Name: Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj wpływ komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu w modelach in vitro. Ta metoda pozwala badać interakcje między komórkami śródbłonka a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi podczas stanu zapalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pępowiny zostały pobrane dzięki pomocy Birmingham Women's Health Care NHS Trust. HMM był wspierany przez Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) oraz Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+on+endothelium+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration.</a> Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+stroma+as+a+regulator+of+leukocyte+recruitment+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).</li>
<li>Serhan, C. N., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+the+beginning+programs+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: the beginning programs the end.</a> Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).</li>
<li>Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+leukocyte+recruitment+and+its+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies.</a> Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ability+of+Exogenous+Chemotactic+Agents+to+Disrupt+Transendothelial+Migration+of+Flowing+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).</li>
<li>Smith, C. W., Rothlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+an+endothelial+determinant+for+CD+18-dependent+human+neutrophil+adherence+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration.</a> The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-leukocyte+adhesion+molecule-1-dependent+and+leukocyte+%28CD11%2FCD18%29-dependent+mechanisms+contribute+to+polymorphonuclear+leukocyte+adhesion+to+cytokine-activated+human+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium.</a> J. Immunol. 142 (7), (1989).</li>
<li>Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Each+step+during+transendothelial+migration+of+flowing+neutrophils+is+regulated+by+the+stimulatory+concentration+of+tumour+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+and+communication%22%5BJournal%5D)">Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha.</a> Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).</li>
<li>Piali, L., Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+receptor+CXCR3+mediates+rapid+and+shear-resistant+adhesion-induction+of+effector+T+lymphocytes+by+the+chemokines+IP10+and+Mig%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig.</a> European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).</li>
<li>McGettrick, H. M., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+different+sites+may+promote+or+inhibit+recruitment+of+flowing+lymphocytes+by+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells.</a> European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).</li>
<li>McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+kinetics+of+migrating+T+cells+suggest+active+retention+by+endothelial+cells+with+continual+bidirectional+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration.</a> Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).</li>
<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+differentially+regulate+neutrophil+and+lymphocyte+recruitment+through+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium.</a> Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).</li>
<li>Tull, S. P., Yates, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+Fatty+acids+and+inflammation%3A+novel+interactions+reveal+a+new+step+in+neutrophil+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment.</a> PLoS biology. 7 (8), e1000177(2009).</li>
<li>Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+D2+regulates+CD4%2B+memory+T+cell+trafficking+across+blood+vascular+endothelium+and+primes+these+cells+for+clearance+across+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium.</a> Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).</li>
<li>Bradfield, P. F., Amft, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+fibroblast-like+synoviocytes+overexpress+the+chemokine+stromal+cell-derived+factor+1+%28CXCL12%29%2C+which+supports+distinct+patterns+and+rates+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cell+migration+within+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue.</a> Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).</li>
<li>Filer, A., Parsonage, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+survival+of+leukocyte+subsets+mediated+by+synovial%2C+bone+marrow%2C+and+skin+fibroblasts%3A+site-specific+versus+activation-dependent+survival+of+T+cells+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils.</a> Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).</li>
<li>Lally, F., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+neutrophil+recruitment+in+a+coculture+model+of+the+rheumatoid+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).</li>
<li>Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro.+model+for+analysing+neutrophil+migration+into+and+away+from+the+sub-endothelial+space%3A+Roles+of+flow+and+CD31%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31.</a> Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).</li>
<li>Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Pathology+of+Atherosclerosis+Smooth+Muscle+Cells+Prime+Cocultured+Endothelial+Cells+for+Enhanced+Leukocyte+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion.</a> Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).</li>
<li>Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+regulate+neutrophil+recruitment+by+glomerular+endothelial+cells+via+IL-6-mediated+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk.</a> Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).</li>
<li>Parsonage, G., Filer, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+address+code+defined+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">A stromal address code defined by fibroblasts.</a> Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).</li>
<li>Luu, N. T., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+mesenchymal+stem+cells+and+endothelial+cells+leads+to+downregulation+of+cytokine-induced+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment.</a> Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-leukocyte+adhesion+molecules+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease.</a> Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).</li>
<li>Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endothelial+cell+surface+factor%28s%29+induced+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro.</a> 136 (12), 4548-4553 (1986).</li>
<li>Burton, V. J., Butler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+of+migrating+leukocytes+by+the+basement+membrane+deposited+by+endothelial+cells+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture.</a> Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31+Regulates+Direction+and+Rate+of+Neutrophil+Migration+over+and+under+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells.</a> Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).</li>
<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stromal+cells+on+lymphocyte+adhesion+and+migration+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells.</a> Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).</li>
<li>Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+assays+of+cell+adhesion+relevant+to+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature.</a> Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).</li>
<li>Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effects+of+stromal+cells+on+the+migration+of+lymphocytes+into+and+through+inflamed+tissue+using+3-D+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models.</a> Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Tutaj opisujemy dwa "naczyniowe" modele in vitro do badania rekrutacji krążących neutrofili przez stan zapalny śródbłonka. Główną zaletą tych modeli jest możliwość analizowania każdego kroku w kaskadzie adhezji leukocytów w kolejności, tak jak miałoby to miejsce in vivo. Wcześniej zaobserwowaliśmy zależny od dawki wzrost adhezji neutrofili i transmigracji przez stymulowany TNFα EC9,29. Opisujemy również, w jaki sposób oba modele można dostosować do badania wpływu komórek zrębu na rekrutację l...

