Name: Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Naucz się izolować i hodować pierwotne neurony dopaminergiczne z embrionalnych mózgów gryzoni. Ta metoda umożliwia badanie neurodegeneracji w chorobie Parkinsona przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wykonana przy użyciu funduszy startowych Wydziału Nauk o Mózgu, Wydziału Medycyny, Imperial College London dla K.N.A.

UWAGA: Zwierzęta były utrzymywane i traktowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, a wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Imperial College's Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) oraz Home Office i Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), zgodnie z przepisami federalnymi i stanowymi.
1. Konfiguracja odczynnika i sprzętu
<ol>
	<li>Rozmrozić, podwielokrotność i przechowywać 1 mg/ml roztworu Lamininy w temperaturze –80 °C. Rozpuścić 2 μl w 1 ml DMEM/F12, otrzymując stężenie powłoki 1-2 μg/cm2, 
	UWAGA: Laminin rozmrażamy powoli na lodzie i rozpuszczamy w zimnym DMEM/F12 i natychmiast dodajemy do płytek/szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Rozcieńczyć 75 ml 0,01% poli-L-ornityny w 425 ml PBS i przechowywać w temperaturze 4 ºC. 
	UWAGA: Okres trwałości roztworu roboczego wynosi do jednego miesiąca.</li>
	<li>Rozpuścić 25% (wag./obj.) BSA w PBS, pH 7,4 i przechowywać w temperaturze 4 ºC przez okres do roku.</li>
	<li>Przygotuj 50% nośnik dezaktywacyjny FBS (w HBSS).</li>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę, dodając 50 U/ml penicyliny i streptomycyny, 1x suplement N2, 5% (obj./obj.) FBS, 0,36% D-(+)-glukozy (wt/obj.), 0,25% BSA (wt/obj.) do DMEM/F12 i przechowywać w temperaturze 4 ºC. 
	UWAGA: Okres przydatności do spożycia wynosi do 10 dni.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe we wrzącym 70% (obj./obj.) etanolu na co najmniej 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady tłuszczu i autoklawu.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe na płytkach 24-dołkowych i dodaj 500 μl roztworu poli-L-ornityny do każdej studzienki. Inkubować przez 1 godzinę pod okapem do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy 500 μl wody. Dodać 500 μl roztworu lamininy do każdej płytki i inkubować O/N w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Chociaż po leczeniu lamininą nie jest konieczne płukanie, mycie poli-L-ornityny mniej niż trzy razy powoduje śmierć komórek 24 godziny po hodowli.</li>
	<li>Wypoleruj końcówki szklanych pipet nad gazem ziemnym lub płomieniem palnika. 
	UWAGA: Po tym kroku średnica końcówki powinna być około połowy jej normalnego rozmiaru.</li>
	<li>Odetnij nakrętki probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą autoklawowanych nożyczek i autoklawu.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie embrionalnej brzusznej części śródmózgowia
<ol>
	<li>Narkotyzować matki w ciąży w czasie (E12,5) przez wdychanie CO2 , a następnie poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Spryskaj brzuch 70% etanolem i wykonaj nacięcie brzucha, aż wszystkie worki maciczne zostaną odsłonięte. Za pomocą kleszczy odetnij przyczep pochwy i usuń macicę. Umieść macicę w lodowatym HBSS, na 100-milimetrowej szalce Petriego.</li>
	<li>Usuń zarodki z macicy i worka owodniowego za pomocą kleszczy (ryc. 1C). Umieść zarodki w świeżym, lodowatym HBSS. 
	UWAGA: Prostokąt na rysunku 1D wskazuje lokalizację embrionalnej brzusznej części śródmózgowia.</li>
	<li>Umieść zarodki pod mikroskopem preparacyjnym (10-krotne powiększenie) i wypreparuj łuk śródmózgowia, przecinając mózg na przesmyku i obszarze granicznym śródmózgowia i międzymózgowia, używając bionożyczek i kleszczy (Ryc. 1E, patrz Rycina 1A, aby zapoznać się z liniami nacięcia).</li>
	<li>Po usunięciu całego śródmózgowia wykonaj nacięcie w śródmózgowiu przyśrodkowym (ryc. 1F).</li>
	<li>Usuń opony mózgowe za pomocą dwóch kleszczy (Rysunek 1H). 
	UWAGA: KROK KRYTYCZNY: Ten krok jest niezbędny dla optymalnej wydajności neuronów i przeżycia. Ponieważ warunki hodowli są optymalne dla komórek mózgowych, większość komórek z otaczającej tkanki obumiera po posiewaniu, a sygnał apoptotyczny z tej tkanki może uszkodzić integralność kultur.</li>
	<li>Spłaszcz tkankę śródmózgowia na szalce Petriego, aby obserwować kształt motyla i odetnij około połowy każdego skrzydła, używając wysterylizowanego ostrza do golenia (Rysunek 1H,I). 
