Name: Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj metodę śledzenia monocytów szpiku kostnego myszy in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy mobilizacji monocytów w stanie ustalonym i po chemioterapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Anne Daron i Pierre'owi Louisowi Loyherowi za pomoc redakcyjną, Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) za pomoc przy mikroskopie dwufotonowym oraz Animal Facility "NAC" i Camille Baudesson za pomoc w hodowli myszy. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 304810 – RAID oraz nr 241440-Endostem od Inserm, od Université Pierre et Marie Curie "Emergence", od la "Ligue contre le cancer", od "Association pour la Recherche sur le Cancer" oraz od "Agence Nationale de la Recherche" Programme Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). P.H. był wspierany przez la "Ligue contre le cancer".

UWAGA: Wszystkie protokoły eksperymentów zostały zatwierdzone przez Francuski Komitet ds. Doświadczeń i Etyki na Zwierzętach oraz zatwierdzone przez "Service Protection et Santé Animales, Environnement" pod numerem A-75-2065. Wielkość próby jest dobierana tak, aby zapewnić powtarzalność eksperymentów i zgodnie z 3R regulacji etycznych zwierząt.

1. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>znieczulenie
	<ol>
		<li>W przypadku krótkiego okresu obrazowania (mniej niż 1 godzina) znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 200 μl roztworu soli fizjologicznej zawierającego ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg).</li>
		<li>Alternatywnie, w przypadku dłuższego okresu obrazowania (do 4 godzin), znieczulić mysz inhalacją izofluranu 2,5% odparowanego w mieszaninie 70/30 O2/N2O, przez dostosowaną maskę.</li>
		<li>UWAGA: W ten sposób zapewnia bardziej stabilną utratę przytomności i pozwala uniknąć seryjnego wstrzykiwania leków do otrzewnowej.</li>
		<li>Po znieczuleniu myszy sprawdź, czy nie straciła przytomności poprzez stymulację opuszki stopy szczypcami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie naczyń krwionośnych/dodatkowe barwienie
	<ol>
		<li>Barwienie naczyń krwionośnych: Wstrzyknąć dożylnie do żyły ogonowej 200 μl dekstranu rodaminy (2 MDa, 10 mg/ml w buforze soli fizjologicznej).</li>
		<li>Do barwienia neutrofili: wstrzyknąć dożylnie 2 μg Ly6G-PE (klon 1A8) do 100 μl roztworu soli fizjologicznej do żyły ogonowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienia
	<ol>
		<li>Do unieruchomienia należy użyć specjalnie wykonanego uchwytu stereotaktycznego dostosowanego do mikroskopu i inhalatora z gazem anestezjologicznym. 
		UWAGA: Uchwyt sterotaktyczny to metalowy wspornik z dwoma metalowymi wspornikami, z których jeden jest zamocowany, a drugi zdejmowany i regulowany, w celu dokręcenia głowy zwierzęcia.</li>
		<li>Zamontuj główkę myszy między płytami mocującymi, aby zapewnić izolację od ruchów oddechowych. Zaciśnij uszy między płytkami mocującymi a głową, aby rozciągnąć skórę. Sprawdzić stabilność i dobrostan oddychania zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń skórę głowy
	<ol>
		<li>Ostrożnie użyj etanolu 70%, aby zwilżyć włosy skóry głowy sterylnym aplikatorem, unikając kontaktu z oczami.</li>
		<li>Przetnij skórę sterylnymi nożyczkami i szczypcami, aby całkowicie usunąć skórę głowy od tyłu kości ciemieniowej do kości czołowej. Przechowywać w odległości do 3 mm od oczu i uszu, aby zapobiec obfitemu krwawieniu. Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą czaszkę (okostną). Zmyj pozostałe włosy ciepłym ręcznikiem papierowym nasączonym PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja systemu zanurzeniowego
	<ol>
		<li>Wklej gumowy pierścień o średnicy 18 mm z klejem chirurgicznym bezpośrednio na czaszkę za pomocą igły o małej średnicy, aby kontrolować dystrybucję. Przyklej cały obwód gumowego pierścienia, aby zapobiec wyciekom (30 μl powinno wystarczyć).</li>
		<li>Wyczyść czaszkę pod pierścieniem po raz ostatni ręcznikiem papierowym nasączonym PBS, a następnie dodaj 37 °C PBS, aby całkowicie zanurzyć czaszkę. Dodaj kroplę 0,9% roztworu NaCl lub specjalnej maści okulistycznej na każde oko myszy, aby uniknąć wysuszenia oczu. Przeciągnij uchwyt stereotaktyczny pod obiektyw.</li>
