Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja transportu monocytów w szpiku kostnym czaszki żywej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego. Najpierw mysz jest znieczulana i wstrzykiwana roztworem zgnilizny, dekstranu żwacza w celu oznaczenia układu naczyniowego. Mysz jest następnie umieszczana w niestandardowym metalowym wsporniku, a skóra głowy od tylnej części kości ciemieniowej do kości czołowej jest usuwana.

Następnie gumowy pierścień nakłada się bezpośrednio na czaszkę za pomocą kleju chirurgicznego, a zbiorniki napełnia się płynną solą fizjologiczną. Wreszcie, mikroskopia wielofotonowa służy do śledzenia rozwoju komórek fluorescencyjnych w czasie w szpiku kostnym czaszki. To me może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie z zakresu immunohematologii, jakim jest mechanizm mobilizacji monocytów w stanie stacjonarnym lub po chemioterapii.

Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w zachowanie modułowych monocytów. Może być również stosowany do badania innych podzbiorów komórek szpiku kostnego w zależności od specyfiki zastosowanego reportera grypy. Poniższy protokół wykorzystuje mikroskop wielofotonowy sprzężony z laserem z kryształu tytanowo-szafirowego oraz modulatorem operacyjnym do kontroli mocy lasera.

Aby umożliwić jednoczesną rejestrację trzech kanałów fluorescencyjnych, konfiguracja powinna zawierać trzy zewnętrzne detektory skanujące non DS lub nds o kombinacji 565 nanometrów i 690 nanometrów, lustra dichroiczne 565, 610 nanometrów i 500 550 nanometrów filtry pasmowo-przepustowe oraz filtr krótkoprzepustowy 485. Należy zauważyć, że w tej konfiguracji generacja drugiej harmonicznej lub SHG i cyjanowe białko fluorescencyjne lub CFP są wykrywane przez NDD po filtrze krótkoprzepustowym 485. CFP jest również wykrywany przez NDD.

Po przepuszczeniu filtra pasmowego 500 550 i pręta dominacji dekstran jest wykrywany przez NDD. Po przeprowadzeniu filtra pasmowego 565 610, na kilka godzin przed obrazowaniem należy ustawić komorę grzewczą na 32 stopnie Celsjusza. Ta temperatura utrzyma mysz w optymalnej temperaturze ciała przez cały czas trwania eksperymentu.

Należy pamiętać, że zastosowana tutaj komora grzewcza jest ciemna i zakrywa obiektywy oraz zmotoryzowaną płytę systemu. Pomaga to uniknąć zanieczyszczenia światłem zewnętrznym. Aby włączyć system, najpierw włącz laser z szafirem tytanowym, a następnie włącz resztę systemu mikroskopu.

Uruchom oprogramowanie do akwizycji. W tym przypadku używane jest oprogramowanie Zeiss Zen. Ustaw zakres długości fali lasera na 870 nanometrów.

Następnie wybierz odpowiedni NDD do nagrywania. Mysz użyta w tym eksperymencie to transgeniczna mysz o nazwie Mac blue, która wykazuje ekspresję cyjanowego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora receptora jednego płynu mózgowo-rdzeniowego. Zalecana metoda znieczulenia zależy od długości obrazowania, dlatego najlepiej zapoznać się z dokumentem towarzyszącym, aby uzyskać szczegółowe informacje.

Trudnym aspektem tej procedury jest wstrzyknięcie żyły T, ponieważ dość łatwo jest przeoczyć żyłę. Jeśli tak się stanie, zamiast tego wykonaj wstrzyknięcie zadoczodołowe. Gdy mysz zostanie znieczulona, użyj szczypiec, aby sprawdzić, czy nie straciła przytomności, stymulując opuszkę stopy. Następny.

Aby zabarwić naczynia krwionośne, wstrzyknąć 200 mikrolitrów dekstranu dominowego pręcika do żyły ogonowej lub do barwienia neutrofili. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów soli fizjologicznej zawierającej LY six GPE. Po wstrzyknięciu należy umieścić głowę myszy między płytkami mocującymi specjalnie wykonanego uchwytu stereotaktycznego dostosowanego do mikroskopu i inhalatora gazów znieczulających.

Gwarantuje to, że ruchy oddechowe nie będą miały wpływu na obrazowanie. Dokręć płytki mocujące, aby rozciągnąć skórę między uszami a głową. Sprawdź stabilność.

Delikatnie naciskając głowę szczypcami, głowa nie powinna się poruszać. Następnie upewnij się, że zwierzę oddycha normalnie. Aby przygotować mysz do obrazowania dwufotonowego, użyj palca, aby nałożyć 70% etanol na włosy na skórze głowy, uważając, aby omijać oczy.

Następnie umieść serwetkę z wycięciem, aby odsłonić skórę głowy. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek i szczypiec przeciąć skórę i całkowicie usunąć skórę głowy z tyłu kości ciemieniowej do kości czołowej. Zachowaj odległość trzech milimetrów od oczu i uszu, aby zapobiec rozległemu krwawieniu.

Usuń luźną tkankę łączną lub okostną pokrywającą czaszkę. Następnie za pomocą ciepłego ręcznika papierowego nasączonego PBS zmyj pozostałe włosy, jak pokazano tutaj. Za pomocą małej igły nałóż klej chirurgiczny na całe obwód gumowego pierścienia o średnicy 10 milimetrów.

Następnie umieść gumowy pierścień bezpośrednio na czaszce za pomocą innego ręcznika papierowego nasączonego PBS. Wyczyść wnętrze pierścienia po raz ostatni. Dodaj ciepły PBS, aby całkowicie zanurzyć czaszkę.

