Name: Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania białek do wykrywania sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochoru Ndc10 i Ndc80 u drożdży Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia badanie modyfikacji potranslacyjnych kluczowych dla podziału komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Oliverowi Kerscherowi za wsparcie i rady oraz członkom laboratorium Basrai za wsparcie i komentarze do artykułu. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. Wzrost komórek drożdży
<ol>
	<li>Zaszczepić komórki drożdży w 30 ml YPD (Tabela 1) w małej kolbie. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, wstrząsając.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do gęstości optycznej 0,2 przy 600 nm (OD600 = 0,2) w 50 ml YPD i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.</li>
	<li>Hoduj kulturę do gęstości optycznej 1,0 przy 600 nm (OD600 = 1,0).</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 2 000 x g i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 40 ml sterylnej wody i wirować przez 5 minut przy 2 000 x g w celu umycia komórek. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białek
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml lodowatego buforu guanidyny (Tabela 1) w celu przeprowadzenia testu ściągającego przy użyciu kulek przelewowych Ni-NTA lub buforu A (Tabela 1) do immunoprecypitacji. Trzymaj probówki na lodzie przez cały czas.</li>
	<li>Przenieść do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Dodaj taką samą objętość szklanych koralików (Tabela materiałów).</li>
	<li>Ubijaj komórki w mini ubijaku do koralików (tabela materiałów) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieść na lodzie na 2-3 minuty. Powtórz to trzy razy.</li>
	<li>Wirować na wysokich obrotach w temperaturze 4 °C przez 30-60 min. Sprawdź komórki poprzez wizualizację pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są zmielone. 
	Uwaga: Zlizowane komórki będą wyświetlane jako ciemne duchy i nie będą miały obwiedni ani zdefiniowanego kształtu. Optymalnie co najmniej 80% komórek powinno być poddanych lizie.</li>
	<li>Nakłuć otwór w dnie probówki za pomocą pinezki i umieścić w stożkowej tubce o pojemności 15 ml (nakrętka powinna być luźna).</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu zebrania lizatu.</li>
	<li>Przenieś lizat do mikroprobówki wirówkowej.</li>
	<li>Wirować przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania wyekstrahowanych białek.</li>
	<li>Zmierz stężenie wyekstrahowanych białek za pomocą zestawu do oznaczania białek (tabela materiałów) i znormalizuj wszystkie ekstrakty, aby zawierały taką samą ilość białka. Doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą odpowiedniego buforu. 
	Uwaga: Około 5 mg białka całkowitego uzyskuje się z 50 OD600 komórek.</li>
	<li>Zaoszczędź 50 μl (250 μg białka, jeśli całkowita zawartość białka wyekstrahowana z kroku 2.10 wynosi 5 mg) jako ekstrakt z całych komórek (WCE). Dodać 50 μl 2x bufor do próbek Laemmli (tabela 1) i inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut. Załadować 10 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie koniugatów HF-Smt3
<ol>
	<li>Otrzymać kulki przepływowe Ni-NTA (Tabela materiałów) niezbędne do eksperymentów (100 μl kulek na próbkę) przez wirowanie z niską prędkością (800-1 500 x g) przez 1 min. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Umyj kulki 5x 1 ml PBS (Tabela Materiałów): Odwróć góra nad dołem, aż kulki zostaną ponownie zawieszone, zbierz kulki przez wirowanie na niskiej prędkości i usuń supernatant.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 1 ml buforu guanidynowego (tabela 1) i podzielić je na liczbę probówek odpowiadającą próbkom, które mają być przetworzone. Zebrać kulki przez wirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant. Dobrze wymieszaj koraliki, odwracając góra na dół. 
	Uwaga: Dobrze wymieszaj koraliki, odwracając górę na dół.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 950 μl pozostałego WCE (z Kroku 2.11: Ekstrakcja białek) do 100 μl kulek przepływowych Ni-NTA.</li>
	<li>Inkubować na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Wirować przy 800-1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zaoszczędź 50 μl jako supernatant (SUP). Dodać 50 μl 2x buforu do próbek Laemmli i inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut. Załadować 10 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).</li>
	<li>Płukać kulki jednorazowo 1 ml buforu guanidyny przez 5-10 min na bujanej platformie.</li>
	<li>Płukać koraliki 5x 1 ml buforu łamiącego (Tabela 1) przez 5-10 min na bujanej platformie.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 90 μl 2x bufora do próbek Laemmli.</li>
	<li>Dodać 10 μl 1 M imidazolu. 
	Uwaga: Imidazol pomaga oddzielić białko znakowane Hisem od kulek Ni-NTA ze względu na konkurencyjną interakcję między imidazolem a kulkami.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut.</li>
	<li>Wirować, a następnie odwirowywać przy 13 000 x g przez 30 sekund. Przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Załadować 10-20 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot). 
	Uwaga: 10-20 μl odpowiada 0,5-1,0 mg wkładu, jeśli stosuje się 5 mg WCE.</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja białek kinetochorowych znakowanych Myc
<ol>
	<li>Otrzymać przeciwciało w żelu o powinowactwie do agarozy anty-c-Myc (tabela materiałów) niezbędne do eksperymentów (25 μl żywicy na próbkę) przez odwirowanie na niskiej prędkości (800-1,500 x g). Usunąć supernatant.</li>
	<li>Przemyć żywicę 5x 1 ml buforu A: Odwrócić od góry do dołu, aż żywica zostanie ponownie zawieszona, zebrać żywicę przez odwirowanie na niskiej prędkości i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić żywicę w 1 ml buforu A i podzielić je na liczbę probówek odpowiadającą próbkom, które mają być przetworzone. Zebrać żywicę przez wirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant. 
	Uwaga: Dobrze wymieszaj żywicę, odwracając górę nad dołem.</li>
	<li>Dodać 950 μl pozostałego WCE (z Kroku 2.11: Ekstrakcja białek) do 25 μl żywicy.</li>
	<li>Inkubować na platformie bujanej w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Wirować przy 800-1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zaoszczędź 50 μl jako supernatant (SUP). Dodać 50 μl 2x buforu do próbek Laemmli i inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut. Załadować 10 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).</li>
	<li>Przemyć żywicę 5x 1 ml buforu A: Odwrócić od góry do dołu, aż żywica zostanie ponownie zawieszona, zebrać żywicę przez odwirowanie na niskiej prędkości i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić żywicę w 100 μl buforu do próbek SUMEB (tabela 1). 
	Uwaga: Bufor do próbek SUMEB zawiera 8 M mocznika i 1 % SDS (silne warunki denaturacji).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut.</li>
	<li>Wirować, a następnie odwirowywać przy 13 000 x g przez 30 sekund. Przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Załadować 10-20 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot). 
	Uwaga: 10-20 μl odpowiada 0,5-1,0 mg wkładu, jeśli stosuje się 5 mg WCE.</li>
</ol>
5. Analiza Western Blot
<ol>
	<li>Załaduj ekstrakty białkowe na 4-12% żele Bis-Tris (Tabela materiałów) i wykonuj elektroforezę pod napięciem 120 V przez 90 minut (Bieżący bufor: Tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieść białka z żelu do membrany nitrocelulozowej (tabela materiałów) za pomocą aparatu transferowego pod napięciem 30 V przez 90 minut (Bufor transferowy: tabela materiałów).</li>
	<li>Zablokuj membranę w 5% mleku/1x TBST (Tabela 1) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym (tabela materiałów) w 5% mleku/1x TBST przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych należy użyć rozcieńczenia 1:1,000 (przeciwciała anty-Flag i anty-Ub) lub 1:5,000 (przeciwciało anty-Myc).</li>
	<li>Umyj membranę 3x po 10 minut za pomocą 1x TBST.</li>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (tabela materiałów) w 5% mleku/1x TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Stosować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowe w stosunku 1:5 000.</li>
	<li>Umyj membranę 3x po 10 minut za pomocą 1x TBST.</li>
	<li>Inkubować błonę z roztworem roboczym ECL (tabela materiałów) przez 5 minut.</li>
	<li>Wystaw membranę na działanie wrażliwej na kolor niebieski filmu rentgenowskiego (tabela materiałów) i wywołaj za pomocą automatycznego wywoływacza (tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mub1%2FUbr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216(2013).</li>
<li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li>
<li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li>
<li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li>
<li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+controls+HEC1+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li>
<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczniki epitopów, takie jak HA, Myc, Flag i GST, są szeroko stosowane do analizy biochemicznej białek. Budowa szczepów z białkami kinetochorowymi znakowanymi HF-Smt3 i Myc, takimi jak Ndc10 i Ndc80, ułatwia wykrywanie PTM, takich jak sumoilacja i ubikwitynacja. Test ściągania HF-Smt3 umożliwia wykrycie sumoilowanych białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80 (ryc. 1). Protokół oczyszczania powinowactwa i analiza western blot przy użyciu przeciwciała anty-Flag ustalają specyficzność interakcji między HF-Smt3...