		<li>W przybliżeniu ustaw pole za pomocą okularu mikroskopu poprzez bezpośrednią transmisję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazowania dwufotonowego
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu wielofotonowego sprzężonego z laserem kryształowym Ti:Sapphire, który dostarcza impulsy światła NIR o prędkości 140 fs, selektywnie przestrajalnego od 680 do 1,080 nm, oraz modulatorem akustyczno-optycznym do kontroli mocy lasera. Użyj konfiguracji obejmującej 3 zewnętrzne detektory niedescanned (NDD) (które umożliwiają jednoczesny zapis 3 kanałów fluorescencyjnych) z kombinacją 2 zwierciadeł dichroicznych (565 nm i 690 nm), filtrów pasmowoprzepustowych 565/610 i 500/550 oraz filtra krótkoprzepustowego 485, z obiektywem do zanurzenia w wodzie o planapochromatycznym ×20 (NA = 1).</li>
	<li>Ustaw komorę grzewczą tak, aby umożliwić dobrą hometermię znieczulonej myszy., 
	UWAGA: Temperaturę można ustawić na 1 godzinę przed sesją obrazowania, aby uzyskać lepszą stabilność. W naszym przypadku wybrano 32 °C, aby uzyskać optymalną temperaturę ciała znieczulonej myszy (36-37 °C) i utrzymuje się ona do 4 godzin. Temperatura ta może być dostosowana do zastosowanego systemu (do sprawdzenia tego punktu można użyć sondy cyfrowej). Ponadto zastosowana komora grzewcza jest ciemna/i zakrywa część systemu (obiektywy i płytę z napędem), aby uniknąć zanieczyszczenia światłem zewnętrznym.</li>
	<li>Włącz system
	<ol>
		<li>Włącz laser Ti:Sapphire, a następnie cały system mikroskopu. Uruchom oprogramowanie do akwizycji. Ustaw zakres długości fali lasera na 870 nm. Wybierz odpowiedni NDD do nagrywania. 
		UWAGA: W naszym przypadku generacja drugiej harmonicznej (SHG) 19i cyjanowe białko fluorescencyjne (ECFP) są wykrywane przez NDD po filtrze krótkoprzepustowym 485. ECFP jest również wykrywany przez NDD po filtrze pasmowoprzepustowym 500/550, a rodamin-dekstran jest wykrywany przez NDD po filtrze pasmowoprzepustowym 565/610.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosowywanie ustawień pobierania
	<ol>
		<li>Użyj polecenia obrazowania "akwizycja na żywo" w oprogramowaniu i korzystając ze sterowania kierunkowego mikroskopu, dostosuj ostrość do obszaru z sygnałem ECFP i rodaminy. Ustaw moc lasera na minimum, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu przy minimalnych uszkodzeniach fotograficznych. 
		UWAGA: Używane ustawienie mocy różni się w zależności od głębokości obszaru zainteresowania. Zazwyczaj ustawienia AOM są ustawione na około 20%, co oznacza moc lasera poza obiektywem około 15 mW. Lepiej jest zwiększyć moc wzmocnienia PMT dla każdego NDD, aby zmniejszyć fotowybielanie i fotouszkodzenia. Typowe ustawienia akwizycji to pojedyncze skanowanie z czasem przebywania piksela 1,58 μs i rozdzielczością 512 x 512 pikseli przy powiększeniu 1,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz regiony zainteresowania
	<ol>
		<li>Po ustawieniu parametrów rejestracji należy ponownie użyć polecenia akwizycji "na żywo" i zbadać tkankę, aby wybrać żądane pole (x,y,z) do monitorowania w czasie rzeczywistym. 
		UWAGA: Zazwyczaj wybieramy pole obejmujące zarówno obszary naczyniowe, jak i miąższowe.</li>
		<li>Zarejestruj pole za pomocą polecenia programowego "position". 
		UWAGA: To polecenie zapamiętuje współrzędne x,y,z różnych odległych pól.</li>
		<li>Wybierz i zarejestruj dodatkowe pola zainteresowań (do 3) przy użyciu tej samej procedury.</li>
		<li>Ustaw stos z 3D za pomocą polecenia oprogramowania "z-stack" na pierwszej zapamiętanej pozycji zgodnie z wymaganą objętością z wybranym powiększeniem. Zapamiętaj najpierw głębszą pozycję, a następnie najwyższą pozycję. Normalizuj moc lasera z głębokością. 
		UWAGA: W przypadku wielokrotnego jednoczesnego obrazowania pola uzyskujemy 5 warstw oddzielonych krokami z 3 μm dla każdego pola, aby uzyskać objętość o grubości 12 μm. Ustawienia te można dostosować do typu badanej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzenie na rynek akwizycji
	<ol>
		<li>Wybierz polecenie programowe "szeregi czasowe" i wybierz czas trwania przedziału czasu oraz liczbę cykli. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe zgodnie z wymaganym upływem czasu i czasem trwania, wybierając polecenie oprogramowania "rozpocznij eksperyment". 