Stan zapalny jest ochronną reakcją na infekcję mikrobiologiczną lub uszkodzenie tkanki, która wymaga ścisłej regulacji wchodzenia i wychodzenia leukocytów z tkanki objętej stanem zapalnym, aby umożliwić rozwiązanie1,2. Wzajemne oddziaływanie między komórkami śródbłonka (EC) wyściełającymi naczynia krwionośne, krążącymi leukocytami i komórkami zrębu rezydującymi w tkance jest niezbędne do koordynowania tego procesu3. Jednak niekontrolowana rekrutacja leukocytów i ich nieskuteczny klirens leżą u podstaw rozwoju przewlekłych chorób zapalnych4. Nasza obecna wiedza na temat rekrutacji leukocytów w zdrowiu i chorobie jest niekompletna i do analizy tego procesu potrzebne są bardziej solidne modele.
Mechanizmy wspomagające rekrutację leukocytów z krwi przez naczyniowe EC w żyłkach pozakapilarnych zostały dobrze opisane1,2,5. Krążące leukocyty są wychwytywane przez wyspecjalizowane receptory (np. VCAM-1, E-selektyna, selektyna P), które są regulowane w górę na śródbłonku objętym stanem zapalnym. Te przejściowe interakcje umożliwiają leukocytom interakcję z chemokinami związanymi z powierzchnią i mediatorami pochodzącymi z lipidów (pochodzenia śródbłonkowego lub zrębowego), które aktywują integryny wyrażane przez leukocyty6-11. To z kolei stabilizuje adhezję i napędza migrację przez śródbłonek do tkanki12-15. W tkance rekrutowane leukocyty są poddawane działaniu czynników pochodzenia zrębowego, które wpływają na ich ruchliwość, funkcję i przeżycie16,17. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że sygnały odbierane na każdym etapie procesu rekrutacji warunkują leukocyty na kolejny. Jednak nasza wiedza na temat rekrutacji leukocytów pozostaje niekompletna i bardzo niewiele wiadomo na temat składników kształtujących ruch leukocytów w tkance.
W Birmingham opracowaliśmy kilka modeli "naczyniowych" in vitro do badania rekrutacji leukocytów z przepływu9,18,19. Teraz rozumiemy, że EC naczyniowe działają jako bezpośrednie regulatory rekrutacji leukocytów, reagując na zmiany w ich lokalnym mikrośrodowisku. W szczególności komórki zrębu rezydujące w tkance mogą aktywnie regulować odpowiedź zapalną, częściowo poprzez rozmowę z sąsiednim naczyniowym EC w celu wpływania na ich rolę w rekrutacji3. Wcześniej wykazaliśmy, że różne komórki zrębu modulują zdolność EC do wspierania adhezji i migracji leukocytów w sposób specyficzny dla tkanki, oraz że efekty te ulegają zmianie w chorobach przewlekłych13,16,20,21. W ten sposób komórki zrębu ustanawiają tkankowe "kody adresowe", które definiują kontekst każdej reakcji zapalnej22. Niedawno wykazaliśmy, że MSC pochodzące ze szpiku kostnego (BMMSC) silnie obniżają odpowiedź EC na cytokiny, prowadząc do zmniejszenia rekrutacji zarówno neutrofili, jak i limfocytów23.
Mechanizmy rządzące rekrutacją wyjaśnione in vitro w dużej mierze wykorzystywały testy obejmujące pojedynczy typ komórki (np. EC) lub białko w izolacji. Badania te nie uwzględniają jednak wpływu lokalnego środowiska tkankowego (tj. obecności komórek zrębu) na rekrutację leukocytów i ich późniejszą migrację do tkanki. W tym miejscu opisujemy dwie metody oparte na przepływie, w których komórki zrębu, w szczególności mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), są hodowane wspólnie z EC23. Takie modele pozwalają nam zbadać wpływ komórek zrębu na odpowiedzi śródbłonka, w szczególności ich zdolność do wspierania rekrutacji leukocytów z przepływu.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza typu Ia</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Rozcieńczyć w 10 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w podwielokrotnościach 1 ml.</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>Z chlorkiem wapnia i magnezu. Przechowywać w sterylnym miejscu i przechowywać w temperaturze RT.</td></tr><tr><td>1X Średni M199</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodać do butelki M199 o pojemności 500 ml.</td></tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 10 i mikro; l podwielokrotności.