Ubikwitynacja i sumoilacja pozwalają na koniugację ubikwityny i małego modyfikatora podobnego do ubikwityny (SUMO; Smt3 w S. cerevisiae 1) odpowiednio do białka docelowego. PTM białek kinetochorowych wpływają na ich poziomy komórkowe i interakcje białko-białko podczas różnych faz cyklu komórkowego, aby zapewnić wierną segregację chromosomów. Na przykład poziomy komórkowe Cse4/CENP-A i zewnętrznego białka kinetochorowego Dsn1 są regulowane przez proteolizę za pośrednictwem ubikwityny w celu zapewnienia stabilności genomu 2-5. Destabilizacja nieprawidłowych przyłączeń kinetochor-mikrotubula wymaga kinazy Ipl1/Aurora B, która fosforyluje kompleksy Dam1 i Ndc80, które bezpośrednio oddziałują z mikrotubulami 6-8. Pomimo zidentyfikowania ponad siedemdziesięciu białek kinetochorowych, istnieje bardzo niewiele badań, które badają modyfikacje tych białek za pomocą PTM, np. ubikwityny i SUMO. Głównym ograniczeniem jest zdolność do zachowania PTM podczas oczyszczania i niedostatek niestandardowych przeciwciał do wykrywania PTM, takich jak sumoilacja, fosforylacja, metylacja i inne. Charakterystyka sumoilowanych białek kinetochoru Ndc10, Cep3, Bir1 i Ndc80 wykorzystała niestandardowe przeciwciało 9. Ponadto Ndc10 został uznany za substrat dla ubikwitynacji 10. Ludzki Hec1 (Ndc80 w S. cerevisiae) jest również substratem ubikwitynacji, regulowanym przez ligazę APC/C-hCdh1 E3 11. Dlatego Ndc10 i Ndc80 są dobrymi kandydatami do optymalizacji protokołu w celu wykrywania zarówno sumoilacji, jak i ubikwitynacji u S. cerevisiae.
Aby ułatwić identyfikację sumoilacji, skonstruowaliśmy szczepy, które wyrażają HF-Smt3 i Ndc10 lub Ndc80 oznaczone Myc. Zastosowanie znaczników epitopowych (HF: His6-Flag) minimalizuje tło ze względu na reaktywność krzyżową, która jest często obserwowana w surowicy poliklonalnej podniesionej przeciwko białku kandydującemu. Opracowaliśmy protokół oczyszczania koniugatów HF-Smt3 z powinowactwem, a następnie użyliśmy komercyjnych przeciwciał anty-Flag i anty-Myc do wykrycia obecności sumoliowanych Ndc10 i Ndc80 w oczyszczonym preparacie Smt3. W celu ubikwitynacji opracowaliśmy zmodyfikowany protokół immunoprecypitacji, który zachowuje ubikwitynację białek kinetochorowych znakowanych Myc i przeprowadziliśmy analizę western blot z komercyjnym przeciwciałem anty-Ub w celu wykrycia ubikwitynacji Ndc10 i Ndc80.