Następnie umieść uchwyt stereotaktyczny pod obiektywem. Gdy mysz znajdzie się na miejscu, użyj okularu mikroskopu z bezpośrednią transmisją, aby view czaszkę i z grubsza ustaw ją w polu widzenia mikroskopu. W lewym górnym rogu okna oprogramowania do obrazowania kliknij akwizycję na żywo.

Skan tkanki na żywo pojawi się w środku okna za pomocą sterowania kierunkowego mikroskopu w oprogramowaniu. Zlokalizuj region z sygnałem CFP i dominacji pręta, aby dostosować ostrość. Następnie ustaw moc lasera na minimum, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu przy minimalnych uszkodzeniach fotograficznych.

Następnie w oprogramowaniu kliknij zakładkę kanału i zwiększ moc wzmocnienia na PMT dla każdego NDD, aby zmniejszyć wybielanie zdjęć i uszkodzenia zdjęć, a następnie kliknij odpowiednią zakładkę, aby ustawić ustawienia akwizycji na pojedyncze skanowanie z czasem przebywania pikseli 1,58 mikrosekundy i rozdzielczością 512 na 512 pikseli przy powiększeniu 1,5. Po ustawieniu parametrów nagrywania kliknij polecenie akwizycji na żywo i zbadaj tkankę, aby wybrać żądane pole x, y, z, które ma być monitorowane w czasie rzeczywistym. Tutaj wybiera się pole obejmujące zarówno obszary naczyniowe, jak i miąższowe.

Obok opcji zapisania lub zarejestrowania współrzędnych X, Y, Z pola wyświetlanego w zakładce pozycje. Kliknij przycisk Dodaj. Powtórz ten proces z maksymalnie trzema dodatkowymi polami, aby zarejestrować wszystkie interesujące Cię współrzędne.

Współrzędne pojawią się na karcie pozycji obok instrukcji oprogramowania. Aby przechwycić stos obrazów z trzema DZ, kliknij przenieś do w zakładce pozycji w oprogramowaniu, aby przejść do pierwszej zarejestrowanej pozycji i wybierz Zack w lewym górnym polu oprogramowania. Spowoduje to otwarcie zakładki stosu Z, przejście do najwyższej pozycji Z i odpowiednie dostosowanie mocy lasera.

Kliknij ustaw jako ostatni, a następnie przejdź do najgłębszej pozycji. Dostosuj moc lasera. Następnie najpierw kliknij ustaw.

Grubość analizowanego stosu powinna być szybko dostosowana do badanej komórki. Poruszające się komórki szybko wyjdą z francuskiego, więc będziesz musiał zaopatrzyć się w grubszy stos. Następnie nabywasz wolno poruszające się komórki.

W lewym górnym polu wybierz polecenie szeregów czasowych, aby otworzyć kartę szeregów czasowych. Ustaw liczbę cykli i interwał czasu. W tym przypadku jeden wolumin będzie pobierany co 30 sekund przez 60 cykli.

Odpowiada to 30 minutom w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe w oknie głównym, wybierz rozpocznij eksperyment przez cały czas trwania procedury, kontynuuj monitorowanie zwierzęcia, aby upewnić się, że jest nieprzytomne. Upewnij się również, że obiektyw jest prawidłowo zanurzony.

Po przechwyceniu sekwencji użyj pipety, aby dodać ciepły PBS. Następnie rozpocznij drugą 30-minutową akwizycję. Jeśli podczas akwizycji obserwuje się postępujący zanik sygnału, sprawdź, czy nie ma wycieku PBS.

Po nagraniu wszystkich wymaganych filmów, przeprowadzeniu analizy danych zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie w celu zbadania fizjologii szpiku kostnego za pomocą obrazowania intrażyciowego, niebieskiej transgenicznej myszy Mac wstrzyknięto 2 miliony dekstranów dominowych prętów daltońskich i zobrazowano za pomocą dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej. Jak pokazano na tym filmie, na uzyskanej mikrofotografii, układ naczyniowy zabarwiony dekstranem dominowym prętów daltońskich o stężeniu 2 milionów daltonów jest pokazany w czerwonej kości, pokazany na niebiesko jest uwidoczniony przez drugą generację harmoniczną. Mocyty ECFP dodatnie pokazane w cyjanie znajdują się w niszach miąższowych, które są widoczne jako ciemne obszary między naczyniami krwionośnymi a kością oraz w naczyniach.

Aby obliczyć trajektorię poszczególnych komórek, wykonano obrazowanie poklatkowe. Ten film pokazuje zachowanie migracyjne monocytów miąższowych. Sygnał ECFP jest w kolorze niebieskozielonym, a ścieżki migracyjne dla każdej czerwonej plamki są wyświetlane na zielono.

Tutaj można zaobserwować zachowanie migracyjne monocytów naczyniowych. Dane te można wykorzystać do obliczenia zarówno średniej prędkości, jak i średniego kwadratu przemieszczenia komórek. Należy zauważyć, że monocyty naczyniowe wykazują zarówno zwiększone przemieszczenie, jak i zwiększoną prędkość w porównaniu z monocytami miąższowymi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak śledzić monocyty szpiku kostnego myszy in vivo za pomocą dwóch obrazowania fotograficznego Po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania migracji komórek i interakcji w szpiku kostnym, które stanowią bardzo ważne miejsce hematopoezy, ale także innych podstawowych funkcji, takich jak pobudzanie antygenu i pamięć immunologiczna.