależności od wielkości powierzchni.</li>
		<li>Umyj komórki 1x PBS i dodaj 1 ml trypsyny I do płytki.</li>
		<li>Po trypsynizacji odłącz komórki za pomocą 9 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS. Zebrać komórki zawieszone w pożywce w probówce o pojemności 10 ml razem z wycinkami tkanki. Po odwirowaniu w celu utworzenia granulek komórkowych, powstałe granulki należy ponownie zawiesić w nowym podłożu.</li>
		<li>Wysiewaj komórki i skrawki tkanek na nowej szalce hodowlanej, w którym to momencie tkanki nie przyczepiają się do szalki, podczas gdy komórki przylegają i rosną. Następnego dnia usuń pływające kawałki tkanki przez aspirację i zmień podłoże. Przyłączone fibroblasty rozmnażają się wraz z kolejnymi kulturami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trójwymiarowa kokultura ludzkich fibroblastów płuc i komórek rakowych
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek i odczynników:
	<ol>
		<li>W przybliżeniu użyj 2 x 105 komórek nabłonka i 2,5 x 105 fibroblastów na studzienkę. Przygotuj kolagen typu IA (3 mg/ml, pH 3), FBS (100%), bufor do rozpuszczenia (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM uzupełniony 10% FBS do hodowli fibroblastów oraz pożywkę do kohodowli 3D (mieszanina 1:1 pożywki hodowlanej fibroblastów i pożywki hodowlanej dla komórek rakowych).</li>
		<li>Hodowla komórek gruczolakoraka płuc A549, fibroblastów i kohodowli A549 3D w DMEM uzupełnionej 10% FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie żelu kolagenowego:
	<ol>
		<li>Umyj fibroblasty wyhodowane na 10 cm naczyniu 1x PBS i dodaj 1 ml trypsyny I do płytki. Po trypsynizacji przez ~5 min w temperaturze 37 °C, odłącz komórki za pomocą 9 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS. Zebrać komórki zawieszone w pożywce w probówce o pojemności 10 ml i odwirować je przy 200-300 x g, aby utworzyć granulki komórek.</li>
		<li>Ponownie zawiesić powstałe granulki w 100% FBS o gęstości 5 x 105/ml.</li>
		<li>Przygotuj żel kolagenowy na lodzie. Schłodzić odczynniki, pipety i probówki w lodówce przed wykonaniem następnej procedury. Nawet na lodzie mieszanina zestala się do pewnego stopnia, a całkowita objętość jest mniejsza niż suma wszystkich składników.</li>
		<li>W każdym dołku przygotuj żel kolagenowy, mieszając 0,5 ml zawiesiny fibroblastów (2,5 x 105 komórek) z FBS, 2,3 ml kolagenu typu IA, 670 μl 5x DMEM i 330 μl buforu do rekonstytucji. Pozwól żelom łatwo stwardnieć w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Energicznie pipetować, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać mieszaninę (3 ml) do każdego dołka na płytce 6-dołkowej i pozostawić do żelowania w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez zakłóceń przez 30-60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek rakowych na żelu kolagenowym:
	<ol>
		<li>Wykonaj trójwymiarową kokulturę przy użyciu wcześniej zgłoszonego protokołu z modyfikacjami6.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki rakowe w pożywce do kohodowli 3D (lub w DMEM z 10% FBS w przypadku komórek A549) o gęstości 1 x 105/ml.</li>
		<li>Wlać 2 ml roztworu zawieszonych komórek (2 x 105 komórek) na powierzchnię każdego żelu. Modyfikuj liczbę komórek rakowych lub fibroblastów w kokulturze w zależności od warunków eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skurcz żelu:
	<ol>
		<li>Inkubuj żele przez noc w temperaturze 37 °C, aby komórki rakowe mogły przylegać do żelu kolagenowego. Odłącz każdy żel i wygeneruj "pływającą kulturę" w każdym dołku płytki 6-dołkowej. 
		UWAGA: Stosując pływającą hodowlę, różne zmiany wielkości żelu są indukowane przez napięcie mechaniczne i degradację kolagenu, w których pośredniczy interakcja komórkowa między współhodowanymi komórkami rakowymi a fibroblastami.</li>
		<li>Użyj kątowej igły 21 G lub małej szpatułki, aby oddzielić każdy żel od krawędzi studzienki. Co 2-3 dni odświeżaj studzienki 2 ml pożywki do kohodowli 3D. Mierz rozmiar każdego żelu codziennie przez 5 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza żeli kolagenowych:
	<ol>
		<li>Zmierz zawartość kolagenu w każdym żelu za pomocą metod oznaczania ilościowego kolagenu, takich jak test Sircol. Wykonaj analizę transkryptomiczną lub ilościowy RT-PCR po pobraniu RNA z żeli5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kultura interfejsu powietrze-ciecz i test inwazji
<ol>
	<li>Po wyhodowaniu żeli kolagenowych w temperaturze 37 °C przez 5 dni, należy wystawić zakontraktowane żele na działanie powietrza, umieszczając je na siatce (porów o wielkości 70 μm) w nowych płytkach 6-dołkowych. Wykonać siatkę z dostępnych w handlu filtrów komórkowych używanych do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Delikatnie napełnij każdą studzienkę 11 ml pożywki do kohodowli 3D.</li>
	<li>Umieść żele na siatce za pomocą sterylnej łyżki i usuń pozostałe podłoże z żeli. Pod tym warunkiem zanurz żele w podłożu, wystawiając górną powierzchnię żelu na działanie powietrza. Zdefiniuj ten warunek hodowli jako interfejs powietrze-ciecz. 
	UWAGA: Po 5-7 dniach utrzymywania kultury na granicy faz powietrze-ciecz w temperaturze 37 °C w inkubatorze, inwazyjne komórki nowotworowe migrują do żelu. W zależności od typu komórki i w wyniku interakcji komórkowych, różne stopnie zmian morfologicznych w komórkach nowotworowych są indukowane przez hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz.</li>
	<li>W celu oceny histologicznej utrwal żel w roztworze formaliny przez noc w temperaturze pokojowej i zanurz w parafinie. Wybarwić pionowe odcinki (4 μm) hematoksyliną i eozyną (H&E). Przeprowadzić analizę immunohistochemiczną na sekcjach4.</li>
</ol>

