Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Celem tej procedury jest skuteczne wyizolowanie i hodowla neuronów pierwotnych z brzusznego śródmózgowia gryzoni. Osiąga się to poprzez najpierw preparację śródmózgowia zarodków gryzoni. Drugim krokiem jest staranne odizolowanie brzusznej części śródmózgowia.

Następnie tkanka neuronalna musi zostać zdysocjowana, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Ostatnim krokiem jest umieszczenie pierwotnych neuronów w małej objętości na szkiełkach nakrywkowych przed późnym przeniesieniem dołączonych komórek do 24-dołkowej płytki. Ostatecznie mikroskopia przeciwciał i immunofluorescencji służy do identyfikacji neuronów dopaminergicznych w kulturze.

Neurony dopaminergiczne w śródmózgowiu biorą udział w kilku funkcjach, w tym w kontroli ruchu i emocji w poznaniu oraz w wydzielaniu nagrody w mózgu. Są również związane ze schorzeniami neurologicznymi i neuropsychiatrycznymi, w tym chorobą Parkinsona, uzależnieniem i schizofrenią. Metoda naprawy brzusznego śródmózgowia.

Hodowle neuronów mogą być wykorzystywane do badania fizjologii i właściwości komórkowych neuronów dopaminergicznych, a także do zrozumienia przyczyny ich zwyrodnienia. W przebiegu zaburzeń, takich jak choroba Parkinsona. Najpierw przygotuj szkiełka nakrywkowe.

Gotuj je w 70% etanolu przez co najmniej 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady tłuszczu. Następnie przeprowadź szkiełka nakrywkowe w autoklawie. Przenieś szkiełka nakrywkowe na płytki 24-dołkowe i dodaj do każdej z nich po pół mililitra poliolu i całego atenu.

Cóż, pozwól płytkom inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że okres trwałości roboczego roztworu poliolu lub Ateny wynosi jeden miesiąc. Następnie umyj szkiełka nakrywki trzy razy pół mililitra wody na pranie.

Bez wszystkich trzech płukań wyhodowane komórki nie przetrwałyby 24 godzin. Następnie napraw roztwór laminy. Pamiętaj, aby najpierw powoli rozmrozić go na lodzie.

Następnie rozpuść lamininę w zimnym D-M-E-M-F 12 i natychmiast ją zużyj. Teraz wlej pół mililitra świeżo przygotowanego działającego roztworu lamininy do każdej studzienki i pozwól płytkom inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec, przygotowując szklaną pipetę, poleruję ich końcówki do połowy ich normalnego rozmiaru.

Wykonaj nacięcie brzucha, aby odsłonić worki maciczne i za pomocą kleszczy odetnij macicę. Przenieś macicę do lodowatego HBSS w 100-milimetrowym naczyniu i zacznij usuwać zarodki za pomocą kleszczy. Przenieś izolowane zarodki do nowego naczynia z zimnym HBSS.

Teraz pod mikroskopem preparacyjnym przygotuj się do uzyskania dostępu do tego miejsca brzusznego śródmózgowia pod 10-krotnym powiększeniem. Wypreparuj wymiary i łuk głowowy, przecinając mózg na przesmyku oraz obszar graniczny mefaliczny i głowowy za pomocą nożyczek biologicznych lub kleszczy. Po wyjęciu całego śródmózgowia wykonaj nacięcie w przyśrodkowej grzbietowej części śródmózgowia.

Za pomocą kleszczy usuń opony mózgowe. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla powodzenia hodowli neuronalnej. Komórki nieneuronalne umrą w hodowli i warunkach i niekorzystnie sygnalizują sąsiednim neuronom.

Teraz spłaszcz tkankę śródmózgowia w kształt motyla. Odetnij około połowy każdego skrzydła sterylnym ostrzem, pozostawiając brzuszne śródmózgowie. Przenieś brzuszną śródmózgowie do lodowatego HBSS w 15-mililitrowej stożkowej rurce.