		UWAGA: W naszym przypadku uzyskujemy jeden wolumin co 30 sekund podczas 60 cykli reprezentujących 30 minut czasu rzeczywistego. Można wykonać mniejszy upływ czasu, aby śledzić szybkie toczenie się komórek w naczyniu krwionośnym. W tym przypadku cieńszy stos z i nie więcej niż 2 różne pola mogą być rejestrowane w tym samym czasie.</li>
		<li>Regularne monitorowanie konfiguracji.
		<ol>
			<li>Zawsze monitoruj zwierzę, aby upewnić się, że jest nieprzytomne. 
			UWAGA: Potrząsanie wąsami lub nogami zwierzęcia jest wskaźnikiem przebudzenia. W przypadku, gdy oddech zwierzęcia jest nierówny, ilość izofluranu może być nieznacznie zmniejszona. Silny dryf tkanek podczas akwizycji jest wskaźnikiem odrodzenia myszy.</li>
			<li>Upewnij się, że obiektyw jest prawidłowo zanurzony. Odnowić PBS w temperaturze 37 °C między dwoma akwizycjami (30 min). 
			UWAGA: Postępujący zanik sygnału podczas akwizycji jest wskaźnikiem wycieku PBS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończenie procedury
	<ol>
		<li>Po nagraniu wymaganych filmów należy szybko poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy przed resuscytacją. 
		UWAGA: gojenie się ran prowadzi do powstania strupa w ciągu 24 do 48 godzin, co ogranicza możliwość wykonania obrazowania podłużnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Korekcja dryftu
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania Imaris Bitplane do automatycznego śledzenia 3D.</li>
		<li>Otwórz sekwencję obrazów 3D w Imaris. Wybierz polecenie "spot" i wygeneruj ręczne śledzenie (kliknięcie myszą + shift) dla wszystkich punktów czasowych dla co najmniej 4 różnych punktów kotwiczenia, jeśli to możliwe, równomiernie rozmieszczonych w terenie.</li>
		<li>Zastosuj korekcję dryfu za pomocą polecenia "correct drift" w zakładce "edytuj ścieżkę".</li>
		<li>Sprawdź jakość poprawki w x, y, a zwłaszcza w z, aby uniknąć sztucznych wahań. 
		UWAGA: Jeśli korekta nie jest zadowalająca, wypróbuj inne punkty kontrolne lub wyklucz film z analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śledzenie komórek
	<ol>
		<li>Użyj polecenia "dodaj nowe miejsca" i wybierz ustawienie algorytmu "śledź miejsca w czasie". Przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Zastosuj procedurę automatycznego śledzenia komórek na całym interesującym Cię kanale za pomocą polecenia "kanał źródłowy". Ustaw średnicę obiektów (np. komórek) na 10 μm. Przejdź do następnego kroku. 
		UWAGA: Wybór będzie zależał od rozróżnienia między obiektami i specyficzności mierzonego sygnału. Krótko mówiąc, automatyczne śledzenie na całym kanale jest możliwe tylko wtedy, gdy wykryty sygnał jest specyficzny dla obiektu zainteresowania. Ponieważ zarówno SHG, jak i ECFP są wykrywane przez NDD po filtrze krótkoprzepustowym 485, śledzenie będzie bardziej szczegółowe i wydajne przy użyciu sygnału ECFP zarejestrowanego przez NDD po filtrach pasmowoprzepustowych 500/550. Zgrupowane lub gęsto upakowane obiekty będą wymagały ręcznego wyboru pojedynczych obiektów, podobnie jak w kroku 3.1.2.</li>
		<li>Wybierz typ filtra "jakość", ustaw próg, aby wykluczyć śledzenie nieokreślonych obiektów. Przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Wybierz "Ruch algorytmu Browna" z dokładnymi parametrami "Maksymalna odległość" i "Rozmiar przerwy" między dwoma punktami. Sprawdź poprawność generowania ścieżek.</li>
		<li>Po automatycznym obliczeniu ścieżek wybierz typ filtra "czas trwania ścieżki", ustaw próg, aby wyeliminować ścieżki krótsze niż 120 sekund (reprezentujące 4 punkty czasowe).</li>
		<li>Obowiązkowe: Po automatycznym śledzeniu sprawdź jakość ścieżek.
		<ol>
			<li>Rozwiń pasek czasu, aby sprawdzić, czy obiekty podążają ścieżkami ścieżek. Jeśli nie, skorzystaj z opcji korekcji punktów trasy dostępnych w zakładce "edytuj": Usuń fałszywe lub niewłaściwe ścieżki za pomocą polecenia "usuń" (usuń dowolny punkt trasy pojedynczo za pomocą polecenia "rozłącz"). Jeśli ścieżka trasy jest nieciągła, należy dodać brakujące punkty czasowe (kliknięcie myszką+shift), zaznaczyć wszystkie punkty na danej trasie, a następnie użyć komendy "połącz" w zakładce "edytuj ścieżkę".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parametry kwantyfikacji
	<ol>
		<li>Wybierz zakładkę "Statystyka" w poleceniu "Preferencje", wybierz interesujące Cię parametry dynamiczne z listy. Wybierz polecenie "Eksportuj wszystkie statystyki do pliku" i zapisz wygenerowany plik Excel. 
