Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie, w jaki sposób komórki rezydujące w tkankach wpływają na zdolność komórek śródbłonka naczyniowego do wspierania rekrutacji leukocytów podczas stanu zapalnego. Cel ten jest realizowany poprzez uprzednie utworzenie kokultur komórek śródbłonka z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi z wykorzystaniem jednego z dwóch modeli naczyniowych in vitro: modelu mikroslajdowego lub modelu filtracyjnego. Następnie kultury te są traktowane cytokinami przed przeprowadzeniem analizy przepływowej.

Następnie system adhezji oparty na przepływie jest montowany krok po kroku, z wprowadzeniem modyfikacji w zależności od stosowanego modelu systemowego. Ostatnim etapem jest perfuzja leukocytów nad komórkami śródbłonka i obserwacja ich rekrutacji z przepływu oraz ich późniejszego zachowania. W efekcie te wielokomórkowe testy adhezji oparte na przepływie wykazały, że interakcje między mezenchymalnymi komórkami macierzystymi a komórkami śródbłonka hamują rekrutację neutrofili podczas stanu zapalnego.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ruchu leukocytów, takie jak: w jaki sposób komórki tkankowe, na przykład mezenchymalne komórki macierzyste, modyfikują ten proces? Czy proces ten ulega zmianie w przebiegu chorób, takich jak przewlekły stan zapalny lub nowotwory? Czy możemy wykorzystać tę wiedzę, aby pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych? Aby rozpocząć, należy utworzyć kokultury komórek śródbłonka z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, korzystając z modelu mikroslajdka lub modelu filtracyjnego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, w celu zestawienia systemu przepływowego.

W pierwszej kolejności należy włączyć podgrzewacz i ustawić temperaturę na 37 °C. Następnie do zaworu trójdrożnego należy podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml bez tłoka oraz strzykawkę o pojemności 5 ml. W kolejnym kroku należy odmierzyć i odciąć długi odcinek rurki o średnicy 2,4 mm, którego długość odpowiada w przybliżeniu odległości między zaworem a kranem trójdrożnym.

Odetnij odcinek rurki o średnicy 1,3 mm o długości od 8 do 10 mm i włóż go w jeden koniec grubszej rurki. Przymocuj koniec z grubszą rurką do zaworu trójdrożnego i podłącz koniec cieńszej rurki do portu elektronicznego mikrozaworu trójdrożnego, aby utworzyć zbiornik do płukania.

Następnie przymocuj kran do komory z pleksi za pomocą taśmy micropore. Dalej, odetnij kawałek grubej i cienkiej rurki o długości od sześciu do ośmiu milimetrów, a następnie włóż cienką rurkę do jednego końca grubej rurki. Przymocuj koniec grubej rurki do strzykawki o pojemności 2 mL pozbawionej tłoka.

Teraz należy podłączyć koniec cienkiej rurki strzykawki o pojemności dwóch mililitrów do portu w elektronicznym mikrozaworze, aby stworzyć zbiornik na próbkę. Następnie należy odmierzyć i odciąć długi odcinek cienkiej rurki o długości odpowiadającej odległości między mikrozaworem a środkiem stolika mikroskopu. W przypadku modelu z mikropreparatem, należy do końca cienkiej rurki dołączyć odcinek grubej rurki o długości od 8 do 10 milimetrów.

Następnie należy przymocować łącznik w kształcie litery L do końca grubszej rurki. Służy on do połączenia z mikropreparatem lub modelem filtra. Do końca cieńszej rurki należy przyłączyć odcinek rurki łączącej manometru Portex blue line o długości od 8 do 10 mm.

Następnie nałóż koniec cienkiej rurki na mikrozawór. Rurka ta stanie się wspólnym wyjściem dla zbiorników z płukaniną i próbką. Napełnij zbiorniki solą fizjologiczną buforowaną fosforanem z dodatkiem albuminy surowicy bydlęcej.

Napełnij przewody roztworem PBSA, przepuszczając go w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie podłącz przewód manometru do szklanej strzykawki o pojemności 50 milliliter. W przypadku modelu mikro-slajdu podłącz do końca przewodu manometru prowadzącego do szklanej strzykawki jedynie odcinek grubej rurki o długości od 10 do 12 millimeter. Na końcu grubej rurki zamocuj łącznik w kształcie litery L.

Przygotuj strzykawkę, napełniając ją 10 mililitrami PBSA. Odwróć strzykawkę tak, aby koniec połączony z drenem był skierowany do góry, i usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie ponownie napełnij ją pięcioma mililitrami PBSA. Na koniec umieść szklaną strzykawkę w pompie strzykawkowej w celu infuzji i odprowadzania cieczy.

Ustaw prędkość przepływu i średnicę szklanej strzykawki, aby przygotować mikroprzesuwniki do przepływu. Umieść mikroprzesuwnik na stoliku odwróconego mikroskopu fazokontrastowego. Przekręć zawór trójdrożny, aby dopuścić przepływ PBSA przez rurkę wlotową.

Podłącz złącze w kształcie litery L do portu wlotowego kanału mikropreparatu. Następnie umieść złącze w kształcie litery L z pompy strzykawkowej w porcie wylotowym kanału. Usuń wszelkie krople PBSA, które dostały się na mikropreparat.

Alternatywnie, w przypadku modelu z filtrem, należy najpierw wyciąć kawałek parafilmy o tym samym rozmiarze co szkiełko podstawowe, korzystając z metalnego szablonu. Następnie, używając metalnego szablonu, należy wyciąć w parafilmie szczelinę o wymiarach 20 na cztery milimetry, aby utworzyć kanał przepływowy. Użyj uszczelki z parafilmy, aby zaznaczyć kanał przepływowy na szkiełku podstawowym.