<table><tbody><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Produkty BioSpec</td><td>11079105</td><td>średnicy 0,5 mm</td></tr><tr><td>Mini bijak do koralików</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8-komórkowy zakłócacz</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc żel powinowactwa do agarozy produkowany w króliku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-Flag M2 wytwarzane u myszy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało c-Myc (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało mysie monoklonalne 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubikwityna (P4G7) przeciwciało monoklonalne</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL IgG królika, całe Ab GE sprzężone z HRP</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mysie IgG, całe Ab sprzężone z HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>Test białka DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0,45 mm wielkość porów</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1,0 mm, 10 dołków</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>Bufor transferowy NuPAGE</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska wrażliwa folia rentgenowska</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny wywoływacz</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży ndc10 i ndc80

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Modyfikacje potranslacyjne (PTM), takie jak fosforylacja, metylacja, acetylacja, ubikwitynacja i sumoilacja, regulują funkcję komórkową wielu białek. PTM białek kinetochorowych, które wiążą się z centromerowym DNA, pośredniczą w wiernej segregacji chromosomów w celu utrzymania stabilności genomu. Podejścia biochemiczne, takie jak spektrometria mas i analiza western blot, są najczęściej stosowane do identyfikacji PTM. W tym miejscu opisano metodę oczyszczania białek, która pozwala na wykrycie zarówno sumoilacji, jak i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, w Saccharomyces cerevisiae. Szczep, który wykazuje ekspresję Smt3 znakowanego polihistydyną (HF-Smt3) i Ndc10 lub Ndc80 znakowanego Myc, został skonstruowany i wykorzystany w naszych badaniach. W celu wykrycia sumoilacji opracowaliśmy protokół oczyszczania powinowactwa z białek sumoilowanych znakowanych przez Hisa za pomocą kulek niklowych i zastosowaliśmy analizę western blot z przeciwciałem anty-Myc w celu wykrycia sumoilowanych Ndc10 i Ndc80. W celu wykrycia ubikwitynacji opracowaliśmy protokół immunoprecypitacji białek znakowanych Myc i zastosowaliśmy analizę western blot z przeciwciałem anty-Ub, aby wykazać, że Ndc10 i Ndc80 są ubikwitynowane. Nasze wyniki pokazują, że białko znakowane epitopem będące przedmiotem zainteresowania w szczepie Smt3 znakowanym His-Flag ułatwia wykrywanie wielu PTM. Przyszłe badania powinny pozwolić na wykorzystanie tej techniki do identyfikacji i scharakteryzowania interakcji białkowych, które są zależne od określonego PTM.

Aby wykryć sumoylację białek kinetochoru Ndc80 i Ndc10, skonstruowano szczepy z HF-Smt3 oraz białkami kinetochoru (Ndc80 lub Ndc10) znakowanymi Myc (Tabela 2), zgodnie z wcześniejszym opisem 9,12. Konjugaty HF-Smt3 oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem kulek Ni-NTA. Analiza western blot oczyszczonego białka HF-Smt3 z użyciem przeciwciała anty-Flag pozwoliła na wykrycie sumoylowanych form substratów SUMO, które były nieobecne w szczepie kontrolnym bez HF-Smt3 (Rysu...