<ol><li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation%2C+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ups.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digest+on+the+role+of+the+tumor+microenvironment+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers.</a> Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).</li>
<li>Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+as+Another+Polarized+Cell+Type+of+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment.</a> Front. Oncol. 4, 62(2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+lung+cancer-associated+fibroblasts+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+gingival+fibroblast-epithelial+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction.</a> J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).</li>
<li>Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+keratinocyte+stratification+by+a+dominant+negative+JunB+mutant+without+blocking+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation.</a> Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Navab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+gene-expression+signature+of+carcinoma-associated+fibroblasts+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).</li>
<li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblasts+from+human+colon+tumors+shows+specific+prognostic+gene+expression+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature.</a> Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).</li>
<li>Hägglöf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+PDGFRbeta+expression+in+prostate+tumors+and+non-malignant+prostate+tissue+predicts+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival.</a> PLoS One. 5 (5), e10747(2010).</li>
<li>Saito, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forkhead+box+F1+regulates+tumor-promoting+properties+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).</li>
<li>Calvo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+YAP-dependent+matrix+remodelling+is+required+for+the+generation+and+maintenance+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

CAF stanowią główny składnik ECM otaczającego komórki rakowe i nie tylko stanowią rusztowanie dla guza, ale także aktywnie uczestniczą w rozwoju guza7. Gromadzenie dowodów ujawnia wpływ CAF lub powiązanych z nimi cząsteczek na ostateczne rokowanie, podkreślając krytyczną rolę progresji nowotworu za pośrednictwem CAF8.
W poprzednim badaniu zastosowaliśmy metodę wzrostu do wyizolowania CAF4 w płucach. W tym eksperymencie kluczowe znaczenie ma utrzymanie adhezji w...

