Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie symulacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetycznych rdzenia drożdży, NDC 10 i NDC 80. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie komórek drożdży, które wyrażają flagę syku oznaczoną SMT trzy i MT oznaczoną NDC 10 lub NDC 80, i wytworzenie ekstraktów białkowych z tych komórek. Drugim krokiem jest oczyszczenie trzech koniugatów SMT oznaczonych flagą syczącą w celu wykrycia sumowania lub immunowytrącenia białek rdzenia kinetycznego mik tagg w celu wykrycia ubikwitynacji.

Następnie sumowanie lub ubikwitynacja jest wykrywana za pomocą analizy western blot. Ostatecznie obecność wzorca drabinkowego dla NDC 10 i NDC 80 potwierdza, że białka te są symulowane i ubikwitynowane. Opisana metoda oczyszczania białek pozwala na wykrycie zarówno symulacji, jak i ubikwitynacji białek connico ND C 10 i NDC 80 w pączkujących drożdżach.

Moja cci. Główną zaletą tej techniki jest to, że stworzony przez nas szczep ma dwa ataki epitopowe, jeden na badane białko, a drugi pozwalający na wykrycie symulacji. Użycie tych znaczników zmniejsza tło ze względu na reaktywność krzyżową, która jest często obserwowana, gdy stosuje się surowicę poliklonalną.

Demonstracja tej procedury zostanie przeprowadzona przez Canero Uni, pracownika naukowego w moim laboratorium. Interesujące nas białka zostaną wyekstrahowane z przygotowanych wcześniej granulek komórek drożdży i przechowywanych w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Resus, zawieś komórki w 0,5 mililitra lodowatego buforu.

Użyj buforu gwinejowego, jeśli ekstrakt jest przeznaczony do testu ściągającego przy użyciu nitrylu niklu, kwasu trioctowego lub kulek niklowych NTA superflow. Użyj buforu A, jeśli ekstrakt jest przeznaczony do immunoprecypitacji. Utrzymuj probówki na lodzie przez cały czas.

Przenieś zawiesiny komórek na dwa mililitry. Przykręć nakrętkę po dwie do każdej tuby. Dodaj objętość szklanych koralików równą objętości koralika zawiesiny komórek.

Ubijaj komórki w mini ubijaku do koralików przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieść rurki na lodzie na dwie do trzech minut. Powtórz trzykrotne ubijanie koralików i oblew. Wiruj z dużą prędkością w czterech stopniach Celsjusza przez 30 do 60 minut.

Sprawdź komórki poprzez wizualizację pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są zmielone. Zlizowane komórki będą wyświetlane jako ciemne duchy i nie będą miały granicy ani określonego kształtu. Optymalnie co najmniej 80% komórek powinno być wykłamanych.

Następnie za pomocą pinezki przebij otwór w dnie rurki. Umieść luźno nakrętkę i umieść rurkę w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Wirować przy 1000 razy G przez jedną minutę.

Aby zebrać lizat, przenieś lizat do wirówki z mikrowirówką o temperaturze 15 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać wyekstrahowane białka. Po zmierzeniu stężenia wyekstrahowanych białek za pomocą zestawu do oznaczania białek, znormalizuj wszystkie ekstrakty, tak aby każdy zawierał taką samą ilość białka. Doprowadzić całkowitą objętość do jednego mililitra za pomocą odpowiedniego buforu.

Około pięciu miligramów białka całkowitego uzyskuje się z 50 OD 600 komórek. Zaoszczędź 50 mikrolitrów wyekstrahowanego białka jako ekstraktu z całej komórki. Pozostałe 950 mikrolitrów ekstraktu białkowego zostanie później wykorzystane do oczyszczania białek lub immunoprecypitacji białek znakowanych MT.

Dodaj 50 mikrolitrów dwóch x laly buforu do 50 mikrolitrów ekstraktu z całych komórek. Inkubować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez trzy do pięciu minut przed analizą za pomocą western blot. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania niklowych kulek przelających NTA niezbędnych do oczyszczenia.

Uzyskać ilość kulek potrzebną do wirowania na niskiej prędkości przez jedną minutę. Usunąć supernatant i umyć kulki PBS. Dodaj jeden mililitr PBS i odwróć rurkę od góry do dołu, aż kulki zostaną ponownie zawieszone.

Zebrać kulki przez wirowanie na niskiej prędkości i usunąć supernatant. Umyj koraliki w ten sposób w sumie pięć razy. Zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu gwinicznego i podzielić je na liczbę probówek odpowiadającą próbkom, które mają być przetworzone.

Zebrać kulki przez odwirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant z każdej próbki. Dodaj 950 mikrolitrów ekstraktu z całych komórek. Przygotowane wcześniej do 100 mikrolitrów koralików.