	UWAGA: Rycina 1J przedstawia izolowaną brzuszną część śródmózgowia.</li>
	<li>Przenieś fragment brzusznej części śródmózgowia do lodowatego HBSS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i kontynuuj z następnym zarodkiem. 
	UWAGA: Kroki 2.1-2.8 nie powinny zająć więcej niż 1 godzinę. Trzymanie zarodków na lodzie dłużej niż ten czas znacznie zmniejsza żywotność komórek.</li>
</ol>
3. Dysocjacja komórek brzusznego śródmózgowia
<ol>
	<li>Przenieś kawałki brzusznej śródmózgowia pod kaptur z przepływem laminarnym. Usunąć HBSS i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 ºC) 0,05% trypsyny-EDTA do stożkowej probówki (objętość wystarczająca na maksymalnie 12 kawałków brzusznej śródmózgowia). Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.</li>
	<li>Usuń trypsynę-EDTA pod maską i dodaj 1 ml pożywki dezaktywującej (surowica dezaktywuje trypsynę) do tkanki.</li>
	<li>Usunąć pożywkę dezaktywującą i dwukrotnie umyć chusteczkę w 1 ml kompletnego podłoża. 
	UWAGA: Należy unikać wyjmowania całego podłoża z probówki i pipetowania tkanki, aby zapobiec wyrzuceniu zdysocjowanych komórek.</li>
	<li>Dodać 1 ml kompletnej pożywki i rozetrzeć tkankę za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo. Unikać tworzenia się pęcherzyków i kontynuować rozcieranie, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. 
	UWAGA: Zwykle do całkowitej dysocjacji wymagane jest 8-10 przejść przez ograniczoną końcówkę.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pożywkę.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża, powoli pipetując w górę i w dół do czterech razy.</li>
</ol>
4. Poszycie komórek brzusznego śródmózgowia
<ol>
	<li>Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 90 μl roztworu błękitu trypanowego i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: Na tym etapie można również sprawdzić żywotność komórek.</li>
	<li>Umieść wysterylizowane nakrętki probówek do mikrowirówek na szalkach Petriego o średnicy 100 mm i przenieś szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-ornityną/laminą, używając kleszczyków, pojedynczo na wierzch nakrętek. 
	UWAGA: Nie myj szkiełek nakrywkowych i unikaj suszenia lamininy, ponieważ może to spowodować nierówne hodowle i zmniejszenie przeżywalności komórek.</li>
	<li>Dostosuj objętość do 1 500 komórek na 1 μl, dodając kompletną pożywkę i dodaj 100 μl (łącznie 150 000 komórek) zawiesiny komórek na wierzch każdego szkiełka nakrywkowego (objętość jest optymalna, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego bez rozlewania). Zamknąć szalki Petriego i inkubować je przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ). 
	UWAGA: ETAP KRYTYCZNY: Ten etap jest wymagany w celu poprawy przyczepności i żywotności komórek oraz zwiększenia liczby szkiełek nakrywkowych na zarodek. Alternatywnie, komórki można przenieść bezpośrednio do studzienek (zawierających szkiełka nakrywkowe), ale liczba komórek powinna zostać zwiększona do 350 000 na studzienkę (zamiast 150 000). Innymi słowy, przy użyciu tej metody można uzyskać 8-10 szkiełek nakrywkowych, podczas gdy transfer bezpośredni daje około 3-4 szkiełka nakrywkowe ze względu na komórki, które przyczepiają się do płytek (obok lub pod szkiełkami nakrywkowymi). Średnia żywotność kultur przy użyciu tej metody wynosiła około 90%.</li>
</ol>
5. Rozwój i utrzymanie kultury
<ol>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe wraz z pożywką na płytki 24-dołkowe, zawierające 400 μl wstępnie podgrzanej (do 37 °C) kompletnej pożywki (całkowita objętość: 500 μl). Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W ciągu 24 godzin po inkubacji studzienek delikatnie dodać 500 μl kompletnej pożywki do każdej studzienki. 
	UWAGA: Pierwsze kilka godzin jest najbardziej krytycznym etapem dla przeżycia neuronów dopaminergicznych, a liczba komórek, które przeżyły, nie zmienia się znacząco poza tym punktem.</li>
	<li>Nie dodawaj dodatkowych pożywek do kultur przez pierwsze dwa tygodnie lub do momentu, gdy podłoże stanie się żółte. Jeśli hodowla trwa dłużej niż dwa tygodnie lub kolor podłoża zmienia się na żółty, należy wymienić połowę pożywki (500 μl) na świeżą, kompletną, wstępnie ogrzaną pożywkę (zwykle co dwa tygodnie). 
	UWAGA: Neurony dopaminergiczne w kulturach przetrwałyby w tych warunkach dłużej niż 6 tygodni.</li>
</ol>