		UWAGA: Kilka parametrów dynamicznych jest uzyskiwanych bezpośrednio z oprogramowania, takich jak długość toru, prędkość chwilowa, prędkość średnia i prostoliniowość toru. Współczynnik ruchliwości 6,20 można określić, ale nie jest on bezpośrednio dostarczany przez oprogramowanie.</li>
		<li>Dla każdej komórki oblicz średnią przemieszczeń dla każdego okresu czasu (δt) (dla 30-sekundowego filmu poklatkowego δt będzie wynosić 30, 60, 90 sekund itd.). Wykreślić średnią przemieszczenia kwadratowego w funkcji przedziału czasu. Uzyskaj współczynnik ruchliwości, obliczając nachylenie liniowej części krzywej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).</li>
<li>Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+regulate+immunity+through+dynamic+networks+of+survival+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death.</a> J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19, 71-82 (2003).</li>
<li>Robbins, C. S., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+roles+of+monocyte+subsets+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+and+progenitor+cells+induce+monocyte+emigration+in+response+to+circulating+toll-like+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands.</a> Immunity. 34, 590-601 (2011).</li>
<li>Jacquelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+reduces+Ly6Chigh-monocyte+motility+within+and+release+from+the+bone+marrow+after+chemotherapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice.</a> Blood. 122, 674-683 (2013).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
<li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).</li>
<li>Milo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+reveals+promiscuous+crosspresentation+of+blood-borne+antigens+to+naive+CD8%2B+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow.</a> 122, 193-208 (2013).</li>
<li>Cavanagh, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+bone+marrow-resident+memory+T+cells+by+circulating%2C+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells.</a> Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J Exp Med. 188, 465-474 (1998).</li>
<li>Rashidi, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+mouse+bone+marrow+reveals+differential+niche+engagement+by+quiescent+and+naturally+activated+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Yost, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neutrophil+extracellular+trap+%28NET%29+formation%3A+a+novel+innate+immune+deficiency+of+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates.</a> Blood. 113, 6419-6427 (2009).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nat Med. 19, 107-112 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytycznymi punktami metodologii obrazowania in vivo jest zapewnienie stabilności ostrości w celu maksymalizacji czasu trwania obrazowania oraz zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia bakteryjnego i stanu zapalnego, które mogą wpływać na dynamikę komórek zapalnych. Obrazowanie szpiku kostnego czaszki jest zgodne z tymi celami, ponieważ operacja wykonywana w celu uzyskania dostępu do szpiku kostnego jest minimalna. Stosowanie sterylnego materiału i środków antyseptycznych jest niezbędne, aby ograniczyć r...

Szpik kostny odgrywa centralną rolę w hematopoezie i stanowi główny rezerwuar monocytów, które konstytutywnie recyrkulują między krwią a miąższem rdzeniowym, odnawiają pulę krążących monocytów o krótkiej żywotności 2,3 i uczestniczą w odtwarzaniu makrofagów tkankowych i komórek dendrytycznych w stanie stacjonarnym 4. Podczas zapalenia lub po przemijającej aplazji monocyty są aktywnie mobilizowane ze szpiku kostnego lub śledziony 5, 6, 7 i kolonizują narządy objęte stanem zapalnym. W proces mobilizacji komórek szpikowych ze szpiku kostnego zaangażowanych jest kilka osi chemoatraktantu 8, 5, 6,9. Poza przedziałem szpikowym szpik kostny jest również ważnym miejscem pobudzania limfocytów T 10 i niszą pamięci immunologicznej 11,12. W związku z tym tkanka ta ma kluczowe znaczenie dla licznych badań w dziedzinie hematologii i immunologii. Nasza wiedza na temat organizacji strukturalnej komórek szpiku rdzenia wynika głównie z analizy przekroju histologicznego tkanek utrwalonych 13. Ten statyczny widok nie pozwala na badanie dynamiki wymiany komórkowej między różnymi przedziałami szpiku kostnego, która jest podstawą jego aktywności funkcjonalnej.