Tkanka nowotworowa może być postrzegana jako rodzaj narządu, który ewoluuje poprzez bliskie interakcje między rakiem a mikrośrodowiskiem zrębu guza, składającym się z fibroblastów związanych z rakiem (CAF), komórek odpornościowych, naczyń nowotworowych i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). CAF są głównym źródłem rozpuszczalnych czynników (cytokin, czynników wzrostu i chemokin), które wywierają działanie mitogenne, promigracyjne i proinwazyjne na komórki nowotworowe. Stymulują również tworzenie naczyń nowotworowych i rekrutują komórki prekursorowe, takie jak komórki pochodzące ze szpiku kostnego (BMDC). Aktywowane CAF biorą udział w produkcji i przebudowie ECM, sprzyjając w ten sposób wzrostowi i rozprzestrzenianiu się komórek rakowych1. CAF zapewniają również niszę, która ułatwia kolonizację komórek nowotworowych i przerzuty oraz są zdolne do nadawania fenotypów komórek macierzystych sąsiednim komórkom rakowym. Obserwacje patologiczne sugerują, że reakcje zrębowe lub zmiany zwłóknieniowe w tkankach nowotworowych wskazują na złe rokowanie. Ostatnie badania wykazały również, że cechy zrębu guza, takie jak sygnatura genowa, mogą przewidywać rokowanie pacjenta. Co więcej, czynniki pochodzące z CAF mogą modulować wrażliwość na chemioterapię, podkreślając rolę CAF w określaniu wrażliwości i oporności na leki2.
Ponieważ CAF odgrywają wieloaspektową rolę w promowaniu progresji nowotworu poprzez szlaki sygnałowe, które pośredniczą w interakcjach między CAF a różnymi typami komórek w mikrośrodowisku guza, przyciągają coraz większą uwagę jako nowe cele terapii przeciwnowotworowych. Niejednorodność populacji komórek w mikrośrodowisku nowotworowym stanowi przeszkodę w celowaniu w CAF. Zaproponowano kilka markerów CAF, takich jak aktyna α mięśni gładkich (α-SMA), białko aktywujące fibroblasty (FAP) i proten-1 specyficzny dla fibroblastów (FSP-1: zwany również S100A4); jednak te markery molekularne nie są specyficzne dla odróżnienia CAF od innych komórek obecnych w tkankach nienowotworowych3. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby uzyskać więcej wiedzy na temat specyficznych właściwości CAF. W tym celu warto scharakteryzować pierwotne hodowane CAF w porównaniu z normalnymi fibroblastami dopasowanymi do pacjenta.
Ostatnio, analizy CAF pochodzące od pacjentów zostały zgłoszone w kilku typach raka, ujawniając unikalne wzorce ekspresji genów i zachowania komórek w porównaniu z fibroblastami pochodzącymi z tkanek nienowotworowych. Wykorzystując wyizolowane CAF z tkanek ludzkiego raka płuc, opracowaliśmy trójwymiarową metodę współhodowli, która umożliwiła nam ocenę właściwości CAF płuc. W tym modelu zbadaliśmy wpływ CAF na inwazję komórek raka płuc, proliferację i skurcz żelu kolagenowego, co eksperymentalnie podsumowało rolę CAFpłuc 4 w promowaniu nowotworu.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu IA</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td>CELL-1A</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do rozpuszczenia</td><td>żelatyny Nitta Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>NUNC</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>Dow Corning Toray</td><td>Smar</td><td></td>wysokopróżniowy</tr><tr><td>Dispase I</td><td>WAKO</td><td>386-02271</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (70 &mu; m)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Progresja raka (inicjacja, wzrost, inwazja i przerzuty) następuje poprzez interakcje między złośliwymi komórkami a otaczającymi je komórkami zrębu. Mikrośrodowisko guza składa się z różnych typów komórek, takich jak fibroblasty, komórki odpornościowe, komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, perycyty i komórki pochodzące ze szpiku kostnego, osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Fibroblasty związane z rakiem (CAF) pełnią rolę pronowotworową poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników, angiogenezę i przebudowę ECM. Eksperymentalne modele przeżycia, proliferacji, migracji i inwazji komórek nowotworowych opierały się głównie na dwuwymiarowych monokomórkowych i jednowarstwowych kulturach tkankowych lub testach w komorze Boydena. Jednak eksperymenty te nie odzwierciedlają dokładnie fizjologicznych lub patologicznych warunków w chorym narządzie. Aby lepiej zrozumieć interakcje zrębu guza lub macierzy nowotworowej, hodowle wielokomórkowe i trójwymiarowe zapewniają potężniejsze narzędzia do badania komunikacji międzykomórkowej i zależnej od ECM modulacji zachowania komórek nowotworowych. Jako platformę do tego typu badań prezentujemy model eksperymentalny, w którym komórki nowotworowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w pierwotnych kulturach CAF.