<ol><li>Prasad, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+immortalized+clonal+cell+lines+from+fetal+rat+mesencephalic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).</li>
<li>Fall, C. P., Bennett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+time+course+of+MPP%2B+-induced+apoptosis+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).</li>
<li>Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+modulation+of+dopamine+expression+in+neuronal+hybrid+cells+by+primary+cells+from+different+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).</li>
<li>Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+P75NTR+expression+causes+death+of+engrailed-deficient+midbrain+dopaminergic+neurons+by+Erk1%2F2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression.</a> Neural Dev. 4, 11(2009).</li>
<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain. 133, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Animal models of Parkinson's disease.</a> Bioessays. 24, 308-318 (2002).</li>
<li>Schober, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classic+toxin-induced+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%3A+6-OHDA+and+MPTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP.</a> Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).</li>
<li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).</li>
<li>Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+type+1+astrocytes+rescue+dopaminergic+neurons+from+death+induced+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation.</a> J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).</li>
<li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+progressive+degeneration+of+nigral+dopaminergic+neurons+in+postnatal+Engrailed+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice.</a> PNAS. 103, 15242-15247 (2006).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifelong+maintenance+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+Nurr1+and+engrailed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed.</a> J Biomed Sci. 21, 27(2014).</li>
<li>Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons%3A+determination+of+their+developmental+fate+by+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors.</a> Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).</li>
<li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+systems+in+the+brain%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li>
<li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39, 889-909 (2003).</li>
<li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%3A+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aetiopathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurology%22%5BJournal%5D)">Aetiopathogenesis of Parkinson's disease.</a> J Neurology. 258, S307-S310 (2011).</li>
<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+gene+expression+of+midbrain+dopaminergic+neurons+reveals+molecules+involved+in+their+vulnerability+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection.</a> Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Neurony dopaminergiczne w śródmózgowiu są głównym źródłem dopaminy w ośrodkowym układzie nerwowym. Są one podzielone na trzy grupy: istota pars compacta (SNpc), brzuszna powierzchnia nakrywki (VTA) i pole zaskrobowe (RRF) 10,11. Neurony w SNpc i VTA dają początek głównym szlakom dopaminergicznym, mezokortykalnym, mezolimbicznym i nigro-prążkowiowym, zaangażowanym w funkcje takie jak kontrola emocji, motywacja i zachowanie motoryczne. Upadek neuronów w SNpc i funkcjonalne zaburzenie układu nigrostria...