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie sumylacji i ubikwitynacji białek rdzenia kinetycznego drożdży pączkujących, NDC 10 oraz NDC 80. Jest to realizowane poprzez wstępne zebranie komórek drożdży wykazujących ekspresję SMT 3 z tagiem His-FLAG oraz NDC 10 lub NDC 80 z tagiem Myc, a następnie przygotowanie ekstraktów białkowych z tych komórek. Drugim krokiem jest oczyszczenie koniugatów SMT 3 z tagiem His-FLAG w celu wykrycia sumylacji lub immunoprecypitacja białek rdzenia kinetycznego z tagiem Myc w celu wykrycia ubikwitynacji.Następnie sumylację lub ubikwitynację wykrywa się za pomocą analizy western blot. Ostatecznie, obecność wzoru drabinowego dla NDC 10 i NDC 80 potwierdza, że białka te uległy sumylacji i ubikwitynacji. Opisana metoda oczyszczania białek umożliwia wykrycie zarówno sumylacji, jak i ubikwitynacji białek kompleksu NDC 10 i NDC 80 u drożdży pączkujących Saccharomyces.Moja cci. Główną zaletą tej techniki jest to, że stworzony szczep posiada dwa epitopy wiążące: jeden dla białka testowego, a drugi umożliwiający detekcję symulacji. Zastosowanie tych znaczników redukuje tło wynikające z reaktywności krzyżowej, która jest często obserwowana przy użyciu surowic poliklonalnych.Demonstracji tej procedury dokona Canero Uni, stażysta naukowy w moim laboratorium. Białka będą ekstrahowane z wcześniej przygotowanych i przechowywanych w temperaturze -20 °C pelletów komórek drożdży. Resuspenduj komórki w 0,5 ml schłodzonego na lodzie buforu.Należy użyć buforu guine, jeśli ekstrakt jest przeznaczony do testu pull-down z użyciem kulek nikiel nitrylowych, trioctowych lub nikiel NTA superflow. Należy użyć buforu A, jeśli ekstrakt jest przeznaczony do immunoprecypitacji. Probówki należy przez cały czas przechowywać w lodzie.Przenieś zawiesiny komórkowe do probówek o pojemności dwóch mililitrów. Zakręć każdą probówkę nakrętką. Dodaj objętość kulek szklanych równą objętości zawiesiny komórkowej.Homogenizuj komórki w mini homogenizatorze kulkowym przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieść probówki w lodzie na dwie do trzech minut. Powtórz proces homogenizacji i chłodzenia trzy razy. Mieszaj w wirówce wortex z dużą prędkością w temperaturze 4 °C przez 30 do 60 minut.Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że uległy one lizie. Zlizowane komórki będą wyglądać jak ciemne cienie (tzw. ghost cells) i nie będą posiadać wyraźnej granicy ani określonego kształtu. Optymalnie co najmniej 80% komórek powinno zostać zlizowanych.Następnie za pomocą pinezki wykonaj otwór w dnie probówki. Luźno zakręć nakrętkę i umieść probówkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wiruj przy 1000 ×g przez jedną minutę.Aby zebrać lizat, należy przenieść go do probówki do mikrocentryfugi i wirować z prędkością 15 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu wyizolowania ekstrahowanych białek. Po zmierzeniu stężenia ekstrahowanych białek za pomocą zestawu do oznaczania białek, należy znormalizować wszystkie ekstrakty tak, aby każdy zawierał taką samą ilość białka. Objętość całkowitą należy uzupełnić do 1 mL odpowiednim buforem.Z 50 OD 600 komórek uzyskuje się około pięciu miligramów całkowitego białka. 50 µL wyekstrahowanego białka należy zachować jako ekstrakt z całych komórek. Pozostałe 950 µL ekstraktu białkowego zostanie wykorzystane później do oczyszczania białek lub immunoprecypitacji białek znakowanych MT.Do 50 µL ekstraktu z całych komórek dodać 50 µL 2x buforu do próbek Laemmli. Próbki inkubować w bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez trzy do pięciu minut przed analizą metodą western blot. Procedurę rozpocząć od przygotowania kulek niklowych NTA superflow niezbędnych do oczyszczania.Uzyskaj odpowiednią ilość kulek, odwirugowując je przy niskich obrotach przez jedną minutę. Odlej nadsącz i przemyj kulki buforem PBS. Dodaj 1 ml PBS i odwracaj probówkę góra-dół aż do ponownego zawieszenia kulek.Osadź kuleczki poprzez wirowanie z niską prędkością i usuń nadsącz. W ten sposób wypłucz kuleczki łącznie pięć razy. Zawieś kuleczki w 1 mL buforu guine i rozdziel je do liczby probówek odpowiadającej liczbie próbek przeznaczonych do analizy.Osadź kuleczki poprzez wirowanie z niską prędkością i usuń nadsącz z każdej próbki. Do 100 µL kuleczek dodaj 950 µL wcześniej przygotowanego