</td></tr><tr><td>Surowica płodu cielęcego (FCS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>FCS musi być testowana partiami w celu zapewnienia wzrostu i żywotności wyizolowanego EC. Inaktywować termicznie w temperaturze 56 °C. Przechowywać w 10 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>Silna i staje się toksyczna w ciągu tygodnia, dlatego co tydzień należy przygotowywać świeżą, kompletną pożywkę HUVEC. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w podwielokrotnościach 1 ml.</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td>Zapas jest w etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 10 i mikro; l podwielokrotności.</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td>Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 100 i mikro; l podwielokrotności.</td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>H3631</td><td>Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 20 000 U/ml. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 100 i mikro; l podwielokrotności.</td></tr><tr><td>100 &mikro; m sitko do komórek do probówki o pojemności 50 ml</td><td>Scientific Lab Supplies (SLS)</td><td>352360</td><td>Można również stosować inne dostępne na rynku sitka komórkowe (np. Greiner bio-one).</td></tr><tr>DMEM <td>Biosura</td><td>LM-D1102/500</td> o <td>niskiej zawartości glukozy</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Mieszanina penicyliny/streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w podwielokrotnościach 1 ml.</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych o pojemności 25 ml</td><td>SLS</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych o pojemności 75 ml</td><td>SLS</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi szpiku kostnego</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Po przybyciu przechowywać w ciekłym azocie. Komórki znajdują się w przejściu 2 po przybyciu, ale są oznaczone jako przejście 0. Pobrać do przejścia 3 i przechowywać w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.</td></tr><tr><td>Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych (MSCGM)</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Ciepłe w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem. Do barwienia Cell Tracker Green użyj podłoża bez FCS.</td></tr><tr><td>Roztwór EDTA (0,02%)</td><td>Sigma</td><td>E8008</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ciepło w temperaturze 37 stopni; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny</td><td>Sigma</td><td>T4424</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach 2 ml. Rozmrozić w temperaturze pokojowej i natychmiast zużyć.</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner bio-one</td><td>2019-02</td><td>Przechowywać na lodzie przed dodaniem przed dodaniem zawiesiny komórkowej.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Sklep w RT. Podczas dodawania kriowiali z komórkami przechowywać w temperaturze -80 & deg; C przez 24 godziny przed przeniesieniem komórek do ciekłego azotu.</td></tr><tr><td>Ibidi u-Slide VI (0,4), poddany obróbce T/C, sterylny</td><td>Ibidi</td><td>IB-80606</td><td>Alternatywne modele obejmują szklane kapilary, biochipy Cellix (www.cellixltd.com), płytki BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) i komory z równoległym przepływem płytek GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).</td></tr><tr><td>Cell tracker zielony barwnik</td><td>Life technologies</td><td>C2925</td><td>Sklep w 5 i mikro; l podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć w 5 ml podgrzanego roztworu (w temperaturze 37 °C; C) MSCGM.</td></tr><tr><td>Komory do liczenia komórek</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>Alternatywnie można użyć hemocytometru.</td></tr><tr><td>Celometr automatyczny licznik komórek T4</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4-203-0238</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik martwicy nowotworu i alfa; (TNF&alfa;)</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-100</td><td>Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 100 000 U/ml. Przechowywać w temperaturze -80 &deg; C w 10 i mikro; l podwielokrotności.