Ta metoda kokultury, naśladująca mikrośrodowisko guza, jest użytecznym narzędziem do badania oddziaływań między komórkami nowotworowymi a fibroblastami osadzonymi w żelach kolagenowych. W poprzednim badaniu w tym modelu eksperymentalnym oceniono trzy parametry: kurczliwość żelu kolagenowego, inwazję komórek nowotworowych oraz zmiany morfologiczne. Proliferację komórek nowotworowych oszacowano również za pomocą immunobarwienia Ki674. Próbki tkanki płucnej pobrano z obszarów nowotworowych i nienowotworowych wyci...

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie interakcji komórkowych między komórkami raka płuc a fibroblastami związanymi z nowotworem z wykorzystaniem metody współhodowli trójwymiarowej. Jest to realizowane poprzez pierwotną hodowlę ludzkich fibroblastów związanych z rakiem płuc z pobranej tkanki płucnej, którą rozdrabnia się na kawałki o wielkości 1 mm. Drugim krokiem jest przygotowanie żeli kolagenowych z zatopionymi fibroblastami poprzez zmieszanie roztworu kolagenu z komórkami poddanymi trypsynizacji, a następnie przeniesienie ich na płytkę 6-dołkową w celu żelatynizacji.Następnie komórki gruczolakoraka płuc wysiewa się na powierzchnię każdego żelu, aby przygotować trójwymiarową kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów, a żel oddziela się od krawędzi dołka w celu stworzenia hodowli pływającej. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie hodowli na styku powietrze-ciecz oraz testu inwazji poprzez wystawienie skurczonych żeli na działanie powietrza, umieszczając je na siatce znajdującej się w płytce sześciodołkowej. W końcowej fazie wykorzystuje się badania histologiczne do oceny inwazji komórek nowotworowych oraz zmian morfologicznych.Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dwuwymiarowe hodowle monowarstwowe, jest możliwość badania oddziaływań wielokomórkowych w warunkach hodowli trójwymiarowej. Procedura ta rozpoczyna się od pierwotnej hodowli fibroblastów z pobranej tkanki płucnej, zgodnie z opisem i odniesieniami zawartymi w protokole tekstowym. W niniejszym filmie zamiast tkanki z raka płuc człowieka wykorzystano płuca mysie.Umieść próbkę tkanki płucnej na 10 centymetrowej szalce do hodowli tkanek bez pożywki. Za pomocą sterylnej pęsety i skalpela podziel tkankę na małe fragmenty o wielkości około jednego milimetra. Podczas tego procesu należy unikać wysuszania fragmentów, w przeciwnym razie wydajność wzrostu komórek zostanie upośledzona. Rozmieść małe fragmenty tkanki płucnej w odstępach od siebie, aby wokół każdego kawałka pozostał wolny obszar.Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcia na powierzchni naczynia do hodowli tkankowej. Alternatywnie, pokrycie fragmentów tkanki zwiększa efektywność wzrostu i propagacji komórek po kilku pasażach. Najpierw nałóż smar silikonowy w dwóch punktach, w odstępie 1,5 centymetra, w każdym dołku.Następnie umieść posiekane fragmenty tkanki pojedynczo w centrum każdego dołka. Następnie przymocuj szkiełko nakrywkowe do powierzchni płytki, używając smaru silikonowego. Delikatnie dodaj pożywkę do naczynia lub płytki sześciodołkowej, zanim sekcje tkanki wyschną.Większość wydłużonego wzrostu komórek zostaje utracona. Jeśli próbki wyschną, nie należy wlewać medium zbyt szybko, aby uniknąć odklejenia się sekcji tkankowych podczas tworzenia żelu kolagenowego. Fibroblasty należy przemyć jednokrotnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), a następnie dodać trypsynę, aby odkleić wyrosłe komórki po inkubacji z trypsyną przez około pięć minut.W temperaturze 37°C odspój komórki, używając 9 mL DMEM uzupełnionego o 10% FBS, zbierz zawiesinę komórek w probówce o pojemności 10 mL i odwiruj je z prędkością 200 do 300 ×g w celu uzyskania osadu komórkowego. Resuspenduj otrzymane osady w 100% FBS do zagęszczenia 0,5 mln komórek/mL. Przed przygotowaniem żelu kolagenowego schłodź w lodówce odczynniki, pipety i probówki niezbędne do jego sporządzenia.Następnie przygotuj żel kolagenowy, energicznie mieszając za pomocą pipety zawiesinę fibroblastów w FBS, kolagenie typu I, 5X DMEM i buforze do rekonstytucji, aby zapewnić jednorodność mieszaniny, unikając przy tym tworzenia pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Następnie dodaj 3 mL mieszaniny do każdego dołka płytki 6-dołkowej i pozostaw do żelowania w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez zakłóceń przez 30 do 60 minut. W celu hodowli komórek nowotworowych na żelu kolagenowym, resuspenduj komórki nowotworowe w pożywce do kokultury 3D w gęstości 1×10⁵ komórek/mL.Wlej 2 mL zawiesiny komórek gruczolakoraka płuca A549 na powierzchnię każdego żelu. W zależności od warunków doświadczalnych zmodyfikuj liczbę komórek nowotworowych lub fibroblastów w kokulturze w celu przeprowadzenia kontrakcji żelu. Inkubuj żele przez noc w temperaturze 37 °C, aby komórki nowotworowe mogły przylgnąć do żelu kolagenowego.Następnie odspój każdą z nich i wytwórz kulturę pływającą w każdej studzience. W płytce sześciodołkowej użyj igły 21 G pod kątem lub małej szpatułki, aby co dwa do trzech dni oddzielać każdy żel od krawędzi studzienki. Odśwież studzienki, dodając 2 mL medium do kokultury 3D.Przez pięć dni codziennie mierz rozmiar każdego żelu. Na koniec zapoznaj się z tekstem protokołu dotyczącym analizy żelu kolagenowego. Po hodowli żeli kolagenowych w temperaturze 37°C przez pięć dni.Wystaw skurczone żele na działanie powietrza, umieszczając je na siatce. W nowych płytkach sześciodołkowych siatkę przygotowuje się z dostępnych komercyjnie sitek do odcedzania komórek stosowanych w cytometrii przepływowej. Ostrożnie napełnij każdy dołek 11 mililitrami pożywki do kokultury 3D (3D co-culture Medium).Za pomocą sterylnej łyżeczki umieść żele na siatce i usuń z nich pozostałości pożywki w tym konkretnym układzie. Żele są zanurzone w pożywce, podczas gdy ich górna powierzchnia jest wystawiona na działanie powietrza. Takie warunki hodowli definiuje się jako interfejs powietrze-ciecz.Ta metoda kokultury naśladująca mikrośrodowisko guza jest użytecznym narzędziem do badania oddziaływań między komórkami nowotworowymi a fibroblastami osadzonymi w żelach kolagenowych. Komórki 5 49 kokultywowano na żelu kolagenowym z osadzonymi fibroblastami, a warstwę komórek 5 49 wystawiono na działanie powietrza poprzez umieszczenie żelu na siatce w medium. Przedstawiono tutaj reprezentatywne zdjęcie żelu umieszczonego na siatce w studni płytki sześciodołkowej oraz analizy histologiczne z barwieniem hematoksyliną i eozyną.Barwienie przekrojów żelu hodowanego trójwymiarowo wykazało inwazję komórek 5 49 w głąb żelu kolagenowego z zatopionymi fibroblastami związanymi z rakiem płuc. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak analiza ekspresji genów lub knockdown, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące funkcji konkretnych genów w interakcji z mikrośrodowiskiem guza.

three-dimensional-co-culture-model-for-tumor-stromal-interaction

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Trójwymiarowy model współhodowli do interakcji guz-stroma

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Ten film demonstruje metodę tworzenia trójwymiarowej kohodowli sferoidów guza i limfocytów T. Przygotowuje się odlew agarozowy z mikrostudzienkami zawierającymi sferoidy guza, a następnie dodaje się limfocyty T. Po inkubacji układ ten pozwala na badanie interakcji limfocytów T ze sferoidami guza w kontrolowanym trójwymiarowym środowisku.

Trójwymiarowy model kohodowli naciekających limfocytów T w sferoidach nowotworowych

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

System modelowy in vitro został opracowany w celu uchwycenia zmian architektonicznych tkanek podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) w trójwymiarowej (3D) kohodowli z fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Ten system organoidów stanowi unikalną platformę do badania ról różnych zmian wewnętrznych i zewnętrznych komórek nowotworowych, które modulują fenotyp guza.

Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Odkryj trójwymiarową metodę kokultury komórek raka płuca i fibroblastów związanych z rakiem w żelu kolagenowym. Technika ta umożliwia badanie inwazji nowotworowej i interakcji guz-zręb w fizjologicznie relewantnym środowisku.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Przeglądaj więcej filmów