Obrazowanie przyżyciowe stanowi ważny wkład biologiczny w badania mobilności komórek, adherencji komórek i interakcji między komórkami, które wcześniej były opisywane tylko z systemów in vitro. Wyzwania techniczne związane z prawidłowym obrazowaniem przyżyciowym obejmują zdolność dotarcia do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania z optycznego punktu widzenia oraz jej maksymalizację izolacji od dryftów fizjologicznych (oddech, skurcze mięśni lub perystaltyczne) lub mechanicznych (rozerwanie i wydłużenie tkanki po operacji oraz wystawienie na działanie obiektywu mikroskopu, a także zaburzenia temperatury i naczyń krwionośnych/natlenienia). Mikroskopijne dryfty mogą ograniczać zdolność do utrzymywania ostrości przez długi czas i mogą wprowadzać artefakty w kwantyfikacji ruchliwości komórek. Jedną z alternatyw, zwalidowaną dla kilku tkanek w celu zmniejszenia tych trudności technicznych, jest praca na eksplantowanej tkance inkubowanej w termostatowanym i natlenionym podłożu; Jednak całkowite zaburzenie krążenia limfatycznego i naczyniowego może być problematyczne. Obrazowanie przyżyciowe szpiku kostnego czaszki ma kilka zalet związanych z tymi kwestiami. Po pierwsze, wymaga minimalnego działania chirurgicznego. Po drugie, grubość kości w tym obszarze umożliwia bezpośrednią wizualizację nisz szpiku kostnego bez ścierania, zmniejszając w ten sposób zaburzenia fizjologiczne. Sieć rdzeniową można zobrazować w okolicy przystrzałkowej kości; Jednak sinusoidy są bardziej widoczne w okolicy czołowo-ciemieniowej, gdzie macierz kostna jest cieńsza 12,14. 
Obrazowanie przyżyciowe opiera się na dostępności najdokładniejszego fluorescencyjnego reportera oznaczającego badaną populację. Znakowanie in vitro oczyszczonej populacji komórek przed transferem adoptywnym doprowadziło do istotnej charakterystyki nisz krwiotwórczych komórek macierzystych 15 lub mikrodomen śródbłonka szpiku kostnego sprzyjających wszczepieniu guza 16 i dostarczyło kilku podstawowych danych wejściowych w zakresie kluczowych pojęć w immunologii 17 . Jednak takie podejście zwykle wymaga setek tysięcy komórek, aby mieć szansę na ich późniejsze wykrycie in vivo. Można to wytłumaczyć wysoką śmiertelnością po barwieniu, rozcieńczeniem w całym ciele i zmianą stanu aktywacji, co może prowadzić do tendencyjnego naprowadzania. Endogenne znakowanie z transgenicznego systemu myszy znacznie przezwycięża te ograniczenia i umożliwia zobrazowanie zachowania endogennych osteoblastów 8, megakariocytów 18 lub podzbiorów linii szpikowej 6 . Niemniej jednak należy zachować ostrożność przy rozważaniu swoistości reportera fluorescencyjnego wśród badanego podzbioru. 
Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, zwany myszą MacBlue 1, jest cennym transgenicznym systemem do badania monocytów rdzeniowych za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym 6. Dożylne wstrzyknięcie rodaminy-dekstranu o dużej masie cząsteczkowej odróżnia miąższ rdzeniowy od naczyniowej sieci sinusoidalnej szpiku kostnego. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest śledzenie zachowania monocytów w różnych przedziałach rdzenia w określonym kontekście fizjopatologicznym. Ponadto proponujemy dodatkową strategię porównywania dynamiki monocytów z dynamiką neutrofili poprzez znakowanie in vivo przy użyciu specyficznego przeciwciała.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml, środek znieczulający</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 mg/ml, środek znieczulający</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>2,5%, środek znieczulający</td></tr><tr><td>O2/NO2</td><td></td><td></td><td>70/30, środek znieczulający</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa, 10 mg/ml, Barwienie naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td><td>Klon Becton-Dickinson</td><td></td><td>1A8, barwienie neutrofili</td></tr><tr><td>Uchwyt stereotaktyczny</td><td>Domowa</td><td></td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>chirurgii Chirurgia sterylnych nożyczek i szczypiec</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gumowy pierścień</td><td></td><td></td><td>o średnicy 18 mm, chirurgia</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo Medyczny</td><td></td><td>klej chirurgiczny, mocowanie pierścienia gumowego</td></tr><tr><td>Igły o małej średnicy</td><td>Chirurgia Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy Zeiss LSM 710 NLO&nbsp;</td><td>Mikroskop Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Szafirowy kryształ laserowy&nbsp;</td><td>Spójne impulsy Chameleon Ultra</td><td></td><td>140 fsec światła NIR</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Acquistion Software</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&nbsp;</td>Oprogramowanie do analizy <td>płaszczyzny bitowej</td><td></td><td>, automatyczne śledzenie 3D</td></tr><tr><td>PBS 1X</td> D. <td>Chirurgia</td><td>Dutschera</td><td></td></tr><tr><td>Komora termostatyczna</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>obrazowanie przyżyciowe</td></tr></tbody></table>