Utrata neuronów dopaminergicznych z istoty czarnej pars compacta prowadzi do głównych objawów motorycznych choroby Parkinsona (PD), drugiego najbardziej rozpowszechnionego zaburzenia neurodegeneracyjnego. Podstawowa przyczyna wyginięcia tej populacji neuronów śródmózgowia nie jest znana. Do zbadania szlaków biochemicznych odpowiedzialnych za rozwój i modulację właściwości neurofizjologicznych oraz przeżycie neuronów mesDA wykorzystano kilka hodowli komórkowych i systemów modeli zwierzęcych. Unieśmiertelnione linie komórkowe, w tym szczurza linia komórek dopaminergicznych 1RB3AN27 (N27), ludzka linia komórkowa nerwiaka dopaminergicznego SH-SY5Y, mysia dopaminergiczna hybrydowa linia komórkowa MN9D i ludzkie śródmózgowiowe komórki LUHMES zostały wykorzystane do badań biochemicznych i ograniczonych badań mechanistycznych 1-5. Do badania specyficznej utraty neuronów mesDA opracowano kilka modeli opartych na neurotoksynach i modelach genetycznych 6-8. Pierwotne hodowle brzusznej części śródmózgowia stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neuronalnych i synaptycznych neuronów dopaminergicznych oraz szlaków zaangażowanych w patogenezę tego powszechnego zaburzenia.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych, który zawiera modyfikacje skutkujące wyższą przeżywalnością i zwiększoną wydajnością szkiełek nakrywkowych na zarodek. Zastosowanie przedwcześnie opracowanego śródmózgowia myszy E12.5 (E14.5 u szczurów) zwiększa przeżywalność. W tym wieku neurony nie rozwinęły jeszcze aksonów, co pozostawia komórki nienaruszone podczas sekcji i minimalizuje stres, co znacznie zwiększa żywotność. Ponadto staranna sekcja brzusznej części śródmózgowia, opisana w sekcji 2 niniejszego protokołu, dodatkowo zwiększa przeżywalność. W celu zwiększenia liczby szkiełek nakrywkowych na zarodek przedstawiono alternatywną metodę posiewu w sekcji 4 niniejszego protokołu. Prowadzi to do uzyskania do 10 szkiełek nakrywkowych na zarodek w porównaniu z 4 szkiełkami nakrywkowymi w standardowych warunkach posiewu, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt w jednym doświadczeniu.
Neurony w kulturze wykazują wzrost aksonów i dentytów, tworzą połączenia synaptyczne i ujawniają obecność markerów neuronalnych i synaptycznych, co czyni te kultury odpowiednimi do obrazowania żywych komórek, badań immunocytochemicznych i elektrofizjologicznych. Co więcej, wykorzystanie kultur neuronalnych ułatwia manipulacje genetyczne i farmakologiczne. Przerost neurytów od 2 dnia in vitro pozwala na badania rozwojowe. Co więcej, długotrwałe przetrwanie kultur (do sześciu tygodni) sprawia, że nadają się one do badania powolnej, postępującej degeneracji tych neuronów.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle firmy Dulbecco F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) (1X), płyn</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca, inaktywowana termicznie (FBS)</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 (100X), płyn</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza roztwór (45% (wag./obj.) w wodzie</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (0,05% (wag./vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albumina (BSA) badana hodowla komórkowa</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko hydroksylazie (Th) anty-tyrozyny</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna, roztwór 0,01% Sigma</td><td></td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Map2 (białko związane z mikrotubulami-2A i -2B)</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-synapsyny-1</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgG&nbsp; &nbsp; przeciwciało</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 osioł anty-królik IgG&nbsp; &nbsp; przeciwciało</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osł anty-owca IgG&nbsp; &nbsp; przeciwciało</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 osioł anty-owce IgG&nbsp; &nbsp; przeciwciało</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 osioł anty-mysie IgG&nbsp; &nbsp; </td><td>przeciwciało Sondy molekularne</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4% (wag./vol))</td>Mikroskop stereoskopowy <td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do szkiełek nakrywkowych &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Dwa kleszcze Dumont # 45 &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt ostrza / młot Płaski uchwyt - 11 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów dla studentów - proste 11,5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowy oświetlacz halogenowy</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mikro; m sterylne jednostki filtracyjne</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm szalki Petriego</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełko nakrywkowe #1 Grubość Szkło niemieckie 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-10012&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneracja śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych (mesDA) jest patologicznym znakiem rozpoznawczym choroby Parkinsona. Badanie procesów biologicznych związanych z funkcjami fizjologicznymi oraz podatnością i śmiercią tych neuronów jest pomocne w zrozumieniu przyczyn leżących u podstaw i odkryciu lekarstwa na tę powszechną chorobę neurodegeneracyjną. Pierwotne hodowle neuronów mesDA dostarczają narzędzia do badania właściwości molekularnych, biochemicznych i elektrofizjologicznych, w celu zrozumienia rozwoju, długoterminowego przeżycia i degeneracji tych neuronów w przebiegu choroby. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę izolacji, hodowli i utrzymania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia z zarodków myszy E12.5 (lub szczura E14.5). Zoptymalizowane warunki hodowli komórkowej w tym protokole skutkują obecnością wypustek aksonalnych i dendrytycznych, połączeń synaptycznych i innych właściwości morfologicznych neuronów, które sprawiają, że kultury nadają się do badania fizjologicznych, biologicznych i molekularnych cech komórkowych tej populacji neuronów.