</td></tr><tr><td>6-dołkowy, 0,4 i mikro; m Filtry PET Transwell</td><td>SLS</td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>K2-EDTA w tubkach 10ml</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Sklep w RT.</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed użyciem ogrzać do RT.</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed użyciem rozgrzać do temperatury RT.</td></tr><tr><td>10 ml probówka z okrągłym dnem</td><td>Appleton Woods</td><td>SC211 142 AS</td><td></td></tr><tr><td>7,5% BSA Fraction V solution</td><td>Life technologies</td><td>15260-037</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Strzykawki Plastipak 20 ml</td><td>BD falcon</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Strzykawki Plastipak</td><td>BD falcon</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Strzykawki Plastipak</td><td>BD falcon</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>3M hipoalergiczna taśma chirurgiczna 9 m x 2,5 cm</td><td>Micropore</td><td>1530-1</td><td>Służy do mocowania strzykawki do ścianki komory z pleksiglasu.</td></tr><tr><td>Rurka z gumy silikonowej, średnica wewnętrzna/średnica zewnętrzna (ID/OD) 1/3 mm (cienka rurka)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB68854</td><td>Przytnij rurkę silikonową do odpowiedniego rozmiaru. Wszystkie rurki prowadzące bezpośrednio do mikrozaworu elektronicznego muszą być cienkie.</td></tr><tr><td>Rurka z gumy silikonowej ID/OD 2/4 mm (gruba rurka)</td><td></td><td>Rurka</td> manometru Fisher Scientific FB68855 <td></td></tr><tr><td>Portex Blue Line</td><td>Smiths</td><td>200/495/200</td><td>Rurka prowadząca do pompy strzykawkowej.</td></tr><tr><td>3-drogowy kran</td><td>BOC Ohmeda AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka 50 ml do pompy</td><td>Popper Micromate</td><td>550962</td><td>Przed użyciem należy go zagruntować, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Raymond A Lamb</td><td></td><td>26 x 76 mm na zamówienie. Numer działki 2440980.</td></tr><tr><td>Uszczelka parafilmowa</td><td>American National Can Company</td><td></td><td>Wytnij kawałek parafilmu o wymiarach 26 x 76 mm za pomocą aluminiowego szablonu i wytnij w nim szczelinę o wymiarach 20 x 4 mm za pomocą skalpela 10a. Grubość uszczelki wynosi około 133 &mikro;m.</td></tr><tr><td>Dwie równoległe płyty z pleksiglasu</td> Laboratorium <td></td><td>Technologii Stosowanej Wolfson</td><td>Specjalnie zaprojektowana komora składająca się z równoległych płyt połączonych ze sobą za pomocą 8. Dolna płyta ma wyciętą pośrodku szczelinę obserwacyjną oraz płytkie wgłębienie wyfrezowane tak, aby zapewnić miejsce na szkiełko nakrywkowe, filtr i uszczelkę. Górna płyta z pleksiglasu ma otwór wlotowy i wylotowy umieszczony nad kanałem przepływowym.</td></tr><tr><td>Elektroniczny mikrozawór 3-drogowy z minimalną martwą przestrzenią</td><td>Lee Products Ltd.</td><td>LFYA1226032H</td><td>Elektronicznie podłączony do 12-woltowego zasilacza prądu stałego.</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa do infuzji/pobierania (PHD2000)</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-2001</td><td>Ustaw średnicę na 29 mm i szybkość napełniania (przepływu).</td></tr><tr><td>Łącznik w kształcie litery L</td><td>Labhut</td><td>LE876</td><td>Do podłączenia do portów wlotowych i wylotowych na kanale mikrosuwakowym Ibidi.</td></tr><tr><td>Kamera wideo</td><td>Qimaging</td><td>01-QIC-F-M-12-C</td><td>Podłączona do komputera, który umożliwia nagrywanie cyfrowych filmów.</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td>Media Cybernetics</td><td>41N70000-61592</td><td>Do analizy danych. Ręcznie oznacz komórki, wyświetlając różne zachowania. Śledź komórki do analizy prędkości toczenia i migracji.</td></tr><tr><td colspan="4">Zapoznaj się z kartami katalogowymi produktów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zagrożeń związanych z używaniem opisywanych tutaj odczynników.</td></tr></tbody></table>

analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Komórki zrębu regulują rekrutację krążących leukocytów podczas stanu zapalnego poprzez wzajemne oddziaływanie z sąsiednimi komórkami śródbłonka. Tutaj opisujemy dwa "naczyniowe" modele in vitro do badania rekrutacji krążących neutrofili z przepływu przez komórki śródbłonka objęte stanem zapalnym. Główną zaletą tych modeli jest możliwość analizowania każdego kroku w kaskadzie adhezji leukocytów w kolejności, tak jak miałoby to miejsce in vivo. Opisujemy również, w jaki sposób oba modele można zaadaptować do badania roli komórek zrębu, w tym przypadku mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), w regulacji rekrutacji leukocytów.
Pierwotne komórki śródbłonka były hodowane samodzielnie lub razem z ludzkim MSC w bezpośrednim kontakcie na mikroszkiełkach Ibidi lub po przeciwnych stronach filtra Transwell przez 24 godziny. Hodowle były stymulowane czynnikiem martwicy nowotworu alfa (TNFα) przez 4 godziny i włączone do testu adhezji opartego na przepływie. Bolus neutrofili był perfundowany przez śródbłonek przez 4 minuty. Uchwycenie przepływających neutrofili i ich interakcji ze śródbłonkiem uwidoczniono za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
W obu modelach, stymulacja cytokinami zwiększała rekrutację śródbłonka przepływających neutrofili w sposób zależny od dawki. Analiza zachowania rekrutowanych neutrofili wykazała zależny od dawki spadek toczenia i zależny od dawki wzrost transmigracji przez śródbłonek. W kohodowli MSC hamowało adhezję neutrofili do śródbłonka stymulowanego TNFα.
Nasze modele adhezji oparte na przepływie naśladują początkowe fazy rekrutacji leukocytów z krążenia. Oprócz leukocytów można je wykorzystać do badania rekrutacji innych typów komórek, takich jak terapeutycznie podawane MSC lub krążące komórki nowotworowe. Nasze wielowarstwowe modele współhodowli wykazały, że MSC komunikuje się ze śródbłonkiem, modyfikując ich odpowiedź na cytokiny prozapalne, zmieniając rekrutację neutrofili. Konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem takich modeli, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób komórki zrębu z różnych tkanek i stanów (zaburzenia zapalne lub nowotwory) wpływają na rekrutację leukocytów podczas stanu zapalnego.