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Obrazowanie wielofotonowe w czasie rzeczywistym stanowi doskonałą okazję do badania transportu komórkowego i interakcji między komórkami w ich fizjologicznym 3-wymiarowym środowisku. Aktywność biologiczna komórek odpornościowych zależy głównie od ich zdolności do ruchliwości. Monocyty krwi mają krótki okres półtrwania w krwiobiegu; Pochodzą one ze szpiku kostnego i są z niego konstytutywnie uwalniane. W stanie zapalnym proces ten ulega nasileniu, co prowadzi do monocytozy krwi, a następnie naciekania obwodowych tkanek zapalnych. Identyfikacja zdarzeń biomechanicznych kontrolujących transport monocytów ze szpiku kostnego w kierunku sieci naczyniowej jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia znaczenia fizjopatologicznego monocytów. Przeprowadziliśmy obrazowanie poklatkowe in vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej szpiku kostnego czaszki myszy Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). Mysz MacBlue ulega ekspresji fluorescencyjnego białka cyjanowego wzmocnionego reporterami (ECFP) pod kontrolą swoistego dla szpiku promotora 1, w połączeniu ze znakowaniem sieci naczyniowej. Opisujemy, w jaki sposób to podejście umożliwia śledzenie poszczególnych monocytów rdzeniowych w czasie rzeczywistym w celu dalszego ilościowego określenia zachowań migracyjnych w obrębie miąższu szpiku kostnego i naczyń krwionośnych, a także interakcji międzykomórkowych. Podejście to dostarcza nowych informacji na temat biologii podzbiorów monocytów szpiku kostnego i pozwala na dokładniejsze zbadanie, w jaki sposób można wpływać na te komórki w określonych stanach patologicznych.

Budowa czaszki myszy stwarza dobrą okazję do badania fizjologii szpiku kostnego za pomocą obrazowania intravitalnego. Ze względu na cienką warstwę kości w okolicy czołowo-parietalnej możliwe jest uzyskanie dostępu do nisz szpiku bez konieczności ścierania tkanki kostnej. Rycina 1 przedstawia szerokie pole widzenia 2D czaszki transgenicznej myszy MacBlue. Macierz kostna składa się głównie z kolagenu I, który jest łatwo wykrywalny za pomocą SHG 19. Iniekcja rodamina-dekstranu barwi sieć naczynio...

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja ruchu monocytów w szpiku kostnym czaszki żywej myszy z wykorzystaniem obrazowania dwufotonowego. Najpierw mysz zostaje poddana znieczuleniu i wstrzyknięto jej roztwór dekstranu FITC w celu oznakowania naczyń krwionośnych. Następnie mysz umieszcza się w specjalnym metalowym wsporniku, a skórę głowy od tylnej części kości ciemieniowej do kości czołowej zostaje usunięta.Następnie gumowy pierścień przytwierdza się bezpośrednio do czaszki za pomocą kleju chirurgicznego, a zbiorniki wypełnia się roztworem soli fizjologicznej. Na koniec wykorzystuje się mikroskopię wielofotonową do śledzenia rozwoju fluorescencyjnych komórek w czasie w obrębie szpiku kostnego czaszki. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunohematologii, takie jak mechanizm mobilizacji monocytów w stanie spoczynku lub po chemioterapii.Zatem metoda ta może dostarczyć wglądu w zachowanie modularnych monocytów. Może ona zostać zastosowana również do badania innych subpopulacji komórek szpiku kostnego, w zależności od specyficzności zastosowanego reportera fluorescencyjnego. Poniższy protokół wykorzystuje mikroskop wielofotonowy sprzężony z laserem tytanowo-szafirowym oraz modulatorem optycznym do kontroli mocy lasera.Aby umożliwić jednoczesną rejestrację trzech kanałów fluorescencyjnych, konfiguracja powinna obejmować trzy zewnętrzne detektory poza skanowaniem (non DS scan detectors lub nds) z kombinacją luster dichroicznych 565 nanometrów i 690 nanometrów, filtrów pasmowych 565, 610 nanometrów oraz 500 550 nanometrów, a także filtra krótkoprzepustowego 485. Należy pamiętać, że w tej konfiguracji generowanie drugiej harmonicznej (SHG) oraz cyjanowa białka fluorescencyjna (CFP) są wykrywane przez NDD po filtrze krótkoprzepustowym 485. CFP jest również wykrywane przez NDD.Po filtrze pasmowym 500 550 Rod Domine Dextran jest wykrywany przez NDD. Przed zastosowaniem filtra pasmowego 565 