ekstraktu z całych komórek.Inkubować na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C przez co najmniej cztery godziny lub przez noc. Odwirować przy 800 do 1500 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Odobrać 50 µL supernatantu.Do otrzymanego supernatantu dodać 50 µL 2x buforu do próbek Laemmli i inkubować w 100 °C w bloku grzewczym przez trzy do pięciu minut. Następnie 10 µL każdej próbki zostanie poddanych analizie metodą western blot. Kuleczki niklowe NTA superflow przemyć raz 1 ml buforu płuczącego przez 5 do 10 minut na wytrząsalnej platformie w temperaturze pokojowej.Następnie należy pięciokrotnie przemyć kuleczki 1 mL buforu do rozrywania; po ostatnim przemyciu buforem do rozrywania zawiesić kuleczki w 90 µL dwukrotnego buforu do próbek Laemmli. Dodać 10 µL 1 M iodoacetamide, aby wspomóc dysocjację białka z tagiem His z kuleczek Ni-NTA. Inkubować w 100 °C w bloku grzewczym przez 3–5 minut. Po wymieszaniu w wortexie odwirować przy 13 000 ×g przez 30 sekund.Przenieś nadsącz do nowej probówki. Aby rozpocząć tę procedurę, uzyskaj niezbędną ilość przeciwciała w żelu powinowactwa anti cmic aero poprzez wirowanie z niską prędkością. Usuń nadsącz, wypłucz żywicę buforem A. Dodaj 1 mL buforu A i odwracaj probówkę góra-dół, aż żywica zostanie resuspendowana.Osad z żywicy należy zebrać poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie usunąć nadsącz. Procedurę płukania powtórzyć łącznie pięć razy. Żywicę zawiesić w 1 ml buforu A i podzielić na odpowiednią liczbę probówek, zgodnie z liczbą próbek przeznaczonych do analizy.Żywicę należy zebrać poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie usunąć nadsącz. Do 25 µL żywicy dodać 950 µL ekstraktu z całych komórek. Inkubować na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia wirować z prędkością od 800 do 1500 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C.Odbierz 50 µL supernatantu. Do supernatantu dodaj 50 µL 2x buforu do próbek LAM ly i inkubuj w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez trzy do pięciu minut. Przemyj żywicę buforem A: dodaj 1 mL buforu A, a następnie odwracaj probówkę góra-dół, aż żywica zostanie ponownie zawieszona.Zebrać żywicę poprzez wirowanie z niską prędkością i usunąć nadsącz po usunięciu nadsączu z końcowego płukania. Resuspendować żywicę w 100 µL buforu do próbek sume i inkubować w 100 °C w bloku grzewczym przez trzy do pięciu minut. Wymieszać w wortexie, a następnie wirować przy 13 000 ×g przez 30 sekund.Przenieś supernatant do nowej probówki. Na koniec nałóż wszystkie próbki pobrane zgodnie z tym protokołem. Do analizy Western blot w żelu SDS-PAGE wykorzystano szczepy drożdży wykazujące ekspresję SMT3 z poli-histydynowym znacznikiem flag (HF-SMT3) oraz NDC80 i NDC10 z znacznikami MT, aby wykryć kolokalizację białek kinetykoreowych.Trzy substraty HF SMT trzy zostały oczyszczone metodą powinowactwa z wykorzystaniem kulek niklowych i wykryte za pomocą przeciwciała anty-Flag. Sumo-modyfikowany NDC 80 został wykryty w substratach HF SMT trzy po inkubacji z przeciwciałem anty-mic. Brak zmodyfikowanych białek w szczepach kontrolnych bez HF SMT trzy wskazuje na specyficzność oddziaływania między HF SMT trzy a białkami docelowymi.Ponadto, w komórkach traktowanych NOCO desole stwierdzono zmniejszenie sumarycznej ilości NDC 80 i NDC 10, aby wykryć ubikwitynację NDC 80 i NDC 10. Próbki z białkami NDC 80 lub NDC 10 znakowanymi MIC poddano immunoprecypitacji, a następnie przeprowadzono analizę western blot z użyciem przeciwciał anty-MIC i anty-ubikwityna. Analiza ekstraktu z całych komórek oraz supernatantu potwierdziła ekspresję NDC 80 M i NDC 10 M. Próbki po immunoprecypitacji poddane detekcji przeciwciałami anty-MIC wykazały obecność wielu prążków o wysokiej masie cząsteczkowej, co sugeruje, że NDC 80 i NDC 10 ulegają modyfikacjom potranslacyjnym. Wzorzec drabinowy w próbkach po immunoprecypitacji poddanych detekcji przeciwciałami anty-ubikwityna wykazał, że NDC 80 i NDC 10 są ubikwitynowane.Wzorce drabinowe białek NDC 80 i NDC 10 zostały nasilone poprzez zastosowanie inhibitora proteasomów MG 1 32. Potwierdza to ponadto, że reprezentują one poliuwikwitynację. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć technikę oczyszczania białek, która umożliwia detekcję mation i wakcynację bat NN.