Immunohistochemia przeciwko tyrozynohydroksylazie (Th) wykazuje, że od 0,5-1% komórek w hodowli ma charakter dopaminergiczny. Projekcje neuronalne pojawiają się w ciągu 2 hr po wysianiu, a do pierwszego dnia aksony i dendryty są rozróżnialne (Rycina 2) przy użyciu przeciwciał przeciwko tyrozynohydroksylazie (TH) i białku Map2 (Microtubule-Associated Protein 2) (Rycina 3). Neurony przeżywają ponad sześć tygodni i wykazują rozległy wzrost wypustek. Stosunek neuronów do gleju w hodowlach je...

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Celem niniejszej procedury jest efektywna izolacja i hodowla pierwotnych neuronów z brzusznej części śródmózgowia gryzoni. Osiąga się to najpierw poprzez wypreparowanie śródmózgowia z embrionów gryzoni. Drugim krokiem jest ostrożna izolacja brzusznej części śródmózgowia.Następnie tkankę neuronalną należy zdysocjować, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Ostatnim krokiem jest wysianie pierwotnych neuronów w małej objętości na okładkach szkiełków przed późniejszym przeniesieniem przytwierdzonych komórek do płytki 24-dołkowej. Ostatecznie, w celu identyfikacji neuronów dopaminergicznych w hodowli, wykorzystuje się przeciwciała oraz mikroskopię immunofluorescencyjną.Neurony dopaminergiczne w śródmózgowiu uczestniczą w wielu funkcjach, w tym w kontroli ruchu i emocji w procesach poznawczych oraz w układzie nagrody w mózgu. Są one również zaangażowane w schorzenia neurologiczne i neuropsychiatryczne, w tym w chorobę Parkinsona, uzależnienia oraz schizofrenię. Metoda regeneracji brzusznej części śródmózgowia.Hodowle neuronalne mogą być wykorzystywane do badania fizjologii i właściwości komórkowych neuronów dopaminergicznych, a także do zrozumienia przyczyn ich degeneracji w przebiegu schorzeń takich jak choroba Parkinsona. W pierwszej kolejności należy przygotować szkiełka nakrywki.Gotuj je w 70% etanolu przez co najmniej 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady tłuszczu. Następnie poddaj szkiełka nakrywki autoklawowaniu. Przenieś szkiełka nakrywki do płytek 24-dołkowych i dodaj do każdego dołka pół mililitra polyol all athene.Pozostaw płytki do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że okres ważności roboczego roztworu poliolu lub Athene wynosi jeden miesiąc. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie, używając 0,5 mL wody podczas każdego płukania.Bez wykonania wszystkich trzech etapów płukania, hodowane komórki nie przeżyłyby 24 godzin. Następnie należy przygotować roztwór lamininy. Należy pamiętać, aby najpierw powoli rozmrozić go na lodzie.Następnie rozpuść lamininę w schłodzonym medium D-M-E-M-F 12 i użyj jej niezwłocznie. Teraz dodaj 0,5 ml świeżo przygotowanego roztworu roboczego lamininy do każdej studni i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37°C. Na koniec, podczas przygotowywania pipet szklanych, szlifuję ich końcówki do połowy normalnej wielkości.Wykonaj nacięcie brzuszne, aby odsłonić worki maciczne, a następnie za pomocą pęsety wyciąć macicę. Przenieś macicę do schłodzonego HBSS w naczyniu o średnicy 100 mm i rozpocznij usuwanie embrionów pęsetą. Przenieś wyizolowane embriony do nowego naczynia z zimnym HBSS.Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, przygotuj dostęp do tego obszaru brzusznej części śródmózgowia przy 10-krotnym powiększeniu. Wypreparuj obszary meas i łuku głowowego, przecinając mózg w obrębie isthmus oraz w regionie granicy meas i cephalic di cephalic, używając nożyczek chirurgicznych lub pęsety. Po usunięciu całego śródmózgowia, wykonaj nacięcie w przyśrodkowej części grzbietowej śródmózgowia.Za pomocą pęsety usuń opony mózgowe. Krok ten jest kluczowy dla sukcesu hodowli neuronów. Komórki nieneuronalne obumrą w warunkach hodowlanych