Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie interakcji komórkowych między komórkami raka płuc a fibroblastami związanymi z rakiem w trójwymiarowej metodzie współhodowli. Osiąga się to poprzez pierwotną hodowlę ludzkich fibroblastów związanych z rakiem płuc z pobranej tkanki płucnej, która jest mielona na kawałki o wielkości jednego milimetra. Drugim krokiem jest przygotowanie żeli kolagenowych osadzonych w fibroblastach poprzez zmieszanie roztworu kolagenu przy użyciu komórek oczu trypsyny i przeniesienie na sześciodołkową płytkę w celu żelatynizacji.

Następnie komórki gruczolakoraka płuc są siane na powierzchni każdego żelu w celu przygotowania wielowymiarowej kokultury komórek rakowych i fibroblastów, a żel jest oddzielany od krawędzi studzienki w celu wytworzenia pływającej kultury. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie hodowli granicy faz powietrze-ciecz i testu inwazji poprzez wystawienie zakontraktowanych żeli na działanie powietrza poprzez umieszczenie ich na siatce umieszczonej na płytce sześciodołkowej. Ostatecznie badania histologiczne służą do oceny inwazji komórek nowotworowych i zmian morfologicznych.

Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dwuwymiarowa hodowla jednowarstwowa, jest to, że interakcje wielokomórkowe można badać w trójwymiarowej kulturze warunków. Procedura ta rozpoczyna się od pierwotnej hodowli fibroblastów z pobranej tkanki płucnej, zgodnie z opisem i odniesieniem w protokole tekstowym. W tym filmie płuca myszy są używane zamiast ludzkiej tkanki raka płuc.

Umieść próbkę tkanki płucnej na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych bez pożywki. Pokrój tkankę na małe odcinki o wielkości około jednego milimetra za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela Podczas tego procesu unikaj wysuszania sekcji, w przeciwnym razie wydajność wzrostu komórek jest osłabiona. Umieść małe odcinki tkanki płucnej oddzielnie od siebie, aby zachować pusty obszar otaczający każdy element.

Wykonaj rysy na powierzchni naczynia do hodowli tkankowej za pomocą ostrza skalpela. Alternatywnie, pokrycie fragmentów tkanek zwiększa skuteczność wzrostu komórek i rozmnażania komórek po kilku pasażach. Najpierw umieść smar silikonowy w dwóch punktach, w odległości 1,5 centymetra od siebie w każdym dołku.

Następnie ułóż kawałki zmielonej tkanki pojedynczo na środku każdego z nich. Następnie przymocuj szkiełko nakrywkowe do powierzchni płyty za pomocą smaru silikonowego. Delikatnie dodaj pożywkę hodowlaną do naczynia lub płytki z sześcioma dołkami, zanim skrawki tkanki wyschną.

W większości przypadków tracony jest efektywny wzrost komórek. Jeśli próbki wyschną, nie nalewaj pożywki zbyt szybko, aby uniknąć oderwania się skrawków tkanki w celu utworzenia żelu kolagenowego. Umyj fibroblasty solą fizjologiczną lub PBS buforowanym fosforanem x i dodaj próbę jednego, aby oderwać wyrastające komórki po trypsynizacji przez około pięć minut.

W temperaturze 37 stopni Celsjusza odłącz komórki za pomocą dziewięciu mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS, zbierz komórki zawieszone w pożywce w 10-mililitrowej probówce i odwiruj je w temperaturze od 200 do 300 razy G, aby utworzyć granulki komórek. Resus. Zawieś powstałe granulki w 100% FBS o gęstości pół miliona komórek na mililitr. Schłodzić odczynniki, pipety i probówki do przygotowania żelu kolagenowego w lodówce przed przygotowaniem żelu kolagenowego.

Następnie przygotuj żel kolagenowy, mieszając zawiesinę fibroblastów z kolagenem FBS typu pierwszego A pięć X-D-M-E-M i energicznie pipetuj bufor do rozpuszczenia, aby zapewnić jednorodną mieszaninę, unikając tworzenia się pęcherzyków podczas procesu pipetowania. Następnie dodać trzy mililitry mieszaniny do każdego dołka sześciodołkowej płytki i pozostawić do żelatynizacji w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez zakłóceń przez 30 do 60 minut w celu hodowli komórek rakowych na żelu kolagenowym Resus. Zawieś komórki rakowe w pożywce do kohodowli 3D o gęstości od jednego razy 10 do piątej komórki na mililitr.

Biedne dwa mililitry ponownie zawieszonego, A 5 49 roztworu komórek gruczolakoraka płuc na powierzchni każdego żelu. Zmodyfikuj liczbę komórek rakowych lub fibroblastów w kokulturze w zależności od warunków eksperymentalnych, aby przeprowadzić skurcz żelu. Inkubuj żele przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby komórki rakowe mogły przylegać do żelu kolagenowego.

Następnie odłącz każdy z nich i wygeneruj pływającą kulturę w każdej studni. Z sześciodołkowej płytki za pomocą kątowej igły o rozmiarze 21 lub małej szpatułki, aby oddzielić każdy żel od krawędzi studzienki co dwa do trzech dni. Odśwież studzienki za pomocą dwóch mililitrów pożywki do kohodowli 3D.

Mierz rozmiar każdego żelu codziennie przez pięć dni. Na koniec zapoznaj się z protokołem tekstowym do analizy żelu kolagenowego. Po wyhodowaniu kolagenu żeluje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni.

Wystawić zakontraktowane żele na działanie powietrza, umieszczając je na siatce. W nowych sześciodołkowych płytkach wykonuje się siatkę z dostępnych na rynku sitek komórkowych używanych do cytometrii przepływowej. Delikatnie napełnij każdą studzienkę 11 mililitrami kokultury 3D. Średni.

Umieść żele na siatce za pomocą sterylnej łyżki i usuń wszelkie pozostałe podłoże z żeli pod tym warunkiem. Żele są zanurzane w pożywce, podczas gdy górna powierzchnia żelu jest wystawiona na działanie powietrza. Zdefiniuj ten warunek hodowli jako granicę faz powietrze-ciecz.

Ta metoda kohodowli naśladująca mikrośrodowisko guza jest użytecznym narzędziem do badania interakcji między komórkami rakowymi a fibroblastami osadzonymi w żelach kolagenowych. A 5 49 komórek poddano wspólnej hodowli na żelu kolagenowym osadzonym w fibroblastach, a warstwę 5 49 komórek wystawiono na działanie powietrza poprzez umieszczenie żelu na siatce w podłożu. Pokazano tutaj reprezentatywny obraz żelu umieszczonego na siatce w studzience z sześciodołkową płytką analizy histologiczne z hematem, toiną i eoiną.

Barwienie przekrojów poprzecznych trójwymiarowego żelu hodowlanego ujawniło inwazję 5 49 komórek do żelu kolagenowego osadzonego w fibroblastach związanych z rakiem płuc. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ekspresja genów lub knockdown, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak specyficzna funkcja genu w interakcji burzy nowotworowej.