Wstępnie przeanalizowano wpływ stymulacji EC za pomocą TNFα na rekrutację neutrofili z przepływu z wykorzystaniem modelu mikropreparatów Ibidi (Sekcja 7 - 9). W przypadku braku TNFα do monowarstwy śródbłonka przylegało niewiele lub wcale neutrofili (Rysunek 2A). Było to spodziewane, ponieważ nieleczone/spoczynkowe EC nie wykazują ekspresji niezbędnych cząsteczek adhezyjnych (selektyn) ani chemokin wspierających wiązanie25,26. W przeciwieństwie do tego, stymulacja cytokinami zn...

Zdolność śródbłonka w stanie zapalnym do rekrutacji leukocytów z przepływu jest regulowana przez mezenchymalne komórki zrębu. Opisujemy dwa modele in vitro obejmujące pierwotne komórki ludzkie, które można wykorzystać do oceny rekrutacji neutrofili na podstawie przepływu i zbadania roli, jaką mezenchymalne komórki zrębu odgrywają w regulacji tego procesu.

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie, w jaki sposób komórki rezydujące w tkankach wpływają na zdolność komórek śródbłonka naczyniowego do wspierania rekrutacji leukocytów podczas stanu zapalnego. Cel ten jest realizowany poprzez uprzednie utworzenie kokultur komórek śródbłonka z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi z wykorzystaniem jednego z dwóch modeli naczyniowych in vitro: modelu mikroslajdowego lub modelu filtracyjnego. Następnie kultury te są traktowane cytokinami przed przeprowadzeniem analizy przepływowej.Następnie system adhezji oparty na przepływie jest montowany krok po kroku, z wprowadzeniem modyfikacji w zależności od stosowanego modelu systemowego. Ostatnim etapem jest perfuzja leukocytów nad komórkami śródbłonka i obserwacja ich rekrutacji z przepływu oraz ich późniejszego zachowania. W efekcie te wielokomórkowe testy adhezji oparte na przepływie wykazały, że interakcje między mezenchymalnymi komórkami macierzystymi a komórkami śródbłonka hamują rekrutację neutrofili podczas stanu zapalnego.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ruchu leukocytów, takie jak: w jaki sposób komórki tkankowe, na przykład mezenchymalne komórki ma

analyzing-effects-stromal-cells-on-recruitment-leukocytes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza wpływu komórek stromy na rekrutację leukocytów z przepływu

Ten film demonstruje test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować interakcję leukocytów i partnerów komórkowych, takich jak komórki śródbłonka. Metoda ta zapewnia dynamiczny wgląd w adhezję, martwość i transmigrację leukocytów po perfuzji przez nienaruszoną i zlewającą się warstwę komórek naczyniowych.

Test oparty na przepływie laminarnym do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka

Film demonstruje metodę badania wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów. W modelu komory z przepływem równoległym cytokiny prozapalne indukują ekspresję receptorów adhezyjnych przez komórki śródbłonka, ułatwiając rekrutację i migrację neutrofili. Wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu a komórkami śródbłonka zmniejsza rekrutację neutrofili do komórek śródbłonka.

Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Komórki strefy brzeżnej B (MZB) reagują na siłę przepływu ścinającego, reorientując swoją ścieżkę migracji w górę przepływu. Protokół ten pokazuje, jak rejestrować i analizować migrację za pomocą jednostki fluidyki, pompy, systemu obrazowania mikroskopowego i bezpłatnego oprogramowania.

Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Poznaj wpływ komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu w modelach in vitro. Ta metoda pozwala badać interakcje między komórkami śródbłonka a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi podczas stanu zapalnego.

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

Przeglądaj więcej filmów