i będą negatywnie wpływać na sąsiednie neurony poprzez sygnalizację.Następnie rozprostuj tkankę śródmózgu, nadając jej kształt motyla. Odetnij sterylnym ostrzem około połowy każdego „skrzydła”, pozostawiając brzuszną część śródmózwia. Przenieś brzuszną część śródmózwia do lodowatego roztworu HBSS w probówce stożkowej o pojemności 15 ml.Następnie należy przejść do preparowania kolejnych embrionów, przetwarzając tak wiele z nich, jak to możliwe w ciągu godziny. Embriony przechowywane w lodzie przez ponad godzinę wykazują słabą żywotność komórek. Aby zapewnić wysoką żywotność neuronów dopaminergicznych, czas od preparowania do wysiania nie powinien przekraczać jednej godziny.Dodatkowo, usunięcie opon mózgowych jest kluczowe dla przeżycia neuronów pod przykryciem. Usunięto HBSS z zebranego brzusznego poziomu śródmózgowia. Następnie dodano jeden mililitr ciepłego 0,05% tripsyny A DTA, co stanowiło ilość roztworu wystarczającą dla 12 fragmentów tkanki.Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. W komorze z laminarnym przepływem powietrza zastąpić trypsynę A DTA jednym mililitrem medium dezaktywującego. Delikatnie wymieszać poprzez lekkie potrząsanie, a następnie usunąć medium dezaktywujące, pozostawiając jednak taką ilość medium, aby nie usunąć zdysocjowanych komórek.Następnie dwukrotnie przemyj tkanki pożywką kompletną, uważając, aby nie stracić komórek. Dodaj jeden mililitr pożywki kompletnej. Następnie trituruj tkankę za pomocą pipety z wypalonym końcem, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Wystarczające powinno być około 8 do 10 pasaży. Po tym czasie wirować komórki z prędkością 400 G przez pięć minut. Usunąć medium i resuspendować komórki w jednym mililitrze pełnego medium.Pipetować komórki do czterech razy, aby uzyskać zawiesinę. Rozpocząć od policzenia i oceny żywotności komórek w zawiesinie, wykorzystując metodę wykluczania błękitu trypanu z użyciem komory licznikowej.Następnie dostosuj zawiesinę komórkową do stężenia 1500 komórek na mikrolitr. Potem przenieś sterylne nakrętki probówek do mikrocentryfugi na płytki o średnicy 100 milimetrów. Za pomocą pęsety umieść przygotowane szkiełka nakrywki na nakrętkach.Nie myć szkiełek nakrywkowych i starać się nie dopuścić do ich wyschnięcia. Nanieść 100 µL zawiesiny na każde szkiełko nakrywkowe. Ta nieco nietypowa metoda zapewnia 90% żywotności hodowli i jest krytycznym krokiem dla osiągnięcia sukcesu.Następnie zamknij szalkę Petriego i przenieś ją do inkubatora na godzinę. Po inkubacji ostrożnie przenieś szkiełka podstawkowe wraz z medium do płytek 24-dołkowych zawierających 400 µL kompletnego medium podgrzanego do 37 °C w każdym dołku, a następnie inkubuj komórki przez noc. Pierwsze kilka godzin jest najbardziej krytyczne dla przeżywalności komórek w ciągu 24 godzin. Delikatnie dodaj 0,5 mL kompletnego medium do każdego dołka.Co dwa tygodnie. Wymienić połowę pożywki. Jeśli hodowla zmieni kolor na żółty, wymianę połowy pożywki można przeprowadzić wcześniej, jednak zabieg ten nadal powinien być wykonywany rzadko.Neurony dopaminergiczne przeżyją w tych warunkach przez ponad sześć tygodni. Po dwóch tygodniach hodowli badania immunohistochemiczne przeciwko tyrozynowej hydroksylazie oraz markerom neuronalnym wykazują, że 1% komórek ma charakter dopaminergiczny. Projekcje neuronalne pojawiają się w ciągu dwóch godzin od wysiania.Pod koniec pierwszego dnia hodowli aksony i dendryty są już rozróżnialne. Ostatecznie neurony przeżywają ponad sześć tygodni i wykazują rozległy wzrost po zastosowaniu tej procedury. W celu odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmów działania neuronów dopaminergicznych można zastosować inne metody, takie jak transdukcja wirusowa, immunofluorescencja lub elektrofizjologia.