610, na kilka godzin przed obrazowaniem, należy ustawić komorę grzewczą na 32 °C. Temperatura ta pozwoli utrzymać mysz w optymalnej temperaturze ciała przez cały czas trwania eksperymentu.Należy zwrócić uwagę, że zastosowana tutaj komora grzejna jest ciemna i zakrywa obiektywy oraz zmotoryzowany stolik systemu. Pomaga to uniknąć zanieczyszczenia światłem zewnętrznym. Aby uruchomić system, najpierw włącz laser tytano-szafirowy, a następnie włącz pozostałe elementy systemu mikroskopowego.Uruchom oprogramowanie do akwizycji. W tym przypadku wykorzystano oprogramowanie Zeiss Zen. Ustaw zakres długości fali lasera na 870 nanometrów.Następnie wybierz odpowiedni NDD do rejestracji. Myszą użytą w tym doświadczeniu jest mysz transgeniczna o nazwie Mac blue, która wykazuje ekspresję cyjanowego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora receptora CSF1.Trudnym aspektem tej procedury jest iniekcja do żyły szyjnej, ponieważ łatwo ją przeoczyć. W takim przypadku należy zamiast niej wykonać iniekcję zaocznojemiołkową. Gdy mysz zostanie znieczulona, należy sprawdzić brak przytomności za pomocą pęsety/kleszczyków poprzez stymulację poduszeczki stopy. Dalej.Aby zabarwić układ naczyniowy, należy wstrzyknąć 200 µL dekstranu rodaminowego do żyły ogonowej, a w przypadku barwienia neutrofili – wstrzyknąć 100 µL soli fizjologicznej zawierającej LY6G PE. Po zastrzyku należy umieścić głowę myszy pomiędzy płytkami mocującymi specjalnie wykonanego uchwytu stereotaktycznego, przystosowanego do mikroskopu oraz inhalatora gazu anestetycznego.Zapewnia to, że ruchy oddechowe nie będą wpływać na obrazowanie. Dokręć płyty mocujące, aby naciągnąć skórę między uszami a głową. Sprawdź stabilność.Po delikatnym uciśnięciu głowy szczypcami, głowa nie powinna się poruszać. Następnie należy upewnić się, że zwierzę oddycha prawidłowo. Aby przygotować mysz do obrazowania dwufotonowego, należy za pomocą palca nanieść 70% ethanol na włosy skóry głowy, uważając, aby nie dopuścić do kontaktu z oczami.Następnie należy założyć obłożenie z otworem umożliwiającym odsłonięcie skóry głowy. Następnie, używając sterylnych nożyczek i kleszczyków, należy naciąć skórę i całkowicie usunąć powłokę skalpu od tylnej części kości ciemieniowej aż do kości czołowej. Należy zachować odstęp trzech milimetrów od oczu i uszu, aby zapobiec obfitemu krwawieniu.Usuń luźną tkankę łączną lub okostną pokrywającą czaszkę. Następnie, używając ręcznika papierowego nasączonego ciepłym PBS, usuń pozostałe włosy, zgodnie z pokazanym tutaj sposobem. Za pomocą igły o małym przekroju nanieś klej chirurgiczny na całą obwód gumowego pierścienia o średnicy 10 milimetrów.Następnie umieść gumowy pierścień bezpośrednio na czaszce, używając innego ręcznika papierowego nasączonego PBS. Oczyść wnętrze pierścienia po raz ostatni. Dodaj ciepły PBS, aby całkowicie zanurzyć czaszkę.Następnie umieść uchwyt stereotaktyczny pod obiektywem. Po ustawieniu myszy użyj okularu mikroskopu z bezpośrednią transmisją, aby obejrzeć czaszkę i wstępnie ustawić ją w polu widzenia mikroskopu. W lewym górnym rogu okna oprogramowania do obrazowania kliknij przycisk akwizycji na żywo.Na środku okna pojawi się obraz z podglądu na żywo, uzyskiwany za pomocą sterowania kierunkowego mikroskopu w oprogramowaniu. Zlokalizuj obszar z sygnałem CFP i domeną pręcikową, aby dostosować ostrość. Następnie ustaw moc lasera na minimum, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu przy minimalnym uszkodzeniu fotochemicznym.Następnie w oprogramowaniu kliknij zakładkę kanałów i zwiększ wzmocnienie (gain) w PMT dla każdego NDD, aby zmniejszyć fotowybielanie i fotouszkodzenia, a następnie kliknij odpowiednią zakładkę, aby ustawić parametry akwizycji na skanowanie pojedyncze z czasem przebywania piksela 1,58 microseconds oraz rozdzielczością 512 na 512 pixels przy powiększeniu 1,5. Po ustawieniu parametrów rejestracji kliknij polecenie akwizycji na żywo i przejrzyj tkankę, aby wybrać pożądane pole x, y, Z do monitorowania w czasie rzeczywistym. W tym przypadku wybrano pole obejmujące zarówno obszary naczyniowe, jak i miąższowe.Następnie, aby zapisać lub zarejestrować współrzędne X, Y, Z pola wyświetlanego w karcie pozycji, należy kliknąć przycisk add. Powtórz ten proces dla maksymalnie trzech dodatkowych pól, aby zarejestrować wszystkie interesujące współrzędne.Współrzędne pojawią się w zakładce pozycji obok instrukcji oprogramowania. Aby zarejestrować stos trzech obrazów DZ, kliknij „move to” w zakładce pozycji w oprogramowaniu, aby przejść do pierwszej zarejestrowanej pozycji, a następnie wybierz „Zack” w górnym lewym