Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie interakcji komórkowych między komórkami raka płuc a fibroblastami związanymi z nowotworem z wykorzystaniem metody współhodowli trójwymiarowej. Jest to realizowane poprzez pierwotną hodowlę ludzkich fibroblastów związanych z rakiem płuc z pobranej tkanki płucnej, którą rozdrabnia się na kawałki o wielkości 1 mm. Drugim krokiem jest przygotowanie żeli kolagenowych z zatopionymi fibroblastami poprzez zmieszanie roztworu kolagenu z komórkami poddanymi trypsynizacji, a następnie przeniesienie ich na płytkę 6-dołkową w celu żelatynizacji.

Następnie komórki gruczolakoraka płuc wysiewa się na powierzchnię każdego żelu, aby przygotować trójwymiarową kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów, a żel oddziela się od krawędzi dołka w celu stworzenia hodowli pływającej. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie hodowli na styku powietrze-ciecz oraz testu inwazji poprzez wystawienie skurczonych żeli na działanie powietrza, umieszczając je na siatce znajdującej się w płytce sześciodołkowej. W końcowej fazie wykorzystuje się badania histologiczne do oceny inwazji komórek nowotworowych oraz zmian morfologicznych.

Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dwuwymiarowe hodowle monowarstwowe, jest możliwość badania oddziaływań wielokomórkowych w warunkach hodowli trójwymiarowej. Procedura ta rozpoczyna się od pierwotnej hodowli fibroblastów z pobranej tkanki płucnej, zgodnie z opisem i odniesieniami zawartymi w protokole tekstowym. W niniejszym filmie zamiast tkanki z raka płuc człowieka wykorzystano płuca mysie.

Umieść próbkę tkanki płucnej na 10 centymetrowej szalce do hodowli tkanek bez pożywki. Za pomocą sterylnej pęsety i skalpela podziel tkankę na małe fragmenty o wielkości około jednego milimetra. Podczas tego procesu należy unikać wysuszania fragmentów, w przeciwnym razie wydajność wzrostu komórek zostanie upośledzona. Rozmieść małe fragmenty tkanki płucnej w odstępach od siebie, aby wokół każdego kawałka pozostał wolny obszar.

Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcia na powierzchni naczynia do hodowli tkankowej. Alternatywnie, pokrycie fragmentów tkanki zwiększa efektywność wzrostu i propagacji komórek po kilku pasażach. Najpierw nałóż smar silikonowy w dwóch punktach, w odstępie 1,5 centymetra, w każdym dołku.

Następnie umieść posiekane fragmenty tkanki pojedynczo w centrum każdego dołka. Następnie przymocuj szkiełko nakrywkowe do powierzchni płytki, używając smaru silikonowego. Delikatnie dodaj pożywkę do naczynia lub płytki sześciodołkowej, zanim sekcje tkanki wyschną.

Większość wydłużonego wzrostu komórek zostaje utracona. Jeśli próbki wyschną, nie należy wlewać medium zbyt szybko, aby uniknąć odklejenia się sekcji tkankowych podczas tworzenia żelu kolagenowego. Fibroblasty należy przemyć jednokrotnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), a następnie dodać trypsynę, aby odkleić wyrosłe komórki po inkubacji z trypsyną przez około pięć minut.

W temperaturze 37°C odspój komórki, używając 9 mL DMEM uzupełnionego o 10% FBS, zbierz zawiesinę komórek w probówce o pojemności 10 mL i odwiruj je z prędkością 200 do 300 ×g w celu uzyskania osadu komórkowego. Resuspenduj otrzymane osady w 100% FBS do zagęszczenia 0,5 mln komórek/mL. Przed przygotowaniem żelu kolagenowego schłodź w lodówce odczynniki, pipety i probówki niezbędne do jego sporządzenia.

Następnie przygotuj żel kolagenowy, energicznie mieszając za pomocą pipety zawiesinę fibroblastów w FBS, kolagenie typu I, 5X DMEM i buforze do rekonstytucji, aby zapewnić jednorodność mieszaniny, unikając przy tym tworzenia pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Następnie dodaj 3 mL mieszaniny do każdego dołka płytki 6-dołkowej i pozostaw do żelowania w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez zakłóceń przez 30 do 60 minut. W celu hodowli komórek nowotworowych na żelu kolagenowym, resuspenduj komórki nowotworowe w pożywce do kokultury 3D w gęstości 1×10⁵ komórek/mL.

Wlej 2 mL zawiesiny komórek gruczolakoraka płuca A549 na powierzchnię każdego żelu. W zależności od warunków doświadczalnych zmodyfikuj liczbę komórek nowotworowych lub fibroblastów w kokulturze w celu przeprowadzenia kontrakcji żelu. Inkubuj żele przez noc w temperaturze 37 °C, aby komórki nowotworowe mogły przylgnąć do żelu kolagenowego.

Następnie odspój każdą z nich i wytwórz kulturę pływającą w każdej studzience. W płytce sześciodołkowej użyj igły 21 G pod kątem lub małej szpatułki, aby co dwa do trzech dni oddzielać każdy żel od krawędzi studzienki. Odśwież studzienki, dodając 2 mL medium do kokultury 3D.

Przez pięć dni codziennie mierz rozmiar każdego żelu. Na koniec zapoznaj się z tekstem protokołu dotyczącym analizy żelu kolagenowego. Po hodowli żeli kolagenowych w temperaturze 37°C przez pięć dni.

Wystaw skurczone żele na działanie powietrza, umieszczając je na siatce. W nowych płytkach sześciodołkowych siatkę przygotowuje się z dostępnych komercyjnie sitek do odcedzania komórek stosowanych w cytometrii przepływowej. Ostrożnie napełnij każdy dołek 11 mililitrami pożywki do kokultury 3D (3D co-culture Medium).

Za pomocą sterylnej łyżeczki umieść żele na siatce i usuń z nich pozostałości pożywki w tym konkretnym układzie. Żele są zanurzone w pożywce, podczas gdy ich górna powierzchnia jest wystawiona na działanie powietrza. Takie warunki hodowli definiuje się jako interfejs powietrze-ciecz.

Ta metoda kokultury naśladująca mikrośrodowisko guza jest użytecznym narzędziem do badania oddziaływań między komórkami nowotworowymi a fibroblastami osadzonymi w żelach kolagenowych. Komórki 5 49 kokultywowano na żelu kolagenowym z osadzonymi fibroblastami, a warstwę komórek 5 49 wystawiono na działanie powietrza poprzez umieszczenie żelu na siatce w medium. Przedstawiono tutaj reprezentatywne zdjęcie żelu umieszczonego na siatce w studni płytki sześciodołkowej oraz analizy histologiczne z barwieniem hematoksyliną i eozyną.

Barwienie przekrojów żelu hodowanego trójwymiarowo wykazało inwazję komórek 5 49 w głąb żelu kolagenowego z zatopionymi fibroblastami związanymi z rakiem płuc. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak analiza ekspresji genów lub knockdown, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące funkcji konkretnych genów w interakcji z mikrośrodowiskiem guza.