isolation-culture-long-term-maintenance-primary-mesencephalic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja, hodowla i długotrwała utrzymanie pierwotnych mezencefalicznych neuronów dopaminergicznych z mózgów zarodkowych gryzoni

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia umożliwiają badanie charakterystyki presynaptycznej neuronów dopaminergicznych. Mogą one być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym kinetyki uwalniania dopaminy oraz poziomów białek/mRNA regulatorów egzocytozy dopaminy. W niniejszym materiale przedstawiamy sposób przygotowania tych hodowli z noworodków gryzoni.

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Przedstawiamy protokół hodowli wysoko oczyszczonych neuronów hipokampa z prenatalnych mózgów myszy bez użycia warstwy komórek glejowych jako komórek zasilających.

Izolacja i hodowla neuronów hipokampa z myszy prenatalnych

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół

Ten film przedstawia metodę hodowli neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy. Proces ten obejmuje leczenie śródmózgowia enzymem proteolitycznym, odłączenie komórek i wyhodowanie ich na pokrytych polimerem szkiełkach nakrywkowych w pożywce bogatej w składniki odżywcze z antybiotykami dla ich wzrostu i długoterminowej żywotności.

Hodowla i utrzymanie neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

Naucz się izolować i hodować pierwotne neurony dopaminergiczne z embrionalnych mózgów gryzoni. Ta metoda umożliwia badanie neurodegeneracji w chorobie Parkinsona przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Przeglądaj więcej filmów