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika oczyszczania białka, która umożliwia wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorów drożdży pączkujących Ndc10 i Ndc80

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Zanieczyszczenie preparatów rybosomów eukariotycznych oczyszczonych metodami tradycyjnymi współoczyszczającymi nukleazami i proteazami negatywnie wpływa na późniejsze analizy biochemiczne i strukturalne. W celu rozwiązania tego problemu zastosowano szybką i prostą metodę oczyszczania chromatograficznego, wykorzystując rybosomy drożdżowe jako system modelowy.

Chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Ten film opisuje metodę ekstrakcji i oczyszczania ubikwitynylowanych peptydów zawierających pozostałości peptydów di-glicyny ze złożonej mieszaniny peptydów. Przedstawiona metoda może pomóc w identyfikacji pierwotnych miejsc ubikwitynacji w białku.

Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

Ten film demonstruje metodę in vitro do SUMOylacji białek substratowych przy użyciu sekwencyjnej kaskady enzymatycznej. Ponadto status SUMOylacji białka jest identyfikowany za pomocą techniki elektroforezy i immunoblottingu.

Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów.  Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Protokół opisuje krok po kroku metodę oczyszczania ubikwitynowanych białek z komórek ssaków na przykładzie białka supresorowego p53. Ubikwitynowane białka p53 oczyszczono z komórek w rygorystycznych warunkach niedenaturacji i denaturacji.

Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Poznaj metodę oczyszczania białek do wykrywania sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochoru Ndc10 i Ndc80 u drożdży Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia badanie modyfikacji potranslacyjnych kluczowych dla podziału komórkowego.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80 (Wideo) | JoVE Journal

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Przeglądaj więcej filmów