Następnie przystąp do sekcji następnego procesu zarodkowego: jak najwięcej zarodków w ciągu godziny. Zarodki trzymane na lodzie przez ponad godzinę mają słabą żywotność komórek. Aby zapewnić wysoką żywotność neuronów dopaminergicznych, czas od rozbioru do posiewu nie powinien przekraczać jednej godziny.

Ponadto usunięcie opon mózgowych ma kluczowe znaczenie dla przetrwania neuronów pod maską. Usuń HBSS z kolekcji brzusznej śródmózgowia. Następnie dodaj mililitr ciepłego 0,05% tripsin A DTA, roztwór wystarczający na 12 kawałków tkanki.

Inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Pod maską zastąp tripsin A DTA na jeden mililitr dezaktywacji. Pożywka delikatnie pęcznieje, aby wymieszać, a następnie usunąć pożywkę dezaktywującą, ale pozostawić wystarczającą ilość pożywki, aby zdysocjowane komórki nie zostały odrzucone.

Następnie dwukrotnie umyj chusteczki kompletnym podłożem, nie tracąc komórek. Teraz dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża. Następnie rozcierać tkankę za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety bez tworzenia pęcherzyków, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Około ośmiu do 10 przejść powinno wystarczyć. Po upływie tego czasu odwirować komórki o masie 400 g przez pięć minut. Usuń pożywkę i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze kompletnego podłoża.

Odpipetować komórki do czterech razy, aby uzyskać zawiesinę. Zacznij od policzenia i oceny stanu zdrowia komórek w zawiesinie. Za pomocą wykluczenia błękitu triama za pomocą hemocytometru.

Teraz dostosuj zawiesinę komórek do 1500 komórek na mikrolitr. Następnie przenieś wysterylizowane nakrętki z mikroprobówek wirówkowych na 100-milimetrowe naczynia. Przygotowane szkiełka nakrywkowe nałóż na nakrętki za pomocą kleszczy.

Nie pierz szkiełek nakrywkowych i staraj się nie dopuścić do ich wyschnięcia. Załaduj 100 mikrolitrów zawiesiny na każde szkiełko nakrywkowe. Ta nieco nietypowa metoda zapewnia 90% żywotności kultury i jest kluczowym krokiem do sukcesu.

Następnie zamknij szalkę Petriego i przenieś ją do inkubatora na godzinę po inkubacji, ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe z pożywką na płytki 24-dołkowe zawierające 400 mikrolitrów kompletnego podłoża podgrzanego do 37 stopni Celsjusza w każdym dołku, a następnie inkubuj komórki przez noc. Pierwsze kilka godzin jest najbardziej krytyczne dla przeżycia komórki w ciągu 24 godzin. Delikatnie dodaj pół mililitra kompletnego podłoża do każdej studzienki.

Co dwa tygodnie. Wymień połowę nośnika. Jeśli kultura zmieni kolor na żółty, wówczas zmianę połowy pożywki można przeprowadzić wcześniej, ale zmiana powinna być nadal rzadka.

Neurony dopaminergiczne przetrwają w tych warunkach dłużej niż sześć tygodni. Po dwóch tygodniach hodowli immunohistochemia przeciwko tyrozynie, hydroksylazie i markerom neuronalnym pokazuje, że 1% komórek jest dopaminergicznych. Projekcje neuronalne pojawiają się w ciągu dwóch godzin od posiewania.

Pod koniec pierwszego dnia w hodowli można odróżnić aksony i dendryty. Ostatecznie neurony przeżywają ponad sześć tygodni i wykazują rozległy rozrost Po tej procedurze. Inne metody, takie jak transdukcja wirusa, fluorescencja immunologiczna lub elektrofizjologia, mogą być wykonywane w celu uzyskania odpowiedzi na pytania mechanistyczne w neuronach dopaminergicznych.