Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Celem niniejszej procedury jest efektywna izolacja i hodowla pierwotnych neuronów z brzusznej części śródmózgowia gryzoni. Osiąga się to najpierw poprzez wypreparowanie śródmózgowia z embrionów gryzoni. Drugim krokiem jest ostrożna izolacja brzusznej części śródmózgowia.

Następnie tkankę neuronalną należy zdysocjować, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Ostatnim krokiem jest wysianie pierwotnych neuronów w małej objętości na okładkach szkiełków przed późniejszym przeniesieniem przytwierdzonych komórek do płytki 24-dołkowej. Ostatecznie, w celu identyfikacji neuronów dopaminergicznych w hodowli, wykorzystuje się przeciwciała oraz mikroskopię immunofluorescencyjną.

Neurony dopaminergiczne w śródmózgowiu uczestniczą w wielu funkcjach, w tym w kontroli ruchu i emocji w procesach poznawczych oraz w układzie nagrody w mózgu. Są one również zaangażowane w schorzenia neurologiczne i neuropsychiatryczne, w tym w chorobę Parkinsona, uzależnienia oraz schizofrenię. Metoda regeneracji brzusznej części śródmózgowia.

Hodowle neuronalne mogą być wykorzystywane do badania fizjologii i właściwości komórkowych neuronów dopaminergicznych, a także do zrozumienia przyczyn ich degeneracji w przebiegu schorzeń takich jak choroba Parkinsona. W pierwszej kolejności należy przygotować szkiełka nakrywki.

Gotuj je w 70% etanolu przez co najmniej 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady tłuszczu. Następnie poddaj szkiełka nakrywki autoklawowaniu. Przenieś szkiełka nakrywki do płytek 24-dołkowych i dodaj do każdego dołka pół mililitra polyol all athene.

Pozostaw płytki do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że okres ważności roboczego roztworu poliolu lub Athene wynosi jeden miesiąc. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie, używając 0,5 mL wody podczas każdego płukania.

Bez wykonania wszystkich trzech etapów płukania, hodowane komórki nie przeżyłyby 24 godzin. Następnie należy przygotować roztwór lamininy. Należy pamiętać, aby najpierw powoli rozmrozić go na lodzie.

Następnie rozpuść lamininę w schłodzonym medium D-M-E-M-F 12 i użyj jej niezwłocznie. Teraz dodaj 0,5 ml świeżo przygotowanego roztworu roboczego lamininy do każdej studni i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37°C. Na koniec, podczas przygotowywania pipet szklanych, szlifuję ich końcówki do połowy normalnej wielkości.

Wykonaj nacięcie brzuszne, aby odsłonić worki maciczne, a następnie za pomocą pęsety wyciąć macicę. Przenieś macicę do schłodzonego HBSS w naczyniu o średnicy 100 mm i rozpocznij usuwanie embrionów pęsetą. Przenieś wyizolowane embriony do nowego naczynia z zimnym HBSS.

Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, przygotuj dostęp do tego obszaru brzusznej części śródmózgowia przy 10-krotnym powiększeniu. Wypreparuj obszary meas i łuku głowowego, przecinając mózg w obrębie isthmus oraz w regionie granicy meas i cephalic di cephalic, używając nożyczek chirurgicznych lub pęsety. Po usunięciu całego śródmózgowia, wykonaj nacięcie w przyśrodkowej części grzbietowej śródmózgowia.

Za pomocą pęsety usuń opony mózgowe. Krok ten jest kluczowy dla sukcesu hodowli neuronów. Komórki nieneuronalne obumrą w warunkach hodowlanych i będą negatywnie wpływać na sąsiednie neurony poprzez sygnalizację.

Następnie rozprostuj tkankę śródmózgu, nadając jej kształt motyla. Odetnij sterylnym ostrzem około połowy każdego „skrzydła”, pozostawiając brzuszną część śródmózwia. Przenieś brzuszną część śródmózwia do lodowatego roztworu HBSS w probówce stożkowej o pojemności 15 ml.