polu oprogramowania. Spowoduje to otwarcie zakładki stosu Z, przejście do najwyższej pozycji Z i odpowiednią regulację mocy lasera.Kliknij set last, a następnie przesuń do najgłębszej pozycji. Dostosuj moc lasera. Następnie kliknij set first.Grubość analizowanego stosu obrazów powinna być dostosowana do prędkości przemieszczania się badanej komórki. Szybko poruszające się komórki szybciej opuszczą obszar ogniskowania, dlatego konieczne będzie zarejestrowanie grubszego stosu. W przypadku komórek poruszających się powoli można zastosować mniejszą liczbę warstw.W górnym lewym polu wybierz polecenie serii czasowej, aby otworzyć kartę serii czasowej. Ustaw liczbę cykli oraz odstęp czasu. W tym przypadku co 30 sekund będzie pozyskiwany jeden wolumen przez 60 cykli.Przedstawia to 30 minut w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe w głównym oknie, należy wybrać opcję start experiment; w trakcie procedury należy nadal monitorować zwierzę, aby upewnić się, że pozostaje ono nieprzytomne. Należy również upewnić się, że obiektyw jest prawidłowo zanurzony.Po zarejestrowaniu sekwencji należy za pomocą pipety dodać ciepły PBS. Następnie należy rozpocząć drugą 30-minutową akwizycję. Jeśli podczas akwizycji obserwuje się postępujący zanik sygnału, należy sprawdzić, czy nie nastąpił wyciek PBS.Po zarejestrowaniu wszystkich wymaganych filmów przeprowadzono analizę danych zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie, aby zbadać fizjologię szpiku kostnego za pomocą obrazowania intravitalnego; mysz transgeniczna Mac blue została wstrzyknięta z 2 million Dalton rod domine dextran i poddana obrazowaniu za pomocą dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej. Jak pokazano na tym filmie, na otrzymanej mikrofotografii naczynia krwionośne zabarwione 2 million Dalton rod domine dextran są widoczne na czerwono, a kość, widoczna na niebiesko, została zwizualizowana za pomocą generowania drugiej harmonicznej. Monocyty dodatnie pod kątem ECFP, widoczne na kolor cyjan, znajdują się w niszach miąższowych, które objawiają się jako ciemne obszary pomiędzy naczyniami a kością, a także wewnątrz naczyń.W celu obliczenia trajektorii poszczególnych komórek wykonano obrazowanie time-lapse. Prezentowany film pokazuje zachowanie migracyjne monocytów miąższowych. Sygnał ECFP jest zaznaczony kolorem cyjanowym, a ścieżki migracji dla każdego czerwonego punktu są wyświetlane w kolorze zielonym.Tutaj przedstawiono zachowanie migracyjne monocytów naczyniowych. Dane te mogą zostać wykorzystane do obliczenia zarówno średniej prędkości, jak i średniego kwadratu przemieszczenia komórek. Należy zauważyć, że monocyty naczyniowe wykazują zarówno większe przemieszczenie, jak i większą prędkość w porównaniu do monocytów miąższowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak śledzić monocyty z szpiku kostnego myszy in vivo przy użyciu dwóch metod obrazowania fotograficznego po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny immunologii do eksploracji migracji i interakcji komórek w szpiku kostnym, który stanowi bardzo istotne miejsce hemopoezy, ale także pełni inne fundamentalne funkcje, takie jak inicjowanie odpowiedzi antygenowej i pamięć immunologiczna.

tracking-mouse-bone-marrow-monocytes-in-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Śledzenie monocytów rdzenia kostnego myszy in vivo

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania świeżego całego szpiku kostnego z tylnych kończyn myszy w celu zbadania całych wad BM u pacjentów z chorobami krwi, takimi jak białaczka.

Pobieranie szpiku kostnego z tylnej kończyny myszy

Ten protokół opisuje procedurę seryjnego pobierania próbek szpiku kostnego kości udowej (BM) bez konieczności poświęcania myszy. Procedura ta ułatwia badania podłużne składu BM myszy w czasie i zapewnia szeregowy dostęp do komórek w BM do badań ex vivo i transplantacji.

Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

Tutaj prezentujemy protokół do analizy ultrastruktury megakariocytów in situ za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Mysie szpiki kostne są zbierane, mocowane, zatapiane w żywicy epoksydowej i cięte na ultracienkie odcinki. Po barwieniu kontrastowym szpik kostny obserwuje się pod mikroskopem TEM przy napięciu 120 kV.

In Situ Badanie mysiej megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj metodę śledzenia monocytów szpiku kostnego myszy in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy mobilizacji monocytów w stanie ustalonym i po chemioterapii.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Przeglądaj więcej filmów