Wysiaduj na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny lub noc. Wirować w temperaturze od 800 do 1500 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zaoszczędź 50 mikrolitrów supernatantu.

Dodaj 50 mikrolitrów dwóch x bufor do próbki laly do tego supernatantu i inkubuj w temperaturze 100 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez trzy do pięciu minut. 10 mikrolitrów każdej próbki zostanie później przeanalizowanych za pomocą Western Blot. Umyj niklowe kulki NTA superflow raz jednym mililitrem bufora guine przez pięć do 10 minut na bujanej platformie w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyj kulki pięć razy jednym mililitrem buforu łamliwego po ostatnim płukaniu buforem łamiącym, ponownie zasmów kulki w 90 mikrolitrach dwóch x laly buforu do próbek. Dodaj 10 mikrolitrów jednego molowego iol, aby pomóc oddzielić oznakowane przez niego białko od niklu NT. Koraliki inkubuje się w temperaturze 100 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez trzy do pięciu minut. Następnie wirować przy 13 000 razy G przez 30 sekund.

Przenieść supernatant do świeżej probówki. Aby rozpocząć tę procedurę, należy uzyskać niezbędną ilość przeciwciała przeciwko żelowi anty CMIC aero affinity przez wirowanie z niską prędkością. Usunąć supernatant, umyć żywicę buforem A Dodaj jeden mililitr buforu A i odwróć górę nad dołem, aż żywica zostanie ponownie zawieszona.

Zebrać żywicę przez wirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant. Umyj w sumie pięć razy. Zawiesić żywicę w jednym mililitrze buforu A i poddzielić do liczby probówek odpowiadającej próbkom, które mają być przetworzone.

Zebrać żywicę przez wirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant. Dodaj 950 mikrolitrów ekstraktu z całych komórek do 25 mikrolitrów żywicy Inkubuj na platformie bujanej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego dnia. Wirować w temperaturze od 800 do 1500 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zaoszczędź 50 mikrolitrów supernatantu. Dodać 50 mikrolitrów dwóch x płaskich do próbek do tego supernatantu i inkubować w temperaturze 100 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez trzy do pięciu minut. Umyj żywicę buforem i dodaj jeden mililitr buforu, odwróć górę na dole, aż żywica zostanie ponownie zawieszona.

Zebrać żywicę przez odwirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant po usunięciu supernatantu z końcowego płukania. Zawiesić żywicę w 100 mikrolitrach buforu próbki sumy, inkubować w temperaturze 100 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez trzy do pięciu minut. Następnie wirować przy 13 000 razy G przez 30 sekund.

Przenieść supernatant do świeżej probówki. Na koniec załaduj wszystkie próbki pobrane z tego protokołu. Na stronie SDS, żelu do analizy Western blot, szczepy drożdży, które wyrażają flagę polihistaminy oznaczone SMT trzy lub HF SMT trzy i MT oznaczone NDC 80 i NDC 10, zostały użyte do wykrycia symulacji białek kinetycznych.

Trzy substraty HF SMT oczyszczono pod kątem powinowactwa za pomocą kulek niklowych i wykryto za pomocą przeciwciała Anti-Flag. Sumaryzowany NDC 80 wykryto w trzech substratach HF SMT podczas sondowania przeciwciałem anty micowym. Brak zmodyfikowanych białek w szczepach kontrolnych bez HF SMT 3 wskazuje na specyficzność interakcji między HF SMT 3 a jego białkami docelowymi.

Co więcej, sumowanie NDC 80 i NDC 10 jest zmniejszone w komórkach poddanych działaniu NOCO w celu wykrycia ubikwitynacji NDC 80 i NDC 10. Mick oznaczył ND C 80 lub ND C 10 był wytrącony immunologicznie, a analizę western blot przeprowadzono z przeciwciałami anty mic i anty ubikwityną, analiza ekstraktu z całych komórek i supernatantu potwierdziła ekspresję NDC 80 M i NDC 10 M Próbki wytrącone immunologicznie z anty MIC wykazały wiele pasm o wysokiej masie cząsteczkowej, co sugeruje, że NDC 80 i NDC 10 zawierają modyfikacje potranslacyjne. Wzorzec drabinkowy próbek wytrąconych immunologicznie badanych z anty ubikwityną wykazał, że ND C 80 i ND C 10 są ubikwitynowane.

Wzorce drabinkowania NDC 80 i NDC 10 zostały wzmocnione przez leczenie inhibitorem proteasomu MG 1 32. Dalsze potwierdzenie, że reprezentują one poliubikwitynację Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć technikę oczyszczania białek, która umożliwia wykrycie macji i szczepienie nietoperzy NN.