Następnie należy przejść do preparowania kolejnych embrionów, przetwarzając tak wiele z nich, jak to możliwe w ciągu godziny. Embriony przechowywane w lodzie przez ponad godzinę wykazują słabą żywotność komórek. Aby zapewnić wysoką żywotność neuronów dopaminergicznych, czas od preparowania do wysiania nie powinien przekraczać jednej godziny.

Dodatkowo, usunięcie opon mózgowych jest kluczowe dla przeżycia neuronów pod przykryciem. Usunięto HBSS z zebranego brzusznego poziomu śródmózgowia. Następnie dodano jeden mililitr ciepłego 0,05% tripsyny A DTA, co stanowiło ilość roztworu wystarczającą dla 12 fragmentów tkanki.

Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. W komorze z laminarnym przepływem powietrza zastąpić trypsynę A DTA jednym mililitrem medium dezaktywującego. Delikatnie wymieszać poprzez lekkie potrząsanie, a następnie usunąć medium dezaktywujące, pozostawiając jednak taką ilość medium, aby nie usunąć zdysocjowanych komórek.

Następnie dwukrotnie przemyj tkanki pożywką kompletną, uważając, aby nie stracić komórek. Dodaj jeden mililitr pożywki kompletnej. Następnie trituruj tkankę za pomocą pipety z wypalonym końcem, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

Wystarczające powinno być około 8 do 10 pasaży. Po tym czasie wirować komórki z prędkością 400 G przez pięć minut. Usunąć medium i resuspendować komórki w jednym mililitrze pełnego medium.

Pipetować komórki do czterech razy, aby uzyskać zawiesinę. Rozpocząć od policzenia i oceny żywotności komórek w zawiesinie, wykorzystując metodę wykluczania błękitu trypanu z użyciem komory licznikowej.

Następnie dostosuj zawiesinę komórkową do stężenia 1500 komórek na mikrolitr. Potem przenieś sterylne nakrętki probówek do mikrocentryfugi na płytki o średnicy 100 milimetrów. Za pomocą pęsety umieść przygotowane szkiełka nakrywki na nakrętkach.

Nie myć szkiełek nakrywkowych i starać się nie dopuścić do ich wyschnięcia. Nanieść 100 µL zawiesiny na każde szkiełko nakrywkowe. Ta nieco nietypowa metoda zapewnia 90% żywotności hodowli i jest krytycznym krokiem dla osiągnięcia sukcesu.

Następnie zamknij szalkę Petriego i przenieś ją do inkubatora na godzinę. Po inkubacji ostrożnie przenieś szkiełka podstawkowe wraz z medium do płytek 24-dołkowych zawierających 400 µL kompletnego medium podgrzanego do 37 °C w każdym dołku, a następnie inkubuj komórki przez noc. Pierwsze kilka godzin jest najbardziej krytyczne dla przeżywalności komórek w ciągu 24 godzin. Delikatnie dodaj 0,5 mL kompletnego medium do każdego dołka.

Co dwa tygodnie. Wymienić połowę pożywki. Jeśli hodowla zmieni kolor na żółty, wymianę połowy pożywki można przeprowadzić wcześniej, jednak zabieg ten nadal powinien być wykonywany rzadko.

Neurony dopaminergiczne przeżyją w tych warunkach przez ponad sześć tygodni. Po dwóch tygodniach hodowli badania immunohistochemiczne przeciwko tyrozynowej hydroksylazie oraz markerom neuronalnym wykazują, że 1% komórek ma charakter dopaminergiczny. Projekcje neuronalne pojawiają się w ciągu dwóch godzin od wysiania.

Pod koniec pierwszego dnia hodowli aksony i dendryty są już rozróżnialne. Ostatecznie neurony przeżywają ponad sześć tygodni i wykazują rozległy wzrost po zastosowaniu tej procedury. W celu odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmów działania neuronów dopaminergicznych można zastosować inne metody, takie jak transdukcja wirusowa, immunofluorescencja lub elektrofizjologia.