Dopasuj krawędzie filtra do szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że filtr zakrywa oznaczenia kanału przepływowego. Ostrożnie wytnij filtr, używając skalpela typu 10.

Następnie ostrożnie przykryj filtr uszczelką z paraformy, upewniając się, że szczelina kanału przepływowego znajduje się na środku filtra. Używając czystej chusteczki, wypchnij wszelkie pęcherzyki powietrza. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe w zagłębieniu dolnej płyty pleksiglasowej komory przepływowej.

Ustaw górną płytkę z pleksiglasu nad uszczelką i skręć obie płytki. Przekręć kran trójdrożny, aby umożliwić przepływ buforu płuczącego PBSA przez zawór. Następnie podłącz przewód manometru do wlotu górnej płytki z pleksiglasu.

Przepuść PBSA przez kanał przepływowy, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie podłącz dren manometru z pompy strzykawkowej do portu wylotowego płyty z pleksiglasu. Zetrzyj cały PBSA, który ściekł na górną płytę komory.

Na koniec umieść komorę na stoliku odwróconego mikroskopu fazowego i dostrój ostrość, aby zwizualizować komórki śródbłonka nad filtrami w celu perfuzji leukocytów nad komórkami śródbłonka. Ustaw pompę strzykawkową w trybie napełniania i naciśnij przycisk start po ustawieniu ostrości. Aby zwizualizować monowarstwę komórek śródbłonka, wlej dwa mililitry oczyszczonych neutrofili do zbiornika na próbkę i pozostaw do ogrzania na dwie minuty.

Następnie przemyj śródbłonek PBSA przez dwie minuty. Otwórz zawór, aby przeprowadzić perfuzję neutrofili nad śródbłonkiem. Podawaj bolus neutrofili przez cztery minuty.

Zamknij zawór i perfunduj PBSA z zbiornika do płukania przez pozostałą część eksperymentu. Podczas przeprowadzania eksperymentu upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie przedostaną się w żadnym momencie podczas analizy, ponieważ zakłóci to monowarstwę komórek śródbłonka i spowoduje odrywanie się przylegających neutrofili. Rejestrację rekrutacji neutrofili przeprowadź albo podczas przepływu neutrofili, albo po perfuzji, korzystając z oprogramowania do cyfrowego przechwytywania obrazów.

Zlokalizuj środek kanału, przesuwając obiektyw do krawędzi kanału przy porcie wlotowym i wyznaczając środek portu. Wykonaj wszystkie rejestracje cyfrowe z co najmniej pięciu do 10 pól w centrum kanału przepływowego lub rejestracje podczas przepływu neutrofili. Wykonuj obrazy pojedynczego pola co 10 sekund przez jedną minutę, a następnie przesuń się wzdłuż kanału i rejestruj kolejne pole przez jedną minutę.

Powtórz ten proces przez cały czas trwania bolusa w celu zarejestrowania etapu po perfuzji. Wykonaj dziesięciosekundowy zapis z pięciu do 10 pól wzdłuż centrum kanału przepływowego w celu oceny zachowania leukocytów. Pobieraj obrazy co sekundę w ramach tego dziesięciosekundowego odstępu.

Zapewnia to wystarczająco dużo czasu na przechwycenie komórek z przepływu oraz analizę zachowania adherentnych neutrofili. Przez pięć minut rejestruj pojedyncze pole zawierające co najmniej 10 neutrofili, które dokonały transmigracji, wykonując zdjęcia co 30 sekund. W celu obliczenia prędkości migrowanych komórek można zarejestrować kolejną serię pól w odstępach dziesięciosekundowych.

Pozwala to neutrofilom na migrację przez monowarstwę śródbłonka. Na koniec zatrzymać pompę strzykawkową, usunąć rurkę wylotową, a następnie rurkę wlotową, rozmontować komorę przepływową i wypłukać zbiornik z próbką za pomocą PBSA; powtórzyć czynność dla kolejnych filtrów i kanałów mikropłytek przed przejściem do analizy rekrutacji i zachowania leukocytów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W modelu mikropłytki stymulacja cytokinami za pomocą czynnika martwicy nowotworów alfa znacząco zwiększyła adhezję neutrofili do śródbłonka w sposób zależny od dawki.

Ponadto zaobserwowano zależny od dawki spadek poziomu TNF alpha w odniesieniu do odsetka neutrofili toczących się po powierzchni śródbłonka. Przełożyło się to na zależny od dawki wzrost poziomu TNF alpha oraz odsetka neutrofili migrujących przez monowarstwę śródbłonka, a tym samym dokonujących transendotelialnej migracji. Podobne wyniki uzyskano w teście przepływowym z wykorzystaniem filtra.

Na przykład stymulacja TNF alpha zwiększyła adhezję neutrofili w sposób zależny od dawki. Ko-kultura komórek śródbłonka z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z szpiku kostnego znacząco zredukowała adhezję neutrofili w porównaniu do samych komórek śródbłonka. Hodowle monokulturowe przebiegały zgodnie z oczekiwaniami dla modelu na płytce mikroskopowej.

Ponownie zaobserwowano podobne efekty przy zastosowaniu modelu opartego na filtrze, przy czym w przypadku ko-kultury odnotowano mniejszą adhezję niż w monokulturze. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak badać komunikację komórek zrębowych z komórkami śródbłonka w celu określenia ich wpływu na rekrutację leukocytów podczas stanu zapalnego.